نوع مقاله : علمی - پژوهشی
چکیده
هدف: هدف این مطالعه بررسی ارتباط بین IAA و برخی از شاخصهای بیوشیمایی و فیزیولوژیکی بهمنظور تحمل به تنش شوری است.
مواد و روشها: بذرهای استریل تنباکو در محیط کشت MS کشت شدند. گیاهچههای تنباکو ((Nicotiana plumbaginifolia تکثیر شده در شرایط کشت بافت بهمدت 4 هفته تحت تیمار IAA (ا میلی گرم در لیتر) و شوری (0، 100 و 200 میلی مولار) قرار گرفتند و بعد از 4 هفته برخی از شاخصهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی نظیر کلروفیل، H2O2، پرولین، پروتئین، کربوهیدرات و آنتیاکسیدانتهای آنزیمی اندازه گیری شدند.
نتایج: در تنش شوری افزایش H2O2 ،پرولین، آنتی اکسیدانتهایی مانند کاتالاز، سوپراکسید دیسموتاز و آسکوربات پراکسیداز و بر عکس کاهش رنگیزههای فتوسنتزی،کربوهیدرات کربن و پروتئین کل مشاهده شد. در گیاهچههای تحت تنش شوری، تیمار اکسین باعث افزایش میزان پرولین و H2O2 شد. کاهش رنگیزههای فتوسنتزی و کربوهیدرات محلول و آنزیمهایی مانند سوپراکسیددیسموتاز و آسکوربات پراکسیداز و پروتئین کل شد. اما میزان کاتالاز در حضور تیمار اکسین افزایش یافت.
نتیجهگیری: تیمار اکسین در گیاهچههای تنباکو به تغییر برخی از شاخصهای فیزیولوژیکی بهبود تحمل تنش شوری را نشان میدهد.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
The effect of IAA on stress resistance of tobacco seedlings (Nicotiana plumbaginifolia) under in vitro culture conditions
چکیده [English]
Aim: In this study, the effect of IAA on salt tolerance of tobacco plants (Nicotiana plumbaginifolia) was investigated under in vitro culture conditions.
Material and Methods: Sterile seeds of N. plumbaginifolia were cultured in MS medium. In vitro propagated seedlings under tissue culture conditions were treated with IAA (mg / l) and salinity (0, 100 and 200 mM) for 4 weeks. Physiological and biochemical parameters including H2O2, chlorophyll, soluble carbohydrate, protein and antioxidant enzyme activity were measured.
Results: Salt stress increased H2O2, proline, catalase, superoxide dismutase and ascorbate peroxidase, while reverse patterns were observed for photosynthetic pigments, soluble carbohydrates and also total protein. In salt-treated seedlings, application of auxin increased proline, catalase and H2O2, but decreased photosynthetic pigmentation, soluble carbohydrates, total protein and some enzymes such as superoxide dismutase and ascorbate peroxidase.
Conclusion: Auxin treatment in salt-treated tobacco seedlings improved salinity tolerance by changes in some physiological parameters.
کلیدواژهها [English]
- Auxin
- Salinity stress
- Tobacco
مقدمه
اکسینها دستهای از هورمونهای گیاهی هستند که نقش ضروری در هماهنگی فرایندهای رشدی چرخه زندگی گیاه ایفا میکنند و نام خود را از کلمه یونانی auxano به معنی رشد کردن میگیرند. واژه اکسین برای مواد شیمیایی طبیعی و مصنوعی که رشد کولئوپتیل و ساقه را موجب میشود، استفاده میشود. اکسین در رشد گیاهان و تشکیل مریستمهای راسی نقش دارد و برای تمایز ریشه ضروری هستند. همه اکسینها ترکیباتی با حلقه آروماتیک و گروه اسید کربوکسیلیک هستند (1). تصور میشود که اکسین پمپ پروتون غشا پلاسمایی را فعال و پروتون را از سیتوزول به آپوپلاست پمپ میکند، که در سست شدن دیواره سلولی و افزایش گسترش سلول نقش دارد (2). در شرایط تنش شوری با اینکه توانایی گیاه برای مصرف آب کاهش مییابد (3)، اما فشار تورگر سلول عامل محدود کننده رشد نیست. علاوه بر این، نشان داده شده است که تورگر اندامهای هوایی و رشد آنها، در هیبریدهای مقاوم در برابر نمک در شرایط تنش شوری حفظ شده است، که بهواسطه افزایش اسمولیتها در عصاره اندامهای هوایی صورت میگیرد. در شرایط تنش (خشکی و شوری)، سیستم ریشهای خوب و گسترده میتواند تاثیر بسیاری را در گیاه داشته باشد (4). بهبود سیستم ریشهای گیاه (افزایش طول و تعداد ریشه اولیه) نه تنها منجر به افزایش عملکرد گیاه در شرایط طبیعی میشود، بلکه توانایی تحمل گیاه به شوری و خشکی را افزایش میدهد (5). مشاهده شده که محدوده وسیعی از اکسینهای مصنوعی میتوانند موجب افزایش طویل شدن سلولها در ساقههای لوبیا شوند. در محیطهای شور بهکارگیری یک یا مخلوطی از تنظیم کنندههای رشد، از قبیل ایندول استیک اسید، ایندول بوتیریک اسید، نفتالین استیک اسید و 4-2 دی کلروفنوکسی استیک اسید، بهصورت برگ پاشی و یا تیمار با بذر در القا و افزایش توان ریشهدهی و در نتیجه افزایش رشد گیاه آثار معنیداری در پی داشت (6).
