مقدمه

سرطان به‫عنوان یکی از کشنده­ترین عوامل مرگ و میر در دنیا، سالیانه بیش از 5/7 میلیون نفر را در به کام مرگ می­کشاند (1). بر اساس پیش­بینی سازمان بهداشت جهانی بروز سرطان در ایران تقریبا 86000 نفر در سال 1399 شمسی خواهد بود که میزان مرگ و میر ناشی از آن حدود  63000 مورد خواهد رسید (2 و 3). درکشورهای در حال توسعه سرطان پستان از جمله شایع­ترین سرطان­ها در بین زنان است­ (4). این سرطان از عوامل اصلی به خطر انداختن سلامتی در میان زنان است و اولین عامل مرگ و میر بر اثر سرطان در بین زنان محسوب می‫شود (5). بر اساس آمار وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشکی در سال 1392 بیش از 40000 نفر در ایران دچار این بیماری شده­اند و بر این تعداد هر ساله افزوده می­شود ­(6). از سوی دیگر پروستات یکی از غدد مهم دستگاه تولید مثل در مردان است و بیماری­های ناشی از آن دارای اهمیت فراوانی هستند ­(7). سرطان پروستات شایع‫ترین سرطان بدخیم در میان مردان است، بیشترین مورد بروز سرطان در مردان (حدود 28 درصد) و دومین عامل مرگ­و­میر (حدود11 درصد­) را به‫خود اختصاص داده است. فاکتورهای ژنی و عوامل محیطی از مهم­ترین فاکتورهای هستند که در بروز سرطان سینه و پروستات نقش دارند، از طرف دیگر عواملی محیطی مانند رژیم غذایی، نحوه زندگی، شرایط جغرافیایی، عوامل استرس­زا، سن و چاقی در بروز این بیماری دخیل هستند (11-8). متخصصین بالینی از روش­های متعددی در تشخیص و درمان انواع سرطان­ها استفاده می­کنند که شیمی درمانی، پرتو درمانی، جراحی و هورمون درمانی عمده­ترین آن‫ها هستند ولی مهم­ترین روش مبارزه با سرطان، شیمی‫درمانی است که عوارض جانبی  زیادی از  جمله خستگی­، حالت تهوع و ریزش مو و غیره را برای بیمار ایجاد می­کند، این عوارض می­تواند بر روی کیفیت زندگی بیمار تاثیر زیادی داشته باشد (12و13). داروی دوکسوروبیسین با نام تجاری آدریامایسیین یکی از قوی­ترین و اصلی­ترین داروهای شیمی درمانی گروه آنتراسیکلین است. این دارو در درمان بسیاری از سرطان­ها نظیر معده، پستان، ریه، تخمدان، استخوان، بیماری هوچکین و سرطان خون مورد استفاده قرار می‫گیرد، این دارو همانند دیگر داروهای شیمی درمانی دارای عوارض جانبی بسیار زیادی است که می­توان به تب، مسمومیت قلبی و غیره اشاره کرد (16-14). چندین مکانیسم برای اعمال خاصیت سمیت این دارو در نظر گرفته می­شود که مهم­ترین آن‫ها آسیب به DNA  می‫باشد. دوکسوروبیسین با پایداری اتصال کمپلکس آنزیم توپوایزومراز II به DNA از اتصال مجدد رشته­های شکسته شده جلوگیری می­کند. آسیب به DNA به‫عنوان یک محرک سلولی باعث فعال شدن پروتئین­های مسیر آپوپتوزیس می­­شود (17). پروتئین­های خانواده BCL₂­، یک گروه از تنظیم کننده­های داخل سلولی آپوپتوزیس یا مرگ برنامه­ریزی شده سلول هستند. تعدادی از پروتئین­ها­ خانوادهBCL₂، پروآپوپتوتیک هستند یعنی آپوپتوزیس به‫وسیله افزایش بیان این پروتئین­ها راه اندازی می­شود و  BAX جز این گروه است. تعداد دیگری از پروتئین­های خانواده  BCL₂آنتی­آپوپتوتیک هستند یعنی آپوپتوزیس به‫وسیله مهار آزاد­سازی این پروتئین­ها باز­داری می­شود مانند­BCL₂  که به‫طور گسترده در سطح غشا خارجی میتوکندری وER  غشا هسته واقع شده­اند و تمامیت غشا را حفظ می­کنند (20-18). تحقیقات زیادی در مدت بیش از بیست سال  بر روی مرگ برنامه­ریزی شده سلول یا آپوپتوزیس پوپتورصورت گرفته است و در نتیجه این تحقیقات ثابت شده است که مرگ برنامه ریزی شده سلول به‫عنوان یک مانع طبیعی رشد سرطان می‫باشد، ترکیبات طبیعی موجود در گیاهان با تاثیر بر روی مسیر آپوپتوزیس سلول­های سرطانی می‫توانند به‫عنوان یک ترکیب ضد توموری شناخته شوند (21).

