نوع مقاله : علمی - پژوهشی
چکیده
هدف: هدف از این تحقیق، بررسی حضور ژن DBAT، یکی از ژن‌های کلیدی در مسیر بیوسنتزی تاکسول، در سرخدار (Taxus baccata) و قارچ اندوفیت مولد تاکسول آن و نیز بررسی میزان شباهت این توالیها با توالی‌های موجود در بانک ژن بود.
مواد و روشها: در این تحقیق، قارچهای اندوفیت از پوست درخت سرخدار جداسازی و به روش نوک هیف خالص‌سازی شدند. DNA ژنومی درخت سرخدار و یکی از قارچهای مولد تاکسول (ایزوله T9) استخراج گردید. حضور ژن DBAT بهوسیله واکنش زنجیره‌ای پلیمراز بررسی گردید. پس از توالی‌یابی، میزان شباهت توالی‌های بهدست آمده از سرخدار و ایزوله T9 با توالی‌های سایر گونه‌های سرخدار و قارچهای اندوفیت، موجود در پایگاه بانک ژن، مقایسه شدند.
نتایج: با استفاده از پرایمرهای اختصاصی، یک قطعه bp 125 از ژن DBAT سرخدار و ایزوله T9 تکثیر گردید. همردیفی توالی نوکلئوتیدی و آمینواسیدی قارچ و گیاه میزبان نشان داد که این توالیها دارای شباهت بسیار بالایی (بیش از 98درصد) بودند. نتایج همردیفی این توالیها با توالی‌های گونه‌های دیگر سرخدار و قارچهای اندوفیت، نیز شباهت بسیار بالایی (98 تا100 درصد) را نشان داد. همچنین، شباهت نسبتا بالایی در توالی نوکلئوتیدی و آمینواسیدی آنزیم DBAT و سایر آنزیمهای آسیل و آروئیل ترانسفراز درگیر در مسیر بیوسنتزی تاکسول مشاهده شد.
نتیجه‌گیری: براساس نتایج، حضور ژن DBAT در قارچ اندوفیت مولد تاکسول جداشده از سرخدار و همچنین شباهت بسیار بالا آن، در سطح نوکلئوتیدی و آمینواسیدی، با توالی بدست آمده از ژن DBAT میزبان (Taxus baccata) و توالی گونه‌های دیگر سرخدار و نیز قارچهای اندوفیت به اثبات رسید
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Comparison of DBAT Gene Sequence, in Nucleotide and Amino Acid Level, in Yew Species and Fungal Endophytes
چکیده [English]
Aim: The aim of this study was investigation of the presence DBAT gene, a key gene in the biosynthetic pathway of taxol, in yew (Taxus baccata) and its taxol producing endophytic fungus and also assessment the similarity of these sequences with sequences available in GenBank.
Material and Methods: In this study, endophytic fungi were isolated from the bark of Taxus baccata and purified, using hyphal tip method. Genomic DNA of yew tree and a taxol producing fungus (T9 isolate) was extracted. Using polymerase chain reaction, presence of DBAT gene was investigated. After sequencing, similarity of sequences obtained from yew and T9 isolate with other taxus species and endophyticn fungi sequences, available in GenBank, were compared.
Results: Using specific primers, a 125 bp fragment of DBAT gene from Taxus baccata and T9 isolate was amplified. Nucleotide and amino acid sequences alignment showed that theses sequences had a high similarity (over 98%) in fungus and host plant. Alignment results of these sequences with other species of yew trees and endophytic fungi sequences also showed very high similarity (98-100%). Besides, relatively high similarity between the nucleotides and amino acid sequences of DBAT and other acyl/aroyltransferases enzymes involved in taxol biosynthesis were observed.
Conclusion: Based on the results, the presence of DBAT gene in taxol producing endophytic fungus and also very high homology of its sequence, in nucleotide and amino acid levels, with host plant (Taxus baccata) and other yew species and fungal endophytes were proved.