نقش اکسین در غلبه بر تنشها شناسایی شد است، تنش شوری میتواند بر هومئوستازی اکسین از طریق تغییر متابولیسم و توزیع آن اثر بگذارد (7). بر طبق تئوری رشد اسیدی، اسیدی شدن بهواسطه ی اکسین در آپوپلاست برگ، برای افزایش توسعه دیواره سلولی ضروری میباشد (8) همچنین شواهدی نشان میدهد که ABA (آبسیزیک اسید) بهواسطه IAA از طریق بتا اکسیداسیون، در مقاومت به شوری عمل میکند (9). اکسینها اولین گروه هورمونهای گیاهی هستند که پس از کشف بهعنوان تنظیم کننده رشد و طویل کردن سلول استفاده شدند. بارزترین ویژگی اکسینها، اثر بر رشد طولی سلولهای ساقه، کلئوپتیل و ریشه است. با این حال، در تشکیل ریشههای جانبی و ریشههای نابجا، تقسیم سلولی در کشت بافت و در بیوسنتز پروتئین و RNAهم نقش دارند، اعتقاد بر این است که اکسین با تغییراتی در بیان ژن موجب فعالیتهای مذکور میشود (10). همچنین گزارش شده است هورمونهای گیاهی ازجمله اکسین نقش مهمی را در تعدیل رشد گیاه بازی میکنند و کاربرد ایندول استیک اسید در ناحیه طویل شدن (Elongation zone) مهار رشد ریشه القا شده از طریق تنش را تعدیل میکند، که نشان دهنده نقش ایندول استیک اسید درمحافظت گیاه در برابر تنشها میباشد. اکسین احتمالا نفوذپری غشا را برای انتشار آب افزایش میدهد که این عمل را یا از طریق فعالسازی پروتئینهای موجود یا سنتز آنزیمهای هیدرولیتیک انجام میدهد. هورمونهای گیاهی از جمله اکسین نقش القای ژ نهای ویژه در سنتز پروتئینها را دارند. همچنین گزارش شده که اکسین در گیاهان تحت تنش باعث افزایش میزان پرولین شده، که افزایش این متابولیت نشاندهنده نقش هورمون اکسین در پاسخ به تنش میباشد (11).
با توجه اینکه نقش فیزیولوژیکی هورمون اکسین در میزان تحمل گیاه نسبت به تنش شوری به خوبی شناخته نشده است لذا، در این پژوهش گیاهچههای تنباکو بهعنوان یک گیاه مدل تحت تیمار IAA قرار گرفتند تا با بررسی برخی از شاخصهای بیوشیمیایی و رشد گیاه نفش اکسین در رابطه به شوری بهتر شناخته شود.
مواد و روشها
کشت بذر و رشد گیاهچه: بذرهای تنباکوی تهیه شده از شرکت پاکان بذر اصفهان پس از استریل شدن روی محیط کشت MS (موراشیگ و اسکوگ) کشت شدند. سپس شیشههای حاوی بذر در اتاق کشت با دمای 1± 25 درجه سانتیگراد و دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی و شدت نور 50 میکرمول فوتون بر مترمربع بر ثانیه قرار داده شدند. جهت بررسی و مقایسه مقاومت به شوری گیاهچههای تنباکو تکثیر شده در شرایط کشت بافت در محیط کشت حاوی نمک 100 و 200 میلی مولار نمک و IAA با غلظت یک میلیگرم در لیتر کشت شدند. (لازم بهذکر است که بر اساس آزمایشات اولیه از بین دامنه صفر تا 3 میلیمولار اکسین بهترین غلظت IAA مقدار 1 میلیگرم بر لیتر انتخاب شد). محیط کشت بدون تیمار IAA و نمک بهعنوان شاهد استفاده شد. گیاهچههای تنباکو بعد از 4 هفته جهت آنالیزهای لازم استفاده شدند. کلیه آزمایشات با حداقل 3 تکرار انجام شده و آنالیز واریانس دادهها با استفاده از نرمافزار SPSS انجام گرفت. مقایسه میانگین دادهها بر اساس آزمون Dancan انجام و سطوح معنیداری تیمارها در سطح p≤0.05 محاسبه شد.
اندازهگیری وزنتر و خشک: پس از چهار هفته، گیاهچههای رشد یافته در غلظتهای مختلف نمک و اکسین، از محیط کشت خارج شد و بهمنظور حذف آگار، ریشهها با آب مقطر شستشو داده شد و سپس بهکمک کاغذ صافی خشک شد. وزن تر گیاهچهها اندازهگیری شد. نمونههای وزن شده در مرحله قبل بهمدت 48 ساعت در دمای 70 درجه سانتیگراد قرار گرفت و سپس وزن خشک آنها اندازه گیری شد.
اندازهگیری H2O2:اندازهگیری H2O2 بر اساس روش Velikova و همکاران (12) صورت گرفت. ابتدا 100 میلیگرم از بافت برگ تازه را با 5 میلیلیتر (تری کلرواستیک اسید) TCA با غلظت 1/0 درصد درهاون چینی بر روی یخ ساییده شد. عصاره حاصل بهمدت 15 دقیقه در rpm10000 درون سانتریفیوژ و در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. سپس 500 میکرولیتر از محلول رویی با 500 میکرولیتر بافر فسفات پتاسیم 100 میلی مولار با 7pH= و 1 میلیلیتر KI (پتاسیم یدور) یک مولار مخلوط شد و جذب نمونهها در طولموج 390 نانومتر توسط کووت شیشهای و با دستگاه اسپکتروفتومتر مدل AE-UV1600 خوانده شدند.
