نوع مقاله : علمی - پژوهشی
چکیده
هدف: با توجه به اینکه فولیکولهای مو و پر در جریان تکوین جنینی طی یک الگوی مشابه شکل میگیرند هدف تحقیق حاضر این بود که ساختار بافتشناسی، قابلیت رشد سلولهای درمی آنها در محیط کشت و قابلیت القایی این سلولهای کشت شده برای شروع برهمکنشهای درمی- اپیدرمی مورد مقایسه قرار گیرد.
مواد و روشها: فولیکولهای پر و مو بهترتیب از کبوتر و موش صحرایی تهیه شد. از یک طرف، برخی از فولیکولها برای کارهای بافتشناسی آماده شدند و از طرف دیگر فولیکولهای باقیمانده برای خارج کردن پاپیلای درمی از آنها مورد استفاده قرار گرفتند. پاپیلاهای خارج شده در محیط کشت رشد داده شدند. سلولهای کشت شده سپس به داخل نیمه-فولیکولهای موی بدون پاپپلا حاصل از موش بدون تیموس پیوند زده شدند. بعد از 28 روز فولیکولهای دریافت کننده پیوند مورد ارزیابی بافتشناسی قرار گرفتند.
نتایج: مطالعات بافتشناسی آشکار کرد که دو فولیکول (پر و مو) علیرغم داشتن تفاتهای مشخص بطور کلی دارای ساختار مشابهی هستند. سلولهای پاپیلای درمی فولیکول مو در محیط کشت نسبت به سلولهای پاپیلای پر از سرعت رشد بیشتری برخوردار بوده و تجمعات سلولی بزرگتر و متراکمتری را ایجاد نمودند. بر خلاف سلولهای پاپیلای مو، سلولهای پاپیلای پر نتوانستند در فولیکولهای تیمار شده سبب القا رشد مو گردند.
نتیجه گیری: علیرغم شباهت در الگوی رشد جنینی، ساختار بافتی و رشد در محیط کشت، بنظر میرسد که در حالت بلوغ پیامهای ارسالی از سلولهای کشت شده پاپیلای درمی فولیکول پر بوسیله سلولهای اپیدرمی فولیکول مو برای شروع برهمکنش درمی-اپیدرمی قابل شناسایی و پاسخگویی نیست.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Comparison of Structural, Cell Culture and Inductive Features of Feather and Hair Follicles Components
چکیده [English]
Aim: During embryonic development, both bird’s feather follicle and mammal’s hair follicle originate by a similar manner, the aim of this research was to access and compare histology, cell growth potential and inductive properties of papilla cells this organs for initiating dermal-epidermal interactions.
Material and Methods: Feather and hair follicles were provided from house pigeons and PVG rats, respectively. Some of the follicles were processed for histological examination whiles others were used to dissect out their dermal papilla. The dissected dermal papillae were cultured in vitro. The cultured cells were then implanted into papilla-depleted follicles. After 28 days the implanted follicles were histologically examined.
Results: Histological surveys revealed that despite some distinct differences, both follicles (feather and hair) share a similar histological structure. Hair’s dermal papilla cells showed a greater rate of growth as well as a higher and denser cell aggregation when compared to that of feather follicles. In contrast to hair papilla, the feather papilla cells were not able to grow a hair fiber in implanted follicles.
Conclusion: Despite similarities in embryonic development, histological structure and cell growth in vitro, it seems that the signals coming from cultured dermal cells of a mature bird are not able to be understood by hair follicle epidermal cells and can not initiate dermal-epidermal interactions
کلیدواژه‌ها [English]
- Cell culture
- Dermal papilla
- Dermis
- Histology
- induction
مقدمه
در جریان تکوین جنینی در مهرهداران، ضمائم پوستی (مو، پر، ناخن، چنگال، سم، فلس، شاخ، غدد عرق، غدد شیری و ..) در نتیجه برهمکنشهای دقیق و دوجانبهای که بین اپیدرم جنینی و اجتماع خاصی از سلولهای درمی اتفاق میافتد شکل میگیرند (1، 2 و 3). هر دوی این بافتها (اپیدرم و درم) برای مورفوژنز و ایجاد الگوی طبیعی ضمائم پوستی لازم و ضروری هستند. دلیل این ضرورت و وابستگی دوجانبه وجود مسیرهای پیامرسانی مولکولی است که بین اپیتلیوم و مزانشیم جنینی وجود داشته که در نتیجه آن نوع، شکل، اندازه و الگوی پوست و ضمائم آن تعیین میگردند (4). این مسیرهای پیامرسانی و برهمکنش دو جانبه صرفا به دوران جنینی محدود نمیگردند بلکه در سرتاسر طول زندگی یک مهرهدار اتفاق میافتد و به همین دلیل است که این ضمائم در طول زندگی این جانوران به طور مرتب یکسری تغییرات چرخهای را پشت سر میگذرانند (1و 5).
هنگام تشکیل ضمائم پوستی، اپیدرم جنینی پیشاپیش به لایههای سلولی قاعدهای، بینابینی و پریدرم سازمان یافته است. در این زمان درم زیرین حاوی سلولهای مزانشیمی است که بهطور سست در یک ماتریکس آبکی محتوی عروق خونی، عناصر عصبی و تعدای از مولکولهای ماتریکس خارج سلولی (Extracellular Matrix) یا ECM قرار دارند (6). تشکیل پلاکود اپیدرمی اولین نشانه مورفولوژیکی از شروع فرآیند مورفوژنز ضمائم پوستی است که با تکثیر موضعی سلولهای اپیدرمی همراه میگردد (7). پیشنهاد شده که چندین فاکتور پیام رسان (سیگنالینگ) در ایجاد این پلاکود نقش دارند، از جمله فاکتور رشد فیبروبلاست 2 (Fibroblast Growth Factor2) یا FGF2 (8) و انواعی از پروتئینهای مورفوژنز استخوان (Bone Morphogenesis Proteins) یا BMPها (9 و 10). متعاقبا پلاکود اپیدرمی فاکتورهایی نظیرSonic hedgehog یا Shh، Wnt-7a و Msx بیان میکند که سبب متراکم شدن سلولهای مزانشیمی زیرین میگردد (11). مزانشیم متراکم شده در پاسخ یک افزایشی در غلظت مولکولهای ECM نظیر فیبرونکتین، مولکولهای چسباننده سلولی (Cell Adhesion Molecules) یا CAM مثل مولکول چسباننده سلولی عصبی (Neural cell adhesion molecule) یا NCAM و تناسین، فاکتورهای رشد از قبیل فاکتور رشد تغییر دهنده β2 (Transforming Growth Factor β2) یا TGFβ2 و سایر مولکولها نمایان میکند که آنرا از مزانشیم مجاور متمایز مینماید (12). این فاکتورها از مزانشیم به اپیدرم ارسال شده تا آنرا وادار به بیان Msx-1 و Msx-2 نماید و این دو فاکتور هستند که رشد و مورفوژنز ضمائم پوستی را تنظیم میکنند. ژنهای Hox احتمالاا فنوتیپ این ضمائم را تعیین مینمایند (11).
