مقدمه

از سال 2000 میلادی استفاده از پلیمرهای زیست تخریب پذیر طبیعی و مصنوعی، برای ساخت نانوالیاف به‫منظور کاربردهای زیست پزشکی وارد عرصه ظهور شد. این پلیمرها برای برنامه­های کاربردی به‫ویژه استفاده در مهندسی بافت و دارو رسانی در حال تست هستند (1). الکتروریسی یک روش ساده و کارآمد است که توسط آن می­توان داربست­های متشکل از الیاف در مقیاس نانو تا میکرومتر تولید کرد که قابل مقایسه با قطر الیاف اجزای ضروری ماتریکس خارج سلولی سلولی یا ECM (Extracellular Matrix) است (2). در این فرآیند از یک ولتاژ بالا برای تشکیل نانو الیاف از پلیمر محلول در حلال آلی فرار استفاده می‫شود.

از جمله پلیمرهای مورد استفاده در ساخت داربست‫های بافتی، پلیمر کیتوزان است. کیتوزان یک پلیمر کاتیونی زیست تخریب­پذیر است که یک سطح آبدوست را برای توسعه چسبندگی سلولی، تکثیر و تمایز آن‫ها فراهم می‫کند. گلیکوزآمینوگلیکان­های سولفاته که از جمله مولکول‫های فراوان در ماتریکس خارج سلولی هستند براحتی به این پلیمر که دارای بار مثبت است متصل می‫شوند (3, 4). الیاف کیتوزان و کیتین به‫عنوان یک پانسمان زیست­سازگار و یا مواد پوشش دهنده برای تسریع ترمیم زخم انسان و حیوانات آزمایش شده است (5). این پلیمر از فعالیت ضدباکتریایی و زیست­سازگاری خوب در برابر پاسخ میزبان برخوردار است. بنابراین ایمپلنت­های حاصل از آن با حداقل واکنش­های ایمنی روبروست (3). کیتوزان ساختاری شبیه به گلیکوز آمینوگلیکان­ها (پلی­ساکاریدهای موجود در ECM) دارد و دارای دمین‫های زیادی برای اتصال سلول‫ها (6) و فاکتورهای رشد می­باشد. این پلیمر در بدن توسط آنزیم لیزوزیم براحتی تجزیه می­شود. مشکل عمده کیتوزان خواص مکانیکی ضعیف آن است که مشکل عمده پلیمرهای طبیعی است که برای غلبه بر آن بهتر است با پلیمر دیگری با خواص مکانیکی بهتر، همراه باشد (7).

پلیمر دیگر مورد استفاده ساخت داربست‫ها، پلیمر فیبروئین ابریشم (Silk fibroin) است. ابریشم ماده‫ای زیست­سازگار است و  سالهاست که به‫عنوان نخ بخیه استفاده می­شود (8). فیبروئین ابریشم یک پروتئین فیبری است که رشته­های ابریشم را تشکیل می­دهد و حدود 70 تا 75 درصد وزن ابریشم را تشکیل می­دهد و توسط سریسین که پروتئین چسب ­مانندی است کنار هم نگه داشته می‫شوند. فیبروئین خواص فیزیکی و شیمیایی منحصر به فردی را داراست. سریسین خواص مکانیکی ضعیف­تری نسبت به فیبروئین داشته و نسبت به تغییرات pH و دما حساس می­باشد (9). ابریشم پس از صمغ­گیری (جداسازی سریسین) تنها حاوی فیروئین است که از اسیدهای آمینه گلایسین، آلانین و سرین تشکیل شده که در تشکیل ساختار منظم و کریستالی فیبروئین شرکت دارند (10).

به‫منظور ترمیم بافت غضروف مفصلی بررسی‫هایی جهت ساخت یک داربست مناسب از نانوفیبر فیبروئین ابریشم و کیتوزان به‫روش الکتروریسی توسط مولفین انجام شد. با توجه به ویژگی­های مطلوب به دست آمده از داربست نانوفیبر فیبروئین ابریشم و کیتوزان ساخته شده با نسبت 50 -50  و 70 – 30، این تحقیق جهت بررسی کشت برون تنی سلول‫های کندروسیت گوساله بر روی این داربست‫ها  و ارزیابی زیست سازگاری، توانایی تکثیر و چسبندگی سلول‫ها و در نهایت کارایی این داربست‫ها جهت استفاده در ترمیم بافت غضروف مفصلی انجام شد. 

