نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
دانشگاه تهران، دانشکده دامپزشکی، گروه علوم پایه، تهران، ایران
چکیده
هدف: در تحقیق حاضر، تاثیر بافت شناسی تجویز کافئین در دوران بارداری بر روی شبکیه چشم و بیانژن PAX6 در نوزادان موش بزرگآزمایشگاهی مورد ارزیابی قرار گرفت.
مواد و روشها: تعداد 24 سر موشبزرگ آزمایشگاهی باردار به سه گروه مساوی تقسیم شدند. گروه کنترل سرم فیزیولوژی و دو گروه دیگر کافئین را با دوزهای 50 و 100 میلیگرم بر کیلوگرم بهصورت داخلصفاقی از روز نهم تا بیستم آبستنی دریافت نمودند. نوزادان متولد شده در روزهای اول و پنجم آسانکشی و ناحیه سر آنها جداسازی و داخل فیکساتیو ثابــت شد. همچنین نوزادان از نظر ناهنجاریهای ظاهری نیز بررسی شدند. ارزیابیهای هیستولوژی و مورفومتری شبکیه، تغییرات فلورسنت بافت چشم و بیان ژن PAX6 با روش رونویسی معکوس واکنش زنجیرهای پلیمراز (Real-time PCR) بررسی شد.
نتایج: نتایج نشان داد که دریافت کافئین مادری بر شبکیه چشم نوزادان متولد شده با تغییرات آتروفیک همراه بوده و موجب کاهش معنیدار (05/0>p) در تراکم سلولهای لایه گانگلیونی، ضخامت شبکیه و ضخامت لایه شبکه داخلی شد. همچنین کافئین باعث تغییرات رفتاری در مادران و فلوروسنت بافتی شده و باعث افزایش معنیدار (05/0>p) الگوی بیانژن PAX6 در گروههای دریافتکننده کافئین شد.
نتیجهگیری: دریافت کافئین در دوره بارداری تغییرات مشخص هیستولوژی و مورفومتری را در ارگانوژنز و اختلال بیان PAX6 در تنظیم تکوین چشم را سبب می‌شود.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Effects of Caffeine During Pregnancy in Histology, Morphometry, Tissue Fluorescence and PAX6 Gene Expression on the Rat Neonate’s Retina
نویسندگان [English]
- H Morovvati
- L Eini
- M Adibmoradi
- H Anbara
Department of Comparative Histology & Embryology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Tehran, Tehran, Iran
چکیده [English]
Aim: In this study, the histology effect of caffeine administration was evaluated on retina and PAX6 expression in rat neonates.
Material and Methods: A total of 24 pregnant rats were divided into three groups. Intraperitoneal injection of saline in the control group and also 50 mg/kg and 100 mg/kg caffeine injection from the ninth day of gestation was done. At 20 or 21 embryonic day, neonates on the first and fifth days were euthanized anesthetized and the eyes were isolated and fixed. The neonates were examined for abnormalities. The Retina Histological and morphometric evaluations, eye tissue fluorescence changes, and PAX6 gene expression were investigated by Real time PCR.
Results: The results showed that the effects of maternal caffeine treatment on the retina in neonates are associated with atrophic changes and cell counts of ganglion cell layer, retinal thickness and thickness of the inner plexiform layer, in the animals were treated with caffeine, were significantly reduced (p < 0.05). Also caffeine induced behavioral changes in mothers and tissue fluorescence and significantly increased (P <0.05) the PAX6 gene expression in the groups receiving caffeine.
Conclusion: Administration of caffeine during pregnancy can induce histopathological changes in organogenesis and developing in rat neonate’s retina.
کلیدواژه‌ها [English]
- Caffeine
- Retina
- Morphometric analysis
- Rat
مقدمه
کافئین ((C8H10N4O2 یکی از انواع متیلگزانتینها میباشد که اغلب از طریق چای، قهوه، نوشابه و شکلات وارد بدن می‌شود. این ماده بهعنوان عمومیترین داروی سایکواکتیو جهان، محرک سیستم اعصاب مرکزی، عضلات قلب و سیستم تنفس است، کمی دیورتیک بوده و خستگی را به تعویق میاندازد (1). تحقیقات نشان داده که کافئین اغلب اثرات مهاری آدنوزین را تغییر داده و فعالیت نورونی را تحریک میکند و روی دستگاه اعصاب مرکزی (CNS) از طریق مهار فعالیت فسفودی استراز و مهار گیرندههای GABA و افزایش فعالیت کلسیم داخل سلولی عمل میکند (2, 3). کافئین بهسرعت در دستگاه گوارش جذب شده و تبدیل به پاراگزانتین، تئوبرومین و تئوفیلین با ساختار مشابه با کافئین می‌شود (4). کافئین یک آنتاگونیست آدنوزینی مهم است که باعث تحریک CNS می‌شود و پس از مصرف بهطور گسترده در تمام بدن منتشر شده و از تمام غشاهای بیولوژیک شامل سد خونیمغزی و جفت بهعلت مشخصات لیپوفیلیکی بهراحتی عبور میکند (5, 6).
ماههای اول بارداری دوران حساس شکلگیری جنین میباشند و با توجه به این که بعضی از مادران دراین ماهها از بارداری خود خبر نداشته و یا ناآگاهانه و یا بنابه ضرورت درمان بیماریها، از داروها و یا برخی از ترکیبات غذایی استفاده میکنند، این امر میتواند موجب تاثیر بر ارگانوژنز و تکامل طبیعی جنین گردد. سیستم بینایی بهدلیل این که دریافتکننده تحریکات بیرونی است اهمیت ویژهای در حفظ حیات اکثر موجودات زنده دارد و دارای ساختاری پیچیده متشکل از چندین قسمت متنوع با منشا جنینی متفاوت است (7). یکی از ساختارهای اصلی و بسیار مهم در این سیستم، شبکیه می باشد که نقش مهمی در ادراک بصری بازی میکند و شامل اجزای اولیه مسیرهای بینایی است (8). این ساختار از بخش خارجی لوله عصبی که بهعنوان وزیکول بینایی نامیده می‌شود، منشا میگیرد (9) و از اپیتلیوم رنگدانهدار خارجی و شبکیه عصبی داخلی تشکیل شده است. شبکیه عصبی لایه حساس به نور است و شامل چند نوع سلول بنام گیرندههای نوری (سلولهای استوانهای و مخروطی)، نورونهای هدایتی (سلولهای دو قطبی و سلولهای گانگلیونی شبکیه)، نورونهای داخلی(سلولهای افقی و آماکرین) و سلولهای حمایتی(سلولهای مولر و میکروگلیال) است (10)، این سلولها در سه لایه که از نظر بافتشناسی از هم مجزا هستند، مرتب شدهاند. تکامل صحیح شبکیه، نقش بسیار مهمی در عملکرد سیستم بینایی دارد که بهوسیله فاکتورهای رونویسی و بیان دقیق ژنهای ویژه تنظیم می‌شود. ایجاد نقص یا تاخیر در تکامل هر کدام از این قسمتها میتواند منجر به اختلال در عملکرد سیستم بینایی شود (11).