پر و مو دو زائده پوستی هستند که در دو رده متفاوت مهرهداران خونگرم یعنی پرندگان و پستانداران یافت میشوند و هر یک نقشهای مهمی در بقا و سازگاری این موجودات در عالم حیات داشته و دارند (13 و 14). این دو زائده محصول فولیکولهایی هستند که همانطور که اشاره شد در طی تکوین جنینی به طریق تقریبا یکسانی شکل گرفته و در حالت بلوغ و رشد کامل نیز از ساختار و عملکرد نسبتا یکسانی برخوردارند. این شباهت چنان است که گاها میتوان بخشهایی از فولیکول پر را با فولیکول مو و یا بالعکس جابهجا کرد بدون اینکه در عملکرد فولیکول حاصله تغییری بوجود آید. برای مثال نشان داده شده است که بافت درمی تشکیل دهنده پر از جوجه این قابلیت را دارد که در اپیدرم در حال تکوین پستانداران تشکیل فولیکول مو را القا نماید و برعکس (15). یک بخش مهم از فولیکول پر و مو که در حفظ عملکرد آنها بسیار ضروری است پاپیلای درمی (dermal papilla) میباشد (16). پاپیلای درمی در فولیکول بالغ در حقیقت باقیماندهای از همان سلولهای متراکم مزانشیمی جنینی است که در انتهای قاعدهای آن قرار میگیرند. این توده سلولی علاوه بر اینکه پیشنیازی برای شروع تکوین فولیکول است در حفظ آن در حالت بلوغ نقش اساسی دارد (17و 18). القا روند تکثیر سلولی در سلولهای بنیادی اپیدرمی در شروع هر چرخه فولیکول در دوران بلوغ نیازمند مولکولهای پیامرسانی است که از پاپیلای درمی منشا میگیرند. بهعلاوه قابلیت القایی پاپیلا به گونهای است که حتی اگر با اپیدرمهای غیر همنوع مجاور گردد قابلیتهای القایی بسیار قوی از خود به نمایش میگذارد (19). بهعنوان نمونه نشان داده شده که اگر در حالت جنینی پاپیلای درمی فولیکول مو بهطور هتروتوپیک بهداخل یک فولیکول مو که قبلا از پاپیلای درمی تخلیه شده پیوند گردد این پاپیلا میتواند ایجاد پر را در فولیکول پیوند شده القا نماید (15). علاوه بر این ثابت شده که سلولهای کشت شده حاصل از پاپیلای درمی فولیکول مو نیز این قابلیت را دارند که اگر به داخل فولیکول عاری از پاپیلای درمی یا بافتی که معمولا مو تولید نمیکند پیوند شوند میتوانند تولید مو را در بافت پیوند شده تحریک نمایند (20 و 21). حال با توجه به قابلیت و استعداد القایی بسیار بالای پاپیلای درمی فولیکول مو که کاملا شناخته شده است این سوال مطرح میشود که آیا سلولهای کشت شده حاصل از فولیکول پر نیز مانند همتایان خود از فولیکول مو این قابلیت را دارند که در صورت پیوند شدن به فولیکول موی فاقد پاپیلای درمی سبب گردند که سلولهای بنیادی اپیدرمی موجود در فولیکول مذکور تحریک شده و با تکثیر و تمایز خود یک رشته موی جدید را بهوجود آورند. این همان سوالی است که این تحقیق قصد پاسخ به آن را دارد. در این مطالعه برای بررسی ساختار فولیکول مو از فولیکولهای ویبریسا (موهای روی لب پشتی برخی پستانداران) موش صحرایی و برای پر از فولیکول پر کبوتر بهعنوان مدل استفاده گردید.
مواد و روشها
بدست آوردن و خارج کردن فولیکولهای مو و پر از پوست: تعداد 5 موش صحرایی نژاد PVG ((inbred Piebald Virol Glaxoکه در شرایط آزمایشگاهی نگهداری میشدند و 5 کبوتر چاهی معمولی Columba livia که از بازار تهیه شد برای این کار انتخاب شدند. در تمام مراحل کار با حیوانات زنده موازین اخلاقی استاندارد و اجباری دانشگاههای انگلستان در مورد رفتار با آنها کاملا رعایت گردید. در مورد هر دو حیوان آنها با قرار دادن آنها در دسیکاتور محتوی کلروفرم ابتدا بیهوش و سپس با رها کردن آنها در این شرایط کشته شدند. در مورد موشها، پس از کشته شدن یک برش بر روی پوست لب پشتی آنها ایجاد شد. پوست بریده شده سپس با گیره مخصوص جراحی (clamp) گرفته و به عقب برگردانده شده به گونهای که سطح داخلی پوست در معرض دید قرار گرفت. سپس به شیوهای که قبلا توصیف شده (22، 23و 24) با کمک پنسهای ظریف فولیکولهای ویبریسا به آرامی و یک به یک از پوست در آورده شد. برخی از فولیکولهای خارج شده برای مطالعات بافتشناسی به محلول فرمالین نمکی 4 درصد (با دمای 4 درجه سانتیگراد) منتقل و برخی دیگر برای کشت سلولهای پاپیلای درمی در محیط حاوی MEM و آنتیبیوتیکها (گیبکو- انگلستان) قرار گرفتند.
