نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه اصفهان، دانشکده فنی و مهندسی، گروه مهندسی پزشکی
2 پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست فناوری جهاد دانشگاهی، مرکز تحقیقات علوم سلولی، گروه زیست فناوری سلولی، اصفهان، ایران
چکیده
هدف: در این پژوهش طراحی و ساخت داربستهای نانوکامپوزیتی تقویتشده با گرافن بهمنظور القای تمایز عصبی در سلول های بنیادی پالپ دندان مورد توجه قرار گرفت.
مواد و روشها: ابتدا داربستهای کامپوزیتی پلی کاپرولاکتون/ نانوگرافن با درصدهای وزنی 1، 3 و 5 درصد گرافن توسط روش ریختهگری حلال ساخته شدند. در ادامه میزان آبدوستی و هدایت الکتریکی نانوکامپوزیتها اندازهگیری شد. با استفاده از نتایج آزمونهای فیزیکی ذکر شده، داربست مناسب با درصد بهینه نانوگرافن انتخاب شد و مورفولوژی، فعالیت متابولیکی و پتانسیل تمایز عصبی سلولهای بنیادی پالپ دندان روی آن بهترتیب توسط میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM)، آزمون MTS و رنگآمیزی ایمونوفلورسنت مورد بررسی قرار گرفت.
نتایج: نتایج آزمون هدایت سنجی نشان داد که با افزودن گرافن به پلی کاپرولاکتون، هدایت الکتریکی کامپوزیت بهمیزان قابل توجهی افزایش مییابد. همچنین افزودن 5 درصد وزنی نانوگرافن به پلیمر منجر به کاهش زاویه تماس از 86/2±89/99 به 36/3±03/64 درجه میشود. در نهایت تصاویر میکروسکوپ SEM و رنگآمیزی ایمونوفلورسنت با نشانگر MAP2 نشان دادند که سلولها روی سطح داربست بهینه به سلولهای شبه عصبی تمایز یافتهاند.
نتیجهگیری: نتایج این پژوهش نشان داد که داربست نانوکامپوزیتی پلیکاپرولاکتون/ 5 درصد گرافن از پتانسیل مناسبی جهت القای تمایز عصبی و کاربرد در مهندسی بافت عصب برخوردار است.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Polycaprolactone/nano-graphene composite scaffolds for neural differentiation of dental pulp stem cells
نویسندگان [English]
- Z Khebreh-Kashani 1
- M Ebrahimian-Hosseinabadi 1
- i E Masael 1
- MH Nasr-Esfahani 2
1 Department of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering, University of Isfahan, Isfahan, Iran
2 Department of Cellular Biotechnology, Cell Science Research Center, Royan Institute for Biotechnology, ACECR, Isfahan, Iran
چکیده [English]
Aim: In this research, design and fabrication of graphene reinforced nano-composite scaffolds for neural induction in dental pulp stem cells (DPSCs) has been considered.
Material and methods: Polycaprolactone / nano-graphene composite scaffolds with 1%, 3% and 5% wt. graphene were firstly fabricated by the solvent casting method. Subsequently, hydrophilicity and electrical conductivity of the nano-composites were measured. According to the results of the mentioned physical experiments, the appropriate scaffold with the optimal ratio of nano-graphene was selected and cellular morphology, metabolic activity and neural differentiation potential of cultured DPSCs on it were evaluated by scanning electron microscopy (SEM), MTS assay and Immunofluorescent staining, respectively.
Results: Conductivity results demonstrated that by adding graphene to pure polymer, the electrical conductivity of the composite considerably increased. The addition of 5% wt. nano-graphene to the polymer can also reduce contact angle amount from 99.89±2.86° to 64.03±3.36°. Finally, SEM and Immunofluorescence images with MAP2 marker illustrated that the cultured cells on the surface of optimum scaffold differentiated into neuron-like cells with neural morphology.
Conclusion: The results of this study showed that conductive polycaprolactone containing 5% graphene nano-composite scaffolds have the appropriate potential for induction of neural differentiation and application in neural tissue engineering.
کلیدواژه‌ها [English]
- Tissue Engineering
- Graphene
- Dental Pulp Stem Cells
- Neural Differentiation
- Polycaprolactone
مقدمه
امروزه با استفاده از راهکارهای مهندسی بافت و پیشرفتهای علمی در این زمینه، داربستهای طبیعی و مصنوعی گوناگونی طراحی شدهاند که از آنها میتوان بهعنوان جایگزین پیوندهای عصبی استفاده کرد. موفقیت مهندسی بافت عصبی بهصورت اساسی به ایجاد تعادل و نظم بین رفتار سلولی وایجاد بافت درون یک داربست مصنوعی یا طبیعی بستگی دارد. خواص فیزیکی-شیمیایی و زیستی این داربست میبایست مشابه ماده زمینه خارج سلولی Extracellular Matrix (ECM) بدن باشد تا بتواند از اتصال، رشد و تمایز سلولها در بدن حمایت کند. خواصی مانند زیستسازگاری، زیستتخریبپذیری، رسانایی و استحکام کششی مناسب از جمله خواص مورد نیاز برای یک داربست عصبی ایده آل میباشند (1, 2).
