نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه اراک، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، اراک، ایران
2 دانشگاه تهران، دانشکده زیست‌شناسی، گروه فیزیولوژی جانوری، تهران، ایران
چکیده
هدف: این پژوهش با این هدف انجام شد تا مشخص نماید که آیا سیلیمارین قادر است اثرات مخرب آلومینیوم را بر روی قابلیت حیات، قابلیت تحرک و پتانسیل غشای میتوکندری اسپرم قوچ مهار کند.
مواد روش‌ها: اسپرمهای اپیدیدیمی قوچ فراهانی به پنج گروه 1- اسپرمهای لحظه صفر، 2- اسپرمهای لحظه 180 دقیقه (کنترل)، 3- اسپرمهای تیمار شده با آلومینیوم کلراید (0.5 mM) بهمدت180 دقیقه 4- اسپرمهای تیمار توام آلومینیوم کلراید (0.5 mM) + سیلیمارین (0.5 µM) بهمدت 180 دقیقه و 5- اسپرمهای تیمار شده با سیلیمارین بهمدت 180 دقیقه تقسیم شدند. برای بررسی قابلیت حیات و پتانسیل غشای میتوکندری به‌ترتیب از سنجش MTT [3 – (4,5- dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] و رنگ آمیزی رودامین 123 استفاده شد در حالی‌که قابلیت تحرک بر اساس دستورالعمل سازمان بهداشت جهانی انجام گرفت. دادهها با استفاده از آنالیز واریانس یکطرفه مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت.
نتایج: تیمار اسپرمها با آلومینیومکلراید 5/0 میلیمولار بهمدت 180 دقیقه درصد قابلیت حیات، حرکت پیشرونده اسپرمها و پتانسیل طبیعی غشای میتوکندری را در مقایسه با گروه کنترل بهطور معنیداری کاهش داد. همچنین این آلاینده بهطور معنیداری موجب افزایش حرکات درجا و ساکن اسپرمها نسبت به گروه کنترل شد. در گروه سیلیمارین+آلومینیوم، سیلیمارین بهطور معنیداری توانست اثرات سمی آلومینیوم کلراید را بر این پارامترهای اسپرمی (به استثنای حرکات درجا) در مقایسه با گروه آلومینیوم مهار کند.
نتیجه‌گیری: آلومینیوم کلراید اثر سمی بر قابلیت حیات، قابلیت تحرک و پتانسیل غشای میتوکندری اسپرم قوچ دارد و سیلیمارین توانست اثرات مخرب آلومینیوم کلراید را بر روی پارامترهای مذکور جبران نماید.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Protective effect of silymarin on viability, motility and mitochondrial membrane potential in spermatozoa treated with alominium.
نویسندگان [English]
- HR Momeni 1
- H Sepehri 2
- M Yosefi 2
- N Eskandari 1
1 Department of Biology, Faculty of Science, Arak University, Arak 38156-8-8349, Iran
2 Department of Animal Physiology, Faculty of Biology, Tehran University, Tehran, Iran
چکیده [English]
Aim: In order to study the efficiency of the tuber specific promoter (Patatin1), the expression of the HBsAg antigen of the hepatitis B vaccine was evaluated using a transient expression method (AgroInfiltration) in the tubers and leaves of potato plants.
Material and Methods: A tuber specific promoter (Pat1) was isolated from the potato plant using a specific primer pairs by Polymerase Chain Reaction (PCR). It was cloned in the upstream of a synthetic optimized codon of the HBsAg gene in the binary plant vector pBI121. In order to compare the tissue specificity of Pat1, the HBsAg gene also was used under the control of a consultative CaMV35S promoter. The genetic constructs were transferred to the tubers and leaves of potato plants using the Agroinfiltration method. An HBsAg antigen content was measured using ELISA method.
Results: The level of HBsAg antigens in the leaves and tubers of potato plants indicated that Pat1 promoter specifically induced HBsAg high expression in the tuber tissues. Very low expression by the Pat1 promoter in the leaf tissues has been also reported and can be partly dependent on the presence of inducing factors in the inoculation media. However, the expression of HBsAg antigen occurs in both leaf and tuber tissues under the consultative promoter CaMV35S. The results showed that the codon optimized HBsAg gene for potato plant was expressed properly in plant tissues.