جنس Blepharis دارای 100 گونه گیاهی است که در مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری رشد می‫کند. گیاه خارسنبل از جنس Blepharisبا نام علمی Blepharis persica شناخته می­شود (22). گونه مشابه این گیاه­، B.edulis است که در بیابان­های خاورمیانه و آفریقا رشد می­کند (23). خارسنبل گیاهی است چندساله و کم ارتفاع، دارای برگ بیضی و میوه کپسولی است. ریشه آن مدر است و برگ­های آن دارای خاصیت بند آوردن خون هستند. در حال حاضر تحقیقات زیادی بر روی این گیاه انجام نشده است و اطلاعات کمی از خواص و فواید دارویی این گیاه وجود دارد ­(24). با توجه به آن‫که گیاهان دارای اثرات ضد توموری از جمله القای آپوپتوزیس و مرگ سلول­های سرطانی هستند و عوارض جانبی از استفاده آن‫ها کمتر است و همچنین این گیاه در مناطق بومی جنبه دارویی دارد، در این تحقیق بر آن شدیم که در ابتدا اثرات ضدسرطانی عصاره بذر گیاه خارسنبل با کمک تست MTT (Dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium  bromide) بر روی رده­های سلول­های سرطانی سینه ­(MCF-7) و پروستات (‫LNCaP) سنجیده شود و با رده سلولی نرمال فیبروبلاست (­SKM) به‫عنوان گروه کنترل مقایسه شود و همچنین میزان القا آپوپتوزیس در رده­های سلولی با کمک روش فلوسایتومتری سنجش شود. ترکیب دارو دوکسوروبیسین و عصاره نیز مورد سنجش قرار گرفت و در پایان بیان ژن Bcl₂ با کمک روش quantitative RT-PCR  Real-Time برای هر یک از گروه­های مورد مطالعه مورد سنجش قرار گرفت.

مواد و روش‌ها

تهیه نمونه گیاهی:این تحقیق یک تحقیق بنیادی، کاربردی است. گیاه خارسنبل از مناطق جنوبی و گرمسیر استان کرمان در فصل بهار در سال 1396 از منطقه کهنوج با طول جغرافیایی 57 و عرض جغرافیایی 27 درجه و ارتفاع از سطح دریا 508 متر جمع آوری شد و بعد از تائید استاد گیاه شناسی ، گیاه در سایه و دمای محیط خشک شد و  سپس بذرهای  گیاه  جدا شدند و تا زمان عصاره­گیری در دمایی اتاق نگه­داری شدند.

 تهیه عصاره گیاهی: برای تهیه عصاره هیدروالکی از روش خیساندن (Macerate) و اتانول 70 درصد استفاده شد (25). ابتدا 40 گرم از بذر به‫کمک دستگاه آسیاب کاملا پودر شد. پودر حاصل در 300 میلی‫لیتر الکل 70 درصد حل شد و به‫مدت 72 ساعت روی دستگاه شیکر با دور متوسط در دمایی اتاق قرار داده شد­. در مرحله بعدی کار با کمک کاغذ صافی واتمن 1 در مدت 30 دقیقه عصاره­های صاف شد و جداسازی الکل با کمک دستگاه روتاری در خلا در دمای 45 درجه سانتی­گراد و مدت 45 دقیقه صورت گرفت. در نهایت برای جداسازی کامل حلال از عصاره در داخل آون به‫مدت 48ساعت در دمایی 45 درجه سانتی­گراد قرار داده شدند. عصاره حاصل تا فرایند آزمایشگاهی در فریزر 20- سانتی­گراد نگه­داری شد .