گرافن (Graphene) یک لایه تک اتمی از کربنهایی است که بهصورت حلقوی با هم پیوند کووالانسی برقرار کردهاند. گرافن دارای ویژگیهای منحصربفردی از جمله هدایت الکتریکی و حرارتی بسیار بالا میباشد. دیگر خواص ویژه گرافن مانند قابلیت کشسانی بالا و تمایل به جذب پروتئینهای سبک، میتواند تمایز عصبی سلولهای بنیادی و رشد و تکثیر سلولهای عصبی را بهبود بخشد (3-5). پس از کشف گرافن در سال 2004 محققین به بررسی خواص و کاربردهای گرافن پرداختند که از جمله کاربردهای زیستی مورد توجه آن میتوان به استفاده در ساخت داربستهای مهندسی بافت، تصویربرداری مولکولی و سیستمهای رهایش ژن و دارو اشاره کرد. همچنین گزارش شده که گرافن در آزمونهای برونتنی فاقد سمیت سلولی بوده و بهعلت هدایت الکتریکی بالا گزینه مناسبی برای مهندسی بافت عصب، می باشد (6).
در طراحی داربستهای مهندسی بافت عصب بهدلیل خواص مکانیکی نزدیک پلیمرها به بافت عصب، استفاده از مواد پلیمری بسیار مرسوم است. تاکنون پلیمرهای زیست سازگار مصنوعی متعددی مانند پلی لاکیتیک اسید (PLA)، پلی لاکتیک گلیکولیک اسید (PLGA) و پلی کاپرولاکتون (PCL) بهمنظور طراحی و ساخت داربستهای عصبی بهکار رفته اند. اما جهت بهبود خواص فیزیکی، شیمیایی و زیستی این داربستهای پلیمری، نیاز به جزء دوم در زمینه داربست نیز ضروری است (7). سایار و همکارانش در گزارش خود بر این عقیدهاند که مواد کامپوزیتی پلیمری تقویت شده با پرکنندههای کربنی در مقیاس نانو، خواص مکانیکی و هدایتی بسیار بهتری نسبت به پلیمرهای خالص دارند. در این تحقیق، آنها از نانوکامپوزیت پلیکاپرولاکتون-گرافن بهعنوان یک داربست مهندسی بافت استفاده کردند. نتایج بهدست آمده نشان داد که پس از ترکیب با گرافن، پلیمر خواص زیستی و فرایندپذیری خود را حفظ میکند، اما خواص مکانیکی و هدایتی آن بهدلیل وجود گرافن افزایش مییابد. همچنین چسبندگی و رشد سلولهای PC12 کشت شده روی این نانوکامپوزیت نیز در مقایسه با پلیمر خالص افزایش داشته است (8). در مطالعهی صورت گرفته توسط روسا و همکارانش نیز نشان داده شده است که سلولهای بنیادی پالپ دندان (Sayyar) روی بستر کامپوزیتی پلیکاپرولاکتون/گرافناکسید از خود تمایز استئوبلاستی (Osteoblastic) و اودونتوبلاستی (Odontoblastic) نشان داده اند (9).
با توجه به اینکه در مطالعات انجام گرفته توسط نویسندگان، تاکنون گزارشی مبنی بر کاربرد داربستهای نانوکامپوزیتی PCL/Graphene بهمنظور بررسی تمایز عصبی سلولهای بنیادی پالپ دندان (DPSCs) مشاهده نشده است، رسیدن به هدف مذکور در این پژوهش مد نظر قرار گرفت. ابتدا داربستهای PCL/Graphene با درصد مختلف وزنی گرافن تولید شده و از نظر فیزیکی و شیمیایی مشخصه یابی شدند. سپس سلولهای DPSCs روی آنها کشت داده شدند و میزان تمایز عصبی القا شده توسط داربست روی این سلولها بررسی شد. استفاده از سلولهای DPSC به این دلیل مورد بررسی قرار گرفت که علاوه بر دسترسی آسانتر نسبت به سایر سلولهای بنیادی، قابلیت تمایز به ردههای سلولی مختلفی چون غضروفی، چربی، عصبی، استخوانی و ماهیچهای را داشته و همچنین ایمنیزایی و رد پیوند کمتری از خود نشان داده است (10). در نهایت نتایج بهدست آمده در این پژوهش نشان دهنده پتانسیل بالای نانوذرات گرافن جهت القای تمایز عصبی در سلولهای بنیادی بهویژه در روشهای مهندسی بافت عصب بودند.