اندازهگیری پرولین:برای اندازهگیری پرولین از روش Bates و همکاران (13) استفاده شد. در این روش ابتدا 30 میلیگرم از بافتهای تازه برگ و ریشه گیاهان وزن شد. هر نمونه با 7/1 میلیلیتر اسیدسولفوسالیسیلیک 3 درصد (حجم/وزن) بهخوبی ساییده شد. عصارههای حاصل درون اپندورفهای 5/1 میلیلیتری منتقل شده و بهمدت 20 دقیقه در rpm 13000 سانتریفیوژ شد. سپس 1 میلیلیتر از محلول رویی برداشته و داخل لولههای آزمایش 10 میلیلیتری منتقل شد. بعد 1 میلیلیتر اسید استیک گلاسیال و 1 میلیلیتر معرف نین هیدرین بههر لوله اضافه شد. پس درب هر لوله با فویل آلومینیومی محکم بسته شد و لولهها بهمدت 1 ساعت در دمای 100 درجه سانتیگراد داخل بن ماری حرارت داده شدند. پس از خارج نمودن لولهها از بن ماری و سرد شدن بر روی یخ، در زیر هود بههر لوله 2 میلیلیتر تولوئن اضافه شد. لولهها بهمدت 20 ثانیه بهشدت مخلوط شد و سپس بهمدت 15 دقیقه در شرایط آزمایشگاهی بهصورت ثابت قرار داده شد. در این مرحله در لولههای آزمایش فاز آلی (قرمز) در بالا و فاز بیرنگ و شفاف در پایین تشکیل شد. و سپس از هر لوله 1 میلیلیتر از فاز بالایی برداشته و داخل کووت شیشهای ریخته شد. جذب ترکیب رنگی هر نمونه در طولموج 520 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر مدل Shimadzu UV-160A ، ساخت کشور ژاپن، خوانده شد.
اندازهگیری کربوهیدرات محلول: بهمنظور اندازهگیری کربوهیدراتهای محلول مقدار 10 میلیگرم بافت خشک از هر تیمار توزین شد و با 10 میلیلیتر آب مقطر گرم در هاون سائیده شد و سپس با کمک کاغذ صافی صاف شد. سپس 50 میکرو لیتر از عصاره گیاهی استخراج شده را با 50 میکرو لیتر فنل 5 درصد وزنی مخلوط کرده و سپس 5/2 میلیلیتر اسیدسولفوریک غلیظ بهصورت عمود بر سطح مایع به آن اضافه شد. این مخلوط بهمدت 15 دقیقه در دمای محیط نگهداری شده و پس از آن جذب محلول در 490 نانومتر خوانده شد (14).
استخراج و سنجش رنگیزههای فتوسنتزی: میزان کلروفیل a و کلروفیل b و کلروفیل کل بر اساس روش (1987) Lichtenthaler اندازهگیری شد (15). 100 میلیگرم از بافتتر برگ از هر تیمار وزن شد و سپس با استفاده از 2 میلیلیتر استون 80 درصد حجمی در محیطی تاریک و درروی یخ درونهاون چینی ساییده شد تا درنهایت محلولی همگن بهدست آمد. سپس عصاره حاصل در دور rpm در دمای 4 درجه سانتیگراد بهمدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس حجم محلول روشناور بهکمک استون 80 درصد در لولههای آزمایش به 10 میلیلیتر رسانده شد. سپس جذب محلول بهدستآمده بهکمک دستگاه اسپکتروفتومتر مدل Shimadzu UV-160A، ساخت کشور ژاپن، درسه طولموج 663 و 646 و 470 نانومتر بهترتیب برای کلروفیل a، کلروفیل b و کاروتنوئیدها خوانده شد و از استون 80 درصد بهعنوان محلول شاهد استفاده شد. میزان کلروفیل a و کلروفیل b و کلروفیل کل و کاروتنوئید طبق فرمول برحسبmg.g-1 FW محاسبه گردید.
chla(mg/g)=[12.21(A663)-2.81(A646)]× ×
chlb(mg/g)=[20.13(A646)-5.03(A663)]× ×
Total chl(mg/g)= chla + chlb
Car(mg/g)=
=A میزان جذب نوری عصاره
=V حجم نهایی عصاره برحسب میلیلیتر
=W وزن بافت گیاهی برحسب گرم
اندازه گیری فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانت:چهار هفته پس از اعمال تیمار فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانت (کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز و سوپر اکسید دیسموتاز) در برگ گیاهچههای رشد یافته در محیط کشتهای حاوی نمک و اکسین توسط دستگاه اسپکتروفتومتر مدل Shimadzu UV-160 ، ساخت کشور ژاپن، اندازهگیری شد.
استخراج عصاره آنزیمی: 100 میلی گرم از بافت تازه برگ و 1 میلیلیتر بافر فسفات (8/7pH= ) بهتدریج به آن اضافه شده و ساییده و بهطور کامل هموژنیز شد (تمام مراحل روی یخ صورت گرفت). عصارههای حاصل بهمدت 20 دقیقه با دور rpm 13000 در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. سپس از محلول رویی جهت اندازهگیری فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانت استفاده شد.
اندازهگیری و تهیه بافر استخراج پروتئین:اندازهگیری پروتئین کل طبق روش برادفورد (16) انجام گرفت. جهت تهیه بافر استخراج، ابتدا محلول A شامل نمک اسیدی NaH2PO4.2H2Oو محلول B شامل نمک بازی Na2HPO4 تهیه و سپس حجم 100 میلیلیتر از مخلوط دو محلول AوB به نسبت 5/8 و 5/91 با غلظت 100 میلی مولار 8/7 pH= خاوی PVP ، 2 درصد و گلیسرول 10 درصد و EDTA 1 mM و DTT 4 Mm تهیه شد.
