نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 کارشناس ارشد ژنتیک، گروه زیستشناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی واحد ورامین–پیشوا، تهران، ایران
2 دکترای ژنتیک مولکولی، گروه زیستشناسی، عضو هیئت علمی دانشگاه آزاد واحد ورامین-پیشوا، تهران، ایران
3 دکترای تخصصی بیوتکنولوژی پزشکی، عضو هیئت علمی انستیتو پاستور، تهران، ایران
چکیده
هدف: در مطالعه حاضر میزان بیان ژنهای مذکور در 30 بیمار مبتلا به سرطان سلولهای غیرکوچک ریه بررسی گردیده است.
مواد و روش-ها: استخراج RNA از بافت توموری و بافت مجاور 30 بیمار مبتلا به سرطان سلولهای غیرکوچک ریه انجام شد. پس از سنتزcDNA ، با روشReal time-PCR بیان ژنهایBeclin1 و LC3 ارزیابی گردید. همچنین میزان بیان این ژنها با یافته‌های بالینی و پاتولوژی بیماران مقایسه شد.
نتایج: در مطالعه حاضر میزان بیان دو ژنBeclin1 (p <0.0001) و LC3 (p <0.0001) افزایش قابل توجهی داشت. همچنین ارتباط معنیداری بین افزایش بیانLC3 بانوع زیرگروه بافتی مشاهده شد (p=0.0171).
نتیجهگیری: افزایش بیان دو ژن Beclin-1و LC3 ممکن است باعث افزایش فرآیند اتوفاژی شود و افزایش فرآیند اتوفاژی میتواند باعث توسعهی تومورزایی گردد که تایید این نتیجه نیاز به تحقیقات بیشتر دارد.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Increased expression of Beclin1 and LC3 genes involved in autophagy in non-small cell lung cancer patients
نویسندگان [English]
- M Akbari-Kelishomi 1
- Sh Karizi 2
- M Karimipoor 3
1 Department of Genetic, Islamic Azad University, Pishva Branch, Varamin, Tehran,Iran(m.akbari404@yahoo.com- 09358586701) (M.Sc
2 Department of Genetic, Islamic Azad University, Pishva Branch, Varamin, Tehran,Iran( shohrehzare@yahoo.com- 091258586701) (ph.D
3 Department of Molecular Medicine, Biotechnology Research Center, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran(mortezakarimi@yahoo.com- 09122806133)
چکیده [English]
Aim: In the present study, the expression of Beclin1 and LC3 genes has been investigated in 30 patients with non-small cell lung cancer.
Material and methods: RNA was extracted from tumor and adjacent normal tissues of 30 patients with non-small cell lung cancer. After synthesis of cDNA, real time-PCR was exploited for quantitative expression of Beclin1 and LC3 genes. Also, the expression of these genes was compared with the clinical and pathological findings of the patients.
Results: the expression levels of Beclin1 (p < 0.0001) and LC3 (p < 0.0001) genes increased significantly. Also, there was a significant correlation between increasing the expression of LC3 with the subtype of tissue (P=0.01).
Conclusion: The increased expression of Beclin-1 and LC3 genes may enhance the process of autophagy and this condition can develop tumorigenesis; however more research is needed to confirm these findings.
کلیدواژه‌ها [English]
- autophagy
- Beclin1
- LC3
- non-small cell lung cancer
مقدمه
سرطان ریه علت اصلی مرگ در اثر سرطان در جهان است (1). در سال 2016، 224390 مورد جدید سرطان ریه (117920 مرد و 106470 زن) در ایالات متحده آمریکا شناسایی شده است. همچنین، تخمین زده شده است حدود 158080 (85920 مرد و 72160 زن) مورد مرگ و میر در اثر این بیماری رخ داده است. پر اهمیتترین سرطانها در ایران سرطان معده، سرطان ریه و سرطان پستان هستند و در سال 2012 در ایران 4361 مرگ بر اثر سرطان ریه گزارش شده است (2). سازمان بهداشت جهانی World Health Organization (WHO) سرطان ریه را از نظر بافتشناسی به دو کلاس بزرگ (سرطان سلولهای کوچک ریه و سرطان سلولهای غیرکوچک ریه) تقسیم می‌کند (3). در سرطان سلولهای کوچک ریه (SCLC) (Small Cell Lung Cancer ) یاخته‌های سرطانی نوع کوچک در زیر میکروسکوپ به شکل جوی دو سر دیده می‌شوند و بههمین دلیل به آن سرطان جو شکل (Oat-shaped) نیز گفته می‌شود. سرطان سلولهای کوچک ریه حدود 13 درصد از سرطانهای ریه را شامل می‌شود. SCLC یک بیماری منحصر بهفرد است که از نظر گرایش برای متاستاز و حساسیت شدید به شروع شیمیدرمانی از NSCLC متمایز می‌شود (4). سرطان سلولهای غیرکوچک ریه (NSCLC) بیش از 85 درصد از سرطانهای ریه را شامل می‌شود (5). سرطان سلولهای غیرکوچک ریه از نظر بافتشناسی به سه نوع کارسینومای سلولهای سنگفرشی (Squamous Cell Carcinoma)(SCC)، آدنوکارسینوما (Adenocarcinoma) (ADC) و کارسینومای سلول بزرگ تقسیم می‌شود (6). با وجود پیشرفتهای قابل توجه در معرفی داروهای جدید و عمل جراحی، پیشآگاهی برای سرطان ریه هنوز ضعیف است و تنها 15 درصد از بیماران مبتلا به سرطان ریه 5 سال پس از تشخیص زنده میمانند، بنابراین تشخیص زودهنگام NSCLC اهمیت بسیاری دارد (7). در طول دوره شکلگیری و پیشرفتNSCLC فاکتورهای زیادی از جمله غیرفعال شدن ژنهای سرکوبگر تومور، اختلال در همئوستازی سلول، موانع حذف اندامکهای سلولی آسیب دیده ، موانع آپوپتوزیس و اتوفاژی (Autophagy) درگیر هستند (8).