مواد و روشها
ساخت غشای نانوکامپوزیت PCL/Graphene: ابتدا پودر نانوگرافن (نوترینو، ایران) در حلال دی متیل فرم آمید (DMF) (Merck، آلمان) با غلظت 5/0 درصد (w/v) پراکنده شده و بهمدت 12 ساعت در حمام آلتراسونیک قرار گرفت تا سوسپانسیون پایداری حاصل شد. بهمنظور ساخت غشای کامپوزیتی PCL/Nano Graphene، پلیمر PCL با وزن مولکولی 80000 (Sigma، آلمان) با غلظت (w/v) 10 درصد در حلال DMF حل شد. سپس سوسپانسیونهای نانو گرافن با درصد وزنی 1 تا 5 درصد در محلول PCL بهمدت 3 ساعت هم زده شدند تا کاملا حل شوند. در نهایت محلولهای آمیزهای درون دیشهای تفلونی با قطر 8 سانتیمتر قالبگیری شدند و در دمای محیط کمی خشک شدند. برای خروج مقادیر بیشتری از حلال، نمونهها بهمدت یک شبانه روز درون آون خلا در دمای پ 70 درجه سانتیگراد خشک شدند. بهعنوان گروه کنترل داربست PCL خالص به روش مشابه تولید شد.
بررسی خواص فیزیکی- شیمیایی داربستها
الگوی پراش اشعه ایکس غشاها توسط دستگاه XRD مدلXMD-300، UNISANTIS ساخت کشور سوئیس تعیین شد. ولتاژ دستگاه KV45 و شدت جریان 8/0 میلیآمپر انتخاب شدند. جهت تشخیص ساختار شیمیایی غشاها از طیف‌سنجی FTIR استفاده شد. بدینمنظور طیف FTIRدر محدوده طول‌موجcm-14000-400 از کلیه نمونهها توسط دستگاه طیف سنج شرکت Thermo-Science مدل IS10 ساخت کشور امریکا تهیه شد. بهمنظور بررسی ترشوندگی داربستها از دستگاه اندازهگیری زاویه تماس ساخت پژوهشگاه مواد و انرژی کشور ایران، با قطره آب با حجم 4 میکرولیتر استفاده شد که مجهز به دوربین مدل DFK23U618 ساخت کشور آلمان با قابلیت عکسبرداری از قطره و نرمافزار سنجش زاویه تماس قطره بود. آزمون زاویه تماس قطره آب برای هر یک از نمونهها در سه نقطه مختلف انجام گرفت. برای بررسی هدایت الکتریکی از روش چهار نقطهای و دستگاه Keithly ساخت کشور آمریکا استفاده شد. در این روش مقاومت سطحی داربستها سنجیده میشود.
آماده سازی داربست ها پیش از کشت سلول: پیش از کشت سلولها، ابتدا داربستها به اندازهی سطح ظروف کشت سلول 24 خانه بریده شدند بهمدت 2 ساعت زیر هود در الکل 70 درصد فیلترشده قرار گرفتند. سپس بهمدت 8 دقیقه در محلول بافر فسفاتی (PBS) دارای 1 درصد آنتیبیوتیک (پنیسیلین، استرپتومایسین) قرار گرفته و با یک پنس استریل به چاهکهای 24 خانه انتقال داده شدند. پس از 2 مرتبه شستشوی مجدد با محلول PBS، داربستها بهمدت یک شبانه روز با محیط کشت معمول مزانشیمی (HighGlucose DMEM) حاوی 1 درصد آنتیبیوتیک و 10 درصد سرم جنین گاوی (FBS) در انکوباتور قرار گرفتند. کلیه مواد مورد نیاز برای کشت سلول شامل محیط کشت، سرم و آنتی بیوتیکها از شرکت Gibco، کشور انگلستان خریداری شدند.
کشت سلولهای DPSCs
بهمنظور کشت سلولهای DPSC جهت آزمونهای سلولی از محیط کشت معمول مزانشیمی استفاده شد. پس از استریل کردن داربستها میزان 50000 سلول روی سطح هر داربست در ظروف 24 خانه کشت شد.