کبوترها نیز پس کشته شدن با کمک دست شاهپرهای بالغ روی بالها کنده شد تا اینکه در لابلای این پرهای بالغ پرهای جوانی که به تازگی از پوست در آمده بودند مشخص شدند. سپس محل اطراف این پرهای جوان با پنبه آغشته با اتانول 70 درصد تمیز شده و سپس همچون موشها در پوست مجاور این فولیکولها با اسکالپل برشی ایجاد و لبه پوست بریده شده با گیره معکوس گردید. متعاقبا از سمت داخل و با کمک پنس فولیکول این پرهای جوان به آرامی از پوست بیرون کشیده شد. نظیر فولیکولهای مو، فولیکولهای پر خارج شده نیز برای مطالعات بافتشناسی و کشت سلول به یکی از دو ظرف که در بالا اشاره شد منتقل شدند. در کل در این تحقیق تعداد 12 فولیکول مو و 10 فولیکول پر برای مطالعات بافتشناسی و 20 فولیکول مو و 22 فولیکول پر برای کشت سلول مورد استفاده قرار گرفتند.
آماده سازی فولیکولهای تهیه شده برای اهداف مختلف: بهمنظور آماده سازی نمونهها برای مطالعات بافتشناسی، نمونهها پس از 24 ساعت تثبیت شدن در محلول 4 درصد فرمالین نمکی با گذراندن از میان یک سری اتانول با غلظت بالارونده (70 درصد و 95 درصد دو ساعت برای هر کدام و 100 درصد سه ساعت) ابتدا آبگیری شدند. فولیکولها متعاقبا با قرار گرفتن در تولوئن برای سه ساعت شفاف شده و سپس مرحله نفوذ دادن (برای 24 ساعت) و قالبگیری با پارافین در مورد آنها انجام شد. با کمک میکروتوم (Leitz 1512، آلمان) برشهایی به ضخامت 7 میکرومتر از فولیکولها تهیه و برشها با ترکیبی از آبی آلسین، هماتوکسلین وایگرت و پونسا کوتیس (مرک، آلمان) رنگ آمیزی گردیدند (22).
برای تهیه کشت سلول از سلولهای پاپیلای درمی ابتدا با کمک پنس و یک تیغه اسکالپل فولیکولها از ناحیه یک سوم تحتانی به دو قسمت بریده شدند. سپس بخش فوقانی دور انداخته شد و بخش یک سوم انتهایی (قاعدهای) که حاوی پاپیلای درمی است به ظروف حاوی MEM (گیبکو-انگلستان) تازه منتقل گردیدند. پاپیلای درمی فولیکول پر و مو سپس با روشی که قبلا شرح داده شده (24) از این بخش انتهایی جدا و به ظروف حاوی محیط کشت منتقل و برای رشد در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتیگراد و شرایط 95 درصد اکسیژن و 5 درصد دی اکسید کربن قرار گرفتند. در مورد پاپیلای درمی فولیکول پر لازم به ذکر است که چون این پاپیلا به طور بسیار محکم به بافت اپیدرمی اطراف چسبیده، برای جدا سازی آن از بافت مذکور برای 3 تا 5 دقیقه در محلول 1 میلیگرم بر میلیلیتر دیسپیس (گیبکو-انگلستان) قرار گرفتند. محیط کشت مورد استفاده برای رشد سلولهای پاپیلای درمی فولیکول پر و مو در هفته اول کشت عبارت بود از MEM، آنتیبیوتیکها بهاضافه 20 درصد سرم جنینی گاوی (FCS) (گیبکو-انگلستان). پس از تثبیت و شروع رشد سلولها غلظت سرم محیط کشت از 20 درصد به 10 درصد کاهش پیدا کرد.
پیوند سلولهای کشت شده پاپیلای درمی فولیکول پر و مو به فولیکولهای مو فاقد پاپیلا: از دو موش صحرایی بدون تیموس (athymic) نژاد HsdHan, NZNU-rnuN (Harlan، انگلستان) که در شرایط کاملا استریل نگهداری میشدند پس از کشته شدن، تعداد 16 فولیکول موی ویبریسا از لب پشتی به شیوه ذکر شده در بالا جدا گردید. فولیکولهای جدا شده به محیط MEM منتقل گردیدند و در آنجا با یک برش عرضی نیمه تحتانی فولیکولها درست از محل بالای ورود عصب به دیواره کپسول فولیکول قطع گردید. نیمه تحتانی که حاوی پاپیلای درمی بود دور انداخته شد ولی نیمه بالایی فولیکول برای ادامه کار حفظ گردید. حال از این نیمههای بالایی فولیکول رشته مو نیز خارج گردید. در نهایت آنچه که از این نیمهفولیکولها باقی ماند شامل کپسول کلاژنی و بافت اپیدرمی ناحیه بالژ (bulge) بود. حال برای پیوند سلولهای کشت شده به این نیمه- فولیکولها ظروف کشت حاوی سلولهای پاپیلای درمی پر و موکه در آستانه پاساژ سوم بودند از انکوباتور خارج و سپس محیط کشت روی سلولها خالی گردید. اکنون با کمک یک اسپاتول بسیار ظریف سلولها به آرامی از کف ظرف کشت تراشیده شده و در گوشهای از ظرف بهصورت یک پلت متراکم شدند. متعاقبا پلت تهیه شده از سلولهای پاپیلای درمی فولیکول پر یا مو با پنس برداشته شده و به فضای بر جای مانده از رشته مو در نیمه-فولیکولهای آماده شده در مرحله قبل وارد گردید بهطوری که سلولهای وارد شده از بیرون قابل روئیت نبودند. بعد از اطمینان از وارد شدن حجم مناسبی از سلولهای کشت شده به نیمه- فولیکولها آنها تا مرحله بعدی در محیط کشت و داخل انکوباتور نگهداری شدند. در این مرحله 8 نیمهفولیکول پُر شده با پاپیلای پر و 8 نیمه-فولیکول پُر شده با پاپیلای مو آماده گردید.