اتوفاژی یک مسیر داخل سلولی عمده برای تخریب و بازیافت پروتئینهایی با عمر طولانی و اندامکهای آسیب دیده است که از طریق مسیرهای مختلف شامل ماکرواتوفاژی، میکرواتوفاژی و اتوفاژی بهواسطهی چاپرونها اتفاق میافتد (11،10،9). در ماکرواتوفاژی (که بهعنوان اتوفاژی شناخته می‌شود) بخشی از سیتوپلاسم سلول داخل یک واکوئل تخصصی به نام اتوفاگوزوم فرو میرود که در نهایت با وزیکولهای لیزوزوم برای تخریب مواد مصادره شده ادغام می‌شود (10). اتوفاژی در بسیاری از فرآیندهای فیزیولوژی مثل رشد سلول، پیری، مرگ سلولی، پاسخ استرس و پاسخ ایمنی همچنین در سرطان درگیر است (12،10). تقریبا 30 ژن فرآیند اتوفاژی را تنظیم میکنند که همه‌ی آن‌ها در مخمر کشف شده‌اند و 16 همولوگ آن‌ها در انسان شناسایی شده‌اند (13). در این میان ژنهایBeclin-1 و LC3 نقش محوری در اتوفاژی دارند (10).
Beclin-1 هم در مسیرهای سیگنالینگ و هم در مرحلهی شروع تشکیل اتوفاگوزوم که در آن تعامل با PI3PK و hvp34 ضروری است درگیر است (15،14،10).
LC3 شامل یک فرم محلول LC3I (با وزن مولکولی18Kb) و فرم لیپیدی به نام LC3II (با وزن مولکولی 16Kb) است و بهصورت 3 ایزوفرم (LC3A,LC3B,LC3C) در بافت پستانداران بیان می‌شود که از این میان LC3B با اتوفاژی مرتبط است (15،14). انواع مختلفی از عوامل استرسزا LC3 را به شدت تنظیم میکنند و آن را به فرم سیتوزولیک تبدیل میکنند و تعامل فرم سیتوزولیک (LC3I) را با فسفاتیدیل اتانول آمین برای تشکیل فرمLC3II که بهطور اختصاصی روی اتوفاگوزوم قرارمیگیرد افزایش میدهند، همچنین LC3II تاکنون بهعنوان قابل اعتمادترین مارکر اتوفاژی نیز در نظر گرفته شده است (15،14).
بررسی بیان ژنهای اتوفاژی در بافت‌های سرطان محدود و دارای نتایج بحث برانگیز است، اگرچه بیشتر مطالعات نشان دادهاند که اتوفاژی به سرکوب تومور کمک می‌کند (12). در مطالعه حاضر بیان دو ژن Beclin-1 و LC3 در سطح mRNA در بافت توموری بیماران مبتلا به سرطان سلولهای غیرکوچک ریه بررسی شده است.
مواد و روش‌ها
انتخاب نمونه: نمونه‌ها از بیماران با تشخیص ابتلا به سرطان سلولهای غیرکوچک ریه که هیچ درمانی روی آن‌ها صورت نگرفته بود، توسط پاتولوژیست از بهمن 1394 لغایت مهر 1395 از بیمارستان مسیح دانشوری تهیه شدند و وارد مطالعه شده‌اند. از هر بیمار در اتاق عمل توسط جراح، نمونه توموری و مجاور توموری جدا شد و پس از قرار دادن در کرایوتیوب بلافاصله به تانک ازت منتقل شد و سپس در فریزر 70- درجه سانتیگراد ذخیره شد. تعداد نمونه بیماران در مطالعه حاضر، بر اساس روش pilot study (مطالعه با مقیاس کوچک) در نظر گرفته شد. بر این اساس، حدود 50 نمونه وارد این مطالعه شدند که 20 نمونه در بررسی پاتولوژی، توموری بودن بافت ریهی آن‌ها تایید نشد و از مطالعه خارج شدند و در نهایت با تایید پاتولوژیست 30 نمونه باقی ماند. همچنین از بیماران فرم رضایت نامه دریافت شده است و روند پژوهش نیز به تصویب بورد دانشگاه رسیده است.