اندازهگیری فعالیت آنزیم کاتالاز: فعالیت آنزیم کاتالاز بر اساس روش Aebi (17) انجام شد. بر این اساس مقدار 900 میکرو لیتر از بافر واکنش بافر فسفات سدیم 50 میلیمولار با 7 pH=و 10 میکرولیتر از عصاره آنزیمی و 100 میکرولیتر پراکسید هیدروژن 2/0 مولار داخل کووت مخلوط و کاهش جذب ناشی از مصرف H2O2 در اثر فعالیت کاتالاز موجود در عصاره آنزیمی در طول موج 240 نانومتر در مدت 60 ثانیه خوانده شد. سپس فعالیت آنزیم کاتالاز با استفاده از رابطه زیر محاسبه شد:
A∆ = تغییر در جذب نور در طولموج مربوطه (اختلاف جذب در 60 ثانیه)
∆T =زمان برحسب دقیقه
V = حجم بافر واکنش (میلیلیتر)
v =حجم عصاره آنزیمی (میلی لیتر)
p =میلیگرم پروتئین در میلیلیتر
ɛ =ضریب خاموشی آنزیمmMˉ¹cmˉ¹ 036/0
مقدار پروتئین کل هر عصاره آنزیمی نیز بر طبق روش Bradford (1976) (16)، بر حسب میلیگرم پروتئین بافت گیاهی اندازه گیری شد.
اندازهگیری فعالیت آنزیم آسکوربات پر اکسیداز: فعالیت آنزیم APX بر اساس روش Nakano and Asada (18) اندازهگیری شد. محلول واکنش آنزیم APX شامل بافر فسفات سدیم با حجم کلی 50 میلیلیتر و غلظت 50 میلی مولار و 7 pH= که حاوی EDTA 2/0 میلیمولار و آسکوربیک اسید 5/0 میلی مولار تهیه شد. جهت اندازهگیری فعالیت آنزیم APX مقدار 850 میکرولیتر از بافر واکنش با 50 میکرولیتر از عصاره آنزیمی و 100 میکرولیتر پراکسید هیدروژن 2/0 مولار مخلوط گردید و فعالیت آنزیم در طولموج جذبی 290 نانومتر و با کووت کوارتز در مدت زمان 60 ثانیه خوانده شد. سپس با استفاده از فرمول مشابه برای کاتالاز با توجه به ضریب خاموشی APX mMˉ¹cmˉ¹ 8/2 فعالیت آنزیم گزارش شد.
اندازهگیری فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز: فعالیت آنزیم SOD با استفاده از روش Beauchamp and Fridovich (19) توسط مهار احیای نوری NBT صورت گرفت. بهمنظور سنجش فعالیت آنزیم ابتدا بافر واکنش حاوی فسفات سدیم 50 میلی مولار با 8/7pH= (بافر شامل Na2H2PO4 و Na2HPO4) متیونین 13 میلیمولار، NBT (نیترو بلو تترا زولیوم) 75 میکرومولار، EDTA 1/0 میلیمولار، ریبوفلاوین 2 میکرومولار و دور از نور تهیه گردید. برای انجام آزمایش 5/1 میلیلیتر از بافر واکنش با 50 میکرولیتر از عصاره آنزیمی را در تاریکی مخلوط نموده سپس در مقابل نور 5000 لوکس بهمدت 15 دقیقه قرار گرفت. سپس از نمونهها به تاریکی منتقل گردید و بلافاصله جذب نمونهها در طولموج 560 نانومتر خوانده شد. میزان جذب در کنترل در 560 نانومتر نشان دهنده 100 درصد احیای نوری NBT میباشد و نیمی از آن معادل یک واحد آنزیمی است. سپس میزان فعالیت آنزیم SOD در مقایسه با کنترل سنجیده شد. اختلاف جذب نمونهها و کنترل در 560 نانومتر بر حسب واحد آنزیمی در میلیگرم پروتئین کل موجود در 50 میکرولیتر عصاره آنزیمی گزارش شد.
نتایج
الگوی رشد گیاه تنباکو و تغییرات وزن و خشک گیاه تنباکو
همانطور که شکل 1 نشان می دهد الگوی رشد گیاه تنباکو تحت تنش شوری 100 و 200 میلیمولار نمک در حضور تیمار اکسین نسبت به عدم اکسین بهتر شد و اکسین توانست اثرات تنش نمک را تا حدودی در الگوی رشد کاهش دهد (شکل 1).
شکل1: اثر IAA بر الگوی رشد گیاهچههای تنباکو Nicotiana plumbaginifoli پس از چهار هفته. A : محیط MS (شاهد)، :B محیط کشت حاوی نمک 100 میلی مولار، :C 200 میلیمولار، :Dمحیط MS حاوی IAA mg/l 1 ، E: محیط MS حاوی IAA mg/l 1+ 100 میلیمولار نمک، F: محیط MS حاوی IAA mg/l1+ 200 میلیمولار نمک
در تایید این الگو، نتایج نشان داد که وزن تر گیاه تنباکو بهواسطه حضور IAA در محیط کشت بهطور معنیداری نسبت به محیط کشت فاقد اکسین در تمام غلظتهای نمک افزایش معنیدار یافت. البته تنش نمک در مقایسه با محیط کشت بدون نمک موجب کاهش وزن تر شد اگر چه تفاوتی بین وزن تر گیاه در تیمار 100 و 200 میلیمولار نمک در محیط کشت فاقد اکسین مشاهده نشد (شکل 2).
شکل2: اثر IAA بر وزنتر گیاهچههای تنباکو Nicotiana plumbaginifolia تحت تنش شوری. دادهها میانگین سه تکرار± stdو حروف غیرمشترک بیانگر معنیدار بودن p≤0.05 بر اساس آزمون دانکن میباشد.