برای پیوند از دو موش صحرایی بدون تیموس دیگر بهعنوان پذیرنده استفاده شد. برای اینکار موشها به اتاق جراحی که به امکانات بیهوشی مجهز بود انتقال داده شدند. موشها با استنشاق فلوتن (شرکت دامپزشکی ملینک رود، انگلستان) بیهوش شدند و سپس به شکم روی میز جراحی خوابانده و سطح پشتی بدن آنها با اتانول کاملا تمیز گردید. سپس یک برش در پوست حیوان در ناحیه کمر و در کنار ستون فقرات درست بالای کلیه ایجاد شد. سپس به آرامی و با کمک وسایل جراحی ریز این برش عمیق تر شد تا اینکه کلیه حیوان نمایان شود. با استفاده از یک گیره مخصوص (towel clamp) کلیه از قاعده گرفته شده و به سطح پوست آورده تا در آنجا ادامه عملیات انجام گیرد. در این موقع یک برش سطحی در کپسول غشائی کلیه ایجاد و سپس لبه بریده این کپسول بلند شد و با کمک سر سوزن سرنگ یک حفره جیب مانند بین کپسول و بافت زیرین ایجاد شد. حال 4 نیمه-فولیکول تهیه شده در مرحله قبل از انکوباتور خارج و یک به یک در داخل این حفره کیسه مانند قرار گرفتند. پس از اینکار، کلیهها به محل طبیعی خود برگردند و سپس پوست ناحیه بریده و با کمک نخ جراحی (5/0 coated vicryle، اتیکون، انگلستان) بهدقت بخیه زده شد. اینکار برای کلیه دیگر حیوان نیز بهترتیب فوق انجام گردید. در نهایت 16 نیمهفولیکول پر شده با سلولهای پاپیلا (8 فولیکول جاوی پاپیلای پر و 8 فولیکول حاوی پاپیلای مو) در 4 کلیه دو موش بدون تیموس جاسازی شدند. بعد از اتمام عمل، حیوانات مذکور در معرض استنشاق اکسیژن خالص (با بستن شیرهوای حاوی فلوتن) قرار گرفتند تا اینکه بهطور کامل بههوش آمده و سپس برای 4 هفته در اتاق حیوانات نگهداری شدند. بعد از گذشت این زمان حیوانات کشته شده و پس از خارج نمودن کلیه آنها فولیکولهای موی پیوند شده از روی کلیهها جدا و برای مطالعات بافتشناسی به طریق اشاره شده در بالا آماده شدند.
نتایج
ساختار تشریحی و بافتی
در مورد فولیکول مو در سرتاسر مرحله رشد یا آناژن (anagen)، انتهای تحتانی فولیکول بخش پیازی شکل یا حباب مانند را به نمایش میگذارد (شکل A1). در قسمت مرکزی این حباب یک پاپیلای درمی قرار گرفته که به استثنای بخش ساقه قاعدهای توسط بخش اپیدرمی که معمولا به آن ماتریکس اپیدرمی گفته میشود احاطه میگردد (شکل B1). پاپیلای درمی بزرگ و مشخص بوده و در قسمت راسی بهداخل بخش مرکزی (مدولا) رشته موی در حال رشد امتداد مییابد. سلولهای پاپیلا در یک ماتریکس خارج سلولی فراوان که میل و قرابت شدیدی با آبی آلسین نشان میدهد قرار دارند. ماتریکس اپیدرمی چند لایه بوده و در ناحیه تحتانی از سلولهای کروی، کوچک و متراکم تشکیل میگردد (شکل C1) ولی در سطوح بالاتر این سلولها حجیم تر و دراز تر شده و بهنظر میرسد در حال پشت سر گذاشتن مراحل تمایز به کراتینوسیتهای رشته مو میباشند.
شکل 1: مورفولوژی و بافت شناسی فولیکول مو (ویبریسا) در مرحلۀ رشد یا آناژن. A) یک نمای کلی فولیکول که شکل حباب-مانند قاعده آنرا نشان میدهد (پیکان سیاه). عصب ورودی به فولیکول (پیکان آبی) نیز به وضوح دیده میشود. B) یک برش طولی فولیکول که پاپیلای درمی بزرگ (p) و ماتریکس اپیدرمی (پیکان آبی) پهن و عریض در آن نمایان است. اپیدرم فولیکول خود بوسیله یک غلاف درمی که در بخش بالای فولیکول (پیکان سیاه) ضخیم تر از نواحی تحتانی است احاطه شده است. C) یک برش نیمه-نازک از بخش قاعدهای و حباب-مانند فولیکول. پاپیلای درمی (p) به استثنای ساقه اتصالی از تمام جوانب بهوسیله یک ماتریکس اپیدرمی وسیع (m) محصور شده است. سلولهای ماتریکس اپیدرمی در نواحی تحتانی کوچکتر و متراکمتر از نواحی بالاتر هستند. در بیرون از ماتریکس اپیدرمی سلولهای غلاف درمی (ds) قرار دارند. رنگ آمیزی A و B آبی آلسین، هماتوکسیلین و پونسا و شکل C آبی آلسین. خط نشانه در A، B و C به ترتیب برابر با 200 250 و 30 میکرومتر.