استخراج RNA و سنتز cDNA : استخراج RNA توسط ترایزول (Qiagen, USA) از بافت براساس دستورالعمل شرکت انجام شد. سپس توسط دستگاه اسپکتروفوتومتر غلظت RNA با اندازهگیری میزان جذب آن در طول موج 260 نانومتر سنجیده شد. همچنین کیفیت RNA استخراج شده نیز توسط اندازهگیری نسبت جذب 280/260 سنجیده شد. سپس RNA تا زمان استفاده در فریزر 70- درجه سانتیگراد قرار داده شد.
سنتز cDNA توسط کیت فرمنتاز انجام شد. بر این اساس ابتدا با توجه به غلظت RNA استخراج شده مقدار 1000 نانوگرم از آن وارد واکنش شد. سپس مقدار 1 میکرولیتر پرایمر رندوم هگزامر (120ul) (Fermentas, USA) اضافه شد و باDEPC-treated water (Fermentas, USA) به حجم 13 میکرولیتر رسانده شد. بهمدت 5 دقیقه در 65 سانتیگراد انکوبه شد و روی یخ سرد شد. در مرحله بعد میزان 4 میکرولیتر بافر5X و 5/0 میکرو لیترآنزیم Ribo Lock RNAse inhibitor (10000u) (Fermentas, USA)، 2 میکرولیتر (Fermentas, USA) dNTP Mix 10mM و 5/0 میکرولیتر (Fermentas,USA) RevertAidReverse Transcriptase (2500u) اضافه شد و بهمدت 5 دقیقه در دمای 25 درجه سلسیوس و بعد 60 دقیقه در دمای 45 درجه سانتیگراد و سپس 5 دقیقه در دمای 70 درجه سانتیگراد انکوبه شد. در نهایت، cDNA سنتز شده در دمای 20- درجه سانتیگراد ذخیره شد.
واکنش real- timePCR کمی: مطالعه میزان بیان ژنهای Beclin-1و LC3 با استفاده از روش real-time PCR نسبی و مسترمیکس سایبرگرین 2X (شرکت امپیلیکون) انجام شد. در مطالعه حاضر از ژن GAPDH بهعنوان ژن مرجع استفاده شد. اطلاعات مربوط به پرایمرها در
جدول 1 آورده شده است، در این مطالعه طراحی پرایمر نیز توسط نرم افزار Gene runner انجام گرفته است.
جدول 1: توالی پرایمرها برای تکثیر ژنهای هدف
|
اندازه محصول(bp) |
دما ( ) |
محل توالی |
5´ 3´ |
ژنهای هدف |
شماره شناسایی |
|
|
190 |
39/59 |
298-279 |
CAAGATCCTGGACCGTGTCA |
Forward |
Beclin1 |
NM_003766.4 |
|
58/59 |
468-445 |
GGCACTTTCTGTGGACATCATC |
Reverse |
|||
|
193 |
62/59 |
196-177 |
TACAGCAGATACGCGACCAG |
Forward |
LC3 |
NM_181509.2 |
|
25/60 |
369-350 |
TTCACCAGCAGGAAGAAGGC |
Reverse |
|||
|
112 |
4/68 |
1109-1087 |
ACACCCACTCCTCCACCTTTG |
Forward |
GAPDH |
NM_001256799.2 |
|
4/68 |
1200-1178 |
TCCACCACCCTGTTGCTGTAG |
Reverse |
|||
حجم کلی واکنش 20 میکرولیتر شامل مسترمیکس سایبرگرین2X، پرایمرها (5 پیکومول)،cDNA و آب تزریقی جهت به حجم رساندن، است. تمام نمونه‌ها بهصورت دوپلیکیت گذاشته شدند. برنامهی دمایی سیستم شامل دو مرحله بود، در مرحلهی آغاز دمای 95 درجه سانتیگراد بهمدت 15 دقیقه برای فعال شدن آنزیم، سپس 40 سیکل شامل دناتوره شدن در دمای 95 درجه سانتیگراد بهمدت 30-15ثانیه و اتصال پرایمرها در دمای 60 درجه سانتیگراد بهمدت 1 دقیقه استفاده شد. بعد از تکثیر از آنالیز منحنی ذوب نیز برای تعیین اختصاصیت تکثیر انجام شده، استفاده شد. واکنش real- time PCR در دستگاه StepOnePlus(Applied Biosystems, USA) انجام شد. پس از تعیین کارایی تکثیر هر یک از پرایمرها توسط نمودار استاندارد، بیان ژنهای مورد نظر سنجیده شد.
آنالیز آماری
میزان تغییرات بیان ژنها نیز بر اساس فرمول سنجیده شد. جهت آنالیز آماری دادهها از نرمافزار Graphpad Prism5 استفاده شد. همچنین معنادار بودن دادهها براساس آزمون t-test (p ≤ 0.05) ارزیابی شد.
