نویسندگان
1 دانشجوی کارشناسی ارشد، پژوهشکده زیست فناوری، سازمان پژوهش های علمی وصنعتی ایران، تهران
2 پژوهشکده زیست فناوری، سازمان پژوهش های علمی وصنعتی ایران، تهران
چکیده
هدف: هدف این مطالعه بررسی اتصال و رشد سلولهای غضروفی گاو بر روی داربست نانوالیاف فیبروئین ابریشم و کیتوزان طراحی و ساخته شده توسط مولفین جهت استفاده در مهندسی بافت غضروف مفصلی بود.
مواد و روشها: سلولهای کندروسیت جداشده از غضروف 3 گوساله به داربست مذکور منتقل شده و برای 30 روز کشت داده شدند. چسبنگی و میزان رشد سلولها با تصویر برداری میکروسکوپ الکترونی و روشهای رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین و DAPI ارزیابی و غضروف زایی با رنگآمیزی تری کروم ماسون جهت ارزیابی تولید کلاژن و رنگآمیزی سافرانین اُ جهت ارزیابی تولید پروتئوگلیگانها و تعیین مقدار گلیکوزآمینوگلیکان سولفاته توسط دی متیل متیلن بلو بررسی شد.
نتایج: نتایج نشان دادند که سلولهای کندروسیت بهخوبی بر روی داربست متصل شده و تکثیر یافته بودند. تعداد سلولهای کشت داده شده پس از یک ماه 4 تا 5 برابر شده بودند. همچنین برسی تولید کلاژن، پروتئوگلیکان وگلیکوزآمینوگلیکان نشان داد که بافت غضروفی بهخوبی برروی داربست تشکیل شده بود.
نتیجهگیری: داربست نانوالیاف کیتوزان/ فیبروئین ابریشم میتواند بهعنوان کاندید مناسبی برای داربستهای مهندسی بافت باشد، هم بهلحاظ ایجاد دمینهایی برای اتصال سلولی بهخاطر ماهیت پروتئینی (فیبروئین ابریشم) و پلی ساکاریدی (کیتوزان) آن و هم به لحاظ قطر نانوالیاف که نزدیک به قطر پروتئینهای ماتریکس خارج سلولی بافت است.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
A study on growth of bovine chondrocytes on silk fibroin/ chitosan electrospun nanofibers scaffold
نویسندگان [English]
- A Jafarzadeh 1
- K Hoseinipajooh 2
- M Kiani rad 2
1 M.S. student, Department of Biotechnology, Iranian Research Organization for Science and Technology (IROST),
2 Department of Biotechnology, Iranian Research Organization for Science and Technology (IROST), Tehran, Iran
چکیده [English]
Aim: The aim of this study was to investigate the bovine chondrocytes growth on new polymeric nanofibers silk fibroin/kitosan scaffolds, designed by authors, to form the cartilage tissue.
Material and Methods: The chondrocyte cells isolated from three calf articular cartilage were loaded on the scaffold. After a monthof incubation, cells morphology was studied by SEM and the rate of cell growth by H&E and DAPI staining. To assay chondrogenesis in the culture, production of collagene was assayed by masson’s trichrom staining and formation of Glycosaminoglycans (GAGs) and Proteoglycan was assayed by DMMB and “safranin O” staining.
Results: The results showed that the cells attached and proliferated to scaffolds very well. The number of cultured cells after one month proliferated by 4 to 5 times. Masson’s trichrom, safranin O staining and GAG assay showed cartilage tissue production in the scaffolds.
Conclusion: According to the results, the scaffold of nanofibers Fibroin silk / chitosan could be a good scaffold candidate for cartilage tissue engineering. This is due to the nature of the proteins in silk fibroin and polysaccharides in chitosan for cellular attachment and also the diameter close to the diameter of extracellular matrix proteins in these scaffolds.