فولیکول پر در حال رشد نیز واجد مشخصاتی است که بسیار مشابه آنچیزی است که فولیکول مو در مرحله مشابه نمایان میکند. این فولیکولها دارای یک ساختار کوزه مانند هستند که توسط غلافی از بافت همبند احاطه میشوند (شکل A2). از سطح فوقانی این فولیکول، غلاف پر (feather sheath) خارج شده که در داخل آن ریشکها قرار دارند. در نهایت همچون ناحیه راسی این غلاف شکافته شده و با نظم گرفتن و مرتب شدن ریشکهای پهنه پر (vane) شکل میگیرد. در نمای میکروسکوپی، یک توده بسیار بزرگ از سلولهای درمی در طول ناحیه میانی فولیکول مشاهده میشوند (شکل B2). این ساختار درمی از دو بخش تحتانی و فوقانی تشکیل میگردد هر چند که از نظر بافتی مرز کاملا مشخصی بین این دو قابل روئیت نیست. ناحیه تحتانی، پاپیلا نام دارد که از سلولهای شبه-فیبروبلاست تشکیل شده و در یک ماتریکس خارج سلولی فراوان قرار میگیرند. برخلاف پاپیلای درمی فولیکول مو، پاپیلای پر با آبی آلسین که با گلیکوزآمینوگلیکانها (GAGs) واکنش میدهد رنگ نگرفت و بلکه با ظاهر قرمز نمایان شد. همچون پاپیلای مو، پاپیلای فولیکول پر نیز بهجز در بخش ساقه اتصالی تحتانی بوسیله یک بخش اپیدرمی ضخیم و چند لایه احاطه میشود. سلولهای بخش اپیدرمی به شکل کاملا متراکم قرار داشته و هنگام رنگ شدن با هماتوکسیلین یک واکنش بازوفیلی قوی از خود نشان میدهند. این بخش اپیدرمی که یقه (collar) نام دارد ناحیهای است که با انجام تکثیر سلولی در آن، سلولهای مورد نیاز برای ساختن رشته پر فراهم میگردد (شکل C2). سه چهارم فوقانی توده درمی پولپ (pulp) نامیده شده و در واقع از سلولهای مرده و مواد خارج سلولی ترشح شده از سلولهای پاپیلا تشکیل میگردد. پولپ توسط یک بافت اپیدرمی که از ناحیه یقه نازکتر بوده و حاوی سلولهای پیگمان دار است احاطه میشود. در این ناحیه از بافت اپیدرمی است که سلولها تمایز پیدا کرده و مقدمه تشکیل ریشکهای پر ایجاد میگردد. بر خلاف مو، در فولیکول پر یک رگ خونی بزرگ از طریق ساقه اتصالی قاعدهای به پاپیلا وارد و در مرکز پاپیلا و پولپ به طرف ناحیه فوقانی فولیکول حرکت میکند (شکل C2).
شکل 2: مورفولوژی و بافتشناسی فولیکول پر کبوتر. A) نمای ظاهری یک فولیکول پر جوان و ضمائم آن. در قسمت پائین ساختار کوزه مانند فولیکول پر (F) و در قسمت میانی غلاف پر (پیکان) و در ناحیه راسی ریشکهای پر (سر پیکان) مشاهده میشود. B) یک نمای طولی از فولیکول پر در حال رشد. فولیکول دارای یک بخش درمی بزرگ میباشد که به دو ناحیه تقسیم میشود، بخش تحتانی پاپیلای درمی (d) و بخش بالایی پولپ (p) نامیده میشود. C) بزرگنمایی بالاتر بخش تحتانی فولیکول پر که مقطع رگ خونی بزرگ مرکزی را نمایان میکند (پیکان) در طول پاپیلای درمی (d) و پولپ (p) حرکت میکند. در اطراف پاپیلا ماتریکس اپیدرمی (c)که بهخوبی با هماتوکسیلین رنگ گرفته، نمایان است. رنگ آمیزی B و C آبی آلسین، هماتوکسیلین و پونسا. خط نشانه در A یک میلیمتر، B و C به ترتیب 50 و 30 میکرومتر.
کشت سلولی
کشت سلولهای درمی حاصل از فولیکول مو و پر نشان داد که سلولهای پاپیلای درمی مو طی حدود 4 تا 5 روز از بافت کشت شده یا اکسپلنت (explant) شروع به خارج شدن نمودند (شکل A3). در این موقع بافت پاپیلا فروریخته و در حال متلاشی شدن بود و سلولهای رشد کرده از این بافت تقریبا بهطور یکسان در تمام جوانب بافت حضور داشتند. این سلولها نسبتا متراکم بوده و یک مورفولوژی فیبروبلاست-مانند با ظاهر ستاره ای را آشکار میکردند. سلولهای نزدیک به بافت در مقایسه با سلولهای دور تر کوچکتر و متراکم تر بودند. سلولهای جدا افتاده یک اندازه بزرگتر و ظاهری پهن و کشیده را نمایان میکردند. سلولهای پاپیلای مو از سرعت تقسیم بسیار بالایی برخوردار بودند بهطوریکه ظرف مدت حدود 15 روز از شروع کشت سلولهای حاصل از 4 تا 5 بافت پاپیلای کشت شده تمام سطح ظرف را میپوشاندند. معمولا ظروف کشت در این مرحله پاساژ داده میشدند و سلولهای حاصله به چند ظرف تقسیم میشوند. ولی اگر ظروف کشت در این مرحله پاساژ نمیشدند و سلولها در ظروف برای مدت بیشتری باقی میماندند مشاهده میشود که سلولها از حالت تک-لایهای (monolayer) یکنواخت خارج شده و تجمعات سلولی چند لایهای در نقاط مختلف ظرف ایجاد مینمودند (شکل B3).