نتایج
در
نمودار 1 و نمودار2 میزان تغییرات بیان هر یک از ژنها در هر یک از نمونههای توموری بهصورت جداگانه ارائه شده است. همان‌طور که مشاهده می‌شود بیان ژن Beclin1 در تمامی نمونه‌ها از حدود 2 تا 587 برابر افزایش بیان معنیداری (p<0.0001) داشته است و بیان ژن LC3 نیز در تمام نمونه‌ها بهجز 1 نمونه از 3 تا حدود 1545 برابر افزایش بیان معنیداری (p<0.0001) را نشان میدهد. همچنین، بر اساس آنالیز دادهها ارتباط معنیداری بین میزان افزایش بیان دو ژن،Beclin1 و LC3 با همدیگر در بافت توموری NSCLC یافت شد (p<0.05) (نمودار).
نمودار 1: میزان بیان ژن Beclin1 در هر یک از نمونههای توموری، همان‌طور که در نمودار نشان داده شده است بیان ژن Beclin1 در همه‌ی نمونههای توموری افزایش یافته است.
نمودار2: میزان بیان ژن LC3 در هر یک از نمونههای توموری؛ همان‌طور که در نمودار نشان داده شده است بیان ژن LC3 در همه‌ی نمونههای توموری به جز یک نمونه افزایش یافته است.
نمودار3: ارتباط بین میزان افزایش بیان ژنهایBeclin1 و LC3 در نمونههای توموری؛ ارتباط معناداری (p<0.05) بین میزان افزایش بیان دو ژن،Beclin1 و LC3 باهمدیگر در بافت توموری NSCLC وجود دارد. این ارتباط بدین معنا است که افزایش بیانBeclin1 روی بیانLC3 نیز تاثیر میگذارد و باعث افزایش بیان آن نیز می‌شود.
در این مطالعه ارتباط بین میزان بیان هر یک از ژنها با علائم بالینی و پاتولوژیکی بیماران از جمله: نوع زیرگروه بافتی، استعمال یا عدم استعمال دخانیات، مرحلهی بیماری و میزان درگیر شدن غدد لنفاوی نیز بررسی شده است (جدول2).
جدول2: علائم بالینی و پاتولوژیکی بیماران، دستهبندی علائم بالینی و پاتولوژیکی بیماران و درصد بیماران موجود در هر گروه.
|
علائم بالینی و پاتولوژیکی بیماران |
زیر گروه |
|
زیرگروه بافتی |
57% بیماران مبتلا به آدنوکارسینوما |
|
43% مبتلا به سرطان سلول سنگفرشی |
|
|
مرحلهی بیماری |
66% بیماران، بیماری آن‌ها در مرحلهی I و II |
|
34% بیماران، بیماری آن‌ها در مرحله III |
|
|
جنسیت |
27% زن |
|
73% مرد |
|
|
سن |
3% زیر 40 سال |
|
3% بین 40 تا 50 سال |
|
|
47% بین50 تا 60 سال |
|
|
47% بالای 60 سال |
|
|
استعمال دخانیات |
73% غیرسیگاری |
|
27% سیگاری |
بیماران مبتلا به سرطان سلولهای غیرکوچک ریه از نظر مرحلهی بیماری به چهار گروه I، II، III و IV تقسیم بندی می‌شوند. در مطالعه حاضر بیماران مرحلهی IV مورد بررسی قرار نگرفتند، زیرا این بیماران معمولا دارای متاستاز به نقاط دور مانند مغز، کبد و استخوان بوده و جراحی نمیشوند. علاوه بر این بهدلیل تعداد کم نمونه‌ها، نمونه بیمارانی که در مراحل I و II بودند در یک گروه و بیمارانی که در مرحله III بودند در گروه دیگر قرار داده شدند. بر طبق نتایج آزمون t-test تفاوت معنیداری بین میزان بیان ژنهای Beclin1 (p=0.3753) وLC3 (p=0.7248) با مرحلهی بیماری یافت نشد (جدول2).
همچنین در مطالعه حاضر افرادی که گرههای لنفاوی آن‌ها درگیر نشدهاند در یک گروه (negative lymph node) و بیمارانی که گرههای لنفاوی آن‌ها چه در یک سمت و چه در دو سمت درگیر شده‌اند در یک گروه (positive lymph node) قرار داده شدند. بر طبق نتایج حاصل از آزمون t-test تفاوت معنیداری بین میزان بیان
ژنهای Beclin1 (p=0.5630) وLC3 (p=0.9982) با درگیری غددلنفاوی یافت نشد (جدول2).
تفاوت معنیداری بین میزان بیان ژنBeclin1 با نوع زیرگروه بافتی نیز یافت نشد (p=0.8318) ولی در مقابل تفاوت معناداری (p=0.0171) بین میزان بیان ژن LC3 با زیر گروه بافتی یافت شد (
نمودار ) (جدول2).