کلیدواژهها [English]
- Tissue engineering
- Nanofibers
- Electrospinning
- Chitosan
- Fibroin silk
مقدمه
از سال 2000 میلادی استفاده از پلیمرهای زیست تخریب پذیر طبیعی و مصنوعی، برای ساخت نانوالیاف بهمنظور کاربردهای زیست پزشکی وارد عرصه ظهور شد. این پلیمرها برای برنامههای کاربردی بهویژه استفاده در مهندسی بافت و دارو رسانی در حال تست هستند (1). الکتروریسی یک روش ساده و کارآمد است که توسط آن میتوان داربستهای متشکل از الیاف در مقیاس نانو تا میکرومتر تولید کرد که قابل مقایسه با قطر الیاف اجزای ضروری ماتریکس خارج سلولی سلولی یا ECM (Extracellular Matrix) است (2). در این فرآیند از یک ولتاژ بالا برای تشکیل نانو الیاف از پلیمر محلول در حلال آلی فرار استفاده میشود.
از جمله پلیمرهای مورد استفاده در ساخت داربستهای بافتی، پلیمر کیتوزان است. کیتوزان یک پلیمر کاتیونی زیست تخریبپذیر است که یک سطح آبدوست را برای توسعه چسبندگی سلولی، تکثیر و تمایز آنها فراهم میکند. گلیکوزآمینوگلیکانهای سولفاته که از جمله مولکولهای فراوان در ماتریکس خارج سلولی هستند براحتی به این پلیمر که دارای بار مثبت است متصل میشوند (3, 4). الیاف کیتوزان و کیتین بهعنوان یک پانسمان زیستسازگار و یا مواد پوشش دهنده برای تسریع ترمیم زخم انسان و حیوانات آزمایش شده است (5). این پلیمر از فعالیت ضدباکتریایی و زیستسازگاری خوب در برابر پاسخ میزبان برخوردار است. بنابراین ایمپلنتهای حاصل از آن با حداقل واکنشهای ایمنی روبروست (3). کیتوزان ساختاری شبیه به گلیکوز آمینوگلیکانها (پلیساکاریدهای موجود در ECM) دارد و دارای دمینهای زیادی برای اتصال سلولها (6) و فاکتورهای رشد میباشد. این پلیمر در بدن توسط آنزیم لیزوزیم براحتی تجزیه میشود. مشکل عمده کیتوزان خواص مکانیکی ضعیف آن است که مشکل عمده پلیمرهای طبیعی است که برای غلبه بر آن بهتر است با پلیمر دیگری با خواص مکانیکی بهتر، همراه باشد (7).
پلیمر دیگر مورد استفاده ساخت داربستها، پلیمر فیبروئین ابریشم (Silk fibroin) است. ابریشم مادهای زیستسازگار است و سالهاست که بهعنوان نخ بخیه استفاده میشود (8). فیبروئین ابریشم یک پروتئین فیبری است که رشتههای ابریشم را تشکیل میدهد و حدود 70 تا 75 درصد وزن ابریشم را تشکیل میدهد و توسط سریسین که پروتئین چسب مانندی است کنار هم نگه داشته میشوند. فیبروئین خواص فیزیکی و شیمیایی منحصر به فردی را داراست. سریسین خواص مکانیکی ضعیفتری نسبت به فیبروئین داشته و نسبت به تغییرات pH و دما حساس میباشد (9). ابریشم پس از صمغگیری (جداسازی سریسین) تنها حاوی فیروئین است که از اسیدهای آمینه گلایسین، آلانین و سرین تشکیل شده که در تشکیل ساختار منظم و کریستالی فیبروئین شرکت دارند (10).
بهمنظور ترمیم بافت غضروف مفصلی بررسیهایی جهت ساخت یک داربست مناسب از نانوفیبر فیبروئین ابریشم و کیتوزان بهروش الکتروریسی توسط مولفین انجام شد. با توجه به ویژگیهای مطلوب به دست آمده از داربست نانوفیبر فیبروئین ابریشم و کیتوزان ساخته شده با نسبت 50 -50 و 70 – 30، این تحقیق جهت بررسی کشت برون تنی سلولهای کندروسیت گوساله بر روی این داربستها و ارزیابی زیست سازگاری، توانایی تکثیر و چسبندگی سلولها و در نهایت کارایی این داربستها جهت استفاده در ترمیم بافت غضروف مفصلی انجام شد.