بیان و عملکرد ژنهای متعددی در انواع مختلفی از سلولها با مراحل رشد و تکوین چشم مرتبط دانسته شده است، مقایسه بیان ژنها، عملکرد و تنظیم آنها در رشد ساختار چشم در بین مهره داران مختلف، حفاظت شگفت انگیزی از مکانیسمهای مولکولی مرتبط را نشان میدهد، در این میان مطالعه فاکتور رونویسی PAX6 بهعنوان یکی از ژنهای اساسی و دخیل، دانسته های ما را از تکوین بخشهای گوناگون سیستم بینایی بالا میبرد. PAX6 برای رشد و تکامل طبیعی بسیاری از ارگانها مانند چشم، مغز و پانکراس ضروری است (12). مطالعات نشان داده است PAX6 بهعنوان یک تنظیمکننده کلیدی تکوین چشم نهتنها در شکلگیری ساختار چشم مهرهداران ضروری است، بلکه برای القای چشم خارجی در حشرات نیز مورد نیاز است (13).
گزارش شده است مصرف کافئین در دوران بارداری با افزایش خطر محدودیت رشد دوران جنینی و سقط خود بهخودی همراه بوده است (14, 15). همچنین اثرات تراتوژنیک مختلف مصرف کافئین در دوران بارداری، از جمله شکاف کام، ناهنجاریهای اندامی و بههم چسبیدن انگشتان (16)، ناهنجاریهای سر و صورت، کاهش استئوسیتها (17)، عقب ماندگی رشد و کاهش توانایی یادگیری (18) به اثبات رسیده است. علاوه بر این کافئین بر عملکرد تطبیقی چشم تاثیر گذاشته (19) و منجر به افزایش مقاومت عروق خونی و کاهش جریان خون در عصب بینایی انسان و کوروئید اطراف شبکیه چشم می‌شود (20).
با توجه به مصرف گسترده ترکیبات گزانتینی بهعنوان عامل طعمآور در انواع خوردنیها، آشامیدنیها و نیز کاربرد آنها در مصارف دارویی، اثرات این ترکیبات بر سیستمهای مختلف بدن مورد توجه محققین بوده است اما از آنجاییکه تحقیقات چندانی در رابطه با اثرات کافئین بر سیستم بینایی بهعمل نیامده، در این تحقیق اثرات جانبی و تراتوژنیک حاصل از کافئین بر سیستم بینایی موشهای بزرگ آزمایشگاهی و نیز مورفولوژی جنین ارزیابی گردید.
مواد و روشها
در این مطالعه تجربی تمامی آزمایشات و تجربیات صورت گرفته بر اساس دستورالعمل کمیته کار با حیوانات آزمایشگاهی دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران طراحی و بهکار گرفته شد. موشهای بزرگ آزمایشگاهی نر و ماده بالغ نژاد ویستار با میانگین وزنی20± 200 گرم از مرکز تکثیر حیوانات آزمایشگاهی دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران تهیه و در شرایط استاندارد با چرخه روشنایی (12 ساعت نور و 12 ساعت تاریکی)، دمای 1± 22 درجه سانتیگراد و رطوبت نسبی50 تا 60 درصد نگهداری شدند. حیوانات در شرایط آزمایشگاهی کنترل شده و قفسهای پلیکربنات به مدت دو هفته سازگار شدند و به آنها اجازه داده شد تا در طول مطالعه آزادانه از آب و پلتهای غذایی استاندارد استفاده کنند، پس از سازگاری با شرایط محیط بهمنظور جفتگیری، دو سر موش ماده بههمراه یک سر موش نر از همان گونه در یک قفس قرار داده شدند. رویت پلاک واژنینال و حضور اسپرم در اسمیر واژنی در صبح روز بعد، نشان دهنده وقوع جفت گیری و تایید بارداری به منزله روز نیم (GD 0.5) بود (21). موشهای بزرگ آزمایشگاهی ماده باردار بهطور اتفاقی به گروههای کنترل و تحت درمان (3 گروه مساوی و در هر گروه 8 سر موش) تقسیم شدند. در گروه کنترل به مقدار 3/0 میلیلیتر سرم فیزیولوژی بهروش داخل صفاقی روزانه تزریق شد و هر یک از گروههای آزمایشی کافئین (Sigma Aldrich) را در دوزهای 50 و 100 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن بهصورت روزانه دریافت کردند. تزریقات از روز نهم بارداری (GD 9) آغاز و تا روز بیستم بارداری (GD 20) ادامه داشت (22). بهطور کلی زایمان موشهای بزرگ آزمایشگاهی در روز 20 و 21 بارداری صورت گرفت. پودر کافئین از شرکت سیگما تهیه شد و از سرم فیزیولوژی (مطابق دستورالعمل) بهعنوان حلال استفاده گردید.
بلافاصله پس از زایمان، تعداد جنینها، وزن بدن، طول سری- نشیمنگاهی، طول دم، فاصله گوش تا پوزه، عرض سر، وجود ناهنجاری ظاهری و جنین مرده در هرگروه محاسبه شد. تقریبا یک سوم رت های تازه متولد شده در هر زایمان ﺑﻪﺻﻮرت ﺗﺼﺎدﻓﯽ اﻧﺘﺨﺎب ﺷﺪه و پس از توزین توسط ترازوی دیجیتالی و اندازهگیریهای مذکور، با دوز بالای ماده بیهوشی (کتامین+زایلازین) کشته شده و ناحیه سر آنها جدا شد. سپس چشمها برداشته و شمارهگذاری شده و در فرمالدئید ده درصد تثبیت شد. بافتهای ﻓﯿﮑﺲ ﺷﺪه در دﺳﺘﮕﺎه ﭘﺮدازش ﺑﺎﻓـﺖ ﻗـﺮار ﮔﺮﻓﺘـﻪ، پس از انجام مراحل آماده سازی و پاساژ بافتی، چشمها درجهت عرضی در پارافین ﻣﺬاب قرار داده شده و قالبگیری شدند. از بافتهای بهدست آمده، برشهای سریال 5 میکرومتری تهیه شد و اسلایدها بهروش رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین مورد رنگ آمیزی بافتی قرار گرفتند.