کلیدواژه‌ها [English]
- Taxol
- fungi
- Taxus baccata
- DBAT gene
مقدمه
تاکسول، یک داروی ضدسرطان با سمیت کم و دامنه اثر گسترده برروی انواع مختلف سرطان‌ها است که اولین بار از سرخدار (Taxus brevifolia) جداسازی گردید (1). تمام گونه‌ها و زیرگونههای سرخدار آلکالوئیدهای با سمیت بالایی بهنام تاکسوئیدها را تولید می‌کنند (2). تاکنون بیش از 350 گونه از تاکسوئیدها شناخته شده است که تاکسول و باکاتین-III، پیش ساز تاکسول، از شناخته شدهترین تاکسوئیدها به شمار می‌آیند (2 و 3). تاکسول یک دیترپنوئید 4 حلقه‌ای با ساختاری پیچیده است. مسیر بیوسنتزی آن در سرخدار از 19 مرحله آنزیمی تشکیل شده که تاکنون 12 آنزیم و ژن کدکننده آن شناخته شده است (4 و 5).
در حال حاضر، مهم‌ترین منبع تاکسول روش نیمه سنتزی آن از پیش ماده‌های جداسازی شده از سرخدار است. مهم‌ترین پیشمادههای استفاده شده جهت تولید تاکسول به روش نیمه سنتز، 10-د استیل باکاتین-III و باکاتین-III هستند (6). باکاتین-III در مراحل انتهایی بیوسنتز تاکسول با اضافه شدن یک گروه استیل به کربن 10 حلقه تاکسان به وجود میآید (شکل 1). آنزیم 10-deacetylbaccatinIII-10-O-acetyltransferase، (DBAT) که این واکنش را کاتالیز میکند، یکی از آنزیمهای کلیدی در مسیر بیوسنتزی تاکسول است (5).
شکل 1: مسیر بیوسنتزی تاکسول در سرخدار
استخراج و خالص سازی تاکسول از سرخدار، بهدلیل عملکرد پائین، بسیار سخت و هزینه بر است (7 و 8). در نتیجه برای حفاظت جهانی از درخت سرخدار و کم کردن فشار تاکسول بر روی منبع طبیعی آن، استفاده از روشهای دیگری برای تولید صنعتی تاکسول ضروری بهنظر میرسد. اولین بار در سال 1993 استیرل و همکاران (9) به دنبال جستجوی منابع دیگری برای تامین نیاز روز افزون تاکسول توانستند یک سویه قارچ اندوفیت از سرخدار جداسازی کنند که قادر به تولید تاکسول در محیط کشت خود بود. این یافته منجر به آغاز تحقیقات بیشتر برای قارچهای اندوفیت مولد تاکسول در سراسر جهان گردید (10، 11 و 12). تاکنون بیش از 30 گونه قارچ اندوفیت مولد تاکسول شناسایی شده است (13).
مقدار تاکسول تولید شده به وسیله اندوفیتها در مقایسه با سرخدار نسبتا کم است. درنتیجه علاوه بر جستجو به دنبال ایزوله‌های با عملکرد بیشتر، دستکاری ژن‌های کلیدی مسیر بیوسنتزی تاکسول در سرخدار و قارچهای اندوفیت جداسازی شده از آن بهعنوان یکی از روشهای مناسب جهت افزایش میزان تولید تاکسول معرفی شده است (14 و 15). مسیر بیوسنتزی تاکسول در قارچ‌ها، برخلاف گیاهان، ناشناخته است. با شناسایی ژن‌های کلیدی در مسیر بیوسنتزی تاکسول در قارچهای اندوفیت می‌توان نقاط مبهم این مسیر را روشن ساخت (16) و از آن‌ها بهعنوان نشانگر مولکولی برای غربال قارچهای اندوفیت مولد تاکسول استفاده کرد (13). همچنین با شناسایی این ژن‌ها می‌توان آن‌ها را در میکروارگانیسمهای ساده‌تر و شناخته شدهتر مانند باکتری E. coli یا مخمر Saccharomyces cerevisiae کلون کرد که هم مطالعه مسیر بیوسنتزی تاکسول را آسان نموده و هم راه را برای کارهای بیوتکنولوژیک بیشتر بر روی این ژن‌ها جهت افزایش عملکرد این متابولیت باارزش هموارتر میکند (13 و 14).
در این پژوهش، یک ناحیه حفاظت شده از ژن DBAT سرخدار و قارچ اندوفیت مولد تاکسول (T9) جداسازی شده از آنبه وسیله واکنش زنجیره‌ای پلیمراز تکثیر شده و توالی یابی گردید. توالی بهدست آمده از سرخدار و قارچ اندوفیت با یکدیگر و با سایر توالی‌های موجود در GenBank در سطح نوکلئوتید و اسیدآمینه مقایسه گردیده است.