مواد و روشها
داربست مورد استفاده: در این مطالعه از داربست نانوفایبر سه بعدی متخلخل فیبرویین ابریشم/کیتوزان با نسبت 50-50 70-30 تهیه شده بهروش الکتروریسی که در پژوهشکده بیوتکنولوژی سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران طراحی و ساخته شد استفاده شد. این داربست دارای ساختار متخلخل یکنواخت، تخلخلی حدود 85 درصد و قطر فیبرهای آن نیز دارای گسترهای از50 تا 170 نانومتر میباشد (بهترتیب با میانگین قطر 51/24±138.5 و 32/52±8/148 نانومتر). خواص مکانیکی داربستهای مورد استفاده بهترتیب به شرح زیر است: مقاوت کششی (Breaking tenacity ) 03/0±14/1 و 2/0±2/2 مگاپاسکال، ازدیاد طول تا پارگی (Elongation at break) 04/0±8/2 درصد و 03/0±94/4 و مدول الاستیسیته یا مدول یانگ (Young´s Module) 02/0±80/0 و 08/0±51/0 مگاپاسکال. میزان تخریب پذیری این داربست ها نیز 2/0 12/6 درصد از کل وزن داربست پس از 12 هفته بود .
جداسازی سلولهای کندروسیت: نمونههای غضروف مفصلی با اندازه تقریبی 1 سانتیمتر مکعب از 3 گوسالهی تازه ذبح شده در کشتارگاه تهیه شد. بدینمنظور نمونههای جدا شده در داخل محیط کشت DMEM L-Glucose ( 1% Pen/Step,Gibco ) تا آزمایشگاه حمل شد. نمونهها پس از شستشوی در PBS، در شرایط استریل به قطعات حدود 1mm3 تقسیم شدند. قطعات مربوط بههر نمونه در فالکونهای جدا ریخته شد. بههر نمونه محیط DMEM حاوی w/v، 25/0 درصد آنزیم تریپسین (Gibco) افزوده و بهمدت 30 دقیقه در شیکرانکوباتور با دمای 37 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. پس از 30 دقیقه تریپسین با محیط حاوی سرم خنثی و سانتریفیوژ شد (11, 12). پس از دور ریختن مایع رویی، به نمونهها محیط DMEM حاوی آنزیم کلاژنازI (Gibco-17100017) با غلظت 1 میلیگرم بر میلیلیتر اضافه شد و مجددا در شیکر انکوباتور برای 16 ساعت انکوبه شدند (13, 14). پس از گذشت این زمان مجددا سلولها سانتریفیوژ شده و مایع رویی دور ریخته شد. بههر فالکون 5ml DMEM حاوی FBS، 10 درصد و U/mL100 پنیسیلین و 100 میکروگرو بر میلیلیتر استرپتومایسین (محیط کامل) اضافه شده و در فلاسکهای 25 سانتیمتر مکعب در انکوباتور و در شرایط CO2، 5 درصد و دمای 37 درجه سانتیگراد کشت داده شد. هر 2 تا 3 روز محیط آن تعویض شد که پس از حدود 7 روز فلاسکها پر شدند.
کشت سلولهای کندروسیت بر روی داربست نانوالیاف: در ابتدا نانوالیاف ساخته شده در یک محلول با ترکیب اتانول/ آمونیاک با غلظت 7 و 70 درصد تحت تیمار شیمیایی قرار گرفتند (6, 15). این عمل باعث تغییرات شیمیایی در نانوالیاف و نامحلول شدن نانوالیاف میشود (6). این داربستها سپس توسط پانچ بهصورت دایرههایی با قطر 5/0 سانتیمتر پانچ شدند. پیش از کشت سلول داربستهای پانچ شده با اتانول 70 درصد بهمدت 30 دقیقه استریل شدند.
داربستهای پانچ شده در دو گروه 50:50 و 70:30 و برای هر تکرار چهار داربست در پلیتهای 48 خانه قرار گرفتند. سلولهای کندروسیت پس از پر شدن فلاسکها، با استفاده از آنزیم تریپسین، از فلاسک جدا شد و بههر داربست تعداد 104×3 سلول اضافه شد و تا 30 روز در شرایط CO2، 5 درصد و دمای 37 درجه سانتیگراد قرار گرفتند. محیط کشت شامل: DMEM L-Glucose، FBS 10%، Pen/Strep، L-proline 0.4 mM، Sodium Pyrovate 0.1mM و Dexamethasone 0.1 μM بود (16, 17). محیط کشت هر 2 تا 3 روز تعویض شد. داربستهای کشت شده مورد بررسیهای زیر قرار گرفتند.