نمودار 4: ارتباط میزان بیان ژنهایBeclin1 وLC3 با زیرگروه بافتی، تفاوت معنیداری بین میزان بیان ژنBeclin1 با نوع زیرگروه بافتی نیز یافت نشد (p=0.8318) ولی در مقابل تفاوت معناداری (p=0.0171) بین میزان بیان ژن LC3 با زیر گروه بافتی یافت شد.
در مطالعه حاضر ارتباط بین میزان بیان ژنهایBeclin1 وLC3 با سیگاری بودن یا نبودن بیماران بررسی شد که ارتباط معنیداری بین میزان بیان ژنهایBeclin1 (p=0.7268) وLC3 (p=0.8293)با سیگاری بودن یا نبودن بیماران یافت نشد(جدول2).
بحث
NSCLC بیش از 85 درصد از سرطانهای ریه را شامل می‌شود و شیمیدرمانی، گزینه درمانی مناسب برای بیماران NSCLC است. با اینحال، حتی در بهترین شرایط نرخ پاسخ تنها 30 تا 50 درصد است. این پاسخ ضعیف در شیمیدرمانی به شکست در درمان سرطان ریه منجر می‌شود. یکی از عوامل موثر در ایجاد سرطان ریه اختلال در فرآیندهای سلولی مثل اتوفاژی است. اتوفاژی در سلولهای سرطانی دارای دو عملکرد است، هم بهعنوان سرکوب کننده تومور نقش ایفا می‌کند و هم از بقای سلولهای توموری حمایت می‌کند. قبل از پیشرفت تومور، اتوفاژی پیشرفت تومور را سرکوب می‌کند. در حالیکه، زمانی که تومور شروع به پیشرفت می‌کند، اتوفاژی از بقای سلول توموری حمایت می‌کند (15).
مطالعات نشان دادهاند اتوفاژی در پاسخ به درمان سرطان توسط کمک به افزایش مقاومت به درمان از سلولهای
توموری حمایت می‌کند. اتوفاژی میتواند هدف درمانی برای سلولهای تومور باشد. ژنهای انتخاب شده ژنهایی هستند که در مسیر اتوفاژی نقش کلیدی دارند و اختلال در بیان آن‌ها در بسیاری از سرطانها دیده شده است. بنابراین دانستن الگوی بیان این ژنها در سلولهای سرطانی ریه، با توجه به اهمیت بالای این سرطان، میتواند زمینهای را برای انجام سایر تحقیقات در جهت رسیدن به درمانهای هدفمند فراهم کند. بدینمنظور در تحقیق حاضر بیان دوژن دخیل در مسیر اتوفاژی شاملBeclin-1 و LC3 در نمونههای توموری 30 بیمار مبتلا به NSCLC بررسی شد.
Beclin-1 اولین ژن اتوفاژی پستانداری است که کشف شده و بهطور مستقیم با پروتئین BCL2تعامل دارد (16). Beclin-1 به طور مثبت اتوفاژی را توسط همکاری با PI3KCIII/Vps34 و دیگر کوفاکتورهای مثبت و منفی مثل Vps15، ATG14L/Barkor، UVRAG، Bif-1، Rubicon، Ambra1، HMGB1، Survivin، Akt و Bcl-2/Bcl-Xl تنظیم می‌کند (16).
در تحقیق حاضر مشاهده شد که میزان بیان Beclin-1 در بافت سرطان سلولهای غیرکوچک ریه در مقایسه با بافت نرمال مجاور آن افزایش پیدا کرده است. همچنین در تحقیق حاضر هیچ ارتباط معنیداری بین میزان افزایش بیان Beclin-1 با علائم بالینی و پاتولوژیکی بیماران از جمله نوع زیرگروه بافتی (آدنوکارسینوما یا سلولهای سنگفرشی)، استعمال یا عدم استعمال دخانیات (مثل سیگار)، مرحلهی سرطان (مرحله I، II و III) و درگیر شدن غدد لنفاوی بیماران یافت نشد که نتیجهی حاصل بدین معنا است که در نمونههای مورد بررسی وجود این علائم باعث افزایش میزان بیان ژن Beclin-1 نشده است. سایر محققین نیز در این زمینه مطالعاتی داشتهاند. Masuda و همکاران (17) با روش ایمونوهیستوشیمی میزان بیان ژن Beclin-1 را در510 نمونه توموری معده بررسی کردند و مشاهده کردند که میزان بیان Beclin-1 در 126 نمونه از 510 نمونه افزایش پیدا می‌کند و بیان نمودند این افزایش بیان ارتباط معنیداری با متاستاز غدد لنفاوی، تهاجم عروقی و متاستاز کبدی دارد. Wu و همکاران (18) نیز با روش ایمونوهیستوشیمی میزان بیان ژن Beclin-1 را در 242 نمونه توموری رودهی بزرگ بررسی و مشاهده کردند که میزان بیان Beclin-1 در 50 درصد نمونه‌ها افزایش پیدا کرده است که ارتباط معنیداری با علائم بالینی نیز ندارد. طبق این مطالعه میتوان افزایش بیان Beclin-1 را به چند روش تفسیر کرد: در طول توسعه و پیشرفت سرطانها، سلولهای سرطانی اغلب در معرض استرس متابولیک مثل کمبود مواد مغذی یا اکسیژن بهدلیل نرخ تکثیر بالا و کمبود عروق هستند، درنتیجه افزایش بیان Beclin-1 ممکن است اتوفاژی را تحریک کند، درنتیجه بقای سلولها را از