نوزادان باقی مانده از زایمان در هر گروه در کنار مادران بیولوژیک خود در قفس پرورش یافتند. این نوزادان در روز پنجم پس از تولد کشته شده و بهروش مشابه، جهت
ارزیابیهای ماکروسکوپی، بافت شناسی و مورفومتری مورد استفاده قرار گرفتند.
بهمنظور بررسی اثر کافئین بر مورفولوژی و وزن نوزادان در روزهای اول و پنجم پس از تولد، نمونه ها با استفاده از استریومیکروسکوپ از نظر ظاهری بررسی شدند. همچنین با کمک ترازوی دیجیتال با دقت یک هزارم، وزن جنینها اندازهگیری شد. پارامترهای مورفومتری نیز مانند قد نوزادان براساس طول از فرق سر تا انتهای نشیمنگاه، فاصله گوش تا بینی، طول دم و عرض سر توسط کولیس دیجیتال با دﻗﺖ مورد اﻧﺪازهﮔﯿﺮی قرار گرفت.
بهمنظور انجام مطالعات بافت شناسی و هیستومتری، پس از تثبیت چشم سمت راست، برشهای مناسب و رنگآمیزی شده از بخش خلفی کره چشم با ضخامت 5 میکرون تهیه شد. هر برش شامل کل شبکیه چشم گسترده شده از اوراسراتا در نیمکره گیجگاهی تا اوراسراتا در نیمکره بویایی بود. برشها بهوسیله ی میکروسکوپ نوری متصل به رایانه مورد بررسی قرار گرفتند. بهطور کلی در هر شبکیه سه مورد اندازهگیری زیر انجام شد. در ابتدا ضخامت کلی شبکیه برای هر چشم، بهعنوان فاصله میان اپیتلیوم رنگدانهدار تا غشا صورت پذیرفت. در ادامه تراکم سلولی خطی (تعداد سلول بر یک دهم میلیمتر) در لایه سلولهای گانگلیونی شبکیه، که با شمارش تعداد هسته سلولها در عرض یکدهم میلیمتر محاسبه شد و در انتها ضخامت لایه شبکه داخلی که در واقع فاصلهی بین لایه سلولی هستهدار داخلی تا لایه سلولهای گانگلیونی میباشد. اندازهها توسط نرم افزار Dino Capture برحسب میکرومتر در مقاطع عرضی شبکیه اندازهگیری شده و میانگین آنها برآورد شد (23). برای ارزیابی وضعیت هسته سلولهای پیشساز عدسی از نظر تراکم از رنگ فلورسنت بافتی DAPI استفاده شد (24).
بهمنظور استخراج RNA سلولی جهت انجام Real Time PCR از کیت استخراج RNA (Vivantis,GF-TR-025) استفاده شد و طبق دستورالعمل آن عمل شد. برای تولید cDNA نیز از کیت (vivantis,2steps RT_PCR) استفاده گردید و مطابق پروتکل آن cDNA سنتز شده با دورg 200 ( rpm1200- 130) و بهمدت 1 دقیقه سانتریفوژ شده و ذخیره شد. برای بررسی بیان ژن PAX6از پرایمرهای جدول شماره 1 استفاده شد (25) و بیان ژن بتا اکتین بهعنوان کنترل داخلی اندازهگیری شد (جدول 1).
جدول شماره 1: مشخصات پرایمرهای استفاده شده برای Real-time PCR
|
توالی |
نام الیگونوکلئوتید |
نام ژن |
|
5´-CTGGAGAAAGAGTTTGAGAGG - 3´ |
Forward primer |
PAX6-F |
|
5´-CTGCTGCTGATAGGAATGTG - 3´ |
Reverse primer |
PAX6-R |
|
5´- GCACCACACTTTCTACAATGAG - 3´ |
Forward primer |
ACTINB |
|
5´- GGCATACAGGGACAACACAG - 3´ |
Reverse primer |
ACTINB |
جهت آنالیز آماری دادههای مربوط به بیان ژن PAX6 نرم افزارهای دستگاه Corbett، LinReg PCR استفاده شد. Efficiencyدادهها بررسی شدند و بیان ژن PAX6 مورد ارزیابی قرار گرفت.
آنالیز آماری
دادههای بهدست آمده از اندازهگیری شاخصهای رشد و نیز دادههای کمی بهدست آمده با میکروسکوپ نوری با روش آماری آنالیز واریانس یک طرفه و تست تعقیبی توکی در نرم افزار SPSS نسخه 20 مورد بررسی قرار گرفتند. نتایج به صورت میانگین ± انحراف معیار ارائه گردید و تفاوت میانگینها در سطح 05/0>p معنیدار در نظر گرفته شد.
نتایج
بررسیهایماکروسکوپی
نتایج ماکروسکوپی تجویز کافئین آشکار ساخت که سمیت مادری، سقط و مرگ مادران باردار در هیچ گروهی مشاهده نشد. متوسط تعداد زایمانها در گروه کنترل و گروههای آزمایش مشابه بود. مشاهدات ماکروسکوپی در نوزادان روز اول و پنجم حاکی از تشکیل کره کامل چشم و پلکهای فوقانی و تحتانی در گروه کنترل و گروههای آزمایشی است و آنوفتالمی یا عدم تشکیل کره چشم در هیچیک از گروهها مشاهده نشد. همچنین مطالعات ریختشناسی و ماکروسکوپی نشان داد در گروه کنترل و گروه موشهای باردار دریافت کننده دوز 50 میلیگرم کافئین، همگی نوزادان زنده بهدنیا آمدند. در حالیکه در گروه دریافت کننده 100 میلیگرم کافئین، دربین نوزادان تازه بهدنیا آمده دو سر نوزاد مرده نیز در زایمان دو مادر باردار مشاهده شد، همچنین چند مورد چروکیدگی پوست و خونریزی موضعی در زیر پوست دیده شد. در هیچکدام از گروههای آزمایشی و کنترل ناهنجاریهای اعضایی مانند گوش، گردن و دم مشاهده نشد (شکل 1).
شکل 1: یافتههای ماکروسکوپی. A) حضور نوزاد مرده (مشخص شده با پیکان قرمز) در بین نوزادان که در دو زایمان مشاهده شد و تشکیل چشم در نوزادان تازه بهدنیا آمده (مشخص شده با پیکان آبی). B) نوزادان تازه بهدنیا آمده از گروه دریافت کننده 100 میلیگرم بر کیلوگرم کافئین که چروکیدگی پوست و خونریزی موضعی در برخی از آنها دیده شد.