بررسی فعالیت متابولیکی سلولها روی داربستها (MTS assay)
بهمنظور بررسی فعالیت متابولیکی و میزان تکثیر سلولها روی داربستهای مختلف از کیت MTS ساخت شرکت Promega (امریکا) استفاده شد. به اینصورت که محلول MTS در حضور فنازین متوسولفات (PMS)، فورموزانی تولید میکند که در محلول فسفات بافر در محدوده 490 تا 500 نانومتر، توسط دستگاه اسپکتوفوتومتری جذب نوری آن خوانده میشود. به این منظور آزمون MTS در روزهای 1، 4 و 7 پس از کشت سلول انجام گرفت. روش انجام بدینصورت است که پس از یک مرحله شستشو با PBS منفی سلولها بههمراه محلول MTS حاوی محیط کشت کامل به نسبت 1:6، بهمدت 3 تا 4 ساعت در انکوباتور دور از نور قرار گرفتند. در نهایت جذب نوری محلول MTS روی سلولها توسط دستگاه الایزا در طول موج 490 نانومتر خوانده شد.
میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM)
بهمنظور بررسی ریخت شناسی و رفتاری سلولها از میکروسکوپ الکترونی روبشی مستقر در مرکز پژوهش متالورژی رازی (SEM, VEGA, TESCAN, Czech Republic) استفاده شد. بهطور خلاصه پس از قراردادن نمونهها در دستگاه، در شرایط خلا با آشکارسازی الکترونهای ثانویه (Secondary Electron (SE)، تصاویر میکروسکوپی الکترونی روبشی با بزرگنمایی مورد نظر تهیه شدند. پوششدهی طلا (قبل از رویت زیر میکروسکوپ) نیز بهمدت 10 دقیقه بهوسیله دستگاه لایهگذاری انجام شد. جهت بررسی ریخت شناسی سلولها ابتدا باید سلولها روی سطح تثبیت شوند. بدینمنظور از محلول تثبیت کننده شامل 10 درصد فرمالدئید 37 درصد، آب دیونیزه، دیسدیم هیدروژنفسفات (Na2HPO4) و سدیمدی هیدروژن فسفات (NaH2PO4) بهمدت 30 دقیقه استفاده شد. از پس از تثبیت عملیات آبگیری با استفاده از غلظتهای سریالی اتانول (60 ، 70 ، 80 ، 90 ، 98 و 100 درصد) انجام شد و نمونهها در دمای محیط خشک شدند.
تمایز عصبی سلولهای DPSC
5 یا 6 روز پس از کشت سلول در محیط کشت مزانشیمی زمانی که سلولها به تراکم مورد نظر رسیدند، محیط کشت مزانشیمی با محیط تمایز عصبی (NB + 1% Pen/Strep + 1% NEAA + 1% L-Glu + 1% ITS) حاوی bFGF (100 ng/ml) (رویان بیوتک، ایران) تعویض یافت. پس از گذشت 6 روز فاکتورهای رشد shh (100ng/ml) (رویان بیوتک، ایران) و FGF8b (10ng/ml) (Sigma، آلمان) نیز بهمدت 6 روز به محیط تمایزی اضافه شدند. طی دوره تمایز نیمی از محیط کشت سلولها هر سه روز یکبار تعویض شد. پس از گذشت دوره 12 روزه تمایز سلولها با پارافرمالدئید 4 درصد جهت رنگآمیزی ایمنوفلورسنت تثبیت شدند.
رنگآمیزی ایمونوفلورسنت
در رنگآمیزی ایمونوفلورسنت از نشانگر هسته ای DAPI (Sigma، آلمان) که به DNA هسته سلولها متصل میشود، بهعنوان نشانگر هستهای سلولها و از آنتیبادی اولیه MAP2 (Microtubule-associated protein2 2 (Chemicon، امریکا) بهعنوان (نشانگر اختصاصی تمایز عصبی استفاده شد. به این منظور پس از تثبیت سلولها بهمدت 1 شبانه روز با آنتی بادی اولیه با غلظت 1:300 در دمای 4 درجه سانتیگراد قرار گرفتند و سپس بهمدت یک ساعت با آنتی بادی ثانویه (Goat anti mouse IgG-FITC, 1:600, Millipore) در دمای 37 درجه سانتیگراد در انکوباتور قرار گرفتند. در نهایت رنگ آمیزی هسته بهمدت 10 دقیقه در دمای محیط انجام گرفت.
آنالیز آماری
بهمنظور بررسی آماری نتایج، ابتدا دادهها با استفاده از شاخص میانگین و همچنین انحراف معیار توصیف گردیدند. سپس برای مقایسه دادههای بیش از دو گروه از آزمون آماری One-Way ANOVA (آنالیز واریانس یکطرفه) در سطح معنیداری 95 درصد استفاده شد. آنالیز آماری با استفاده از نرم افزار SPSS انجام گرفت.