طریق ترویج عروق افزایش میدهد و از سلولهای سرطانی در برابر مداخلههای درمانی حفاظت می‌کند. البته در بعضی مطالعات سرطان ریه، کاهش بیان ژن Beclin-1 مشاهده شده است. Jiang و همکاران (19) با روشهای ایمونوهیستوشیمی، وسترن بلات و Real-time PCR میزان بیان ژن Beclin-1 را در بافت NSCLC در 142 نمونه توموری بررسی کردند و مشاهده کردند که میزان بیان Beclin-1 در سطح پروتئین و mRNA کاهش پیدا کرده است و این کاهش بیان ارتباط معنیداری با بافت شناسی و تمایز دارد. همچنین Zhou و همکاران (20) نیز با روش ایمونوهیستوشیمی میزان بیان ژن Beclin-1 را در NSCLC در 244 نمونه توموری بررسی کردند و مشاهده کردند که میزان بیان Beclin-1 کاهش پیدا کرده و این کاهش بیان با افزایش تومورزایی نیز ارتباط دارد.
تناقض بین نتایج مطالعه حاضر و مطالعات فوقالذکر میتواند بهدلیل جامعهی کوچک مورد بررسی در تحقیق حاضر و نوع روش مورد استفاده در تحقیقات فوقالذکر باشد. زیرا در روش ایمونوهیستوشیمی میزان بیان پروتئین بررسی می‌شود و این احتمال وجود دارد که با اینکه میزان بیان mRNA افزایش یافته است ولی تمامی این mRNAها بهدلیل وجود عوامل مهارکننده به پروتئین تبدیل نشدهاند، در نتیجه میزان بیان ژن مورد نظر در سطح پروتئین با کاهش مواجه شده است. جالب توجه است که در سرطان رودهی بزرگ، در دو مطالعهی جداگانه هم کاهش بیان و هم افزایش بیان در Beclin-1 گزارش شده است (21).
چندین مکانیسم وجود دارد که توضیح میدهد چگونه تحریک اتوفاژی توسط Beclin-1 از سرطان جلوگیری می‌کند.
- مرگ سلولی که به واسطهی اتوفاژی رخ میدهد.
- اتوفاژی میتواند ارگانهای آسیب دیده را حذف کند بدین وسیله منابع تولید کننده مواد سمی مثل محصولات حاصل از آسیب DNA حذف می‌شوند. درنتیجه این عملکرد از استرس اکسیداتیو حاصل از آسیب ارگانها جلوگیری می‌کند (21).
LC3 شامل یک فرم محلول LC3I و فرم لیپیدی LC3II است (22). زمانی که اتوفاژی رخ میدهد فرم سیتوپلاسمی LC3 (LC3I) بهفرم غشایی اتوفاژیک LC3 (LC3II) که روی اتوفاگوزوم قرار میگیرد، تبدیل می‌شود. این تبدیل بهنظر میرسد با فعالیت اتوفاژی مرتبط باشد، در واقع LC3 در مرحلهی طویل سازی تشکیل اتوفاگوزوم نقش دارد (23). تغییرات در بیان LC3 در سرطانهای مختلف با نوع تومور و مرحلهی سرطان مرتبط است (24). در تحقیق حاضر مشاهده شد که میزان بیان LC3 در بافت سرطان سلولهای غیرکوچک ریه در مقایسه با بافت نرمال مجاور آن افزایش پیدا کرده است. ارتباط معنیداری (p=0.0171) بین میزان افزایش بیان LC3 با نوع زیرگروه بافتی (آدنوکارسینوما یا سلولهای سنگفرشی) یافت شد که این بدین معنی است که بیان LC3 در نمونههایی با NSCLC نوع آدنوکارسینوما نسبت به نوع سلول سنگفرشی افزایش بیشتری مییابد. گروهی از محققین بیان نمودهاند که افزایش بیان LC3 با متاستاز غدد لنفاوی، رگزایی ومتاستاز کبدی در ارتباط است و افزایش بیان LC3 باعث پیشآگهی ضعیف در سرطان پانکراس و ملانوما بوده است (25). سایر محققین نیز در این زمینه مطالعاتی داشتهاند از جمله: Masuda و همکاران (17) با روش ایمونوهیستوشیمی میزان بیان ژن LC3 را در 510 نمونه تومورری معده بررسی کردند و مشاهده کردند که میزان بیان این ژن در 79 نمونه از 510 نمونه افزایش یافته است و همچنین دریافتند که این افزایش بیان با متاستاز غدد لنفاوی، تهاجم عروقی و متاستاز کبدی مرتبط است. Huang و همکاران (26) با روش ایمونوهیستوشیمی میزان بیان ژن LC3 را در کارسینومای غدد بزاقی در 74 بیمار مبتلا به کارسینوم غدد لنفاوی و 12 آدنومای پلئومورفیک و 18 نمونه ترمال بررسی کردند و افزایش بیان قابل توجهی را در این ژن مشاهده کردند و همچنین مشاهده کردند که این افزایش بیان با سرطان زایی و پیشرفت سرطان مرتبط است. Wu و همکاران (18) نیز با روش ایمونوهیستوشیمی میزان بیان ژن LC3 را در سرطان رودهی بزرگ در 242 نمونه مورد بررسی قرار دادند و مشاهده کردند که میزان بیان این ژن در 20 درصد نمونه افزایش مییابد. این افزایش بیان با تمایز سلولی مرتبط است.