در مورد فولیکولهای پر باید اشاره کرد که تلاشهای اول برای کشت سلولهای پاپیلای درمی موفقیت آمیز نبود چراکه آنها معمولا به کف ظرف کشت نمیچسبیدند. در نتیجه برای کمک به اتصال آنها به بستر، بعد از گذاشتن پاپیلاها در ظرف کشت لاملهای استریل روی آنها قرار داده شد تا بدینوسیله بهطور محکم تر در تماس با کف ظرف قرار گیرند. لاملها تا مرحله پاساژ اول بر روی بافت باقی ماندند. بدین ترتیب، پنج تا شش روز بعد از کشت، رشد سلولی در اطراف بافتهای کشت شده مشاهده شد. سلولهای رشد کرده ظاهر سلولهای مزانشیمی داشته به گونه ای که دوکی شکل بوده و واجد زوائد دندریتیکی در اطراف خود بودند. سلولهای مستقر در نزدیک بافت کشت شده متراکم و کوچک ولی بهطرف نواحی پیرامونی سلولها پهنتر، بزرگتر و پراکنده تر میشدند (شکل C3). در مقایسه با سلولهای پاپیلای مو این سلولها بهطور خیلی آهسته تر رشد کرده بهطوریکه برای آنها 30 تا 46 روز وقت لازم بود تا اینکه به مرحله پاساژ دادن برسند. بعد از پاساژ نیز آنها یک رفتار غیرمعمول را نشان میدادند به این ترتیب که فقط حدود یک سوم از سلولهای پاساژ داده شده به بستر میچسبید و بقیه بهحالت شناور در سطح محیط کشت باقی میماندند. بهعلاوه بعد از سه یا چهار بار پاساژ دادن حدود 25 تا 30 درصد سلولها شروع به مردن میکردند در حالیکه بقیه بطور طبیعی به رشد آهسته خود ادامه میدادند. سلولهای پاپیلای پر در حالت کاملا متراکم یا کانفلوئنت همچون پاپیلای مو یک درجهای از رفتار روی هم سوار شدن و تشکیل تجمعات سلولی را به نمایش میگذاشتند، ولی در مقایسه با همتایانشان از فولیکول مو این تجمعات به مراتب کمتر و کوچکتر بود (شکل D3).
شکل 3: تصاویر میکروسکوپ فاز-کنتراست از رفتار سلولهای پاپیلای درمی فولیکول مو و پر در محیط کشت. A) سلولهای پاپیلای درمی مو 3 تا 5 روز بعد از شروع کشت از اطراف بافتهای کشت شده خارج شدند. سلولهای مرکزی نسبت به سلولهای پیرامونی کوچکتر و متراکمترند. B) سلولهای پاپیلای درمی مو در حالت متراکم تجمعات سلولی زیادی را بر روی کف ظرف کشت ایجاد نمودند. C) سلولهای پاپیلای درمی فولیکول پر 14 روز بعد شروع کشت. همانطور که مشاهده میشود بافت دچار فروپاشی شده و سلولها از آن به بیرون رشد نمودهاند سلولهای اطراف بافت کشت شده بسیار متراکمتر و کوچکتر از سلولهای پیرامونی هستند. D) سلولهای پاپیلای درمی پر در حالت کانفلوئنت تجمعات سلولی (پیکان) را به نمایش میگذارند. از نظر تعداد این تجمعات و تعداد سلولهای شرکت کننده در آنها به میزان آنچه در مورد پاپیلای مو دیده شد نیست. خط نشانه A و B برابر با 200 و C و D برابر با 100 میکرومتر.
قابلیت القایی سلولهای کشت شده پاپیلا در نیمه بدون پاپیلای فولیکول مو موش بدون تیموس
بعد از گذشت 24 روز از پیوند سلولهای کشت شده در نیمهفولیکولهای فاقد پاپیلا مشاهده شد که از 8 مورد نیمهفولیکولهایی که پاپیلای مو را دریافت کرده بودند در 6 مورد یک موی پیچ خورده از راس فولیکول خارج گردیده است (شکل A4)، در حالیکه در هیچ یک از نیمه-فولیکولهایی که سلولهای پاپیلای درمی پر را دریافت کرده بودند از بیرون هیچ نشانهای از رشد رشته مو دیده نشد. برای پی بردن به جزئیات ساختاری، این نیمه-فولیکولها برای مطالعات بافتشناسی آماده شدند. برشهای بافتی تهیه شده از آنها نشان داد که در نمونههایی که سلولهای پاپیلای مو دریافت کرده بودند یک ساختار حباب مانند (متشکل از ماتریکس اپیدرمی و پاپیلای درمی) در بخش قاعدهای تشکیل شده (شکل B4) و یک رشته مو از این ساختار درمی-اپیدرمی بوجود آمده است. مشاهدات میکروسکوپی نیمه-فولیکولهای پیوند شده با سلولهای پاپیلای پر نشان داد که آنها فاقد چنین ساختاری بوده و هیچیک از ماتریکس اپیدرمی و پاپیلای درمی در آنها تشکیل نشده بود. این درحالی بود که هنوز سلولهای پیوند شده در ناحیه مرکزی فولیکول تیمار شده حضور داشتند. همچنین با توجه به ساختار فولیکول حتی هیچ نشانهای از تشکیل ماتریکس اپیدرمی در اطراف سلولهای پیوند شده مشاهده نمیشد (شکل C4).
شکل 4: نیمه-فولیکولهای پر شده با سلولهای کشت شده پاپیلای درمی مو و پر. A) نمای خارجی نیمه-فولیکولی که سلولهای کشت شده پاپیلای مو را دریافت کرده بود. همانطور که ملاحظه میشود یک موی بلند و پیچ خورده از انتهای راسی فولیکول نمایان است. B) مقطع بافت شناسی نیمه-فولیکول شکل A. در ناحیه تحتانی یک ماتریکس اپیدرمی نازک (پیکان) در اطراف سلولهای پاپیلای درمی (p) شکل گرفته است. C) برش بافتی فولیکولی که سلولهای کشت شده پاپیلای پر را دریافت کرده بود. سلولهای پاپیلای کبوتر در مرکز ناحیۀ تحتانی فولیکول مشاهده میشوند (پیکان) ولی در اطراف آنها هیچ ماتریکس اپیدرمی تشکیل نشده است. رنگ آمیزی در B و C آبی آلسین، هماتوکسیلین و پونسا. خط نشانه در A، B و C به ترتیب 200، 100 و 75 میکرومتر.