مواد و روش‫ها

داربست مورد استفاده: در این مطالعه از داربست نانوفایبر سه بعدی متخلخل فیبرویین ابریشم/کیتوزان با نسبت 50-50  70-30  تهیه شده به‫روش الکتروریسی که در پژوهشکده بیوتکنولوژی سازمان پژوهش‫های علمی و صنعتی ایران طراحی و ساخته شد استفاده شد. این داربست دارای ساختار متخلخل یکنواخت، تخلخلی حدود 85 درصد و قطر فیبرهای آن نیز دارای گستره‫ای از50 تا 170 نانومتر می­باشد (به‫ترتیب با میانگین قطر 51/24±138.5 و 32/52±8/148 نانومتر‫). خواص مکانیکی داربست‫های مورد استفاده به‫ترتیب به شرح زیر است: مقاوت کششی (Breaking tenacity )  03/0±14/1 و 2/0±2/2 مگاپاسکال، ازدیاد طول تا پارگی (Elongation at break) 04/0±8/2 درصد و 03/0±94/4 و مدول الاستیسیته یا مدول یانگ (Young´s Module) 02/0±80/0 و 08/0±51/0 مگاپاسکال. میزان تخریب پذیری این داربست ها نیز 2/0 12/6 درصد از کل وزن داربست پس از 12 هفته بود . 

جداسازی سلول‫های کندروسیت: نمونه‫های غضروف مفصلی با اندازه تقریبی 1 سانتی‫متر مکعب از 3 گوساله‫ی تازه ذبح شده در کشتارگاه  تهیه شد. بدین‫منظور نمونه‫های جدا شده در داخل محیط کشت  DMEM L-Glucose ( 1% Pen/Step,Gibco ) تا آزمایشگاه حمل شد. نمونه‫ها پس از شستشوی در PBS‫، در شرایط استریل به قطعات حدود 1mm3 تقسیم شدند. قطعات مربوط به‫هر نمونه در فالکون‫های جدا ریخته شد. به‫هر نمونه محیط DMEM حاوی w/v، 25/0 درصد آنزیم تریپسین (Gibco) افزوده و به‫مدت 30 دقیقه در شیکرانکوباتور با دمای 37 درجه سانتی‫گراد قرار داده شدند. پس از 30 دقیقه تریپسین با محیط حاوی سرم خنثی و  سانتریفیوژ شد (11, 12). پس از دور ریختن مایع رویی، به نمونه‫ها محیط DMEM حاوی آنزیم کلاژنازI (Gibco-17100017) با غلظت 1 میلی‫گرم بر میلی‫لیتر اضافه شد و مجددا در شیکر انکوباتور برای 16 ساعت انکوبه شدند (13, 14). پس از گذشت این زمان مجددا سلول‫ها سانتریفیوژ شده و مایع رویی دور ریخته شد. به‫هر فالکون 5ml DMEM حاوی FBS، 10 درصد و  U/mL100 پنیسیلین و 100 میکروگرو بر میلی‫لیتر استرپتومایسین (محیط کامل) اضافه شده و در فلاسک‫های 25 سانتی‫متر مکعب در انکوباتور و در شرایط CO₂، 5 درصد و دمای 37 درجه سانتی‫گراد کشت داده شد. هر 2 تا 3 روز محیط آن تعویض شد که پس از حدود 7 روز فلاسک‫ها پر شدند.

کشت سلول‫های کندروسیت بر روی داربست نانوالیاف‫: در ابتدا نانوالیاف ساخته شده در یک محلول با ترکیب اتانول/ آمونیاک با غلظت 7 و 70 درصد تحت تیمار شیمیایی قرار گرفتند (6, 15). این عمل باعث تغییرات شیمیایی در نانوالیاف و نامحلول شدن نانوالیاف می‫شود (6). این داربست‫ها سپس توسط پانچ به‫صورت دایره‫هایی با قطر 5/0 سانتی‫متر پانچ شدند. پیش از کشت سلول داربست‫های پانچ شده با اتانول 70  درصد  به‫مدت 30 دقیقه استریل شدند.