نتایج
بررسی الگوی پراش اشعه ایکس غشاهای نانو کامپوزیتی
ساختار بلورین غشاهای کامپوزیتی توسط الگوی پراش اشعه ایکس مورد مطالعه قرار گرفت که نتایج آن در شکل 1-A نشان داده شده است. به طور کلی مشاهده میشود که پیک شاخص صفحههای گرافن 84/31 آنگستروم قرار دارد که با افزایش درصد گرافن در غشاها شدت آن افزایش یافته است، همچنین الحاق گرافن تغییری در ساختار بلوری پلیمر ایجاد نکرده است. از طرفی تشابه بین الگوی پراش غشاهای مرکب با درصدهای متفاوت نانوگرافن، نشاندهنده این است که غشاها ساختار بلوری مشابه دارند.
بررسی طیف FTIR غشاهای کامپوزیتی
در این پژوهش از طیف سنجی FTIR برای تشخیص برهمکنشهای احتمالی بین ذرات نانو گرافن و پلیمر استفاده شدهاست. بهطور کلی طیف جذبی پلیکاپرولاکتون دارای سه پیک شاخص در اعداد موج cm-1 1720، 2865 و 2940 میباشد، که بهترتیب نشان دهنده وجود ارتعاش کششی پیوندهای –CH2 و ارتعاش پیوندهای –C=O میباشد. در مقایسه با پلیکاپرولاکتون خالص این سه پیک در طیفهای مربوط به نمونههای پلیکاپرولاکتون/گرافن نیز دیده میشود (Error! Reference source not found.). بنابراین هیچ تفاوتی بین طیف غشای پلیمر خالص و غشاهای مرکب حاوی نانوگرافن دیده نمیشود، بدینمعنی که پلیمر PCL با گرافن برهمکنش فیزیکی داشته است.
شکل 1: A) الگوهای پراش اشعه ایکس، B) طیف های جذبی FTIR غشاهای مرکب قالب گیری شده
بررسی میزان آبدوستی غشاهای کامپوزیتی
پس از ساخت داربستها (شکل 2-A) میزان آبدوستی سطح آنها با استفاده از دستگاه اندازهگیری زاویه تماس بررسی شد. نتایج نشان داده شده در شکل 2-B نشان دادند که زاویهی تماس آب با سطح این داربستها بهترتیب در پلیکاپرولاکتون، پلیکاپرولاکتون- 1 درصد گرافن، پلیکاپرولاکتون 3 درصد گرافن و پلیکاپرولاکتون 5 درصد گرافن برابر با 86/2±89/99، 20/1±28/70، 62/4±23/69 و 36/3±03/64 درجه میباشد. به این معنی که بهطور کلی با افزایش میزان نانوگرافن در داربستها، میزان ترشوندگی نیز افزایش یافته است.
بررسی هدایت الکتریکی غشاهای کامپوزیتی
شکل 2-C نتایج اندازه گیری هدایت الکتریکی داربستهای مختلف را نشان میدهد، بهطور کلی با افزایش درصد گرافن در پلیمر هدایت الکتریکی غشاها نیز افزایش یافته است. مقدار هدایت الکتریکی داربستها بر اساس رابطه σ=G.L /A اندازهگیری شد (11) . در این رابطه σ معرف رسانایی بر حسب S.cm-1، L معرف فاصله بین دو الکترود برحسب cm، A معرف مساحت مقطع عرضی غشا بر حسب cm2 و G معرف مقدار معکوس مقاومت الکتریکی غشا بر حسب زیمنس (S) است. در این مرحله با توجه به نتایج مشخصه یابی داربستها، غشاءPCL-5%G برای مطالعات سلولی بعدی انتخاب شد.
شکل 2: A) تصاویر غشاهای مرکب قالب گیری شده، B) نتایج آزمون اندازهگیری زاویه تماس قطره، C) نتایج آزمون اندازهگیری هدایت الکتریکی. علامت * نشان دهنده اختلاف معنیدار نتایج در مقایسه با گروه کنترل (PCL) می باشد (p≤0.05).
بررسی ریخت شناسی و رفتار متابولیکی سلولها روی غشاهای کامپوزیتی
بهمنظور بررسی تاثیر خصوصیات فیزیکی و شیمیایی داربستها روی رفتار چسبندگی سلولها از تصویربرداری SEM استفاده شد (شکلهای 3-A و 3-B). همانطور که در تصاویر مشخص است یک هفته پس از کشت، سلولها روی سطح داربست ایدهال PCL-5%G چسبندگی، پهنشدگی و رشد مطلوبی از خود نشان دادهاند و استحالههای سلولی آنها نیز بهخوبی مشخص است.