تغییرات وزن خشک گیاهان تنباکو تخت تیمار نمک و اکسین کم و بیش از الگوی تغییرات وزن تر تبعیت نمود با این تفاوت که تیمار اکسین در غلظت 200 میلیمولار نمک در مقایسه با محیط کشت بدون اکسین تاثیر معنیداری نشان نداد ولی همچنان اکسین توانست وزن خشک گیاه را در تنش نمک حداقل تا 100 میلیمولار افزایش دهد (شکل 3).
شکل 3: اثر IAA بر وزنت خشک گیاهچههای تنباکو Nicotiana plumbaginifolia تحت تنش شوری. دادهها میانگین سه تکرار± stdو حروف غیرمشترک بیانگر معنیدار بودن p≤0.05 بر اساس آزمون دانکن میباشد.
اثر تیمار IAA و تنش شوری بر میزان H2O2
میزان H2O2 در محیط کشت حاوی نمک 100 و 200 میلی مولار و فاقد اکسین در مقایسه با محیط کشت حاوی اکسین افزایش معنیدار نشان داد. البته تنها استثنا غلظت 100 میلی مولار نمک همراه با اکسین و محیط
کشت فاقد نمک و اکسین (شاهد) بود که اختلاف آنها معنیدار نبود بههر حال کاهش پراکسید هیدروژندر اثر توسط اکسین در تنش نمک بهوضوح دیده شد (شکل 4)
شکل4:ا ثر IAA بر میزان H2O2 اندام هوایی گیاهچههای تنباکو گونه Nicotiana plumbaginifolia تحت تنش شوری. دادهها میانگین سه تکرار± stdو حروف غیرمشترک بیانگر معنیدار بودن p≤0.05 بر اساس آزمون دانکن میباشد.
اثر IAA و تنش شوری بر پرولین
میزان پرولین برگ در حضور و عدم حضور IAA با افزایش نمک به 100 و 200 میلیمولار در مقایسه با شاهد افزایش معنیداری نشان داد. نکته جالب اینکه افزایش پرولین برگ در حضور IAA در مقایسه محیط کشت فاقد اکسین نیز اختلاف معنیداری را نشان داد (شکل5).
میزان پرولین ریشه در مقایسه با برگ متفاوت بود بهعنوان مثال دامنه تغییرات پرولین در برگ بین صفر تا 300 میکرومول بر گرم بود در حالیکه این دامنه در ریشه بسیار کمتر و بین صفر تا خد اکثر حدود 40 میکرومول بر گرم مشاهده شد. علاوه براین، افزایش غلظت نمک در محیط کشت میزان پرولین ریشه را بدون اکسین و با حضور اکسین نسبت به شاهد افزایش داد میزان پرولین ریشه در غلظتهای 100 و 200 میلیمولار نمک اختلاف معنیدار نشان نداد (شکل6).
شکل5: اثر IAA بر میزان پرولین برگ گیاهچههای تنباکو گونه Nicotiana plumbaginifolia تحت تنش شوری. دادهها میانگین سه تکرار± stdو حروف غیرمشترک بیانگر معنیدار بودن p≤0.05 بر اساس آزمون دانکن میباشد.
شکل6: اثر IAA بر میزان پرولین ریشههای گیاهچههای تنباکو گونه Nicotiana plumbaginifolia تحت تنش شوری. دادهها میانگین سه تکرار± stdو حروف غیرمشترک بیانگر معنیدار بودن p≤0.05 بر اساس آزمون دانکن میباشد.
اثر IAA و تنش شوری برکربوهیدراتها
درحضور و عدم حضور IAA با افزایش میزان نمک در محیط کشت (100و 200 میلیمولار) کاهش میزان هیدرات کربن محلول با تغییراتی مشاهده شد (کاهش 39
درصد) مقایسه میزان کربو هیدرات محلول در محیط کشت حاوی اکسین و بدون اکسین در تمام غلظتها به استثناء 100 میلیمولار نکته قابل توجه بود (شکل7).
شکل7: اثر IAA بر میزان کربن محلول اندام هوایی گیاهچههای تنباکو گونه Nicotiana plumbaginifolia تحت تنش شوری. دادهها میانگین سه تکرار± stdو حروف غیرمشترک بیانگر معنیدار بودن p≤0.05 بر اساس آزمون دانکن میباشد.
اثر IAA و تنش شوری بر کلروفیل و کاروتنوئید
در حضور و عدم حضور IAA میزان کلروفیل کل و کاروتنوئید در شوری 100 و 200 میلی مولار در مقایسه با محیط کشت فاقد نمک کاهش معنیدار مشاهده شد. بیشترین کاهش کلروفیل در عدم حضور تیمار IAA و حضور IAA در شوری 200 میلیمولار است که در مقایسه با شاهد بهترتیب 19 و31 درصد کاهش نشان داد (شکل8). بیشترین کاهش کاروتنوئید در عدم حضور تیمار IAA و حضور IAA در شوری 200 میلیمولار است که در مقایسه با شاهد بهترتیب 61 و56 درصد کاهش نشان داد (شکل9). تیمار اکسین در محیط کشت اثر منفی بر میزان کلروفیل و کاروتنوئید در حضور و یا عدم حضور نمک نشان داد.
شکل 8: اثر IAA بر میزان کلروفیل کل اندام هوایی گیاهچههای تنباکو گونه Nicotiana plumbaginifolia تحت تنش شوری. دادهها میانگین سه تکرار± stdو حروف غیرمشترک بیانگر معنیدار بودن p≤0.05 بر اساس آزمون دانکن میباشد.
شکل9: اثر IAA بر میزان کاروتنوئید اندام هوایی گیاهچههای تنباکو گونه Nicotiana plumbaginifolia تحت تنش شوری. دادهها میانگین سه تکرار± std و حروف غیرمشترک بیانگر معنیدار بودن p≤0.05 بر اساس آزمون دانکن میباشد.