تهیه غلظت­های مختلف عصاره و دارو: در این تحقیق از 8 غلظت عصاره هیدرو­الکلی بذر خارسنبل و 4 غلظت دارویی دوکسوروبیسین استفاده شد. به‫منظور تهیه 10­ میلی‫لیتر استوک10 میلی­گرم برمیلی‫لیتر عصاره هیدرو الکلی، ابتدا میزان 100 ­میلی­گرم از عصاره نیاز است که این مقدار در 400 میکرو لیتر  Dimethyl sulfoxide (DMSO) (4 درصد) حل شد، در ابتدا 1 میلی‫لیتر محیط کشت فاقد سرم اضافه شد و بعد از آن مابقی محیط کشت اضافه تا کاملا در عصاره حل شود. غلظت­های دیگر به­ترتیب  5/7، 5 ، 5/2، 25/1، 625/0 ، 315/0و 156/0 میلی­گرم بر میلی­لیتر از استوک اصلی با کمک فرمول m₁c₁=m₂c₂  به‫دست آمد. در این تحقیق از دارو دوکسوروبیسین 50 میلی­گرم بر 25میلی لیتر به‫صورت محلول با نام تجاریEbedoxo  استفاده شد. ابتدا برای تهیه 7 میلی­لیتر از استوک نانوگرم بر میلی لیتر 500  از این دارو 25/1 میکرولیتر از آن را در 400 میکرولیتر  DMSOو محیط کشت بدون سرم به‫صورت کم کم اضافه شد تا حجم محلول 7 میلی­لیتر شود و از استوک به دست آمده غلطت­های 250 ، 125 و 5/62 نانوگرم بر میلی­لیتر دارو  تهیه شد. عصاره موجود و دارو را قبل از رقت سازی با فیلتر سررنگی 22/0­میکرومتر فیلتر شدند. در این تحقیق همچنین اثر ترکیبی دارو دوکسوروبیسین در غلظت‫های کم (125­و 5/62 نانوگرم برمیلی لیتر با غلظت­های کم عصاره (625/0 و 315/0 میلی گرم بر میلی لیتر) مورد سنجش قرار گرفت .

کشت سلولی : در این پژوهش­، سه رده سلول­های سرطانی سینه (MCF7)­، پروستات (LNCaP) و فیبروبلاست ((SKM در داخل فلاسک 25 سانتی­متر مربع به‫صورت کشت شده از انستیتو پاستور ایران خریداری شدند. سلول­­های سرطانی در محیط کشت 1640 RPMI و سرم جنینی  گاو  FBS 10 درصد به‫همراه 1 درصد آنتی بیوتیک­های استرپتومایسین و پنی­سیلین کشت داده شدند و هر سه رده سلولی را در انکوباتور 5 درصد CO₂ و دمای 37 درجه سانتی­گراد کشت داده شدند. سلول­های نرمال فیبروبلاست در محیط کشت­DMEM  حاوی 10 درصد سرم FBS کشت داده شدند. سلول­های سرطانی سینه و پروستات بعد از ده مرحله پاساژ منظم و سلول­های فیبروبلاست بعد از 5 مرحله پاساژ آماده تیمار با غلظت­های مختلف عصاره­، دارو و ترکیب غلظت کم­دارو و عصاره شدند.