بهمنظور بررسی زندهمانی، فعالیت متابولیکی و تکثیر سلولها روی داربستهای مرکب نیز از آزمون MTS استفاده شد (شکل 3-C). با توجه به نتایج جذب در روزهای مختلف اگرچه فعالیت متابولیکی سلولها روی سطح ظرف کشت سلول معولی افزایش معنیداری نسبت به داربست ها دارد، اما روند افزایشی و غیرسمی بودن داربستها نیز حائز اهمیت است. این روند افزایشی نشان دهنده این است که داربستهای پلیکاپرولاکتون/گرافن میتوانند بستر مناسبی جهت چسبندگی، بقا، رشد و مهاجرت سلولی باشند.
شکل 3: A و B) تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی از سلولهای DPSC کشت شده روی سطح غشا PCL-5%G در دو بزرگنمایی 500 و 50 میکرومتر، C) نتایج آزمون بررسی فعالیت متابولیکی سلولها (MTS assay). علامت * نشان دهنده اختلاف معنیدار نتایج در مقایسه با گروه کنترل (PCL) می باشد (p≤0.05).
بررسی تمایز عصبی سلولها روی غشاهای کامپوزیتی
طبق تصاویر بهدست آمده از رنگ آمیزی ایمنوفلورسانس سلولهای کشت شده روی سطح داربست PCL-5%G، مشاهده میشود که سلولها علاوه بر اینکه نسبت به مارکر عصبی MAP2 مثبت بودند، مورفولوژی شبه نورونی نیز از خود نشان دادند (شکل 4). از طرفی روی سطح غشاهای مرکب سلولها در یک جهت رشد یافته اند که میتواند بهدلیل وجود لایههای نانوگرافن باشد.
شکل4: تصاویر رنگ امیزی فلورسنت سلولهای بنیادی پالپ دندان کشت داده شده روی سطح داربست PCL-5%G پس از 12 روز.
بحث
آسیبهای سیستم عصبی بهخصوص آسیبهای طناب نخاعی و اعصاب محیطی یکی از مهمترین مسائل در زمینه پژوهشهای درمانی است که از دیرباز توجهات بسیاری را بهخود جلب کردهاند. با توجه به این مساله که بافت عصبی قابلیت خود ترمیمی بسیار کمی دارد، اغلب درمانهای متداول به جایگزینی بافت با استفاده از پیوند معطوف شده است. معایب درمانهای وابسته به پیوند مانند آسیب به ارگانهای دیگر، رد پیوند و انتقال بیماریها استفاده ازاین روشها را محدود کرده و توجه زیادی را به راهکارهای مهندسی بافت معطوف کردهاست (12). تا کنون تحقیقات بسیاری روی بیومتریالهای مختلف و روشهای سلولی برای درمان آسیبهای عصبی صورت گرفته است.
در این میان مطالعات متعددی به استفاده از لایههای کربنی گرافن جهت القاء تمایز عصبی بهعلت هدایت الکتریکی بالا، پایداری شیمیایی مناسب و زیست سازگاری بالای آنها بسیار پرداخته اند (13-15). همچنین ذکر شده است که دیگر خواص گرافن مانند الاستیسیته بالا و قابلیت جذب پروتئینهای سبک، نیز میتواند تمایز سلولهای بنیادی و رشد و تکثیر سلولهای عصبی را بهبود بخشد (16, 17).
بدین ترتیب در این پژوهش طراحی و کاربرد غشاهای کامپوزیتی پلیکاپرولاکتون/گرافن مورد بررسی قرار گرفتهاند. جز پلیمری بهکار رفته بهمنظور افزایش خواص مکانیکی داربست بهویژه جهت کاربرد در مطالعات درون تنی بعدی انتخاب شده است. برهمکنش بین ذرات نانوگرافن و پلی کاپرولاکتون بهصورت فیزیکی بوده است که این مطلب با توجه به نتایج الگوی پراش اشعه ایکس و طیفهای FTIR بهدست آمده قابل اثبات میباشد (شکل 1). بدیهی است که چنانچه برهمکنش شیمیایی در سطح مشترک پلیمر و نانوگرافن رخ می داد تغییرات پیکهای جذبی FTIR و تغییرات میزان بلورینگی میبایست مشاهده شود. برهمکنشهای شیمیایی عموما در اثر افزودن اکسید گرافن به پلیمرها گزارش شده است و در مورد گرافن بهعلت عدم وجود گروه فعال شیمیایی چنین مواردی مشاهده نمیشود. بهعنوان مثال وان و همکاران (18) گزارش کرده اند که افزودن گرافن اکسید به پلی کاپرولاکتون منجر به ایجاد پیوند هیدروژنی بین دو ماده میشود و ساختار شیمیایی ترکیب حاصله را دچار تغییر میکند.