داربست‫های پانچ شده در دو گروه 50:50 و 70:30  و برای هر تکرار چهار داربست در پلیت‫های 48 خانه قرار گرفتند. سلول‫های کندروسیت پس از پر شدن فلاسک‫ها، با استفاده از آنزیم تریپسین، از فلاسک جدا شد و به‫هر داربست تعداد 10⁴×3 سلول اضافه شد و تا 30 روز در شرایط CO₂، 5 درصد و دمای 37 درجه سانتی‫گراد قرار گرفتند. محیط کشت شامل: DMEM L-Glucose،  FBS 10%، Pen/Strep،  L-proline 0.4 mM،  Sodium Pyrovate 0.1mM و Dexamethasone 0.1 μM بود (16, 17). محیط کشت هر 2 تا 3 روز تعویض شد. داربست‫های کشت شده مورد بررسی‫های زیر قرار گرفتند.

رنگ آمیزی هماتوکسیلین / ائوزین ( H&E ): این رنگ آمیزی به‫منظور بررسی روند رشد و گسترش سلول‫ها در روزهای 10،20 و 30 کشت از هر دو داربست (هر کدام سه تکرار) انجام گرفت. بعد از خارج کردن محیط کشت از روی داربست‫ها نمونه‫ها با PBS شستشو داده شد. به‫منظور فیکس کردن سلول‫ها‫، نمونه‫ها برای با استن برای یک شب در دمای 20 -درجه سانتی‫گراد  قرارگرفتند و سپس با PBS شستشو داده شدند. از رنگ هماتوکسیلین برای 5 دقیقه برای رنگ آمیزی هسته سلول‫ها استفاده شد. برای پاک کردن رنگ اضافی هماتوکسیلین از سیتوپلاسم سلول‫ها شستشو با آب مقطر و PBS انجام شد. پس از آن رنگ ائوزین به‫مدت 5 دقیقه برای رنگ آمیزی سیتوپلاسم سلول‫ها استفاده شد. مجددا شستشو با آب مقطر و PBS برای حذف رنگ اضافی ائوزین انجام شد. آنالیز نمونه‫ها توسط میکروسکوپ نوری (Olympus BX51, Tokyo, Japan) متصل به دوربین دیجیتال (Olympus DP71) انجام گرفت. در  رنگ آمیزی هماتوکسیلین/ ائوزین هسته سلول را به‫رنگ آبی و سیتوپلاسم به‫رنگ صورتی دیده می‫شوند.

در پایان 30 روز کشت‫، از داربست‫ها برش‫های بافتی توسط دستگاه میکروتوم صورت گرفت و با هماتوکسیلین و ائوزین رنگ آمیزی شد. برای تهیه برش‫های بافتی از این داربست‫ها‫، نمونه‫ها پیش از بلوک گیری با پارافین‫، در بوئن فیکس شدند. سپس با دستگاه میکروتوم مقاطع 5 میکرومتر از آن‫ها تهیه شد. پس از دپارافینه کردن لام‫های تهیه شده‫، نمونه‫ها تحت رنگ‫آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین قرار گرفتند. رنگ آمیزی مقاطع تهیه شده از داربست برای بررسی دقیق تر ساختار بافتی تشکیل شده بر روی داربست‫ها صورت گرفت.

رنگ‫آمیزی هسته سلول زنده با رنگ فلورسنت DAPI: برای رنگ‫آمیزی هسته سلول زنده و شمارش آن‫ها در داربست‫ها در زمان‫های 10، 20 و 30 روز کشت (هر کدام 3 تکرار) رنگ‫آمیزی با رنگ فلورسنت DAPI (Diaminophenylindole) صورت گرفت. این رنگ قادر است از غشای سلول زنده عبور کرده و به DNA سلول زنده متصل شود. در این بررسی رنگ DAPI بدون فیکس کردن نمونه‫ها و تنها با شستشوی آن‫ها در بافر TBS به آن اضافه شد. برای این منظور نمونه‫ها بعد از خارج کردن محیط کشت از نمونه، با بافر1 درصد، BSA/PBS شستشو شدند. ‌نمونه‫ها به‫مدت 5 دقیقه با رنگ DAPI (1 میکروگرم بر میلی‫لیتر) در تاریکی انکوبه شدند. سپس مجددا با PBS شسته شدند و بعد از گذاشتن داربست‫ها روی لام و ریختن یک قطره گلیسرول رقیق شده با PBS با نسبت 1 به 1 روی بافت‫‫ها، لامل گذاری بر روی بافت‫ها انجام گرفت. این رنگ در محدوده 365 نانومتر تهییج شده و در محدوده 461 نانومتر نشر دارد. آنالیز نمونه‫ها توسط میکروسکوپ فلورسانس(Olympus BX51, Tokyo, Japan) متصل به دوربین دیجیتال (Olympus DP71) انجام شد.