در واقع زمانی که بیان ژن Beclin-1 افزایش مییابد، بهعنوان شروع کنندهی فرآیند اتوفاژی، باعث افزایش فرآیند اتوفاژی و همچنین افزایش بیان سایر ژنهای موجود در این مسیر ازجمله LC3 می‌شود. از سویی دیگر در شرایط کمبود مواد مغذی و استرس، mTOR غیرفعال می‌شود، درنتیجه اثر مهاری آن از روی ULK1 برداشته شده و درنتیجه فعالیت ULK1 افزایش مییابد و باعث افزایش فرآیند اتوفاژی و افزایش بیان سایر ژنهای موجود در این مسیر ازجمله LC3 می‌شود. همچنین ULK1 با تاثیری که بهطور غیرمستقیم بر LC3 دارد باعث افزایش تبدیل LC3I به LC3II شده و درنتیجه باعث افزایش فرآیند اتوفاژی می‌شود. بههمین دلیل افزایش فرآیند اتوفاژی و افزایش بیان ژنهای درگیر در این مسیر در بافت‌های سرطانی به جهت تامین نیاز سلول در شرایط بحرانی قابل توجیه است (27).
همچنین همان‌طور که گفته شد براساس آنالیز دادهها ارتباط معنیداری (p<0.05) بین میزان افزایش بیان دو ژن،Beclin1 و LC3 باهمدیگر در بافت توموری NSCLC یافت شد (نمودار). این ارتباط بدین معنا است که افزایش بیانBeclin1 روی بیانLC3 نیز تاثیر میگذارد و باعث افزایش بیان آن نیز می‌شود، به این دلیل کهBeclin1 شروع کنندهی مسیر اتوفاژی است در نتیجه زمانی که میزان بیان آن افزایش مییابد، فرآیند اتوفاژی آغاز می‌شود. انتظار میرود میزان بیانLC3 نیز بهعنوان یکی از مهرههای کلیدی در میانهی این مسیر افزایش یابد.
درنهایت، با استفاده از بررسی میزان بیان سایر ژنهایی که در این مسیر فعالیت میکنند. بررسی عوامل موثر مانند microRNAها بر این ژنها میتوان زمینه را برای درمانهای هدفمند فراهم کرد. همچنین با بررسی میزان بیان Beclin-1 و LC3 در سطح پروتئین میتوان بهطور قطع بیان کرد که بیان آن‌ها در فرآیند اتوفاژی افزایش یا کاهش مییابد.
نتیجهگیری
در تحقیق حاضر مشاهده گردید که میزان بیان دو ژن Beclin-1 و LC3 در بافت سرطان سلولهای غیرکوچک ریه نسبت به بافت نرمال مجاور آن افزایش قابل توجهی مییابند. این افزایش بیان ممکن است باعث افزایش فرآیند اتوفاژی شود و افزایش فرآیند اتوفاژی میتواند باعث توسعه ی تومورزایی گردد که تایید این نتایج نیاز به تحقیقات بیشتر در این زمینه دارد.
تشکر و قدردانی
این مقاله بخشی از پایاننامه دانشجویی در مقطع کارشناسی ارشد میباشد که با حمایت دانشگاه آزاد اسلامی واحد ورامین-پیشوا به انجام رسیده است، بدین وسیله از کلیهی افرادی که ما را در انجام این تحقیق یاری کردند تشکر و قدردانی می‌شود.
- Boolell V, Alamgeer M, David N, Ganju V. The Evolution of Thrapies in Non-Small Cell Lung Cancer. Cancer (Basel). 2015; 7(3): 1815-1846.
- Ettinger DS, Wood DE, Akerley W, Bazhenova LA, etal. . NCCN Guidelines Insights: Non-Small Lung Cancer, Version 4.2016 JNCCN 2016; 14(3): 255-264.
- Travis D, Brambilla E, Noguchi M, Nicholson A, etal. International Association for the Study of Lung Cancer/American Thoracic Society/European Respiratory Society International Multidisciplinary Classification of Lung Adenocarcinoma.JTO. 2011; 6 (2): 244–285.