Conclusion: findings indicate that potato tuber specific promoter Pat1 can be used effectively to express the synthetic optimized HBsAg antigen in the transgenic potato plants.
کلیدواژه‌ها [English]
- HbsAg
- Hepatitis B
- Potato
- Transient expression
- Tuber specific promoter Pat1
مقدمه
آلومینیوم یک عنصر غیرضروری و سمی برای بدن انسان است (1). با اینحال انسان از راه‌های متعدد در معرض این عنصر قرار میگیرد. آلومینیوم در صنعت تصفیه آب (2)، داروسازی، صنایع غذایی (3)، تهیه رنگ و تهیه مواد آرایشی (4) استفاده میشود. نشان داده شده است که پس از روند تصفیه آب، مقدار آلومینیوم در آن در حدود 40 تا 50 درصد افزایش پیدا میکند (2). این عنصر از طریق داروها، پوست صدمه دیده و دستگاه تنفس جذب و وارد بدن میشود (5). به این ترتیب انسان و دام بهطور فزایندهای از طریق آب، هوا، صنعت، مواد دارویی و مواد افزودنی غذا در معرض این عنصر قرار میگیرند (6). اثر آلومینیوم بر روی سیستم عصبی (7)، استخوانها (8)، سیستم قلب و عروق (9)، خون (01)، دستگاه گوارش (11) و دستگاه تولید مثل (21) به اثبات رسیده است. آلومینیوم همچنین اثرات سویی در باروری داشته و نقش آن در بروز اختلالات دستگاه تناسلی مرد به اثبات رسیده است (31). در این خصوص مشخص شده است که آلومینیوم باعث کاهش تعداد، تحرک و قابلیت حیات اسپرم (41) میشود و اثرات مخربی بر تمامیت غشای پلاسمایی و تمامیت آکروزوم اسپرم دارد (21).
مطالعات نشان داده است که توانایی آلومینیوم در ایجاد سمیت در انسان و حیوان عمدتا بهعلت توانایی آلومینیوم در تولید گونههای واکنشگر (Reactive Oxygen Species, ROS) و سایر رادیکالهای آزاد و همچنین مهار سیستم دفاع آنتی اکسیدانتی در اندامهایی مثل بیضه، کبد، ریه و مغز است (51). با توجه به اثرات سمی آلومینیوم و نقش محوری آن در القا استرس اکسیداتیو، استراتژی استفاده از آنتی اکسیدانتها و به‌خصوص آنتی اکسیدانتهای گرفته شده از گیاهان دارویی میتواند با هدف افزایش ظرفیت سیستم دفاع آنتی اکسیدانتی بدن گامی در جهت کمک به جاروب رادیکالهای آزاد و مهار استرس اکسیداتیو در بدن بردارد. این امر احتمالا میتواند راه حل پیشنهادی مناسبی برای جلوگیری از روند ناباروری به‌خصوص در جوامع صنعتی باشد.
سیلیمارین فلاونوئیدی است که بهعنوان ماده موثر عصاره گیاه ماریتیغال یا خار مریم (Silybum marianum) شناخته شده (16) و دارای اثرات دارویی متعددی از جمله خاصیت ضد التهابی و ضد سرطانی میباشد (17-18) علاوه بر این، سیلیمارین بهعنوان یک ماده آنتی اکسیدانت قوی (16)، تنظیم‌کننده مقدار گلوتاتیون داخل سلولی و تثبیت‌کننده غشا سلولی مطرح است (19). خاصیت آنتی اکسیدانتی سیلیمارین به‌خاطر ساختمان پلی‌فنلی بههمراه گروه متوکسی موجود بر روی یکی از حلقههای فنلی میباشد (02). اثرات حفاظت سلولی سیلیمارین وابسته به خواص آنتی اکسیدانتی و جارو کردن رادیکالهای آزاد آن میباشد و میتواند بهطور مستقیم با اجزا غشا سلولی واکنش داده و سبب جلوگیری از هر گونه ناهنجاری در ترکیب لیپیدهای مسئول حفظ سیالیت طبیعی غشا شود (12). سیلیمارین با این خاصیت قادر است از فرایندهای پراکسیداسیون دخیل در ضایعات کبدی ناشی از تتراکلرورکربن، اتانول، پاراستامول و سایر مواد سمی کبدی پیشگیری کند (22).