بررسیهای مورفومتری
بررسیهای مورفومتری نشان داد که وزن نوزادان روز اول و پنجم از موشهای باردار دریافت کننده کافئین بهمقدار 50 و 100 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن در مقایسه با گروه کنترل کاهش معنیدار داشت (05/0>p). در این مقایسه میانگین وزن نوزادان روز اول بین گروههای50 و 100 میلیگرم بر کیلوگرم به لحاظ آماری معنیدار نبود. همچنین تحلیل آماری دادههای کمی حاصل از اندازهگیری طول فرقسری-نشیمنگاهی نوزادان روز اول و پنجم حاصل از موشهای باردار در دو گروه آزمایشی 50 و 100 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن در مقایسه با گروه کنترل کاهش معنیدار نشان داد (05/0>p). اندازهگیریهای مربوط به عرض سر (فاصله بین دو گوش)، فاصله گوش تا بینی و طول دم نیز بهشکل مشابه تفاوت معنیداری در بین نوزادان گروه کنترل با نوزادان روز اول و پنجم گروههای آزمایشی نشان داد (05/0>p). اندازه عرض سر در بین نوزادان روز اول گروه 50 میلیگرم بر کیلوگرم با گروه کنترل به لحاظ آماری اختلاف معنیدار (05/0>p) نداشت (جدول 2).
جدول شماره 2: تاثیر دوزهای مختلف کافئین بر وزن، طول سری-نشیمنگاهی، عرض سر، فاصله گوش تا پوزه و طول دم در روزهای اول و پنجم پس از تولد.
|
پارامترها |
گروهها |
|||
|
کنترل |
50 میلیگرم |
100 میلیگرم |
||
|
وزن (گرم) |
روز 1 تولد |
a 64/0 ±03/8 |
b 81/0 ±29/6 |
b 81/0 ±76/5 |
|
روز 5 تولد |
a 02/1 ±74/12 |
b 22/1 ±21/10 |
c 05/2 ±05/7 |
|
|
طول سری-نشیمنگاهی (سانتیمتر) |
روز 1 تولد |
a 08/0 ±80/4 |
b 15/0 ±10/4 |
c 08/0 ±80/3 |
|
روز 5 تولد |
a 04/0 ±44/5 |
b 03/0 ±95/4 |
c 06/0 ±82/4 |
|
|
عرض سر (سانتیمتر) |
روز 1 تولد |
a 03/0 ±23/1 |
a 01/0 ±20/1 |
c 02/0 ±03/1 |
|
روز 5 تولد |
a 02/0 ±46/1 |
b 02/0 ±32/1 |
c 04/0 ±10/1 |
|
|
فاصله گوش تا بینی (سانتیمتر) |
روز 1 تولد |
a 05/0 ±10/2 |
b 02/0 ±91/1 |
c 03/0 ±75/1 |
|
روز 5 تولد |
a 11/0 ±44/2 |
b 16/0 ±71/1 |
b 13/0 ±66/1 |
|
|
طول دم (سانتیمتر) |
روز 1 تولد |
a 05/0 ±15/2 |
b 02/0 ±86/1 |
c 02/0 ±77/1 |
|
روز 5 تولد |
a 01/0 ±90/2 |
b 02/0 ±69/2 |
c 02/0 ±21/2 |
|
سطح معنیداری (05/0>p) میباشد. حروف انگلیسی نامشابه در یک ردیف نشاندهنده معنیدار بودن است. نتایج بهصورت Mean±SD بیان شده است.
بررسیهای میکروسکوپی هیستومتری و بافتشناسی
در مطالعات میکروسکوپی ناحیه شبکیه چشم، اندازه کلی و ضخامت لایههای مختلف شبکیه و نیز تعداد سلولهای لایه گانگلیونی مورد ارزیابی قرار گرفت (شکل 2).
شکل2: بررسی هیستومورفومتریک شبکیه چشم. A) تصویر برش عرضی شبکیه چشم. ساختار لایههای مختلف شبکیه در گروه کنترل (از راست به چپ تصویر)،NFL : لایه فیبر عصبی، GCL: لایه سلولهای گانگلیونی،IPL : لایه شبکه داخلی، INL: لایه هسته داخلی، OPL: لایه شبکه خارجی،ONL : لایه هستهای خارجی، IS: لایه داخلی فتورسپتور، OS: لایه خارجی فتورسپتور،PE : لایه اپیتلیوم رنگدانه دار. (رنگ آمیزی هماتوکسیلین – ائوزین، بزرگنمایی x400). B) تصویر برش عرضی شبکیه چشم a: ضخامت کلی شبکیهRT (retinal thickness) ، b: ضخامت لایه شبکه داخلی (IPL)، c: تراکم سلولهای لایه گانگلیونی در یکدهم میلیمتر. (رنگ آمیزی هماتوکسیلین – ائوزین، بزرگنمایی x400).
یافتههای هیستومورفومتری شبکیه در گروههای آزمایشی روز اول و پنجم تحت تیمار با کافئین50 و 100 میلیگرم بر کیلوگرم، تغییرات معنیدار هیستوپاتولوژی در مقایسه با گروه کنترل نشان داد (05/0>p). تعداد سلولهای گانگلیونی و ضخامت لایه شبکه داخلی در گروههای آزمایشی روز اول و پنجم تحت تیمار با کافئین50 و 100
میلیگرم بر کیلوگرم به شکل معنیداری نسبت به گروه کنترل کاهش داشت (05/0>p). یافتههای کمی تاثیر کافئین نشان داد که میانگین ضخامت کل شبکیه (RT) در گروههای تحت تیمار با میزان 50 و 100 میلیگرم کافئین در نوزادان روز اول و پنجم بهصورت معنیداری کمتر از گروه کنترل بود (05/0>p)، که بخش عمده این کاهش به دلیل کمتر شدن ضخامت لایه شبکه داخلی (IPL) است (نمودار 1).
نمودار 1: مقایسه میانگین ضخامت کلی شبکیه (RT) بر حسب میلی متر، مربوط به نوزادان روز اول (ستونهای آبی رنگ) و روز پنجم پس ازتولد (ستونهای سبز رنگ) در گروه کنترل و گروههای آزمایشی 50 و 100 میلیگرم بر کیلوگرم کافئین. سطح معنیداری (05/0>p) میباشد.حروف انگلیسی نامشابه در یک ردیف نشاندهنده معنیدار بودن است.نتایج بهصورت Mean±SD بیان شده است.