اثر IAA و تنش شوری بر پروتئینهای محلول
افزودن تغییرات میزان پروتئینهای محلول برگ با افزایش نمک نامحسوس بود. در غلظت 100 و 200 میلیمولار نمک حضور اکسین در محیط کشت توانست میزان پروائین گیاه را افزایش دهد. میزان
پروتئین محلول گیاه در 200 میلیمولار نمک بدون اکسین نشبت به سایر غلظتهای نمک کاهش معنیدار نشان داد. بنابراین اکسین در مجموع توانست پروتئین گیاه را در تنش نمک افزایش دهد (شکل 10) .
شکل 10: اثر IAA بر میزان پروتئین کل اندام هوایی گیاهچههای تنباکو گونه Nicotiana plumbaginifolia تحت تنش شوری. دادهها میانگین سه تکرار± stdو حروف غیرمشترک بیانگر معنیدار بودن p≤0.05 بر اساس آزمون دانکن میباشد.
اثر IAA و تنش شوری بر آنزیم های آنتی اکسیدانت
افزودن اکسین به محیط کشت تنها در شرایط غیر تنش نمک توانست میزان فعالیت APX را افزایش دهد در حالیکه در شرایط تنش نمک تاثیر معنی داری بر فعالیت این آنزیم نشان نداد (شکل 11). فعالیت انزیم کاتالاز با افزایش غلظت نمک در حضور
اکسین افزایش معنیداری نشان داد با این توضیح که در غلظت 200 میلیمولار فعالیت آنزیم در شرایط تنش نمک بیشتر از محیط کشت دارای اکسین گزارش شد (شکل 12). وقتی فعالیت آنزیم SOD بررسی شد مشاهد شد که تنها تنش نمک بدون اکسین در محیط کشت فعالیت این آنزیم را افزایش می دهد ولی اکسین بههمراه نمک در هیچ غلظتی از
نمک تغییر معنیداری در فعالیت آنزیم نشان نداد (شکل 13).
شکل 11: اثر IAA بر فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز اندام هوایی گیاهچههای تنباکو گونه Nicotiana plumbaginifolia تحت تنش شوری. دادهها میانگین سه تکرار± stdو حروف غیرمشترک بیانگر معنیدار بودن p≤0.05 بر اساس آزمون دانکن میباشد.
شکل 12: اثر IAA برفعالیت انزیم کاتالاز اندام هوایی گیاهچههای تنباکو گونه Nicotiana plumbaginifolia تحت تنش شوری. دادهها میانگین سه تکرار± stdو حروف غیرمشترک بیانگر معنیدار بودن p≤0.05 بر اساس آزمون دانکن میباشد.
شکل13: اثر IAA بر فعالیت انزیم سوپراکسیددسموتاز اندام هوایی گیاهچههای تنباکو گونه Nicotiana plumbaginifolia تحت تنش شوری. دادهها میانگین سه تکرار± stdو حروف غیرمشترک بیانگر معنیدار بودن p≤0.05 بر اساس آزمون دانکن میباشد.
بحث
یکی از ویژگیهای مطلوب جهت ارزیابی تاثیر تنش شوری در گیاهچههای گیاهان، تعیین وزن تر و خشک گیاه میباشد. روند عمومی که گیاهچههای در شرایط تنش با آن روبرو هستند، کاهش تولید، وزنتر وخشک میباشد (20) . طبق نتایج این پژوهش
وزنتر و خشک گیاهچههای تنباکو با افزایش غلظت نمک کاهش معنیداری را در مقایسه با نمونههای شاهد نشان دادند. نتایج مشابه در آزمایشات سایر پژوهشگران نیز نیز مشاهده شده است. بهعنوان مثال گزارش منتشر شده توسط Dogan (21) نشان میدهد که افزایش شوری باعث کاهش وزنتر و خشک گیاه سویا در مقایسه با گیاه شاهد شد.
یکی از دلایل کاهش وزنتر و خشک در گیاهچههای تحت تنشهای غیرزیستی، تولید ROS(گونههای فعال اکسیژن) میباشد که در نهایت باعث غیر فعال شدن آنزیمها و یا تجزیه پروتئینهای سلولی و کلروپلاستی و کاهش شدید میزان کلروفیل و در نهایت کاهش فتوسنتز و تولید بیوماس میشود (22). برگها بهعنوان اندام تولیدکننده مواد فتوسـنتزی، مـواد غذایی لازم را برای گیاه بهویژه ریشه تهیه و بـه آنهـا منتقـل میکنند. میزان مواد انتقال یافته به گیاه به سطح فتوسـنتز کننده و راندمان فتوسنتز در واحد سطح برگ بستگی دارد (23). فتوسنتز و رشد سلول و به تبع آن رشد برگ از جمله فرایندهایی است که در ابتدا توسط شوری تحت تاثیر قرار میگیرد. علت کاهش فتوسنتز، کاهش میزان کلروفیل، افـزایش فلورسانس کلروفیل، اختلال درفراینـدهای متـابولیکی و بسـته شدن دهانه روزنهها میباشد (24). بهنظر مـیرسـد که با افزایش شدت تنش شوری بهعلت منفیتر شدن پتانسـیل اســمزی و کــاهش فراهمــی آب گیــاه دچــار تــنش خشــکی فیزیولوژیک شده و در این شرایط یکی از بارزترین واکنشهایی که درگیاهچههای مشاهده میشود کاهش محتوی نسـبی آب بـرگ است. پژوهشگران دیگر نیز تایید کردهاند که بین تنش شـوری و محتوی نسبی آب گیاه یک رابطه منفی برقرار است و با افـزایش شدت تنش شـوری محتـوی نسـبی آب گیـاه کـاهش مییابد (25). اکسین رشد طولی ساقهها و کولئوپتیل را تحریک میکند و تقسیم سلولی را افزایش میدهد. در مطالعه حاضر غلظت 1 میلیگرم بر لیتر IAA استفاده شد که غلظت بهینه در فرایند رشد و نمو تحمل به شوری در گیاه تنباکو بود. غلظت بالاتر از حد مطلوب اکسین از رشد ممانعت مینماید که علت آن اثر تحریککنندگی اکسین برای تولید هورمون گیاهی اتیلن است که رشد طولی را کاهش میدهد. بهطور کلی گیاهچههای حاوی تیمار IAA وزنتر و خشک بیشتری در مقایسه با گیاهچههای فاقد تیمار IAA نشان دادند. که نشان دهنده نقش اکسین بهعنوان هورمون رشد در افزایش رشد و تقسیم سلولی در گیاه است (26).