رنگ آمیزی هماتوکسیلین / ائوزین ( H&E ): این رنگ آمیزی بهمنظور بررسی روند رشد و گسترش سلولها در روزهای 10،20 و 30 کشت از هر دو داربست (هر کدام سه تکرار) انجام گرفت. بعد از خارج کردن محیط کشت از روی داربستها نمونهها با PBS شستشو داده شد. بهمنظور فیکس کردن سلولها، نمونهها برای با استن برای یک شب در دمای 20 -درجه سانتیگراد قرارگرفتند و سپس با PBS شستشو داده شدند. از رنگ هماتوکسیلین برای 5 دقیقه برای رنگ آمیزی هسته سلولها استفاده شد. برای پاک کردن رنگ اضافی هماتوکسیلین از سیتوپلاسم سلولها شستشو با آب مقطر و PBS انجام شد. پس از آن رنگ ائوزین بهمدت 5 دقیقه برای رنگ آمیزی سیتوپلاسم سلولها استفاده شد. مجددا شستشو با آب مقطر و PBS برای حذف رنگ اضافی ائوزین انجام شد. آنالیز نمونهها توسط میکروسکوپ نوری (Olympus BX51, Tokyo, Japan) متصل به دوربین دیجیتال (Olympus DP71) انجام گرفت. در رنگ آمیزی هماتوکسیلین/ ائوزین هسته سلول را بهرنگ آبی و سیتوپلاسم بهرنگ صورتی دیده میشوند.
در پایان 30 روز کشت، از داربستها برشهای بافتی توسط دستگاه میکروتوم صورت گرفت و با هماتوکسیلین و ائوزین رنگ آمیزی شد. برای تهیه برشهای بافتی از این داربستها، نمونهها پیش از بلوک گیری با پارافین، در بوئن فیکس شدند. سپس با دستگاه میکروتوم مقاطع 5 میکرومتر از آنها تهیه شد. پس از دپارافینه کردن لامهای تهیه شده، نمونهها تحت رنگآمیزی هماتوکسیلین و ائوزین قرار گرفتند. رنگ آمیزی مقاطع تهیه شده از داربست برای بررسی دقیق تر ساختار بافتی تشکیل شده بر روی داربستها صورت گرفت.
رنگآمیزی هسته سلول زنده با رنگ فلورسنت DAPI: برای رنگآمیزی هسته سلول زنده و شمارش آنها در داربستها در زمانهای 10، 20 و 30 روز کشت (هر کدام 3 تکرار) رنگآمیزی با رنگ فلورسنت DAPI (Diaminophenylindole) صورت گرفت. این رنگ قادر است از غشای سلول زنده عبور کرده و به DNA سلول زنده متصل شود. در این بررسی رنگ DAPI بدون فیکس کردن نمونهها و تنها با شستشوی آنها در بافر TBS به آن اضافه شد. برای این منظور نمونهها بعد از خارج کردن محیط کشت از نمونه، با بافر1 درصد، BSA/PBS شستشو شدند. نمونهها بهمدت 5 دقیقه با رنگ DAPI (1 میکروگرم بر میلیلیتر) در تاریکی انکوبه شدند. سپس مجددا با PBS شسته شدند و بعد از گذاشتن داربستها روی لام و ریختن یک قطره گلیسرول رقیق شده با PBS با نسبت 1 به 1 روی بافتها، لامل گذاری بر روی بافتها انجام گرفت. این رنگ در محدوده 365 نانومتر تهییج شده و در محدوده 461 نانومتر نشر دارد. آنالیز نمونهها توسط میکروسکوپ فلورسانس(Olympus BX51, Tokyo, Japan) متصل به دوربین دیجیتال (Olympus DP71) انجام شد.