رنگ‌آمیزی‫های اختصاصی بافت غضروفی: برای رنگ‌آمیزی رشته‫های کلاژن به‫عنوان بیشترین  بخش ماتریکس غضروف از رنگ‌آمیزی تری کروم ماسون  (در این رنگ‌آمیزی کراتین و رشته‫های عضلانی به‫رنگ  قرمز،  کلاژن به رنگ سبز یا آبی  و سیتو‫پلاسم به‫رنگ صورتی دیده می‌شود) و برای  بررسی تشکیل پرو تئوگلیگان‌ها از رنگ آ‫میزی  سافرانین اُ  که  می‫تواند به پرو تئوگلیگان‌ها متصل شود و به‫همین جهت برای رنگ‌آمیزی اختصاصی غصرو ف  به‫کار می‫رود (ضمن اینکه با کلاژن اتصال برقرار نمی‫کند) استفاده شد. در رنگ‌آمیزی با سافرانین پروتئوگلیگان‌ها به‫رنگ نارنجی تا قرمز و سیتوپلاسم به‫رنگ سبز یا آبی  دیده می‌شود. بنابر‫این مشاهده  رنگ نارنجی یا قرمز نشان دهند تشکیل بافت غضروفی می‫باشد.

تعیین مقدار گلیکوزآمینوگلیکان سولفاته (DMMBAssay): برای اندازه‫گیری مقدار گلیکوزآمینوگلیکان (‫GAG‫) به‫طور مستقیم در نمونه‫ها‫، از رنگ اختصاصی دی متیل متیلن بلو  DMMB (sigma-341088) استفاده شد. این رنگ به‫طور اختصاصی به GAG سولفاته بافت متصل می‫شود و در طول موج 530 تا 630 نانومتر بیشترین جذب نوری را دارد (16). برای این منظور نمونه‫ها (روزهای 10، 20 و 30‫) ابتدا با آنزیم پروتئیناز K طی 24 ساعت هضم شده و سپس به پلیت 96 خانه انتقال یافتند. سپس به‫هر نمونه 200 میکرولیتر از رنگ DMMB اضافه شد. کندروئیتین سولفاتA ( sigma-C9819) به‫عنوان کنترل جهت تهیه نمودار استاندارد غلظت گلیکوزآمینوگلیکان استفاده شد (‫با غلظت‫های 5/0، 10، 15 و 20 میکروگرم بر میلی‫لیتر) (18, 19). با اندازه‫گیری میزان جذب کندروئیتین سولفات و رسم نمودار استاندارد‫، غلظت GAG در بافت تولید شده در زمان‫های 10‫، 20 و 30 روز برای هر دو داربست 50:50 و 70 :30 اندازه‫گیری و میزان غضروف زایی این دو مقایسه شد.

آنالیز آماری

محاسبات آماری با استفاده از نرم افزار  spss و به‫روش آزمون آنوا با سطح معنی‫داری  05/0p< انجام شد.    

نتایج

مورفولوژی و اتصال سلول کندروسیت به سطح داربست

 برای بررسی مورفولوژی سلول‫ها بر روی سطح داربست از تصاویر میکروسکوپ SEM استفاده شد. در شکل 1،  تصویر داربست 50-50 قبل از کشت و در شکل2 تصویر تهیه شده از داربست پس از کشت 20 روزه مشاهده می‫شود. مورفولوژی کروی سلول و تشکیل ECM سلولی بر روی سطح داربست کاملا قابل مشاهده است.

 شکل 1:  تصویر SEM از نانوالیاف فیبروئین ابریشم –کیتوزان با نسبت 50-50 بدون کشت سلول

شکل 2: تصویر SEM از نانوالیاف فیبروئین ابریشم –کیتوزان با نسبت 50-50 پس از کشت سلول A) سلول کروی شکل کندروسیت بر روی سطح داربست،  B)  ECM تشکیل شده بر روی سطح داربست

رنگ آمیزی هماتوکسیلین - ائوزین(H&E)

رنگ آمیزی هماتوکسیلین - ائوزین نشان از اتصال و پر شدن سطح داربست با سلول‫های کندروسیت بود. مقایسه دو داربست نانوالیاف فیبروئین ابریشم-کیتوزان با نسبت 70- 30 و 50 -50 نشان داد که اتصال سلول و پرشدگی در 10 روز اول برای داربست 50 - 50  بیش از داربست 70 :30  بوده است. اما پس از گذشت 20 و 30 روز توزیع سلولی در هر دو داربست یکسان بوده است و سطح داربست کاملا از سلول پر شده است (شکل 3).