گونههای فعال اکسیژن یا (ROS)ها اغلب جز فراوردههای جانبی متابولیسم طبیعی سلول در جریان مسیر انتقال الکترون در کلروپلاست و میتوکندری میباشند که در تمام گیاهان در مقادیر مختلف تولید میشوند (27). تنش شوری بهعنوان یک تنش غیر زنده منجر به افزایش میزان ROS کل و به تبع آن H2O2 میشود. در مقایسه با دیگر ROSها، H2O2 نسبتا پایدار بوده و میتواند آزادانه در میان بخشهای سلولی و بین سلولها بهراحتی از طریق کانالهای غشایی آکواپورین (aquaporin) حرکت کند. در مطالعه حاضر میزان پراکسید هیدروژن (H2O2) در تنش نمک افزایش یافت داده های انزیم SOD نیز تایید کننده این افزایش میباشد. ولی تیمار اکسین مقدار آنرا کاهش داد. آنجاییکه پراکسید هیدروژن اثرات مخربی در رشد و نمو گیاه دارد بنابراین بهنظر میرسد اکسین تا حدود زیادی باعث مهار آن شده است. علاوه بر این، در برخی از گیاهان گزارش شده که H2O2 باعث کاهش طول ریشه شده و کاهش انقباض سلولی و رشد ریشه میشود و از این فرضیه حمایت میکند که H2O2 یک جزء پایین دست از اکسین در مهار طویل شدن ریشه است (28).
سازوکارهای متعددی برای حفظ تورژسانس در گیاهان تحت تـنش شـوری وارد عمـل مــیشــوند. یکــی از آنهــا انباشــتگی پــرولین اســت. پرولین انباشته شده در پاسخ به شوری، نقش مهمی در تنظیم اسمزی درون ســلولی ایفــا مــی کنــد و آنــزیمهای ســلولی و پــروتئینهای غشــایی را در برابــر واسرشتگی (denaturation)حفظ مینماید (29). در پژوهشهای پیشین اغلب خاصیت اسمولیتی پرولین در گیاهچههای تحت تنش جهت حفظ تعادل آب بیان شده است (30) . علاوه بر این گزارش شده است که پرولین بهخوبی میتواند بهعنوان یک انتی اکسیدانت رادیکالهای آزاد اکسیژن را حذف نموده و به اینترتیب ماکرومولکولهای اساسی مثل پروتئینها، لیپیدها و DNAرا از خطرات رادیکالهای آزاد حفظ نماید (31) در مطالعه ای بر روی گیاهچههای تنباکو تحت تنش شوریSkopelitis و همکاران (32) نشان دادند که ROS تولید شده طی تنش سبب فعال شدن مسیرهای سیگنالینگ در سیتوزول و میتوکندری میشود و در نهایت توسط آنزیم گلوتامات دهیدروژناز، گلوتامات پیش ساز سنتز پرولین در میتوکندری تولید میشود. بنابراین بیوسنتز پرولین طی تنش شوری و سایر تنشهای محیطی افزایش مییابد (32) در مطالعه حاضر اکسین موجب افزایش میزان پرولین برگ شد ولی در ریشه تغییرات کمی را نشان داد. مسیر اصلی القا بیوسنتز پرولین توسط اکسین مشخص نشده است ولی بهنظر میرسد اکسین از طریق تحریک تقسیم سلولی و القای رشد مسیر سنتز پرولین را تحریک نموده باشد. از طرف دیگر میزان پرولین سنتز شده در برگ نسبت به ریشه بسیار بیشتر میباشد. این خود میتواند دلیلی بر تحریک سنتز پرولین در اندام هوایی در نتیجه اثر اکسین و تنش شوری باشد. البته اینکه ایا افزایش میزان پرولین در برگ نتیجه سنتز ان در برگ بوده و یا انتقال بخشی از پرولین از ریشه به برگ هنوز مشخص نشده است و نیاز به مطالعات دقیق تری در آینده دارد.