عواملی همچون قابلیت حیات، قابلیت تحرک و تمامیت میتوکندریها در جهت فراهم نمودن موثر ATP برای تحرک اسپرم بهعنوان فاکتورهای کلیدی در سلامت اسپرم محسوب میشوند و میتوانند تضمین‌کننده لقاح موثر اسپرم با تخمک باشند. این پارامترهای اسپرم نسبت به استرس اکسیداتیو بسیار حساس بوده و اختلال در آنها میتواند تولید مثل انسان و دام را به مخاطره بیاندازد. با توجه به اثرات سمی آلومینیوم بر دستگاه تولیدمثل نر و این که این اثرات احتمالا از طریق القا استرس اکسیداتیو اعمال میشود، این پژوهش با این هدف انجام شد تا مشخص شود که آیا سیلیمارین قادر است اثرات مخرب آلومینیوم بر قابلیت حیات، قابلیت تحرک و تمامیت میتوکندری‌های اسپرم قوچ را مهار نماید.
مواد و روش‌ها
آماده‌سازی، گروهبندی و تیمار اسپرمها: در این تحقیق تجربی، بیضههای قوچ فراهانی بالغ بلافاصله بعد از ذبح در کشتارگاه اراک، در مجاورت یخ به آزمایشگاه تحقیقاتی زیست‌شناسی انتقال یافتند. به‌منظور جمعآوری اسپرم، چند برش در ناحیه دمی اپیدیدیم ایجاد شد و سپس اسپرمها بهوسیله سرنگ حاوی محیط کشت
(Human Tubal Fluid, HTF) بهدرون لوله فالکون استریل وارد شدند. ابتدا پارامترهای غلظت و قابلیت تحرک اسپرم تعیین شد تا اطلاعات اولیهای از لحاظ کیفیت اسپرم کسب شود. سپس نمونه‌های اسپرمی با کیفیت بالا از نظر تعداد و تحرک در انکوباتور 73 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. شمارش اسپرم و بررسی قابلیت تحرک اسپرم بر اساس دستورالعمل سازمان بهداشت جهانی (World Health Organization, WHO) انجام شد. نمونه‌های اسپرم بعد از شمارش در لوله‌های اپندورف جداگانه تفکیک شد بهطوریکه هر لوله حاوی 106×5 اسپرم در محیط کشت باشد. سپس لوله‌های حاوی سوسپانسیون اسپرم و محیط کشت به پنج گروه (6n= برای هر گروه) تقسیم شدند: 1- اسپرمهای لحظه صفر، 2- اسپرمهای لحظه 180 دقیقه (کنترل)، 3- اسپرمهای تیمار شده با آلومینیوم کلراید (5/0 میلیمولار بهمدت 180 دقیقه)، 4- اسپرمهای تیمار توام سیلیمارین (5/0 میکرومولار) و آلومینیومکلراید (5/0 میلیمولار بهمدت 081 دقیقه) و 5- اسپرمهای تیمار شده با سیلیمارین (5/0 میکرومولار بهمدت 081 دقیقه). لوله‌های حاوی نمونه‌های اسپرم در محیط کشت در طول مدت تیمار در انکوباتور 2OC دار و درجه حرارت 73 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. غلظتهای اشاره شده از آلومینیوم کلراید و سیلیمارین بهعنوان غلظتهای موثر این مواد مد نظر میباشند که پس از غلظتیابی حاصل و برای کلیه آزمایشها مورد استفاده قرار گرفته شد.
سنجش قابلیت حیات اسپرم، سنجش MTT: برای ارزیابی قابلیت حیات اسپرم از روش سنجش MTT [3 – (4,5- dimethy lthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] استفاده شد (23). بدین ترتیب سوسپانسیون اسپرم و محیط کشت (حاوی 106×5 اسپرم) از گروههای مختلف در لوله‌های اپندورف جداگانه وارد شدند. سپس بههر کدام از لولهها 10 میکرولیتر از محلول غلیظ MTT (mg/ml5) اضافه شد و بهمدت یک ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد قرار گرفت. لولهها سپس با دور rpm 0006 بهمدت 6 دقیقه سانتریفیوژ شده و پس از برداشت محلول رویی در 002 میکرولیتر دی متیل سولفوکساید (DMSO) حل شد. سپس محلول با دور rpm 0004 بهمدت چهار دقیقه مجددا سانتریفیوژ شد و 001 میکرولیتر از محلول بنفش رویی در پلیت 69 خانه وارد شد. سپس جذب نوری محلول بنفش رنگ حاصل با استفاده از دستگاه الایزا (SCO diagnostic,Germany) با طول موج 505 نانومتر خوانده شد. درصد قابلیت حیات نمونه‌های اسپرم گروههای مختلف با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد.