بحث
مو علاوه بر کارکرد بیولوژیکی (محافظت، عایق بندی حرارتی، درک حس و غیره) با توجه به نقش اجتماعی و مذهبی که در جامعه انسانی دارد از جنبههای مختلف همچون ساختار میکروسکوپی، ویژگیهای اولترا میکروسکوپی، کشت سلول اجزا و بخشهای مختلف، سیگنالهای سلولی، مولکولهای پیام بر سلولی و ویژگیهای القایی بخشهای مختلف، مورد مطالعات گسترده قرار گرفته است (25، 26، 27 ، 28 و 29). لیکن پر بهدلیل نداشتن همین نقش اجتماعی علیرغم اینکه هر دوی آنها طی دوران جنینی از طریق یک الگوی مشابه تشکیل میشوند و در حالت بلوع نیز یک الگوی فعالیت چرخهای مشابهی را به نمایش میگذارند مورد مطالعه چندانی قرار نگرفته است. البته نباید فراموش کرد که مطالعات نسبتا زیادی روی ویژگیهای القایی بافت جنینی سازنده پر انجام گرفته ولی این تحقیقات با تحقیقات فوق العاده گستردهای که روی فولیکول مو انجام گرفته و میگیرد به هیچ وجه قابل قیاس نیست (30، 31، 32 و 33). در این مطالعه نشان داده شد که فولیکول پر در طی دوره رشد یک ساختاری را به نمایش میگذارد که قطع نظر از تفاوتهای محدود بهطور کلی شبیه ساختمان فولیکول مو میباشد. یکی از این تفاوتها که در این مطالعه مورد توجه و مشاهده قرار گرفت این بود که علاوه بر عروق خونی کوچک (شبه-مویرگ) که بهطور پراکنده هم در پاپیلای درمی پر و هم پاپیلای درمی مو دیده میشود، پاپیلای فولیکول پر واجد یک رگ بزرگ مرکزی است که در طول پاپیلا و پولپ حرکت میکند و این با گزارشات قبلی در تطابق است (2). با توجه به اینکه نقشی که پر در زندگی و فعالیتهای زیستی پرنده دارد بسیار حیاتی تر از نقشی است که مو در زندگی پستاندار دارد وجود این رگ بزرگ غذا رسان به فولیکول پر قابل درک است، چراکه پرنده در طول پرواز برای معلق ماندن در هوا و غلبه بر نیروی جاذبه زمین پرنده به فعالیت پرهای خود متکی است و این می طلبد که بدن به این اندام حیاتی توجه بیشتری کرده و تبادلات غذایی و گازهای تنفسی آنرا تسریع و تسهیل نماید. در این مطالعه مقدور نشد که ساختمان فولیکول پر پرندگان غیرپروازی همچون مرغ خانگی مورد مطالعه و مقایسه با پر کبوتر قرار گیرد ولی به احتمال بسیار قوی در پرندگان غیر-پروازی این رگ مرکزی یا وجود ندارد و یا از ابعاد کوچکتری برخوردار میباشد. همچنین در مطالعات قبلی (22) مشخص شده که نه تنها دیواره این رگ بلکه ماهیچه راست کننده آن از لحاظ بیان اکتین عضلۀ صاف (ASMA) بسیار غنی است. اکتین عضله صاف در فعالیتهای انقباضی نقش دارد و بیان بسیار زیاد این پروتئین در این رگ در فولیکول پر شاید نشان از نقش آن در حرکت ساقه پر باشد. وجود ناحیهای مشخص در بالای پاپیلای درمی (پولپ) پر که صرفا محتوی ماتریکس خارج سلولی است و عدم وجود آن در فولیکول مو تفاوت دیگری بود که در این دو فولیکول یافت شد. عقیده بر این است که این ناحیه در نتیجه مرگ سلولی برنامه ریزی شده (آپوپتوزیس) که در سلولهای پاپیلا رخ میدهد بهوجود میآید و در منشعب شدن یا رشته رشته شدن پر نقش دارد (11). در فولیکول مو اجتماعی از سلولهای اپیدرمی در ناحیه فوقانی فولیکول که به ناحیه بالژ (bulge region) شناخته میشود وجود دارند که در حقیقت سلولهای بنیادی اپیدرمی مو هستند (34). در فولیکول پر چنین اجتماعی از سلولها در این ناحیه فوقانی وجود ندارد بلکه عقیده بر این است که سلولهای بنیادی اپیدرمی مو در همان ناحیه یقه (collar) و اطراف پاپیلای درمی وجود دارند و نه در بالای فولیکول (2). مطالعات نشان داده اند که برخلاف منشا جنینی یکسان این دو زائده پوستی دارای منشا تکاملی متفاوتی هستند و شاید این یکی از دلایل تفاوتهای ساختاری مشاهده شده در این دو فولیکول باشد (30).
مطالعات کشت سلولی نشان داد که سلولهای پاپیلای درمی فولیکول مو همان رفتاری را نمایان میکنند که قبلا بهوسیله دیگران توصیف شده است (35)، به این ترتیب که آنها از تمایل و سرعت بسیار خوبی برای رشد در محیط کشت نشان میدادند بهطوریکه در مدت کوتاهی بعد از کشت قابلیت پاساژ مجدد را بهدست میآوردند. از طرف دیگر تحقیقات بسیار محدودی بر روی کشت سلولهای پاپیلای درمی فولیکول پر انجام گرفته است و بیشتر این تحقیقات نیز بر روی مرغ بعنوان حیوان مدل صورت گرفته است. بهعنوان نمونه Choung و همکاران (36) با کشت سلولهای پاپیلای پر به بررسی بیان مولکولهای چسباننده سلولی (CAM) در سلولهای کشت شده پرداختند. آنها در حین مطالعه مشاهده کردند که این سلولها در حالت متراکم تجمعات سلولی محدود را به نمایش میگذارند. در تحقیق حاضر نشان داده شد که در مقایسه با سلولهای پاپیلای درمی مو، همقطارانشان از فولیکول پر از سرعت رشد کمتری برخوردار بوده و در حالت تراکم تجمعات سلولی مشخصی را به نمایش میگذارند، هرچند که این تجمعات از نظر شدت و تراکم به اندازه پاپیلای مو نبود.