- Pillai RN, Owonikoko TK. Small Cell Lung Cancer: Therapies and Targets. SeminOncol .2014; 41(1): 133-142.
- Boolell V, Alamgeer M, David N, Ganju V. The Evolution of Thrapies in Non-Small Cell Lung Cancer. Cancer. 2015; 7(3): 1815-1846.
- Larsen JE, Minna, JD. Molecular Biology of Lung Cancer: Clinical Implications. Clin Chest Med. 2011; 32(4): 730-740
- Wang A, Kubo J, Luo J, Desai M, etal. ACtive and passive smoking in relation to lung cancer incidence in the women’s health initiative observational study prospeCtive cohort. Ann Oncol. 2015; 26(1): 221–30.
- Aita VM, Liang XH, Murty VV, Pincus DL, etal. Cloning and genomic organization of beclin 1, acandidate tumorsuppressor gene on chromosome 17q21. Genomics. 1999; 59(1): 59-65.
- Toton E, Lisiak N, Sawick M, Rybczynska M. Beclin-1 and it’s role as a target for anticancer therapy. J Physiol Pharmacol. 2014; 65(4): 459-467.
10.Eskelinen EL, Saftig P. Autophagy: a lysosomal degradation pathwaywith a central role in health and disease. BiochimBiophysActa. 2009; 1793(4): 664-73.
11. Yu L, Strandberg L, Lenardo MJ. The selectivity of autophagy and itsrole in cell death and survival. Autophagy .2008; 4(5): 567-73.
12. Bialik S, Kimchi A. Autophagy and tumor suppression: recentadvances in understanding the link between autophagic cell deathpathways and tumor development. AdvExp Med Biol. 2008; 615: 177-200.
13. Bialik S, Kimchi A. Autophagy and tumor suppression: recentadvances in understanding the link between autophagic cell deathpathways and tumor development. AdvExp Med Biol. 2008; 615: 177-200.
14. Kabeya Y, Mizushima N, Ueno T, etal. LC3, a mammalianhomologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. Embo J. 2000; 19(21): 5720-8.
15. Klionsky DJ, Abeliovich H, Agostinis P, Agrawal DK, etal. Guidelines for the useand interpretation of assays for monitoring autophagy in highereukaryotes. Autophagy. 2008; 4(2): 151-75.
16. Yang Sun, MD, Zhi-Lan Peng. Autophagy, Beclin 1, and Their Relation To Oncogenesis. LABMEDICIN. 2008; 39(5): 287–290
17. Masouda G, Yashiro M, Kitayama K, Miki Y, etal. ClinicopathologicalCorrelations of Autophagyrelated Proteins LC3, Beclin 1 and p62 in GastricCancer. Anticancer Res. 2016; 36 (1): 129-136
18. Wu S, Sun C, Tian D, Li Y,Gao X, etal. Expression and clinical significances of Beclin-1, LC3 and mTOR in coloreCtal cancer. Int J ClinExp Pathol. 2015; 8(4): 3882-3891
19. Jiang L, Liang X, Liu M, Wang W, etal. Reduced expression of liver kinase B1 and Beclin-1 is associated with the poor survival of patients with non-small cell lung cancer. oncology reports .2014; 32(5): 1931-1938.
20. Zhou S, Zhao S, Kuang M, Zhang B, etal. Autophagy in tumorigenesis and cancer therapy: Dr. Jekyll or Mr. Hyde?. Cancer Lett. 2012; 323(2): 115–127.
21. Won KY, Kim GY, Lim SJ, Kim YW. Decreased Beclin-1 expression is correlated with the growth of the primary tumor in patients with squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the lung. Human pathology. 2012; 43:62-68.
22. Kabeya Y, Mizushima N, Ueno T, Yamamoto A, etal. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. The EMBO Journal. 2000; 19(21): 5720-5728.
23. Mathew R, Kongara S, Beaudoin B, Karp CM, etal. Autophagy suppresses tumorprogression by limiting chromosomal instability. Genes Dev. 2007; 21(11): 1367–1381.
24. Marino G, Salvador-Montoliu N, Fueyo A, Knecht E, etal. Tissue-specific autophagy alterations and increased tumorigenesis in mice deficient in atg4c/autophagin-3. JBiolChem. 2007; 282(25): 18573–18583.
25. Cao Q, Liu F, Yang Z, Fu X, etal. Prognostic value of autophagy related proteins ULK1, Beclin 1, ATG3, ATG5, ATG7, ATG9, ATG10, ATG12, LC3B and p62/SQSTM1 in gastric cancer. Am J Transl Res. 2016; 8(9): 3831-3847.
26. Huang C, Deng W, Zhang L, Zhang W, etal. Expression of LC3, LAMP2, KEAP1 and NRF2 in Salivary Adenoid Cystic Carcinoma. Pathol Oncol Res. 2016; 22(1): 109–114
27. Chen Y, He J, Tian M, Zang Y, etal. UNC51-like kiase 1, autophagic regulator and cancer therapeutic target. Cell Prolif. 2014; 47(6): 494-505.
)