100 × = درصد قابلیت حیات
سنجش قابلیت تحرک اسپرم: سنجش حرکت اسپرم بر اساس دستورالعمل سازمان جهانی بهداشت (WHO, 2010) انجام شد. بدین ترتیب که 10 میکرولیتر سوسپانسیون اسپرم گروههای پنج گانه روی لام چمبر با دمای 37 درجه سانتیگراد منتقل و حرکات اسپرم در زیر میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی ×002 مورد بررسی قرار گرفت. حداقل پنج میدان دید میکروسکوپ برای تعیین قابلیت تحرک 002 اسپرم بررسی و درصد اسپرمهای پیشرونده، درجا و بدون حرکت محاسبه شد.
سنجش پتانسیل غشای میتوکندری اسپرم-رنگ آمیزی رودامین 123
پتانسیل غشای میتوکندری اسپرم بر اساس روش ارائه شده توسط Johnson و همکاران (24) انجام شد. بهطور خلاصه به هر کدام از لوله‌های حاوی سوسپانسیون اسپرم در محیط کشت گروههای پنج گانه، پنج میکرولیتر از رنگ رودامین 123 با غلظت نهایی mg/ml 1 اضافه و بهمدت 10 دقیقه در دمای 25 درجه سانتیگراد و در شرایط تاریکی نگهداری شد. سوسپانسیون با دورg 300 بهمدت 10 دقیقه سانتریفیوژ و محلول رویی دور ریخته شد. سپس روی رسوب حاصل یک میلیلیتر از محلول (PBS) Phosphate Buffered Salineاضافه، با دور g 300بهمدت 10 دقیقه سانتریفیوژ و سپس محلول رویی دور ریخته شد. به منظور شستشوی اسپرم این مرحله دو مرتبه انجام شد. در مرحله آخر روی رسوب حاصل یک میلیلیتر از محلول PBS اضافه شد. بعد از پیپتاژ چند میکرولیتر از سوسپانسیون روی لام قرار گرفت و بعد از تهیه گسترش، توسط میکروسکوپ فلورسانس (Olympus, DP71, Japan) مجهز به دوربین، با فیلتر مناسب با بزرگنمایی× 1000 تعداد 100 اسپرم شمارش و اسپرمهای با پتانسیل غشای میتوکندری طبیعی بهصورت درصد بیان شد. در این روش قطعه میانی اسپرمهای با پتانسیل غشای میتوکندری طبیعی بهصورت رنگ سبز درخشان و قطعه میانی اسپرمهای با پتانسیل غشای میتوکندری آسیب دیده بهصورت غیر درخشان ظاهر شدند.
آنالیز آماری
آنالیز آماری دادهها: دادههای حاصل بهصورت میانگین ± انحراف معیار، بیان و توسط آنالیز واریانس یکطرفه و تست توکی مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت. تفاوت میانگینها در سطح 50/0> p معنیدار در نظر گرفته شد.
نتایج
ارزیابی قابلیت حیات اسپرم
سنجش MTT نشان داد که درصد قابلیت حیات اسپرم در گروههای تیمار شده با آلومینیوم کلراید نسبت به گروه کنترل بهطور معنیداری (100/0>p) کاهش یافت. کاربرد مشترک سیلیمارین و آلومینیوم کلراید این اثر را نسبت به گروه تیمار شده با آلومینیوم کلراید بهطور معنیداری (100/0>p) تا حد گروه کنترل جبران کرد (نمودار 1). این نمودار همچنین نشان میدهد که کاربرد سیلیمارین به‌تنهایی و همچنین انکوباسیون اسپرمها پس از 081 دقیقه (کنترل) تغییر معنیداری را در درصد قابلیت حیات آنها به‌ترتیب نسبت به گروه کنترل و لحظه صفر ایجاد نکرد.