میانگین اندازه لایه شبکه داخلی نیز نشان داد که کاهش ضخامت این لایه در گروههای آزمایشی روز اول و پنجم
در گروههای دریافت کننده 50 و 100 میلیگرم کافئین نسبت به گروه کنترل معنیدار بود (05/0>p) (نمودار 2).
نمودار 2: مقایسه میانگین اندازه لایه شبکه داخلی (IPL) بر حسب میلیمتر، مربوط به نوزادان روز اول (ستونهای آبی رنگ) و روز پنجم پس ازتولد (ستونهای سبز رنگ) در گروه کنترل و گروههای آزمایشی 50 و 100 میلیگرم بر کیلوگرم کافئین. سطح معنیداری (05/0>p) میباشد.حروف انگلیسی نامشابه در یک ردیف نشاندهنده معنیدار بودن است.نتایج به صورت Mean±SD بیان شده است.
لازم به ذکر است که لایه شبکه داخلی (IPL) یک ساختار غیر سلولی دارد. در عین حال ما تعداد سلولهای گانگلیونی را در لایه سلولهای گانگلیونی (GCL) شمارش شد، نتایج نشان داد تعداد سلولهای گانگلیونی در گروه کنترل نسبت به گروههای آزمایشی روز اول و پنجم دریافت کننده 50 و 100 میلیگرم کافئین کاهش معنیدارداشت (05/0>p) (نمودار 3).
نمودار 2: مقایسه میانگین اندازه لایه شبکه داخلی (IPL) بر حسب میلیمتر، مربوط به نوزادان روز اول (ستونهای آبی رنگ) و روز پنجم پس ازتولد (ستونهای سبز رنگ) در گروه کنترل و گروههای آزمایشی 50 و 100 میلیگرم بر کیلوگرم کافئین. سطح معنیداری (05/0>p) میباشد. حروف انگلیسی نامشابه در یک ردیف نشاندهنده معنیدار بودن است. نتایج به صورت Mean±SD بیان شده است.
همچنین مشاهدات بافت شناسی مشخص نمود که لایههای مختلف تشکیل دهنده شبکیه در گروههای آزمایشی روز اول و پنجم و گروه کنترل بهخوبی شکل گرفته بود با اینحال لایه فیبر عصبی (NFL) دستخوش تغییرات هیستولوژیکی شده و تغییراتی مانند کاهش و آتروفی لایه فیبر عصبی (NFL) در گروههای آزمایشی روز اول و پنجم دریافت کننده 50 و 100 میلیگرم کافئین مشاهده شد (شکل 3).
شکل 3: تغییرات مشاهده شده در لایه فیبرهای عصبی در شبکیه چشم. ضخامت لایه فیبر عصبی در گروه کنترل (A) و گروههای آزمایش تحت تیمار با دوز 50 (B) و 100 (C) میلیگرم بر کیلوگرم کافئین. کاهش ضخامت و آتروفی لایه فیبر عصبی در تصاویر A و B مربوط به گروههای 50 و 100 میلیگرم بر کیلوگرم کافئین مشهود میباشد (رنگ آمیزی هماتوکسیلین – ائوزین، بزرگنمایی x400).
بررسی تاثیر کافئین بر تغییرات رفتاری و شناختی
در مادران باردار دریافت کافئین در طی روزهای نهم تا بیستم بارداری با میزان 50 و 100 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن تغییراتی را در رفتار مادران نشان داد، نتایج مشاهدات حاکی از آن بود که با تزریق مقادیر مربوطه به موشهای باردار، فعالیت حرکتی آنها در پاسخ به تزریق افزایش مییافت. بهطوریکه تا یک ساعت پس از تزریق، این تغییر رفتار در گروه دریافت کننده 100 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن کافئین قابل مشاهده بود. شایان ذکر است یک همبستگی مثبت بین میزان کافئین در دوره پرهناتال و میزان این تغییرات رفتاری وجود داشت و این تغییرات در گروه دریافت کننده 50 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن کافئین، مدت زمان کمتری اتفاق میافتاد اما موشها حالت تهاجمی بیشتری داشتند و در گروه دریافت کننده 100 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن کافئین با حرکات چرخشی رو به عقب و دور قفس همراه بود.
بهعلاوه با افزایش مدت زمان بارداری و سنگینتر شدن وزن مادران، تغییر الگوی رفتاری در گروه دریافت کننده 100 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن کافئین بهصورت واضحتری آشکار گردید.
نتایج رنگآمیزی فلورسنت بافتی DAPI
یافتههای بهدست آمده از رنگآمیزی فلورسنت نیز تاییدی بر مشاهدات میکروسکوپی و رنگآمیزی هماتوکسیلین ائوزین بود، نتایج ما نشان داد که هسته سلولهای پیشساز عدسی در گروه دریافت کننده 100 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن کافئین که بهوسیله رنگ DAPI رنگآمیزی شده بود، با تاخیر از بین رفته و تراکم غیرطبیعی هسته سلولها در بخشهای مرکزیتر عدسی مشاهده شد که اشاره به مهاجرت و ناپدید شدن کندتر سلولهای پیشساز نسبت به گروه کنترل دارد، همچنین حضور سلولهای اپیتلیالی در بخش قدامی و خلفی عدسی در گروه دریافت کننده 100 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن کافئین در مقایسه با گروه کنترل مشاهده شد (شکل 4).
شکل 4: رنگآمیزی فلورسنت بافتی DAPI در مقطع عرضی چشم نوزاد یک روزه موش صحرایی.
A) تصویر مربوط به گروه کنترل، هسته سلولهای اپیتلیالی در بخش قدامی ساختار عدسی دیده می‌شود (پیکان های قرمز رنگ). L: عدسی، C: قرنیه
B) تصویر مربوط به گروه مواجه شده با دوز 100 میلیگرم بر کیلوگرم کافئین در چشم نوزاد یک روزه موش صحرایی، تاخیر در ناپدید شدن هسته سلولها در بخش مرکزی ساختار عدسی. پیکان ها نشان دهنده حضور هسته سلولها در بخشهای مرکزی عدسی هستند. بهعلاوه سلولهای اپیتلیالی در بخش قدامی و خلفی عدسی (پیکانهای قرمز رنگ) دیده می‌شود.