مواد و روشها
جمعآوری نمونه‌های گیاهی: نمونه برداری از درختان سرخدار جنگل‌های استان مازندران صورت گرفت. نمونه‌ها از نواحی سالم و فاقد نشانههای بیماری از پوست تنه اصلی و شاخههای جانبی درختان انتخاب و در پاکتهای کاغذی سربسته به آزمایشگاه منتقل گردید.
جداسازی اندوفیتها: پوست رویی نمونه‌ها با استفاده از تیغ اسکالپل حذف شده و پوست زیرین با استفاده از اتانول 70 درصد (به مدت 5/1 دقیقه) و هیپوکلریت سدیم 5/1 درصد (به مدت 10 دقیقه)، جهت از بین بردن قارچهای اپیفیت و ساپروفیت، استریل گردید (17). نمونه‌ها 3 مرتبه با آب مقطر استریل شستشو و به قطعات کوچک‌تر تقسیم شدند. قطعات فوق برروی محیط کشت PDA (Potato Dextrose Agar)، (Merck)، قرار داده شدند تا امکان رشد برای قارچهای اندوفیت فراهم گردد. قارچهای رشد کرده برروی محیط، با استفاده از روش نوک هیف به محیط PDA جدید منتقل و خالص سازی شدند (18). در این مدت هر کدام از قارچ‌ها از نظر خلوص چک شده و درصورت مشاهده ناخالصی به محیط جدید منتقل گردیدند.
استخراج DNA ژنومی: جهت استخراج DNA ژنومی ابتدا دو قطعه حدودا 1 × 1 سانتیمتر مربعی از کشت جامد قارچ جدا گردیده و در ارلن 100 میلیلیتری حاوی 50 میلیلیتر محیط کشت PDB (Potato dextrose broth)، (Scharlau) قرار داده شد. ارلن کشت شده به مدت یک هفته برروی شیکر انکوباتور با دمای 28 درجه سانتیگراد و دورrpm 120 نگهداری گردید. پس از گذشت این مدت، محیط مایع با استفاده از کاغذ صافی 4 لایه فیلتر شده و میسیلیوم قارچی بهدست آمده دو بار با آب مقطر استریل شستشو داده شد. 5/0 تا 1 گرم از میسیلیوم با استفاده از نیتروژن مایع کاملا پودر گردید. جهت استخراج DNA ژنومی سرخدار 5/0 تا 1 گرم از برگ تازه با استفاده از نیتروژن مایع پودر گردید. استخراج DNA ژنومی قارچ و گیاه به روش CTAB (19) تغییریافته انجام گرفت.
PCR و الکتروفورز: جهت بررسی حضور ژن DBAT در نمونه‌ها از پرایمرهای اختصاصی استفاده گردید (13). واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در دستگاه ترموسایکلر (Bio Rad) در حجم نهایی 25 میکرولیتر با 1 واحد آنزیم ExPrime (Genet Bio) انجام گرفت. مخلوط PCR به مدت 6 دقیقه در دمای 94 درجه سانتیگراد و سپس 35 سیکل در 94 درجه سانتیگراد به مدت 60 ثانیه، 48، 50 و 52 درجه سانتیگراد (شیب دمایی) به مدت 50 ثانیه و 72 درجه سانتیگراد به مدت 60 ثانیه و در نهایت 72 درجه به مدت 5 دقیقه انکوبه شد. آنالیز محصولات PCR در ژل آگارز 5/1 درصد و دستگاه الکتروفورز (Bio Rad) صورت گرفت. توالی یابی محصولات PCR توسط شرکت Bioneer (کره جنوبی) انجام گرفت.