رنگآمیزیهای اختصاصی بافت غضروفی: برای رنگآمیزی رشتههای کلاژن بهعنوان بیشترین بخش ماتریکس غضروف از رنگآمیزی تری کروم ماسون (در این رنگآمیزی کراتین و رشتههای عضلانی بهرنگ قرمز، کلاژن به رنگ سبز یا آبی و سیتوپلاسم بهرنگ صورتی دیده میشود) و برای بررسی تشکیل پرو تئوگلیگانها از رنگ آمیزی سافرانین اُ که میتواند به پرو تئوگلیگانها متصل شود و بههمین جهت برای رنگآمیزی اختصاصی غصرو ف بهکار میرود (ضمن اینکه با کلاژن اتصال برقرار نمیکند) استفاده شد. در رنگآمیزی با سافرانین پروتئوگلیگانها بهرنگ نارنجی تا قرمز و سیتوپلاسم بهرنگ سبز یا آبی دیده میشود. بنابراین مشاهده رنگ نارنجی یا قرمز نشان دهند تشکیل بافت غضروفی میباشد.
تعیین مقدار گلیکوزآمینوگلیکان سولفاته (DMMBAssay): برای اندازهگیری مقدار گلیکوزآمینوگلیکان (GAG) بهطور مستقیم در نمونهها، از رنگ اختصاصی دی متیل متیلن بلو DMMB (sigma-341088) استفاده شد. این رنگ بهطور اختصاصی به GAG سولفاته بافت متصل میشود و در طول موج 530 تا 630 نانومتر بیشترین جذب نوری را دارد (16). برای این منظور نمونهها (روزهای 10، 20 و 30) ابتدا با آنزیم پروتئیناز K طی 24 ساعت هضم شده و سپس به پلیت 96 خانه انتقال یافتند. سپس بههر نمونه 200 میکرولیتر از رنگ DMMB اضافه شد. کندروئیتین سولفاتA ( sigma-C9819) بهعنوان کنترل جهت تهیه نمودار استاندارد غلظت گلیکوزآمینوگلیکان استفاده شد (با غلظتهای 5/0، 10، 15 و 20 میکروگرم بر میلیلیتر) (18, 19). با اندازهگیری میزان جذب کندروئیتین سولفات و رسم نمودار استاندارد، غلظت GAG در بافت تولید شده در زمانهای 10، 20 و 30 روز برای هر دو داربست 50:50 و 70 :30 اندازهگیری و میزان غضروف زایی این دو مقایسه شد.
آنالیز آماری
محاسبات آماری با استفاده از نرم افزار spss و بهروش آزمون آنوا با سطح معنیداری 05/0p< انجام شد.
نتایج
مورفولوژی و اتصال سلول کندروسیت به سطح داربست
برای بررسی مورفولوژی سلولها بر روی سطح داربست از تصاویر میکروسکوپ SEM استفاده شد. در شکل 1، تصویر داربست 50-50 قبل از کشت و در شکل2 تصویر تهیه شده از داربست پس از کشت 20 روزه مشاهده میشود. مورفولوژی کروی سلول و تشکیل ECM سلولی بر روی سطح داربست کاملا قابل مشاهده است.
شکل 1: تصویر SEM از نانوالیاف فیبروئین ابریشم –کیتوزان با نسبت 50-50 بدون کشت سلول
A |
B |
شکل 2: تصویر SEM از نانوالیاف فیبروئین ابریشم –کیتوزان با نسبت 50-50 پس از کشت سلول A) سلول کروی شکل کندروسیت بر روی سطح داربست، B) ECM تشکیل شده بر روی سطح داربست
رنگ آمیزی هماتوکسیلین - ائوزین(H&E)
رنگ آمیزی هماتوکسیلین - ائوزین نشان از اتصال و پر شدن سطح داربست با سلولهای کندروسیت بود. مقایسه دو داربست نانوالیاف فیبروئین ابریشم-کیتوزان با نسبت 70- 30 و 50 -50 نشان داد که اتصال سلول و پرشدگی در 10 روز اول برای داربست 50 - 50 بیش از داربست 70 :30 بوده است. اما پس از گذشت 20 و 30 روز توزیع سلولی در هر دو داربست یکسان بوده است و سطح داربست کاملا از سلول پر شده است (شکل 3).