یکی از موارد مهم موثر در چسبندگی سلولی آبدوستی سطح موردنظر میباشد بهصورتیکه هر چقدر سطح داربست آبدوستتر باشد زاویه تماس قطره آب کوچکتر و چسبندگی سلولها بهتر خواهد شد (9). شایان ذکر است که البته آبدوستی یک بستر کشت سلول باید میزان بهینهای داشته باشد و آبدوستی بیش از حد هم منجر به جداشدن سلولها از سطح میشود. گزارش شده است که میزان بهینه زاویه تماس قطره آب برای چسبندگی موثر سلولها به یک سطح حدود 40 تا 70 درجه سانتیگراد میباشد (19). در این پژوهش با افزودن نانوگرافن به پلیمر آبدوستی آن بهصورت معنیداری در مقایسه با پلیمر خالص افزایش یافته است و هرچقدردرصد نانوگرافن اضافه شده افزایش یافته است، کاهش زاویه تماس قطره آب نیز بیشتر شده است (شکل 2-B). با توجه به مقادی زاویه تماس قطره بهدست آمده نمونه حاوی 5 درصد گرافن بهنظر میرسد در محدوده بهینه آبدوستی برای چسبیدن سلولها قرار دارد. علت فزایش آبدوستی پلی کاپرولاکتون پس از افزودن گرافن را میتوان به افزایش زبری سطح و رسانایی الکتریکی آن نسبت داد (20).
عامل موثر دیگر در طراحی داربستهای مهندسی بافت عصب، رسانایی داربست میباشد. گرافن با توجه به هدایت الکتریکی بالایی که دارد هدایت سیگنالهای الکتریکی موثر در تمایز را تسهیل میکند و منجر به القای تمایز عصبی میشود (14). در این پژوهش هم با افزایش مقدار ماده رسانای گرافن، رسانایی داربستها افزایش داشته بهطوریکه با افزودن گرافن به پلیمر خالص هدایت الکتریکی آن حدود 104 برابر شده است (شکل 2-C) بهطوریکه سایار و همکاران (8) نیز در مطالعات خود روی کامپوزیت پلیکاپرولاکتون/گرافن به هدایت الکتریکی مشابه دست یافتند. بنابراین از لحاظ هدایت الکتریکی نیز غشاهای ساخته شده با 5 درصد گرافن میتوانند پیشنهاد مناسبی برای کاربردهای مهندسی بافت عصب باشند. بنابراین از میان نمونههای مرکب ساخته شده، غشای مرکب حاوی 5 درصد گرافن برای مطالعات سلولی انتخاب شد.
همانطور که در شکلهای 3-A و 3-B مشخص است سلولها روی سطح داربست چسبندگی، پهنشدگی و رشد مطلوبی را از خود نشان دادهاند و استحالههای سلولی بهخوبی مشخص است. با توجه به نتایج MTS assay نیز (شکل 3-C)، مشاهده میشود که اگر چه فعالیت متابولیکی سلولها روی سطح ظروف کشت سلول معمولی نسبت به داربستها طی یک هفته کشت سلول بیشتر بوده است اما روند افزایشی فعالیت متابولیکی سلولها طی زمان در سایر گروهها نیز دیده میشود. این روند افزایشی نشان دهنده این است که غشاهای پلیکاپرولاکتون/گرافن میتوانند بستر مناسبی جهت چسبندگی، بقا، رشد و مهاجرت سلولها باشند و اثر سمیتی روی سلولهای DPSC ندارند. بهطور کلی گزارشهای ضد و نقیضی در زمینه سمیت سلولی ترکیبات گرافن وجود دارد که وابسته بهروش ساخت گرافن و ماهیت سلولهای بهکار رفته هستند. اما در اکثر مقالات گزارش شده است که ترکیبات گرافنی روی رفتار سلولی (چسبندگی، تکثیر و تمایز) بهصورت مثبت تاثیر گذار هستند که عمدتا بهعلت ساختار اتمی این ترکیبات است. بهعنوان نمونه حلقههای آروماتیک موجود در ساختار گرافن میتواند تجمع پروتئینهای ماده زمینه خارج سلولی مانند لامینین و فیبرونکتین را توسط پیوندهای غیرکووالانسی افزایش دهد (21). همچنین این حلقه ها می توانند بهعنوان یک نقطه اتصال برای گیرندههای سطح سلولی عمل کنند (22).
مقالات متعددی پتانسیل بالای ترکیبات گرافنی جهت القای تمایز عصبی را گزارش کرده اند (14, 15, 22-25). بهطور کلی نانوگرافن از سه طریق تمایز عصبی سلولهای بنیادی را بهبود میبخشد:
بهطور کلی ویژگی های سطحی منحصر به فرد گرافن میتواند در تمایز مستقیم سلولهای بنیادی به ردههای مختلف موثر باشد (14).
ساختار سه بعدی داربستهای مرکب ریز محیطی فراهم می آورد که میتواند شرایط درون تنی بدن موجود زنده را شبیه سازی کند (14, 26).