مقایسه توالیها: توالی‌های بهدست آمده از ژن DBAT سرخدار و ایزوله T9 با استفاده از نرم افزار MegAlign از مجموعه DNASTAR V.7 مقایسه شد. توالی‌های مذکور با توالی‌های ثبت شده در GenBank نیز مقایسه گردید. برای این منظور توالی مربوط به DBAT سرخدار و ایزوله T9 با استفاده از BLASTN با توالی‌های ثبت شده همردیف گردیدند. از بین نتایج همردیفی، برخی از توالی‌های مربوط به گونه‌های مختلف سرخدار و قارچهای اندوفیت، انتخاب و ذخیره شدند. این توالیها با استفاده از نرم افزار MegAlign مورد همردیفی چندگانه قرار گرفتند. با داشتن توالی نوکلئوتیدی DBAT در سرخدار و ایزوله T9، توالی آمینواسیدی با استفاده از نرمافزار BLASTX مورد بررسی قرار گرفت. از بین نتایج همردیفی، توالی‌های پروتئینی برخی گونه‌های سرخدار و قارچ اندوفیت ثبت شده در GenBank انتخاب شده و برای بررسی‌های بیشتر بهوسیله نرم افزار MegAlign، ذخیره گردید. در نهایت همردیفی چندگانه بین توالی‌های آمینواسیدی با استفاده از نرم افزار MegAlign انجام شد.
نتایج
ایزوله T9، از قارچهای اندوفیت مولد تاکسول، جهت بررسی حضور ژن DBAT مورد استفاده قرار گرفت (20). DNA ژنومی استخراج شده از سرخدار و ایزوله T9 با استفاده از روشهای اسپکتروفتومتری و الکتروفورز در ژل آگارز 1 درصد مورد بررسی قرارگرفت (جدول 1).
جدول 1: نتایج اسپکتروفتومتری DNA ژنومی استخراج شده از برگ سرخدار و ایزوله T9 به روش CTAB تغییر یافته
|
نمونه |
280/260 |
230/260 |
(ng/µl)کمیت |
|
برگ سرخدار |
04/2 |
96/1 |
870 |
|
میسیلیوم ایزوله قارچ اندوفیت T9 |
84/1 |
67/1 |
2740 |
شکل 2:نتایج PCR بررسی حضور ژن DBAT در ژنوم درخت سرخدار (الف) و ایزوله اندوفیت مولد تاکسول T9 (ب). چاهک M، مارکر. چاهک 2،1 و 3 به ترتیب شیب دمایی 48، 50 و 52 درجه سانتیگراد برای دمای اتصال.
یک ناحیه از ژن DBAT سرخدار و ایزوله T9 با استفاده از پرایمرهای اختصاصی تکثیر شد. نتایج الکتروفورز حضور تک باند حدودا bp 150 را در نتایج PCR نمونه‌های DNA سرخدار و ایزوله T9 نشان داد (شکل 2). وضوح باندها و عدم وجود اسمیر و چندباندی نشان دهنده شرایط تکثیر مناسب بود.
پس از توالی یابی محصول PCR نمونه‌های سرخدار و ایزوله T9 و حذف چند نوکلئوتید ابتدایی و انتهایی، قطعه‌ای به طول 125 نوکلئوتید برای هردو نمونه بدست آمد. نتایج همردیفی توالی مربوط به سرخدار و ایزوله T9 نشان داد که نوکلئوتید 64 در دو توالی متفاوت است. با انجام همردیفی چندگانه مشخص شد که توالی مربوط به T. baccata، T. cuspidata،T. wallichiana و T. brevifolia با توالی ژن DBAT سرخدار دارای شباهت 100 درصدی و با توالی مربوط به ایزوله T9 شباهت 99 درصدی است. همچنین گونه‌های T. media، T. chinensis، T. Canadensis، T. sumatrana و T. globosa، 99 درصد با توالی سرخدار و 98 درصد با توالی ایزوله T9 شباهت داشتند. در پایگاه GenBank دو توالی ژن DBAT مربوط به قارچهای اندوفیت نیز یافت شد، توالی مربوط به قارچ Cladosporium cladosporioides که دارای شباهت 99 درصدی با توالی مربوط به سرخدار و 98 درصدی با ایزوله T9 و نیز توالی مربوط به Aspergillus candidus که دارای شباهت 98 درصد با هردو توالی مورد بررسی بود (55-10 < E Value) (شکل 3).
نتایج BLASTX نشان داد که توالی پروتئینی کدشده به وسیله توالی DNA بدست آمده از سرخدار و ایزوله T9 در اسیدآمینه موقعیت 22 با هم متفاوت هستند (18-10 < E Value). همچنین مشخص شد که توالی اسیدآمینه‌ای مربوط به سرخدار با توالی گونه‌های T. baccata، T. cuspidata،T. wallichiana، T. Canadensis، T. sumatrana وT brevifolia و نیز با توالی پروتئینی قارچ C. cladosporioides کاملا مشابه است. اما با توالی مربوط به گونه‌های T. globosa و T. media و نیز توالی قارچ A. candidus در یک اسید آمینه اختلاف دارد (شکل 4).