در باره تجمعات سلولی سلولهای مزودرمی پژوهشهای زیادی صورت گرفته و نشان داده شده که تشکیل آن یک مرحله حیاتی در مورفوژنز بسیاری از سیستمها و اندامهای زیستی است و در شکلگیری تمام ضمائم پوستی از جمله فولیکول مو و پر ارتباط تنگاتنگی دارد (5). در طی مرحله جنینی فولیکول پر و مو، تشکیل تجمع سلولی پیشاپیش تشکیل پاپیلای درمی اتفاق میافتد و سلولهای پاپیلا این ویژگی را نه تنها در طی دوره رویانی بلکه در تمام طول زندگی بعد از تولد نیز حقظ میکنند (37). چون فولیکول مو و پر بطور مداوم درگیر فرآیندهای چرخهای رشد و پسرفت (regression) هستند پیشنهاد شده که که این ویژگی گرد هم آمدگی سلولهای پاپیلا از تخریب و اضمحلال فولیکولهای مربوطه جلوگیری میکند (35). از طرف دیگر شواهد معتبری وجود دارد که آندسته از سلولهایی درمی که از قابلیت تجمع و گردآمدگی خوبی برخوردارند، در مقایسه با فیبروبلاستها که فاقد این ویژگی هستند، از قابلیت القایی بسیار خوبی برخوردار میباشند (38). البته نتیجهگیری قطعی در مورد ارتباط بین قابلیت تجمع سلولی و واکنشهای القایی نیاز به تحقیقات بیشتری دارد ولی گزارش شده که جمعیتهای سلولهای غلاف درمی (dermal sheath) حاشیه فولیکول مو بسته به میزان قابلیت گردآمدگی که در محیط کشت نشان میدهند از قابلیت القایی متفاوتی برخوردار هستند. به این ترتیب که سلولهای غلاف درمی پائین فولیکول نسبت به سلولهای غلاف درمی حاصل از بخش بالایی فولیکول در کشت از پتانسیل جمع شدگی بیشتری برخوردارند و آنها در صورت پیوند به فولیکولهای دیگر میتوانند در برهمکنش با بافت اپیدرمی یک رشته مو ایجاد کنند درصورتیکه سلولهای غلاف درمی بخش بالای فولیکول قابلیت شروع چنین برهمکنشهایی را ندارند (20). همچنین مدارکی وجود دارد که نشان میدهند سلولهایی که در محیط کشت استعداد بیشتری برای گردهمآمدگی نشان میدهند از نطر ECMs بسیار غنی هستند و آنها نیز میتواند یکی از عوامل درگیر در فرآیندهای القایی باشند.
در تحقیقات قبلی نشان داده شده است که سلولهای جنینی درمی و اپیدرمی ضمائم پوستی پرندگان و پستانداران این قابلیت را دارند که در صورت قرار گرفتن در کنار یکدیگر برهمکنشهای القایی را شروع کرده و فولیکول کامل پر یا مو را ایجاد نمایند (15). اما در این مطالعه نشان داده شد که سلولهای پاپیلای درمی فولیکول پر کبوتر برخلاف پاپیلای مو فاقد پتانسیل لازم برای برهمکنش با اپیدرم فولیکول موی موش صحرایی هستند. بخشی از این عدم موفقیت ممکن است ناشی از مقدار کمتر ECMs در بین سلولهای پاپیلای پر باشد که این موضوع در قابلیت گردهمآمدگی کمتر این سلولها نیز نمایان شد. همانطور که در بالا اشاره شد نشان داده شده که ECMs در شروع برهمکنشهایی القایی نقش دارند و در نتیجه یک احتمال برای عدم موفقیت ممکن است این باشد که مقدار ECMs موجود در بین سلولهای پاپیلای پر برای شروع گفتگو و واکنش با اپیدرم فولیکول مو کافی نبوده است. از طرفی، در تحقیقات قبلی از بافتهای جنینی استفاده میشده است و شاید در این مرحله جنینی پیامی که توسط سلولها ارسال میشود میتواند بهوسیله سلولهای دیگر شناسایی و فهمیده شود. در مطالعه اخیر از سلولهای حیوان بالغ استفاده و لذا یکی دیگر از دلایل این ناکارآمدی سلولهای پاپیلای درمی فولیکول پر در شروع واکنشهای القایی ممکن است این باشد که در مرحله بلوغ سلولهای اپیدرمی فولیکول مو قادر نبودهاند سیگنالهای ارسالی از سوی پاپیلای پر را شناسایی و درک نمایند. طبیعتا با عدم شناسایی پیام پاسخی نیز در آنها ایجاد نشده است. نکته آخر اینکه در مورد سلولهای پاپیلای درمی فولیکول مو گزارش شده که این سلولها در محیط کشت بعد از چند بار پاساژ دادن قابلیت القایی خود را از دست داده و دیگر نمیتوانند بافت اپیدرمی را برای تشکیل فولیکول مو القا کنند (39 و 40). از همین جهت برای بازگرداندن قدرت القایی آنها محیط کشتهای خاصی طراحی شده (با فعال کردن مسیرهای سیگنالینگ Wnt و BMP) تا مدت ماندگاری این قابلیت را در آنها افزایش دهند (41 و 42). در تحقیق حاضر از سلولهایی پاپیلای درمی که در آستانه پاساژ سوم بودند استفاده گردید. با توجه به نکته فوق شاید اگر در این تحقیق نیز از سلولهای جوانتری استفاده میشد نتیجه بهتری حاصل میگردید. با همه این موارد، ارائه یک جواب و دلیل قطعی برای این تفاوت در قابلیت القایی سلولهای پایپلای درمی پر و مو مستلزم این است که تحقیقات بیشتری در این زمینه انجام گیرد.
نتیجهگیری
علیرغم شباهت در الگوی رشد جنینی، ساختار بافتی و رشد در محیط کشت، بهنظر میرسد که در حالت بلوغ پیامهای ارسالی از سلولهای کشت شده پاپیلای درمی فولیکول پر بوسیله سلولهای اپیدرمی فولیکول مو برای شروع برهمکنش درمیاپیدرمی قابل شناسایی نبوده و به همین دلیل سلولهای پاپیلای پر نتوانستند تشکیل ماتریکس جدیدی را در فولیکولهای تیمار شده موش بدون تیموس القا نمایند.
تشکر و قدردانی
این تحقیق در گروه زیستشناسی دانشگاه دورهام، انگلستان، صورت گرفته که بدینوسیله از همکاری مدیریت این گروه و دانشگاه صمیمانه سپاسگزاری میگردد
)