نمودار 1: ارزیابی قابلیت حیات اسپرم قوچ در گروههای تیمار شده با سیلیمارین (5/0 میکرومولار) و آلومینیوم کلراید (5/0 میلیمولار) بهکمک سنجش MTT. مقادیر بهصورت میانگین ± انحراف معیار ارائه شده است. میانگینهای با کد حرفهای مختلف، دارای تفاوت معنیدار نسبت به یکدیگر میباشد. آنالیز واریانس یکطرفه، تست توکی، n=6 برای هر گروه،p
ارزیابی قابلیت تحرک اسپرم
در اسپرمهای تیمار شده با آلومینیوم کلراید نسبت به گروه کنترل، درصد اسپرمهای با حرکت پیشرونده کاهش معنیداری (100/0>p) داشت. در حالی‌که در این گروه درصد اسپرمهای با حرکت درجا (50/0>p) و بدون حرکت (100/0>p) افزایش معنیداری را نشان داد (نمودار2). در اسپرمهای تیمار شده با سیلیمارین+ آلومینیوم کلراید، سیلیمارین توانست کاهش حرکات پیشرونده اسپرمها و افزایش اسپرمهای بدون حرکت ناشی از آلومینیوم کلراید را بهطور معنیداری (100/0>p) نسبت به گروه آلومینیوم کلراید جبران نماید (نمودار 2).
نمودار2: ارزیابی قابلیت تحرک اسپرم (حرکات پیشرونده، حرکات درجا، و بی‌حرکت) قوچ در گروههایهای تیمار شده با سیلیمارین 5/0 میکرو مولار و آلومینیوم کلراید 5/0 میلیمولار. مقادیر بهصورت میانگین ± انحراف معیار ارائه شده است. میانگینهای با کد حرفهای مختلف، دارای تفاوت معنیدار نسبت به یکدیگر میباشد. آنالیز واریانس یک طرفه، تست توکی، 6= n برای هر گروه50.0<p.
این نمودار همچنین نشان میدهد که کاربرد سیلیمارین به‌تنهایی و همچنین انکوباسیون اسپرمها پس از 180 دقیقه تغییر قابل ملاحظهای در سه سطح حرکتی اشاره شده به‌ترتیب نسبت به گروه کنترل و لحظه صفر ایجاد نکرده است.
ارزیابی پتانسیل غشای میتوکندری اسپرم
نتایج نشان داد که درصد اسپرمهای با پتانسیل غشای میتوکندری طبیعی در گروه تیمار شده با آلومینیوم کلراید بهمدت 081 دقیقه نسبت به گروه کنترل بهطور
معنیداری (100/0>p) کاهش یافت. در گروه سیلیمارین + آلومینیوم کلراید به مدت 081 دقیقه سیلیمارین توانست این اثر را نسبت به گروه تیمار شده با آلومینیوم کلراید بهطور معنیداری (100/0>p) جبران کند (نمودار 3 و شکل 1). این نمودار همچنین نشان میدهد که کاربرد سیلیمارین به‌تنهایی و همچنین انکوباسیون اسپرمها پس از 081 دقیقه تغییر قابل ملاحظهای در درصد پتانسیل طبیعی غشای میتوکندری به‌ترتیب نسبت به گروه کنترل و لحظه صفر ایجاد نکرده است (نمودار 3).
نمودار 3: ارزیابی پتانسیل غشای میتوکندری در اسپرم قوچ تیمار شده با سیلیمارین (5/0 میکرومولار) و آلومینیوم کلراید (5/0 میلیمولار). مقادیر بهصورت میانگین ± انحراف معیار ارائه شده است. میانگینهای با کد حرفهای مختلف، دارای تفاوت معنیدار نسبت به یکدیگر میباشد. آنالیز واریانس یک طرفه، تست توکی، 6=n برای هر گروه، 50.0>p.
شکل 1 : ارزیابی پتانسیل غشای میتوکندری در اسپرم قوچ تیمار شده با سیلیمارین و آلومینیوم کلراید توسط رنگآمیزی رودامین 321. 1) اسپرمهای لحظه صفر 2) اسپرمهای گروه کنترل (پس از 180 دقیقه) 3) اسپرمهای تیمار شده با آلومینیوم کلراید 5/0 میلیمولار بهمدت 081 دقیقه 4) اسپرمهای تیمار شده با سیلیمارین 5/0 میکرومولار + آلومینیوم کلراید 5/0 میلیمولار بهمدت 081 دقیقه 5) اسپرمهای تیمار شده با سیلیمارین 5/0 میکرومولار بهمدت 081 دقیقه. a- اسپرم با پتانسیل غشای میتوکندری آسیبدیده با گردن غیر درخشان. b- اسپرم با پتانسیل غشای طبیعی، گردن اسپرم رنگ سبز درخشان بزرگنمایی x 0001.