عامل سوم که مهمترین عامل نیز می باشد، رسانایی الکتریکی گرافن است. از آنجاییکه سلول های عصبی با تحریک الکتریکی فعال میشوند و برای مهاجرت، تکثیر و تمایز به انتقال بار الکتریکی نیاز دارند، ترکیبات رسانا می توانند تاثیر زیادی در القای تمایز عصبی در آنها داشته باشند (27).
یکی از مزایای قابل توجه گرافن در مقایسه با پلیمرهای رسانا برای ساخت داربستهای مهندسی بافت عصب این است که رسانایی گرافن در شرایط محیطی مختلف تقریبا پایدار باقی میماند (14). در این پژوهش از گرافن بهعنوان جزء رسانا در ساختار یک پلیمر عایق استفاده شده است تا از قابلیت انتقال بار الکتریکی ترکیب حاصله بهمنظور القای تمایز عصبی روی سلولهای DPSC استفاده شود. بدیهی است که استفاده از جز پلیمری نه تنها قابلیت شکلگیری و انعطاف پذیری داربست را افزایش میدهد بلکه روی خواص مکانیکی آن نیز تاثیر گذار است. بهعلاوه گزارش شده است که در مواردی ساختار صفحهای صاف گرافن انتقال بار الکتریکی را محدود کرده است، بنابراین استفاده از ترکیب گرافن با یک زیست پلیمر دیگر میتواند این مشکل را رفع کند (28). در این پژوهش تصاویر ایمنوفلورسنت سلولهای رنگی آمیزی شده با نشانگر عصبی MAP2 نشان دادند که سلول های DPSC کشت شده روی داربست PCL-5%G نسبت به این نشانگر مثبت بودند و مورفولوژی شبه نورونی را نیز از خود نشان دادند (شکل 4). بهعلاوه در غشاهای نانو کامپوزیتی میتوان جهت گیری سلولهای عصبی را نیز تا حدی مشاهده کرد. منابع متعددی وجود دارند که در آنها داربستهای که قادر به القای آرایش یافتگی در سلولها هستند را برای کاربرد در مهندسی بافت عصب مناسب میدانند (7, 12). اگرچه پروتئین MAP2 یکی از نشانگرهای اساسی در بررسی تمایز عصبی میباشد، اما بررسیهای دقیق تر در سطح mRNA و پروتئین برای نشانگرهای اختصاصی دیگر مانند NF (Neurofilament) نیز پیشنهاد میشود.
همچنین در مطالعات بعدی استفاده از سلولهای پیشساز عصبی و پیوند داربستها در مدل موش صحرایی برای مطالعات درون تنی تمایز نیز پیشنهاد میشود.
نتیجهگیری
با توجه به اهمیت استفاده از مواد رسانا در ساخت داربستهای مهندسی بافت عصب، در این مطالعه غشاهای نانوکامپوزیتی پلیکاپرولاکتون/گرافن مورد بررسی قرار گرفتند. غشاهای نانوکامپوزیتی با زمینه پلیکاپرولاکتون تقویت شده با نانوصفحههای گرافن با مقادیر 0-5 درصد وزنی گرافن توسط روش ریختهگری حلالی ساخته شدند. طیفهای حاصل از طیف‌سنجی اشعه مادون قرمز و الگوی پراش اشعه ایکس برهمکنش فیزیکی بین پلیمر و ذرات نانوگرافن را نشان دادند. در آزمون هدایت سنجی نیز افزایش هدایت الکتریکی بهازای افزایش مقدار وزنی گرافن دیده شد. با انجام مطالعات تکمیلی روی غشاها و مقایسه خواصی همچون زاویه تماس و آزمون سمیت سلولی، با سلولهای بنیادی پالپ دندان، مشاهده شد که افزودن گرافن به پلیکاپرولاکتون میتواند موجب افزایش آبدوستی داربست و پاسخ سلولی مناسبتری نسبت به پلیمر خالص شود که این مطلب توسط تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی از غشاهای حاوی سلول نیز مجددا تایید شد. همچنین تمایز عصبی و مورفولوژی عصبی سلولها پس از گذشت دوره تمایز توسط رنگآمیزی ایمونوفلورسنت و تصاویر حاصل از میکروسکوپ فلورسانس تایید شد. بنابر مطالعات انجام شده در این پژوهش، غشای نانوکامپوزیتی رسانای پلیکاپرولاکتون/5 درصد گرافن (PCL-5%G) برای کاربردهای مهندسی بافت عصب بهعنوان داربست پیشنهاد میشود.
تشکر و قدردانی
نویسندگان این پژوهش از حمایتهای دانشگاه اصفهان و پژوهشکده زیست فناوری پژوهشگاه رویان تشکر و قدردانی میکنند.
)