تست تترازولیومMTT: رده­های سلولی در فلاسک 25 سانتی­متر مربع به صورت مجزا کشت داده شدند و بعد از چند پاساژ به فلاسک 75 سانتی­متر مربع انتقال داده شدند و در انکوباتور 5 درصد CO₂ و دمای 37 درجه سانتی گراد کشت داده شدند. بعد از شمارش سلولی به میزان 100 میکرو‫لیتر شامل تقریبا 7000 سلول از سوسپانسیون سلولی در پلیت‫های 96 خانه ریخته شدند و به‫مدت 24 ساعت در انکوباتور حاویCO₂  و دمای 37 درجه سانتی­گراد به‫منظور چسبیدن و رشد سلول­ها به کف پلیت قرار داده شدند. سپس محیط کشت رویی سلول­ها خارج شد و محیط حاوی غلظت­های عصاره، دارو و ترکیب ­دارو با عصاره و همچنین محیط کشت  فاقد سرم به‫عنوان کنترل به سلول­ها اضافه شدند. بعد از 24­ ساعت به‫هر یک از چاهک­ها به میزان 10میکرو‫لیتر  MTT(­MELFORD ساخت اتگلستان ) اضافه شد و  بعد از آن­که 4 ساعت در انکوباتور نگه­داری شدند به هریک از چاهک­ها 150 میکرولیتر­DMSO  اضافه شد و بعد از 30 دقیقه جذب سلول­ها توسط دستگاه الیزا ریدر در طیف جذب 490 و 630 خوانده شد و  بر حسب فرمول مربوطه میزان زنده­مانی محاسبه شد. 

100 ×میانگین جذب سلول های تحت اثر ماده توکسیک- 1= درصد مهار­کنندگی رشد

                                   میانگین جذب کنترل منفی

درصد مهار­کنندگی رشد -100=  درصد بقا یا زنده­مانی

بررسی مرگ  برنامه­ریزی شده سلول توسط دستگاه فلوسایتومتری:جهت سنجش میزان آپوپتوزیس در رده سلول­های سینه، پروستات و سلول­های فیبروبلاست عصاره هیدروالکلی با غلظت 25/1 میلی­گرم بر میلی­لیتر انتخاب شد و سلول­های تیمار شده و بدون تیمار (کنترل) از روش Annexin/PI با کیت تشخیصیKit I Pharmingen™, USA)  (BD و با کمک دستگاه فلوسایتومتری (­CYFlow شرکت  partec G mbH ساخت آلمان) انجام گرفت. آزمایش به این صورت انجام شد که سلول­های سرطانی و فیبروبلاست با عصاره هیدروالکی 25/1 میلی­گرم برمیلی لیتر در مدت 24 ساعت تیمار داده شدند و برای هر کدام از رده­های سلولی یک کنترل در نظر گرفته شد. سلول­ها با محلول نمکِ فسفات با خاصیت بافری (PBS) شستشو داده شدند. بعد از سانتریفیوژ سلول­ها، به رسوب حاصل بافر بایندینگ اضافه شد. سپس 5 میکرولیتر از رنگ annexin V اضافه می­شود و به‫مدت 15 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد و سلول­ها در مرحله بعدی با محلول بایندینگ شستشو داده شدند و در 10 ماکرولیتر رنگ PI به سلول­ها اضافه شد و در پایان کار آنالیز توسط دستگاه انجام شد. 

بررسی بیان ژن BCL2: فرایند استخراجRNA  کل از سلول­های سرطانی پستان­، پروستات و سلول‫های فیبروبلاست بدون تیمار و تحت تیمار عصاره هیدروالکلی 25/1 میلی­گرم بر میلی­لیتر بذر خارسنبل به‫مدت 24 و 48 ساعت و همچنین تحت تیمار ترکیب عصاره  25/1 میلی­گرم بر میلی­لیتر با دارو 5/62 نانوگرم بر میلی­لیتر انجام پذیرفت. ابتدا سلول­های تحت تیمار و کنترل از کف فلاسک­های 25 سانتی­متر مربع با کمک آنزیم تریپسین جدا شدند و برای مراحل استخراج آماده شدند. استخراجRNA  با RNA-X PLUS انجام شد.  بعد از استخراج کمیت و کیفیت RNA موجود با دستگاه اسپکتوفتومتری و ژل الکتروفورز مورد سنجش قرار گرفت.cDNA  با کمک کیت سنتز ­(­Takara ساخت ژاپن­) با دستگاه Biometra GmbH) PCR ساخت آلمان (ساخته شد و توالی پرایمر رفت و برگشت ژن­BCL₂  و ژن کنترل داخلی بتااکتین با استفاده از نرم­افزار  Primer3 طراحی شده و به‫منظور اطمینان بیشتر از درصد­GC ، دمای Tm و نداشتن دایمر با همدیگر، پرایمرها با برنامه ( Gene  Runner­­ نسخه 3.50 ( Hasting Software, Inc بررسی شدند (جدول1).