بحث
قابلیت حیات و تحرک اسپرم از جمله پارامترهایی است که منعکس‌کننده صلاحیت عملکرد اسپرم است و با قابلیت الحاق موفق اسپرم با تخمک مرتبط میباشند. نتایج این پژوهش نشان داد که تیمار اسپرم قوچ فراهانی با آلومینیوم کلراید سبب کاهش معنیداری در قابلیت حیات، پتانسیل طبیعی غشای میتوکندری و اختلال در طرح‌های حرکتی اسپرم شد و سیلیمارین توانست اثرات زیان آور این آلاینده را بر روی این پارامترهای اسپرم جبران کند. اینکه آلومینیوم با چه مکانیسم(هایی) منجر به اختلال در این پارامترهای عملکردی اسپرم شده است قابل بحث است. احتمالات متعددی وجود دارد که طی آن آلومینیوم توانسته است اثرات نامطلوب خود را اعمال نموده باشد. با توجه به اینکه آلاینده‌های زیست محیطی با تولید رادیکالهای آزاد و القا استرس اکسیداتیو نقش مهمی در خصوص ضعف عملکردی اسپرم و بنابراین ناباروری دارند، این‌طور می‌توان فرض کرد که آلومینیوم با قابلیت القا استرس اکسیداتیو اثرات مخرب را بر روی این پارامترهای اسپرم ایجاد نموده باشد. رادیکالهای آزاد معمولا از طریق فعالیت طبیعی آنزیمهای آنتی اکسیدانت موجود در سلول از بین میرود. از طرف دیگر مواد سمی نظیر آلومینیوم، با کاهش تولید ATP رادیکالهای آزاد بیشتری تولید می‌نمایند. این عدم توازن بین رادیکالهای آزاد و فعالیت آنزیمهای سیستم دفاع آنتی اکسیدانتی باعث تولید استرس اکسیداتیو میشود (52). علاوه بر این، آلومینیوم از طریق مهار آنزیمهای آنتی اکسیدانتی میتواند استرس اکسیداتیو را القا نموده (62) و باعث کاهش عملکرد میتوکندری شود (72).
مطالعات نشان داده‌اند که قابلیت تحرک و متابولیک اسپرم توسط پراکسیداسیون لیپیدی ناشی از رادیکالهای آزاد معیوب شده و بهدنبال آن موجب کاهش قابلیت تحرک و حیات اسپرم میشود (82). از آنجا که غشای پلاسمایی اسپرم غنی از اسیدهای چرب غیراشباع (که برای سیالیت غشای پلاسمایی اسپرم و در نتیجه قابلیت تحرک و ادغام غشاها به‌منظور لقاح ضروری است) و همچنین دارای سیستم آنتی اکسیدانتی ضعیف میباشد، بنابراین به پراکسیداسیون لیپید توسط رادیکالهای آزاد بسیار حساس است (92). رادیکالهای آزاد سبب مهار یک یا تعداد بیشتری از آنزیمهای فسفوریلاسیون اکسیداتیو در میتوکندری و گلیکولیز در سیتوپلاسم میشود و در نتیجه تولید ATP را بهوسیله اسپرم محدود میکند. کاهش ATP نیز موجب کاهش فسفوریلاسیون وابسته به ATP پروتئینهای آکسونم (که برای تحرک اسپرم ضروری است) میشود (92). از این رو کاهش قابلیت تحرک اسپرم میتواند با آسیب میتوکندریایی مرتبط باشد (03). آلومینیوم میتواند با اختلال در آنزیمهای میتوکندری در عملکرد این اندامک اختلال ایجاد کند و بدین ترتیب تحرک اسپرم را تحت تاثیر قرار دهد (13). علاوه بر این، فلزات سنگین قادر به تجمع در بافتهای جانوران بوده و در فرایند تکامل اسپرم نیز تاثیرات منفی دارند. این فلزات همچنین با اتصال به پروتئین و یا آنزیمهای موثر بر متابولیسم تاژک اسپرماتوزوئید موجب تغییر ساختار تاژک، دژنره شدن پروتئینها و توقف تحرک اسپرم میشوند (23).