شکل 3: رنگ آمیزی H&E در  روز 10،20 و 30  کشت در نمونه‫های بدون برش بافتی. A) داربست 70:30 و B) داربست 50:50 . نقاط تیره رنگ هسته سلول می باشد (بزرگنمایی ×200 )

برای بررسی دقیق‫تر و تهیه تصاویر بهتر برش‫های بافتی از نمونه‫های 30 روزه تهیه شد (شکل 4)‫. در این رنگ‫آمیزی که بر روی نمونه‫های برش خورده انجام گرفت ساختار بافتی یکنواختی که توسط کندروسیت‫ها تشکیل شده قابل مشاهده است.

شکل 4:  رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین از برش تهیه شده از داربست 70:30 پس از کشت 30 روزه

رنگ آمیزی DAPI برای شمارش سلول‫ها

برای شمارش سلول‫ها و به‫دست آوردن محتوی DNA از رنگ فلورسنت DAPI استفاده شد. نتایج شمارش سلولی

در 200 میکرومتر مکعب از داربست کشت داده شده در روزهای 10، 20 و 30 در شکل 5 و تصویر داربست رنگ‫آمیزی شده در شکل 6 آمده است. 

شکل 5:  نمودار رشد سلول‫ها در زمان‫های 10،20و 30 روز کشت و مقایسه رشد آن‫ها در دو داربست فیبروئین ابریشم- کیتوزان 50:50 و  70:30 (شمارش در 200 میکرومتر مکعب)

شکل 6:  تصویر A ) رنگ آمیزی هسته سلول‫های زنده بر روی داربست  با رنگ فلورسنت DAPI، تصویر B ) داربست بدون سلول به‫عنوان کنترل

رنگ‌آمیزی تری کروم ماسون و سافرانین اُ

 در رنگ‌آمیزی تری کروم ماسون داربست‌های برش‫گیری شده رشته‫های کلاژن به‫رنگ آبی به‫مقدار فراوان مشاهده شد که نشانه تشکیل مقدار زیاد کلاژن در  ماتریکس و ایجاد بافت غضروفی بود (شکل 7 ).

شکل7: رنگ‌آمیزی تری کروم ماسون. رشته‫های کلاژن به‫رنگ آبی  دیده می‫شوند( بزرگنمایی ×20)

همان طور که گفته شد در رنگ‌آمیزی سافرانین اُ رشته‫های پروتئوگلیکان به‫رنگ نارنجی تا قرمز رنگ می‫شوند و سیتوپلاسم به‫رنگ آبی یا سبز دیده می‌شود . در رنگ‌آمیزی داربست‌های کشت شده با این رنگ‌آمیزی رنگ قرمز که نشان دهنده تراکم بالای پروتئوگلیکان بوده است دیده شد که تاییدی دیگر بر تشکیل بافت غضروفی بود (‫شکل 8). با توجه به آن که این رنگ‫آمیزی یک ارزیابی کیفی است و تفاوت مشخصی بین داربست 50-50 و 70-30 در این رنگ آمیزی‫ها وجود نداشت تنها تصاویر داربست 50-50 در اینجا آورده شده است.

شکل 8: رنگ‌آمیزی  داربست  کشت شده به‫روش سافرانین اُ.  رشته‫های پروتئوگلیکان به رنگ قرمز دیده می‫شوند ( بزرگنمایی ×20)

تعیین مقدار گلیکوزآمینوگلیکان ( GAG)

منحنی استاندارد تهیه شده از غلظت گلیکوزآمینوگلیکان در شکل 9 آمده است. مقادیر جذب نوری ثبت شده از نمونه‫های مورد بررسی با نمودار منحنی استاندارد مقایسه

شد. مقایسه تغییرات غلطت GAG برای برای هر دو نوع داربست در شکل 10 نشان داده شده است.

شکل 9: منحنی استاندارد گلیکوزآمیونوگلیکان

شکل 10:  میزان تولید گلیکوزآمینوگلیکان در دو داربست 50:50 و 70:30 در زمان‫های 10، 20 و 30 روز پس از کشت