بررسی تغییرات الگوی بیان ژن PAX6 در بافت چشم
بررسی تاثیر کافئین بر بیان ژن PAX6 نشان داد که بافت چشم در وضعیتBase line مقادیری ثابتی از ژن را بیان میکنند که در اثر تیمار با کافئین، تفاوت در روند بیان را شاهد بودیم. همانطور که نشان داده شده است ژن PAX6 در هر دو گروه آزمایشی دریافت کننده 50 و 100 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن کافئین افزایش بیان معنی داری را نشان میدهند (05/0>p).
این درحالی است که افزایش میزان بیان PAX6 در گروه دریافت کننده 100 میلیگرم بر کیلوگرم از کافئین نسبت به گروه کنترل 39/11 برابر بوده و این افزایش معنیدار بود (05/0>p). میزان بیان PAX6در گروه دریافت کننده 50 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن کافئین نیز نسبت به گروه کنترل افزایش داشته و این افزایش66/4 برابر بود (05/0>p). میزان بیان ژن PAX6 در گروه 100 میلیگرم نسبت به 50 میلیگرم نیز افزایشی برابر 03/2 بود (نمودار 4).
نمودار 4: (A) نمودار بیان نسبی ژن PAX6 در گروههای آزمایش تحت تیمار با دوز 50 و (B) 100 میلیگرم بر کیلوگرم کافئین در مقایسه با گروه کنترل، (C) نمودار بیان نسبی PAX6در گروه100 میلیگرم بر کیلوگرم کافئین نسبت به 50 میلیگرم بر کیلوگرم کافئین.
بهعلاوه محصولات حاصل از Real-time PCRروی ژل آگارز برده شد، بـا توجـه بـهوجود تنها یک پیـک بـرای هـر قطعـه ژن در دمـای ذوب منحصــر بــه خــودش،
اختصاصــی بــودن محصــول PCR مشخص شد. جهت تاییـد نتـایج منحنـی ذوب قطعـات تکثیری، محصول Real-time PCR با ژل الکتروفورز آنـالیز شده و نتایج تایید شد (شکل 5).
شکل 5: آنالیز ژل الکتروفورز محصولات حاصل از Real-time PCR، باند چاهکهای PC1 و PC2 بیانگر محصول تکثیری PAX6 در گروه کنترل ،چاهکهای 2-1 گروه50 میلیگرم بر کیلوگرم کافئین و چاهکهای 4-3مربوط به گروه 100 میلیگرم بر کیلوگرم کافئین، باند چاهک NC مربوط به کنترل منفی واکنشها بوده و باند چاهک M سایز مارکر میباشد.
بحث
چشم بهعنوان یک عضو پیچیده و بسیار تکامل یافته حساس به نور بوده و قادر است برآورد دقیقی از شکل، شدت نور و رنگی که از اجسام مختلف منعکس می‌شود را بهعمل آورد. بنابراین اهمیت ویژهای در حفظ حیات اکثر موجودات ایفا میکند. مصرف کافئین توسط مادران در دوره بارداری، نوزادان آنها را در معرض این نوع ترکیبات متیل گزانتین قرار میدهد که با اثرات مضر و تراتوژن متعدد همراه است. در مطالعه حاضر دوز متوسط و زیاد کافئین مورد استفاده قرار گرفت، دوزهای مورد استفاده شامل 50 و 100 میلیگرم بر کیلوگرم بودند. کافئین بهراحتی از جفت عبور کرده و مقادیر زیادی از آن به مایع آمنیوتیک و بندناف رسیده و در ادرار و پلاسمای نوزادان پدیدار می‌شود. علاوه بر این دفع کافئین در جنین و نوزاد تازه متولد شده آهسته است (26)، با توجه به حساسیت شکلگیری جنین در ماههای اولیه، مواجهه جنین با مقادیر زیاد ترکیبات کافئیندار ممکن است به افزایش اثرات زیانآور منجر شده و موجب تاثیر منفی بر ارگانوژنز و تکامل طبیعی جنین شد. از سوی دیگر شایان ذکر است که امروزه در سراسر جهان قهوه و چای بهعنوان نوشیدنی فراگیر و اصلی مردم جایگاه خود را دارا میباشد.
مطالعه ما تائیدی بر گزارشهایی است که محققان در رابطه با مصرف کافئین و ایجاد اختلال و تاثیر بر رشد داخل رحمی، منتشر نمودهاند. تایر و همکارانش (22)، افزایش در میزان ناهنجاریهایی ازجمله شکاف کام و فقدان یک یا چند انگشت در موشهایی که دوز 100 میلیگرم بر کیلوگرم را بهصورت روزانه دریافت میکردند را نشان دادند. علاوه بر این مصرف کافئین در موشهای باردار، بهصورت وابسته به دوز، موجب کاهش وزن بدن و وزن بیضه، کوچکتر شدن بیضهها و درنهایت کاهش توانایی تولید اسپرم نوزادان متولد شده در هنگام بلوغ می‌شود (27). در پژوهشی که فرناندز و همکاران (28) انجام دادند افزایش معنیدار آماری در خطر سقط خودبهخودی و وزن کم هنگام تولد نوزادان در زنان بارداری که بیش از 150 میلیگرم کافئین در روز مصرف میکنند، نشان داده شده است. با توجه به نتایج بهدست آمده از بخش تکوینی پژوهش حاضر که اشاره به کاهش وزن، طول سری-نشیمنگاهی، عرض سر و برخی از شاخصهای رشد بهصورت وابسته به دوز دارد، چنین تصور می‌شود که ترکیبات متیل گزانتینی ازجمله کافئین بر اندامهای حرکتی تاثیر منفی داشته که طی آن مهاجرت سلولی با اشکال روبرو شده و در نتیجه رشد و نمو اندامها با اختلال همراه شده و این ترکیب پورینی که بهخوبی از مادر به جنین در حال تکوین انتقال مییابد، با اثرات منفی خود مانع از رشد بافتهای جنین خواهد شد که یکی از موارد آن کاهش وزن و کوتاهی طول سری-نشیمنگاهی است.