اثر آسیب‌رسان غیر مستقیم آلومینیوم بر روی پتانسیل غشای میتوکندری و همچنین قابلیت حیات از طریق القای استرس اکسیداتیو به اینصورت قابل توجیه است که رادیکالهای آزاد با اکسیداسیون لیپیدها و پروتئینها از طرفی سبب نفوذپذیر شدن غشای خارجی و داخلی میتوکندری و در نهایت آزادسازی پروتئین های پیش آپوپتوزی محدود به فضای بین دو غشا و همچنین از دست رفتن پتانسیل غشای داخلی میتوکندری میگردد و از طرف دیگر با آسیب به آنزیمهای میتوکندریایی سبب اختلال در سنتز ATP و همچنین اختلال در اعمال متابولیکی میتوکندری میگردد. رادیکالهای آزاد همچنین با اکسید کردن منافذ غشای میتوکندری سبب باز شدن آنها میشوند (33). این منافذ کمپلکس پروتئینی بزرگ هستند که در محل ارتباط بین غشای داخلی و خارجی میتوکندری قرار دارند و هنگامی که باز میشوند به کلسیم و همچنین دیگر ترکیبات با جرم مولکولی کم ماتریکس اجازه میدهد که به راحتی میتوکندری را ترک کنند و در نتیجه سبب بالا رفتن غلظت کلسیم در حد کشنده و از دست رفتن پتانسیل غشای میتوکندری (که برای سنتز ATP ضروری است) میگردد (33). افزایش غیر طبیعی یون کلسیم داخل سلولی منجر به کاهش قابلیت حیات و سرانجام مرگ سلولی میشود (43). بدین ترتیب که افزایش این یون موجب تجمع بیش از اندازه کلسیم در میتوکندریها شده و منجر به تغییر ولتاژ غشای این اندامک و باز شدن منافذ آن میشود که به‌واسطه آن موجب آزاد شدن پروتئینهای آپوپتوژنیک همچون سیتوکروم C، فاکتورهای القاکننده آپوپتوزیس (AIF) و آندونوکلئاز G از این اندامک میشود (53).
با توجه به مطالب اشاره شده این‌طور می‌توان فرض کرد که در این پژوهش آلومینیوم با القا استرس اکسیداتیو منجر به کاهش قابلیت تحرک و قابلیت حیات و همچنین اختلال در پتانسیل طبیعی غشا میتوکندری اسپرم شده است. برای بررسی این فرضیه کاربرد یک آنتی اکسیدانت میتواند اثرات مخرب آلومینیوم ناشی از القای استرس اکسیداتیو را جبران نماید. در این خصوص، در تحقیق حاضر نشان داده شد که سیلیمارین بهعنوان یک آنتی اکسیدانت قوی (63) توانست کاهش قابلیت حیات، کاهش درصد اسپرمهای دارای حرکت پیشرونده، افزایش درصد اسپرمهای ساکن و همچنین کاهش درصد اسپرمهای با پتانسیل غشای میتوکندری طبیعی را در گروه تیمار شده با سیلیمارین + آلومینیوم کلراید بهطور معنیداری در مقایسه با گروه تیمار شده با آلومینیوم کلراید جبران کند. لذا این احتمال وجود دارد که سیلیمارین از طریق حذف و یا کاهش رادیکالهای آزاد و یا افزایش سیستم دفاع آنتی اکسیدانتی اسپرم توانسته است با مهار استرس اکسیداتیو، اختلالات حاصل از آلومینیوم کلراید را در پارامترهای اسپرم از جمله قابلیت حیات، تحرک و پتانسیل غشای میتوکندری بهبود بخشد.
نتیجه‌گیری
نتایج مطالعه حاضر نشان داد که آلومینیوم کلراید قابلیت حیات، قابلیت تحرک و پتانسیل غشای میتوکندری اسپرم را کاهش داد و سیلیمارین توانست اثرات مخرب آلومینیوم کلراید را بر روی پارامترهای مذکور جبران نماید. بررسی میزان پراکسیداسیون لیپید و همچنین آنزیمهای سیستم دفاع آنتی اکسیدانتی اسپرم در گروههای مورد آزمایش که جهت پژوهش‌های آتی پیشنهاد میشود میتواند در جهت تقویت این نتیجه‌گیری کمک نماید.
)