جدول 1: توالی و طول محصولات آغازگرهای مورد استفاده

پس از طراحی، پرایمرها برای سنتز به شرکت   FAZA Biotechسفارش داده شدند .محلولCYBR Green  مخصوص فرایند Real time-qPCR از شرکت یکتا تجهیز آزما تهیه شد و بیان ژن­های مورد نظر بعد از تیمار با کمک دستگاه rotor-Gene RG-3000 )ساخت استرالیا و شرکت CORBETT Research)  مورد سنجش قرار گرفت.

آنالیز آماری

با توجه با آنکه برای هر تیمار و کنترل در تستMTT  ، 3 تکرار وجود داشت. ابتدا داده­ها وارد اکسل شدند و سپس توسط نرم­افزار SPSS 20 ­در طرح کاملا تصادفی آنالیزها انجام گرفت و از آزمون  ANOVAیک‫طرفه برای مقایسه گروه­ها و آزمون دانکن برای آزمون تفاوت بین گروه­ها استفاده شد. تست­های مربوط به ژن BCL₂  و ژن داخلی بتا اکتین برای هر نمونه سه تکرار در دستگاه rotor-Gene RG-3000  گذاشته شد و نتایج حاصل از بیان ژن برای بررسی اختصاصیت محصول تکثیر شده، منحنی ذوب مورد بررسی قرار گرفت و داده­های خام به‫صورت Ct از دستگاه استخراج شد و با کمک فرمول ct  ΔΔ نمونه­های شاهد و تیمار به‫دست آورده و نسبت ژن هدف به ژن مرجع بتااکتین را از طریق ^{ct  ΔΔ -}2 محاسبه شد . نتایج حاصل از ^{ct  ΔΔ -}2 ­­برای سه تکرار به اکسل منتقل شد و با نرم­افزار SPSS در سطح 5 و یک درصد میزان معنی­دار شدن بیان ژن هدف مورد بررسی قرار گرفت.

نتایج

تست MTT

در این تحقیق تاثیر عصاره هیدروالکلی خارسنبل با 8 غلظت مختلف، 4 دوز دارو دوکسوروبیسین و ترکیب غلظت پایین عصاره با غلظت پایین دارو دوکسو روبیسین روی رده­های سلول­های سرطانی سینه، پروستات و سلول فیبروبلاست مورد بررسی قرار گرفت. نتابج با کمک روش MTT در سه تکرار به این شکل بود در هر سه رده سلولی تاثیر عصاره بر روی زنده­مانی سلول­ها در سطح 1درصد و 5 درصد معنی­دار بود. به‫طوری که عصاره هیدروالکلی بذر گیاه خارسنبل در غلظت­های 10­و 5/7 میلی­گرم بر میلی­لیتر به ترتیب بر روی رده­های سلولی پروستات و سینه و فبیروبلاست بیشترین تاثیر را داشت (شکل1)، غلظت 10 و 5/7 میلی­گرم بر میلی­لیتر در پروستات 64/85 و 29/82 درصد سمیت سلولی، در سرطان سینه 03/83 و 20/77 و در فیبروبلاست 68/74و 62/72 بازدارندگی رشد  ایجاد کرده بود.

شکل 1: (a) سلول کنترل یا بدون تیمار فیبروبلاست، (b) سلول تحت تیمار فیبروبلاست غلظت 25/1 میلی‫گرم بر میلی‫لیتر، (c) سلول کنترل یا بدون تیمار پستان‫، (d) سلول پستان تحت تیمار با غلظت  25/1 میلی‫گرم بر میلی‫لیتر، (e) سلول کنترل یا بدون تیمار پروستات، (f) سلول پروستات تحت تیمار با 25/1 میلی‫گرم بر میلی‫لیتر در 24 ساعت (بزرگ‫نمایی  x 100­ ­رده­های سلولی )