این مطالعه نشان داد که مصرف کافئین در دوران بارداری میتواند علاوه بر القاء ناهنجاریهای معمول منتسب به آن، اختلالات چشمی نیز ایجاد نماید. گروهی از محققین نشان دادند که مواجهه موشهای باردار با کافئین سبب ایجاد تغییراتی در قرنیه چشم ازجمله افزایش ضخامت، افزایش فعالیت میتوزی استرومای قرنیه، فقدان سلولهای اندوتلیال و سلولهای اندوتلیال واکوئله همراه هایپرکروماتینی هسته و پلی مورفیسم می‌شود (26). همچنین اورکلیاوغلو و همکاران (21) به ارزیابی بافتشناسی تاثیر کافئین در طول دوران بارداری بر لنز کریستالی پرداختند و یافتههای آنها، آثار کاتاراکتوژنزیز (دژنراسیون ائوزینوفیلیک، تورم سلولهای عدسی و تجمع مایع) را نشان داد. همچنین در تحقیق دیگری که توسط نویسندگان مقاله انجام شده حضور سلولهای اپیتلیالی در بخش خلفی در عدسی نوزادان یکروزه، اشکال درتغییر ماهیت عدسی و شفاف شدن آن در طی تکامل و تراکم غیرطبیعی سلولها در بخشهای میانی عدسی مشاهده شد (29).
یافتههای مطالعه حاضر نشان داد که اثر تیمار کافئین مادری اختلالات هیستومورفومتری و آتروفیک را در شبکیه چشم در نوزادان تازه متولد شده ایجاد میکند که این تغییرات بهصورت وابسته به دوز در گروههای تحت تیمار همراه بود، بهعلاوه تغییرات دژنراتیو در لایه شبکه داخلی (IPL) نیز بهصورت وابسته به دوز در مقایسه با گروه کنترل مشاهده شد. نتایج نشان داد که بیشتر تغییرات در بخش شبکه داخلی که توسط مویرگهای مشتق از شریان مرکزی عروقدهی میشوند اتفاق افتاده و بخش شبکه خارجی (ONL) که فاقد رگ بوده و اکسیژن و مواد مغذی را توسط عروق کروئید دریافت میکند، کمتر تحت تاثیر قرار گرفته است. این یافتهها پیشنهاد میکند که بخشی از این اختلالات بهدلیل انقباض عروقی ناشی از کافئین در عروق جفتی و کاهش جریان خون مویرگی در طول بارداری رخ میدهد.
بسیاری از مطالعات اثر کافئین بر ارگانهای مختلف را بررسی کردهاند و برخی از مکانیسمهای ممکن برای اثرات مضر آن را به عنوان فرضیه ارائه داده اند.کافئین سطح آدنوزین منوفسفات حلقوی (cAMP) را بهوسیله مهار فسفو دیاستراز افزایش میدهد، بنابراین افزایش cAMP ممکن است با رشد و نمو سلولهای جنینی تداخل داشته باشد (15, 30). کافئین بهعنوان آنتاگونیست آدنوزینی و مهار گیرنده آدنوزین سبب انقباض عروقی و کاهش اکسیژن رسانی می‌شود، انقباض عروقی مصرف کافئین در بارداری باعث کاهش جریان خون جفت و کاهش جریان خونی مغزی می‌شود (31, 32). بهطور مشابه جریان خون در شریان مزانتریک در افراد بالغ و نوزادان تازه متولد شده را کاهش میدهد (33). علاوه بر این گروهی از محققین نشان دادند کافئین سبب کاهش جریان خون ماکولا (34) و شبکیه (35)، یکساعت پس از تجویز خوراکی آن، در مقایسه با مقدار پایه می‌شود. همچنین گروهی نشان دادند کافئین مقاومت عروقی را افزایش و جریان خون را در عصب بینایی و کروئید شبکیه انسان، کاهش میدهد (36). بنابراین این یافتهها پیشنهاد میکند کاهش فشار خون چشمی ممکن است در تاثیر نامطلوب کافئین بهوسیله نکروز ایسکمی-هیپوکسی بافت دخیل بوده و آثاری همچون تاخیر رشد سیستم بینایی ازجمله شبکیه را بهدنبال داشته باشد. در تحقیق حاضر نیز احتمال اینکه عوامل مذکور باعث بروز تغییرات ناشی از کافئین بر ضخامت لایههای مختلف شبکیه و نیز سلولهای لایه گانگلیونی شده باشد، دور از ذهن نیست. علاوه بر این یکی دیگر از مکانیسمهایی که میتوان به آن اشاره کرد آپوپتوزیس سلولهای شبکیه بهواسطه تغییر بیان ژنها میباشد، در شکلگیری سیستم بینایی بیان صحیح ژنهای موثر اهمیت ویژهای دارد، برخی از مهمترین این ژنها شاملSIX3 ,RX ,Otx2 ,Lhx2 ,Pax6 میباشند. بیان صحیح Pax6 در شکلگیری عدسی و شبکیه اهمیت ویژه ای دارد. بنابراین ایجاد اختلال در بیان این ژنها و پروتئینها میتواند منجر به ایجاد اختلال در شکلگیری و تکامل سیستم بینایی شود (11, 37). ممکن است کافئین با اثر بر بیان این ژنها و تغییر الگوی بیان آن، تاثیر خود را بر تکوین ناقص شبکیه القا کرده باشد. میزان صحیح فعالیت PAX6 جهت تکوین ساختار نرمال چشم اهمیت قابل توجهی دارد، پژوهشها نشان دادهاند افزایش بیان PAX6 در موش منجر به شکلگیری فنوتیپهای شدیدی در چشم آنها شده است (38). درحالیکه از سوی دیگر کاهش فعالیت PAX6 در موتاسیونهای هتروزیگوت PAX6، برخی دیگر از فنوتیپها از جمله آنیریدیا (فقدان چشم) را در انسان (39) و فنوتیپ چشم کوچک را در موش و رت بهدنبال داشته است (40). الگوی بیان حفظ شده PAX6 در طی تکوین و نیز مطالعات کاربردی در این زمینه با ایجاد مدلهای دارای موتاسیون، در سالیان اخیر، اشاره به دخالت این فاکتور در طیف گسترده ای از وقایع رشد و نمو نرمال ساختار چشم دارد. در این تحقیق حاضر نیز، نتایج Real time PCR نشان داد که بیان ژن PAX6 در گروه مواجه شده با کافئین نسبت به گروه کنترل افزایش داشته است.