روز 10 |
روز 20 |
روز 30 |
شکل 3: رنگ آمیزی H&E در روز 10،20 و 30 کشت در نمونههای بدون برش بافتی. A) داربست 70:30 و B) داربست 50:50 . نقاط تیره رنگ هسته سلول می باشد (بزرگنمایی ×200 )
برای بررسی دقیقتر و تهیه تصاویر بهتر برشهای بافتی از نمونههای 30 روزه تهیه شد (شکل 4). در این رنگآمیزی که بر روی نمونههای برش خورده انجام گرفت ساختار بافتی یکنواختی که توسط کندروسیتها تشکیل شده قابل مشاهده است.
شکل 4: رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین از برش تهیه شده از داربست 70:30 پس از کشت 30 روزه
رنگ آمیزی DAPI برای شمارش سلولها
برای شمارش سلولها و بهدست آوردن محتوی DNA از رنگ فلورسنت DAPI استفاده شد. نتایج شمارش سلولی
در 200 میکرومتر مکعب از داربست کشت داده شده در روزهای 10، 20 و 30 در شکل 5 و تصویر داربست رنگآمیزی شده در شکل 6 آمده است.
شکل 5: نمودار رشد سلولها در زمانهای 10،20و 30 روز کشت و مقایسه رشد آنها در دو داربست فیبروئین ابریشم- کیتوزان 50:50 و 70:30 (شمارش در 200 میکرومتر مکعب)
شکل 6: تصویر A ) رنگ آمیزی هسته سلولهای زنده بر روی داربست با رنگ فلورسنت DAPI، تصویر B ) داربست بدون سلول بهعنوان کنترل
رنگآمیزی تری کروم ماسون و سافرانین اُ
در رنگآمیزی تری کروم ماسون داربستهای برشگیری شده رشتههای کلاژن بهرنگ آبی بهمقدار فراوان مشاهده شد که نشانه تشکیل مقدار زیاد کلاژن در ماتریکس و ایجاد بافت غضروفی بود (شکل 7 ).
شکل7: رنگآمیزی تری کروم ماسون. رشتههای کلاژن بهرنگ آبی دیده میشوند( بزرگنمایی ×20)
همان طور که گفته شد در رنگآمیزی سافرانین اُ رشتههای پروتئوگلیکان بهرنگ نارنجی تا قرمز رنگ میشوند و سیتوپلاسم بهرنگ آبی یا سبز دیده میشود . در رنگآمیزی داربستهای کشت شده با این رنگآمیزی رنگ قرمز که نشان دهنده تراکم بالای پروتئوگلیکان بوده است دیده شد که تاییدی دیگر بر تشکیل بافت غضروفی بود (شکل 8). با توجه به آن که این رنگآمیزی یک ارزیابی کیفی است و تفاوت مشخصی بین داربست 50-50 و 70-30 در این رنگ آمیزیها وجود نداشت تنها تصاویر داربست 50-50 در اینجا آورده شده است.
شکل 8: رنگآمیزی داربست کشت شده بهروش سافرانین اُ. رشتههای پروتئوگلیکان به رنگ قرمز دیده میشوند ( بزرگنمایی ×20)
تعیین مقدار گلیکوزآمینوگلیکان ( GAG)
منحنی استاندارد تهیه شده از غلظت گلیکوزآمینوگلیکان در شکل 9 آمده است. مقادیر جذب نوری ثبت شده از نمونههای مورد بررسی با نمودار منحنی استاندارد مقایسه
شد. مقایسه تغییرات غلطت GAG برای برای هر دو نوع داربست در شکل 10 نشان داده شده است.