میزان سمیت سلولی در غلظت‫های بالا (10، 5/7، 5 ، 5/2 و 25/1) تفاوت معنی‫داری در سطح 1 درصد ­بر روی رده­های سلول‫های سرطانی و  فیبروبلاست نسبت به کنترل آن‫ها وجود داشت. غلظت 15/0میلی­گرم بر میلی­لیتر هیچ­گونه سمیت سلولی نداشت ولی غلظت 315/0 و 625/0 میلی­گرم بر میلی­لیتر بر روی پستان، فیبروبلاست و پروستات با آن‫که افزایش میزان سمیت سلولی مشاهده می­شد ولی تفاوت معنی­داری در سطح 5 درصد میزان سمیت سلولی تیمارها با کنترل دیده نشد (شکل 2).

شکل2: میزان سمیت سلولی غلظت­های مختلف(mg/ml)  عصاره هیدروالکلی بذر خارسنبل بر روی رده­های سلولی سرطان پروستات (رنگ سبز)، فیبروبلاست (رنگ آبی) و سینه  (قرمز) و تفاوت معنی‫دار در سطح 1درصد در اثر افزایش غلظت عصاره

 نتایج نشان می­دهد که با افزایش غلظت عصاره هیدروالکلی درصد زنده­مانی هر سه رده سلولی کاهش یافته است. نتایج تست MTT در 4 غلظت دارویی دوکسوروبیسین بر روی دو رده سلول­های سرطانی سینه و پروستات دارای اثرات سمیت سلولی بوده و بقای سلولی را کاهش می­دهد ، دوزهای500 و 250 نانوگرم بر میلی­لیتر دارو در سرطان سینه و دوز 500 نانوگرم بر میلی لیتر در سرطان پروستات اثرات سمیت قابل توجهی داشتند‫، به‫طوری‫که بیش از 50 درصد سلول­ها را کشته بودند ولی اثر ترکیبی غلظت 125و 5/62 نانوگرم بر میلی­لیتر دارو دوکسوروبیسین با دو غلظت 315/0­و

625/0 میلی­گرم بر میلی­لیتر  عصاره بذر گیاه در هر سه رده سلولی­ با کنترل آن‫ها هیچ‫گونه تفاوت معنی‫داری را نشان نداد (شکل 3).

شکل3:DOX   :تاثیر دوزهای مختلف داروی دوکسوروبیسین ،  BPE: تاثیرغلظت کم اثر عصاره خارسنبل بر روی سرطان پستان و پروستات. BPE+DOX: اثرترکیبی غلظت کم عصاره خارسنبل و دوز پایین دارو بر روی دو رده سلول­های سرطانی 

تست فلوسایتومتری

نتایج حاصل از دستگاه فلوسایتومتری در رده سلول‫های پستان، پروستات و فیبروبلاست تیمار شده با عصاره هیدروالکلی با غلظت 25/1 میلی­گرم بر میلی­لیتر و کنترل ­(بدون تیمار) بعد از 24 روز مورد سنجش قرار گرفتند. سلول­های کنترل پروستات، سینه و فیبروبلاست، به‫ترتیب میزان زنده‫مانی سلول­ها 46/84، 18/90­، 28/92 و مقدار آپوپتوزیس اولیه 24/7­، 57/4­، 97/3 و  درصد آپوپتوزیس تاخیری­ 14/5 ،32/4 ، 14/2 و درصد نکروزیس در سلول­های کنترل 15­/1 ­، 93/0­و 61/1 نشان داده شد­ (شکل4).