شکل 3: همردیفی چندگانه توالی نوکلئوتیدی ژن DBAT سرخدار و ایزوله مولد تاکسول T9 با توالی‌های ثبت شده در بانک ژن. شماره دستیابی توالی‌های همردیف شده به صورت زیر است: (JQ611238) Taxus baccata، (EU107143) Taxus brevifolia، (EU107134) Taxus canadensis، (AY544993) Taxus chinensis، (JQ611268) Taxus cuspidata، (EU107145) Taxus globosa، (EU107144) Taxus sumatrana، (EU107142) Taxus wallichiana، (AY452666) Taxus x media، (EU375527) Cladosporium cladosporioides، (EU883596.3) Aspergillus candidus
شکل 4:همردیفی چندگانه توالی اسیدآمینه‌ای ژن DBAT سرخدار و ایزوله مولد تاکسول T9 با توالی‌های ثبت شده در بانک ژن. شماره دستیابی توالی‌های همردیف شده به صورت زیر است: (AAL57617) Taxus baccata، (ABW84244) Taxus brevifolia، (ABW84235) Taxus canadensis، (AFJ04857) Taxus cuspidata، (ABW84246) Taxus globosa، (ABW84245) Taxus sumatrana، (ABW84243) Taxus wallichiana، (ABK41194) Taxus x media، (ACA48517) Cladosporium cladosporioides، (ACI47063) Aspergillus candidus
بحث
با توجه به نتایج الکتروفورز و اسپکتروفتومتری، مشخص شد که استخراج DNA ژنومی از برگ‌های سرخدار و میسیلیوم ایزوله قارچی از کمیت و کیفیت بالایی برخوردار بود. کمتر بودن میزان DNA استخراج شده از برگ‌های سرخدار را می‌توان به وجود متابولیتهای ثانویه و مواد موسیلاژی زیاد در بافت برگ و ایجاد اختلال در فرایند استخراج DNA مرتبط دانست (2 و3). نتایج الکتروفورز نشان داد که 50 درجه سانتیگراد بهترین دما جهت اتصال پرایمرها بود. زانگ و همکاران (13) نیز در پژوهش خود 50 درجه سانتیگـراد را بهعنـوان دمـای اتصـال پرایمرها معرفی
کردند.
ژن DBAT، کد کننده یکی از آنزیمهای مهم و کلیدی در مسیر بیوسنتزی تاکسول است که تشکیل باکاتین-III، آخرین واسطه دیترپن در مسیر بیوسنتزی سرخدار، را کاتالیز میکند (5). توالی ژنومی کامل این ژن تاکنون تنها برای یک گونه از جنس سرخدار (T. media) شناسایی و توالی یابی شده است. پرایمرهای طراحی شده بر اساس این ژن یک ناحیه حفاظت شده از نواحی ابتدایی آنرا تکثیر میکند. بنابراین از این پرایمرها در این تحقیق نیز استفاده شد. PCR انجام شده به وسیله این پرایمرها یک قطعه حدودا bp 150 را تکثیر کردند که پس از توالی یابی و حذف چند نوکلئوتید ابتدایی و انتهایی (به دلیل وجود خطا در ابتدا و انتهای قطعه در فرایند توالی یابی) یک قطعه به طول 125 نوکلئوتید از هرکدام از نمونه‌های مورد بررسی بدست آمد. زانگ و همکاران (13) با استفاده از این پرایمرها یک قطعه از ژن DBAT را (بدون مشخص کردن توالی) در قارچهای اندوفیت تکثیر کردند. والکر و کروتائو (21) اولین بار توالی mRNA ژن DBAT را از T. cuspidata جداسازی و توالی آن را مشخص کردند.
نتایج بررسی‌های همردیفی مشخص کرد که این قطعه نوکلئوتیدهای 316 تا 440 ژن DBAT را شامل می‌شود و نیز مشخص شد که آخرین نوکلئوتید از این قطعه، اولین نوکلئوتید تنها اینترون ژن DBAT است (440 تا 663). شباهت بین توالی بهدست آمده از سرخدار با توالی بهدست آمده از ایزوله مولد تاکسول T9 بسیار بالا (99 درصد) بود. زانگ و همکاران (16) شباهت بالای توالی ژن DBAT بهدست آمده از قارچ اندوفیت مولد تاکسول (A. candidus) را با میزبان آن گزارش کردند. با انجام همردیفی چندگانه مشخص گردید که شباهت توالی بهدست آمده از سرخدار با توالی گونه‌های دیگر نیز بسیار بالا است (99 تا 100 درصد). شباهت توالی سرخدار و ایزوله T9 با دو قارچ اندوفیت بررسی شده نیز بسیار بالا بود.