شکل 9: منحنی استاندارد گلیکوزآمیونوگلیکان
شکل 10: میزان تولید گلیکوزآمینوگلیکان در دو داربست 50:50 و 70:30 در زمانهای 10، 20 و 30 روز پس از کشت
بحث
در این مطالعه کشت کندروسیتها بدون استفاده از فاکتور رشد، برای بررسی اثر ساختار پروتین – پلی ساکاریدی نانوالیاف بکار رفته بهعنوان یک جایگزین برای ECM بافت غضروف بر روی داربستها صورت گرفت. داربست ساخته شده در هر دو نسبت کیتوزان و فیبروئین بهدلیل وجود کیتوزان و داشتن ساختاری مشابه گلیکوزآمینوگلیکان (GAG) و دمینهایی جهت اتصال سلول، بستر مناسبی را برای اتصال کندوسیتها که بهطور طبیعی جز سلولهایی با میزان رشد پایینی محسوب میشوند فراهم کرده است و این روند در اتصال سلولها در 10 روز کاملا مشهود است.
نمودار رشد سلولها و مقایسه آنها در دو داربست 50: 50 و 70:30 در زمانهای 10 ، 20 و 30 روز از کشت بیانگر رشد بهتر سلولها بر روی داربست 50: 50 بود. همانطور که گفته شد وجود پلیمر کیتوزان
بیشتر در این داربست زمینه ساز این رشد برای سلولها بوده است.
برای اثبات وجود بافت غضروفی در ساختارهای حاصل از القای تمایز، روشهای مختلف بهکار میرود. همانگونه که در تحقیقات دیگر بیان شده است، وجود کلاژن نوع II و پروتئوگلیکان آگریکان نشان دهنده بافت غضروفی است. بنابراین با روشهای ایمونوهیستوشیمی با استفاده از آنتیبادیهای مربوط به ترکیبات فوق و نیز روش RT-PCR وجود بافت غضروف و القای کندروژنیک میتواند بررسی شود. در این مطالعه رنگآمیزی تریکروم ماسون وجود رشتههای کلاژن را در دابست بهخوبی نشان داد. تراکم رنگ نشان از تراکم بالای کلاژن تشکیل شده و نشانهای از تمایز مناسب سلولهای مزاشیمی به بافت غضروف بود.
از تعیین میزان GAG نیز بهعنوان شاخصی برای غضروفزایی استفاده میشود. گلیکوزآمینوگلیکان یکی از ترکیبات غضروف مفصلی محسوب میشود و تولید آن بهعنوان شاخصی برای غضروف زایی کندروسیتهای کشت داده شده عنوان میشود و بیانگر پویایی بافت تشکیل شده و عدم از دست دادن تمایز سلولها است. در این بررسی نیز غلظت GAG در داربست 50:50 بیش از داربست 70:30 بود که این روند با توجه به رشد بیشتر سلولی بر روی این داربست قابل توجیه است. این امر میتواند بهدلیل حضور بیشتر پلیمر کیتوزان در آن باشد. پلیمر کیتوزان با داشتن خواصی مشابه پروتئوگلیکانها، بستر مناسبی را جهت اتصال سلولها و حفظ فنوتیپ و گسترش آنها فراهم میکند. تصاویر SEM گرفته شده پس از کشت 20 روزه حضور سلولهای کروی شکل بر روی داربست را تایید کرد که این امر حفظ فنوتیپ طبیعی کندروسیتها بر روی داربست نانوالیاف فیبروئین ابریشم – کیتوزان را تایید میکند. مقایسه مقدار گلیکوزآمینوگلیکان تولید شده توسط کندروسیتها با سایر تحقیقات صورت گرفته نشان از فعالیت غضروفزایی مطلوب این سلولها بر روی داربست نانوالیاف فیبروئین ابریشم – کیتوزان داشته و حتی در مواردی از تحقیقاتی که در آن از فاکتورهای رشد TGF-β3 و ITS بهمنظور افزایش توان غضروفزایی کندروسیتها استفاده شده، بیشتر بوده است.
در تحقیقی که توسط Neves و همکارانش (17) برای تولید بافت غضروف بر روی داربستی از جنس پلیمرهای کیتوزان – پلی کاپرولاکتون صورت گرفت، میزان تولید GAG پس از سه هفته تنها 7 میکرو گرم بر میلیلیتر بود و این درحالی بود که در تحقیق مذکور از دو فاکتور رشد ITS و TGF-β3 که اثر مستقیمی در غضروفزایی دارد، استفاده شده بود.