شکل4: نتایج حاصل از دستگاه فلوسایتومتری :Q₁= درصد میزان نکروز، Q₂= درصد آپوپتوزیس تاخیری، Q₃= درصد میزان سلول­های زنده، Q₄= درصد سلول­های که وارد آپوپتوزیس اولیه  شدند. سلول­های کنترل یا بدون تیمار (a) فیبرویلاست، (b) پستان و (c) پروستات، سلول­های تحت تیمار با غلظت 25/1 میلی گرم بر میلی‫لیتر در (d) فیبروبلاست، (e) پستان و(f)  پروستات

باتوجه به آنکه سلول­ها تحت تیمار قرار نگرفته بودند میزان آپوپتوزیس و نکروزیس دیده شده در رده­های سلولی قابل قبول بودند. درصد زنده­مانی سلول­های تحت تیمار با غلظت 25/1 میلی­گرم بر میلی­لیتر عصاره هیدروالکلی خارسنبل در رده­های سلولی پروستات، پستان، فیبروبلاست به‫ترتیب 10/71 ،23/74 ،02/82 و میزان آپوپتوزیس اولیه 37/24، 20/15 ، 27/13­، درصد آپوپتوزیس ثانویه به‫ترتیب 47/3 ، 28/7 و 48/3 و همچنین درصد نکروز در سلول­های تحت تیمار به‫ترتیب 06/1­­، 28/3 و 23/1 مشخص شد. نتایج نشان داد میزان درصد آپوپتوزیس اولیه، آپوپتوزیس تاخیری، مجموع کل آپوپتوزیس و نکروزیس دیده شده در  رده­های سلولی تیمار شده نسبت به رده­های سلولی بدون تیمار افزایش داشته است.

نتایج بیان ژن BCL₂  : استخراج  RNA کل از سه رده سلول­های SKM،  LNCaPو MCF-7 تحت تیمار در مدت 24 و 48 ساعت و ترکیبی عصاره هیدروالکلی 25/1 میلی­گرم بر میلی­لیتر با دارو در مدت 24 ساعت و همچنین استخراج از سلول­های بدون تیمار یا کنترل انجام گرفت. کیفیت RNAهای نمونه­ها روی ژل آگاروز 5/1 درصد بررسی شد. دو باند مربوط بهS  18و  S28به‫وضوح قابل تشخیص بودند که نشان دهنده کیفیت بالای RNA استخراجی بود (شکل 5).

شکل 5: RNA کل استخراج شده رده­های سلولی در مدت 24 ساعت، شماره 1: تحت تیمار پروستات ،2: تحت تیمار پستان  3: مربوط به‫ترکیبی دارو و عصاره، 4: کنترل پروستات ، 5: کنترل فیبروبلاست، 6: کنترل پستان 7: تحت تیمار فیبروبلاست و 8: نردبان ملکولی یا Ladder 1kbp روی ژل اگاروز 5/1 درصد

بررسی تغییر بیان ژن آپوپتوزیسیBCL₂  نسبت به ژن کننرل بتا اکتین در رده­های سلولی­MCF7  و LNCaP در غلطت 25/1 میلی­گرم بر میلی­لیتر عصاره و ترکیب این غلطت با غلظت کم­دارو  با روش qPCR-Realtime  در مدت 24 و 48 ساعت بدین‫شکل بود که در مدت 24 و 48 ساعت بیان ژنBCL₂  در تمامی رده­های سلولی کاهش یافته بود و این کاهش بیان در مدت ­24 و 48 ساعت نسبت به ژن کنترل در سطح 1 درصد معنی‫دار بود. بیشترین کاهش بیان به‫ترتیب در سلول­های سرطانی پروستات، سینه نشان داده شد (شکل 6).

شکل 6: مقایسه بیان ژن BCL2 نسبت به ژن کنترل داخلی بتااکتین در مدت زمان 24 و 48 ساعت در رده سلول­های سرطانی LNCap  و MCF-7

تفاوت معنی­داری در سطح 1 درصد بین دو تیمار غلظت 25/1 میلی­گرم بر میلی­لیتر عصاره و اثر ترکیبی آن با دارو مشاهده نشد و کاهش چشم­گیری در بیان

ژن BCL₂  بین این دو تیمار مشاهده نشد. به­منظور اطمینان از تک باند بودن پرایمرهای موجود، محصولات حاصل از Realtime-qPCR را روی ژل آگاروز 2 درصد بارگذاری شدند (شکل 7).

شکل 7: محصول Realtime-PCR –  سمت راست چاهک اول نردبان ملکولی 1kbp  ( Ladder) و بقیه مربوط به ژن Bcl2 با طول 119 bp  در رده سلولی روی ژل آگاروز 2درصد