بررسی‌های بیشتر به وسیله BLASTX انجام گرفت که این امکان را فراهم میکند که با استفاده از توالی نوکلئوتیدی، توالی‌های اسیدآمینه‌ای مشابه جستجو گردد. با این کار تاثیر یا عدم تاثیر اختلافات موجود در توالی نوکلئوتیدی بر توالی پروتئینی مشخص می‌گردد. نتایج نشان داد که این قطعه 41 اسیدآمینه در چهارچوب خوانش 1+، از 106 تا 146، کد میکند. شباهت بین توالی آمینواسیدی سرخدار با ایزوله T9 بسیار بالا بوده و تنها اختلاف آن‌ها در آمینواسید موقعیت 22 مشاهده شد، که در اثر جایگزینی یک نوکلئوتید A به جای C در موقعیت 64 توالی نوکلئوتیدی و تغییر کدون از CTT (L) به ATT (I) به وجود آمده بود. البته تبدیل شدن آمینواسید لوسین به ایزولوسین بهدلیل شباهت ساختاری و خصوصیات بیوشیمیایی این دو اسیدآمینه، احتمالا نمیتواند تغییر عمده‌ای در ساختار و عمل پروتئین حاصله بوجود آورد. همچنین مشخص شد که اختلافات موجود در توالی نوکلئوتیدی گونه‌های T. Canadensis، T. sumatrana و C. cladosporioides بر توالی آمینواسیدی آن‌ها تاثیری نداشته است که دلیل این امر، کد شدن یک اسیدآمینه به وسیله چند کد ژنتیکی متفاوت است.
بررسی‌ها نشان داد که ژن DBAT شباهت بالایی (65 تا 80 درصد) هم در سطح نوکلئوتیدی و هم در سطح آمینواسیدی با توالی ژن‌های مربوط به سایر آسیل و آروئیل ترانسفرازهای درگیر در مسیر بیوسنتزی تاکسول دارد. والکر و کروتائو (21) و والکر و همکاران (22) وجود شباهت درسطح نوکلئوتیدی و آمینواسیدی ژن‌های کدکننده آنزیمهای اسیل و آروئیل ترانسفراز درگیر در مسیر بیوسنتزی تاکسول را گزارش کردند. از این شباهت بالا می‌توان در طراحی پرایمر و پروب جهت غربال کتابخانه cDNA در شناسایی آسیل و آروئیل ترانسفرازها استفاده کردند.
نتیجه گیری
نتایج این پژوهش حضور ژن DBAT در قارچ اندوفیت تولید کننده تاکسول (T9) و Taxus baccata را به اثبات رسانده و مشخص کرد که شباهت بسیار بالایی، هم درسطح نوکلئوتیدی و هم در سطح آمینواسیدی، بین توالی بدست آمده از سرخدار و ایزوله T9 وجود دارد. بررسی‌های بیشتر نشان داد که این توالیها و توالی‌های مربوط به ژن DBAT گونه‌های مختلف سرخدار و قارچهای اندوفیت تولید کننده تاکسول که در بانک ژن ثبت گردیده‌اند دارای شباهت بسیار زیادی هستند. همچنین شباهت بالایی بین ژن DBAT و سایر آسیل و آروئیل ترانسفرازهای درگیر در مسیر بیوسنتزی تاکسول دیده شد.
تشکر و قدردانی
نویسندگان این مقاله از همکاری متخصصین اداره کل منابع طبیعی شهرستان نوشهر بویژه آقای مهندس خدابخش و نیز از خانم مهندس یوسفی پور که در نمونه برداری از گیاهان سرخدار با این گروه همکاری کردند صمیمانه سپاسگزاری مینمایند.شایان ذکر است که این مقاله قسمتی از پایان نامه کارشناسی ارشد بوده و بودجه پژوهشی آن از طرف دانشگاه بوعلی سینا تامین شده است.
)