Levorson و همکارانش (20) بهمنظور تولید بافت غضروف از داربست پلی کاپرولاکتون- پلی ونیل الکل استفاده کردند که میزان تولید GAG پس از سه هفته تنها 1μg/scaffold بود. در این تحقیق نیز همانند تحقیق صورت گرفته توسط Neves و همکارانش (17)، از فاکتور رشد ITS استفاده شده بود.
در تحقیق دیگر انجام شده توسط Jeong و همکاران (21) میزان GAG تولید شده در هر داربست پس از 4 هفته تنها 2 میکرولیتر گزارش شده است و این در حالی است که تعداد سلولهای اولیه لود شده در هر داربست 106×20 سلول بوده است.
Li و همکارانش (22) در بررسی میزان غضروفزایی در داربست پلی لاکتیک- کاپرولاکتون (PLCL) و پلی هیدروکسی بوتیرات – هیدروکسی والرات (PHBV) میزان تولید GAG را در بیشترین میزان، 8 میکروگرم بر میلیلیتر گزارش کرد در حالی که تعداد سلول اولیه 107×1 سلول بود و در مقایسه تعداد سلول گذاشته شده بر روی داربست در تحقیق حاضر تنها 104×3 سلول بود.
در تحقیقی که توسط Correia و همکارانش (19) برای تشکیل بافت غضروف در داربست پلیمری کیتوزان – هیالورونیک اسید انجام شد، میزان تولید GAG پس از 35 روز، 8 میکروگرم بر میلیلیتر گزارش شد. در این تحقیق نیز از فاکتور رشد TGF-β3 و ITS بهمنظور افزایش قدرت غضروفزایی استفاده شده بود.
Silva و همکاران (23) نانوالیافی از جنس پلی کاپرولاکتون – نشاسته را برای کشت کندروسیت بهمنظور تشکیل بافت غضروف بر روی آن ساختند. میزان تولید GAG بر روی این داربست پس از یک ماه 2 میکروگرم بر میلیلیتر بود. در این تحقیق از انسولین و فاکتور رشد bFGF برای افزایش قدرت غضروفزایی استفاده شده بود.
مقایسه میزان گلیکوزآمینوگلیکان تولید شده در تحقیق حاضر در مقایسه با سایر تحقیقات حتی با وجود استفاده آنها از فاکتور رشد بیشتر بوده و این نشان از مناسب بودن بستر پروتیئنی فیبروئین ابریشم و گلیکو پلی ساکاریدی کیتوزان برای اتصال و گسترش کندروسیتها دارد. بستری که شبیه به ماتریکس خارج سلولی (پروتئین – پلیساکارید) طراحی شده و نتایج حاصل گویای این واقعیت است که علیرغم عدم استفاده از فاکتورهای رشد، کندورسیتها فنوتیپ و قدرت غضروفزایی خود را بر روی آن پس از گذشت 30 روز از کشت بهخوبی حفظ کرده اند.
نتایج حاصل در این تحقیق بیانگر این است که داربست نانوالیاف فیبروئین ابریشم – کیتوزان تولید شده دارای ویژگیهای برتری نسبت به سایر داربستهای پلیمری طبیعی است. ترکیب پلیمر فیبروئین ابریشم با کیتوزان، خواص تخریب پذیری پلیمر کیتوزان را که سرعت تخریب بالایی دارد، بسیار بهبود بخشیده و سرعت تخریب آن را طی 12 هفته بررسی تنها به 5 درصد از وزن کل داربست کاهش داده است..
نتیجهگیری
بهطور کلی مقایسه دو داربست 50:50 و 70:30 نشان میدهد که خواص مکانیکی و تخریب پذیری داربست 70:30 از 50:50 مطلوبتر اما در مقابل میزان رشد و گسترش سلولی و غضروفزایی بر روی داربست 50:50 بیشتر از 70:30 است.
بررسی درون تنی این داربست برای بررسی دقیقتر عملکرد این داربستها در ترمیم غضروف مفصلی در حیوانات مدل در حال انجام است.
تشکر و قدر دانی
از آقای دکتر حسن مروتی استاد بخش بافت شناسی دانشکده دامپزشکی تهران که بخشی از رنگ آمیزیی بافتی با کمک ایشان انجام شد قدردانی میشود.