ژنگ و همکاران (41) به بررسی بیان پروتئین PAX6 در جنین جوجه پرداختند که در این بررسی تخم مرغهای لقاح یافته را در معرض مقادیر 5، 10 و 15 میکرومول کافئین در هر تخم مرغ قرار داده و تاثیر کافئین را در رشد نمو بخش بینایی جنین اولیه جوجه، مورفولوژی چشم و بیان پروتئینهای PAX6 و نوروفیلامنت بهروش ایمنوهیستوشیمی بررسی کردند. آنها دریافتند مقادیر زیاد کافئین نهتنها شکلگیری و رشد وزیکول بینایی به شبکیه را تحت تاثیر قرار میدهد، بلکه رشد عدسی چشم را نیز تحت تاثیر قرار داده و همچنین باعث تشکیل چشم نامتقارن شده و رشد استخوان Orbit که یکی از ساختارهای جانبی چشم است را نیز در جوجههای تیمار شده با کافئین دچار اختلال میکند. نتایج تحقیق این گروه نشان داد که بیان پروتئین PAX6 در وزیکول بینایی و اکتودرم عدسی در گروه تیمار با کافئین در مقایسه با گروه کنترل مختل شده و ایجاد کننده دیسپلازی در جنین های 9، 12 و 13 روزه است. بهطوریکه مواجهه با کافئین سبب توزیع گستردهتر بیان پروتئین PAX6 در وزیکول بینایی شده و موفوژنز آن را دچار اختلال مینماید.
نتایج مطالعات نشان دهنده اهمیت دوز و الگوی صحیح بیان PAX6 در شکلگیری صحیح سیستم بینایی دارد. مطالعه دورا و همکاران (42) در سال بیانگر تاثیر دوز PAX6 بر رشد ،ترمیم زخم و تکوین قرنیه میباشد.
گروهی از محققین به سرپرستی دیویز، به بررسی افزایش بیان ژن PAX6 در قرنیه چشم در مدل موش دارای جهش در این ژن پرداختند و نشان دادند که بیان بالای PAX6 در قرنیه، منجر به شکلگیری غیرطبیعی آن، همراه با تغییر مورفولوژی سلولهای اپیتلیالی، نورگزایی (Neovascularization) و تهاجم سلولهای ایمنی می‌شود و در واقع تغییرات عمده این افزایش بیان، در عملکرد سیستم ایمنی، ایجاد عروق و تمایز سلولهای اپیتلیالی در موش ترانسژن میباشد (43).
بهطور مشابه برخی دیگر از مطالعات نیز تاثیر افزایش بیان را حائز اهمیت دانستهاند، بهطوریکه با ایجاد یک مدل موشی ترانسژن، اثرات دوز بیان ژن PAX6 را بر روی تکامل ساختار چشم بررسی نمودند و نتایج تحقیق آنها منجر به آشکار شدن اهمیت سطح بیان PAX6 در شکلگیری نرمال بافت چشم شد. ارزیابی نتیجه تحقیق آنها نشان داد که میزان بیان کم و یا زیاد ژن PAX6، به تشکیل چشمهای غیر طبیعی منجر می‌شود. لذا این امر به حساسیت قابل توجه دوز این ژن روی تکامل صحیح اشاره میکند و بیانگر این موضوع است که بهطور جالب توجه، چشم تنها ارگانی است که توسط اثرات دوز این ژن تحت تاثیر قرار میگیرد، همچنین آنها با بیان این نتایج پیشنهاد کردند که عملکرد PAX6 در این بافت احتمالا مکانیسم متفاوتی دارد و یا تکوین صحیح این ساختار در صورت تغییر الگوی بیان، نیازمند زمان بیشتری خواهد بود . بهعلاوه موتاسیون در ژن PAX6 به تشکیل آنیدریدیا در انسان و چشم کوچک در موش منتج می‌شود (38).
نتایج مطالعه حاضر نیز با گزارشات فوق که بیانگر اهمیت دوز ژن PAX6 هستند، مطابقت دارد. این تحقیق نشان داده است که نه تنها بیان کم این ژن، بلکه افزایش بیان آن نیز میتواند تکوین صحیح ساختار بینایی را با اختلال مواجه نماید. بهطوریکه در نتایج به آن اشاره شد، تیمار با کافئین با میزان 50 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن سبب افزایش الگوی بیان PAX6 نسبت به گروه کنترل شده است. بعلاوه نتایج حاصل از این مطالعه نشان میدهد که این تغییرات بیان در شرایطی که موشهای باردار در معرض میزان 100 میلیگرم بر کیلوگرم از کافئین قرار گرفتند نیز الگوی افزایشی داشته است.
تخریب بافتی بهوسیله استرساکسیداتیو میتواند به تولید رادیکالهای آزاد منتج شود که بهدلیل غلبه رادیکال آزاد بر مهار دفاع آنتیاکسیدانتی بدن در آسیبها میباشد. شبکیه عصبی که شامل غشایی با محتوای اسیدچرب غیراشباع میباشد، میزان مصرف اکسیژن بالایی را در میان بافتهای بدن دارد و به همین دلیل بسیار مستعد به استرساکسیداتیو است، لذا برخی از اثرات سو کافئین ممکن است بهدلیل آسیبهای اکسیدانت باشد، با استناد به نتایج بهدست آمده از پژوهشهای محققین که از یکسو اشاره به مستعد بودن چشم خصوصا شبکیه عصبی به استرساکسیداتیو و معرفی این ساختار بهعنوان یکی از بافتهای پرمصرف اکسیژن دارد و نیز از سوی دیگر ارتباط افزایش قابل توجه اکسیژن فعال (ROS) در بافتها در شرایط حضور کافئین، میتوان اثر محافظتی ویتامین C را به عنوان آنتیاکسیدانت در جلوگیری از اختلال کافئین بر سیستم بینایی مورد توجه قرار داد.
نتیجهگیری
نتایج مطالعه ما نشان داد که کافئین در طی دوران ارگانوژنز نهتنها میتواند سبب کاهش وزن تولد، کاهش رشد، کاهش طول سری- دمی و کاهش عرض سر (تاثیر رشد داخل رحمی جنین) در موش شود، بلکه ناهنجاریهای چشمی را نیز سبب می‌شود. آزمایش حاصل نشان داد که مصرف کافئین در زمان بارداری باعث ایجاد تاخیر و نقص در تکامل سیستم بینایی از جمله شبکیه می‌شود و کافئین این اثرات را میتواند بهوسیله چندین مکانیسم اعمال کند که از جمله این مکانیسمها میتوان به اختلاف افزایشی بیان PAX6 در شرایط تحت تیمار با کافئین اشاره کرد، البته شناخت کاملتر این مکانیسمها به تحقیقات بیشتری نیاز دارد. البته جهت بررسی مکانیسمهای مولکولی، مطالعات تکمیلی دقیقتری نیز توصیه می‌شود.
تشکر و قدردانی
بدین وسیله مراتب قدردانی و سپاس خود را از همکاری و مساعدتهای خانم رضوان باقری و آقای همایون چهری ابراز داشته و از بخش بافت شناسی دانشکده دامپزشکی تشکر مینماییم.
)