بهمنظور فهم اینکه آیا میزان کلروفیل گیاهچههای تحت تاثیر تنش شوری آسیب می بیند و آیا تیمار اکسین بر میزان کلروفیل اثر دارد، مقدار کلروفیل کل و نیز کاروتنوئید در گیاهچههای تنباکو اندازهگیری شد. از آنجا که محتوای کلروفیل و فتوسنتز برگ بـهعنـوان یکی از شاخص فیزیولوژیک تحمل به نمک در گیاه محسوب میشود این سنجش انتخاب شد. خشکی فیزیولوژیکی حاصل از تنش شوری ممکن است موجب محدودیت در جذب آب شـود، از سوی دیگر افزایش جذب نمک توسـط گیـاه، سـبب اخـتلال در کارکرد سلولی و آسیب رسـاندن بـه فرآینـدهای فیزیولـوژیکی از قبیـل فتوسـنتز و تــنفس میشود. یکی از دلایل احتمالی کاهش رنگیزههای فتوسنتزی در تنش شوری رقابت و پیشـی گـرفتن گلوتـامین کینـاز (آنـزیم کاتـالیز کننـده پرولین) به هنگام تنش شوری از آنـزیم گلوتامـات لیگـاز (اولـین آنزیم مسیر بیوسنتز کلروفیل) است که باعث میشود تا پیش سـاز گلوتامات (پیش ساز مسیر سـنتز کلروفیـل و پـرولین) بیشـتر بـه مصرف پرولین برسد و بنابراین بیوسنتز کلروفیـل بـا محـدودیت مواجه میشود (33). علـت دیگـر آن نیـز احتمالا بهدلیل سست شدن اتصـال کلروفیـل بـا پـروتئینهای کلروپلاستی، با افزایش فعالیت آنزیم کلروفیلاز (متلاشـی کننـده ساختارکلروپلاست) در اثر افزایش غلظت یونهای سمی سـدیم و کلر و تنظیم کنندههای رشـدی ماننـد اسـید آبسـزیک و اتـیلن تحت تنش شوری میباشد. محتوای کلروفیل برگ میتواند بهدلیل کمبود یونهای منیزیم و پتاسـیم) بهعنوان عناصر اصلی در سنتز کلروفیل و کاهش نسبت پتاسیم به سدیم و همچنین تخریـب سـاختمان کلروفیـل کـاهش یابـد (34). اﻛﺴﻴﻦ ﺳﻨﺘﺰ آﻧﺰﻳﻢ ADPﮔﻠﻮﻛﺰ- ﻓﺴﻔﺮﻳﻼز را اﻟﻘﺎ ﻣﻲ ﻧﻤﺎﻳﺪ (از ﻃﺮﻳﻖ ﺗاﺛﻴﺮ ﺑﺮ ژن APS) ﻛﻪ ﻳﻚ آﻧﺰﻳﻢ ﻛﻠﻴﺪی در ﺳﻨﺘﺰ ﻧﺸﺎﺳﺘﻪ اﺳﺖ و ﺑﺎزدارﻧﺪه ﻋﻤﻞ آﻧﺰﻳﻢ ﺑﺘا-آمیلاز (Atβ-Amy) میباشد. همچنین بازدارنده ساخت زیرواﺣﺪ ﻛﻮﭼﻚ آﻧﺰﻳﻢ روﺑﻴﺴﻜﻮ اﺳﺖ (از ﻃﺮﻳﻖ ﺗاﺛﻴﺮ ﺑﺮ آﻧﺰﻳﻢ RBCS ﻛﻪ ﻛﺪ ﻛﻨﻨﺪه زﻳﺮ واﺣﺪ ﻛﻮﭼﻚ آﻧﺰﻳﻢ روﺑﻴﺴﻜﻮ اﺳﺖ) و در ﻧﺘﻴﺠﻪ ﻛﺎﻫﺶ ﻣﻴﺰان ﻓﺘﻮﺳﻨﺘﺰ اﺗﻔﺎق میافتد (35). بنابراین ممکن است بهنحوی عدم شنتز یا تخریب کلروفیل دلیل بر کاهش کلروفیل باشد. تفسیر دیگری که میتوان نمود این است که اکسین محرک تقسیم سلولی است و موجب افزایش رشد برگ میشود بنابراین ممکن است میزان کلروفیل در واحد حجم کاهش یافته است و در واقع پدیده رقت اتفاق افتاده است.
تجمع کربوهیدراتهای محلول در گیاه علیرغم کاهش چشمگیر نرخ تثبیت خالص CO2 به گستردگی بهعنوان پاسخی به شوری و خشکی گزارش شده است (36). کربوهیدراتها (گلوکز، فروکتوز، سوکروز و فروکتان) و نشاسته تحت تنش شوری تجمع مییابند و بهعنوان اسمولیت و منبع انرژی در تعدیل اسمزی، ذخیره کربن و تصفیه رادیکالهای آزاد در تنشهای محیطی عمل مینمایند (37) . گزارش شده که در برگهای گیاه گوجه محتوای قند محلول تحت تنش شوری افزایش مییابد (38). علاوه بر گزارشهای بسیاری کـه بیـانگر افـزایش غلظت قندهای محلول در اثر تنش اسمزی میباشد، گـزارشهایی نیز مبنی بر کاهش غلظت قنـدهای محلـول در اثـر تـنش شوری در گیاهچههای مختلـف وجـود دارد. در این پژوهش نیز کاهش میزان قند تحت تنش شوری مشاهده شد. کاهش مقدار قند میتواند بهعلت کاهش فتوسنتز باشد، زیرا کاهش آب موجب کاهش آماس شده و از دست دادن فشـار آماس به بسته شدن روزنهها در نتیجـه کـاهش فتوسـنتز منجـر میشود (39). البته در شرایط کشت بافت ممکن است کاهش کربوهیدراتهای محلول بهدلیل عدم سنتز ان باشد زیرا از یک طرف در محیط کشت مقدار مناسبی قند وجود دارد و از طرف دیگر گیاه در شیشه کشت نوعی میکسوترفیک است. بنابراین نیاز چندانی به افزایش قند در بافت برگ ندارد.
غلظتهای بالای نمک با اختلال در هومئوستازی یون باعث ایجاد سمیت یونی، تنش اسمزی و تولید رادیکالهای آزاد اکسیژن میشود (41). گیاهان در برابر آسیب اکسیداتیو مکانیسمهای آنتی اکسیدانتی آنزیمی و غیر آنزیمی مختلفی را بهکار میگیرند. از میان ROSها رادیکالهای سوپر اکسید برای ساختارهای سلولی مخربترین گونه میباشند. سوپر اکسید دیسموتاز (SOD)یک آنزیم کلیدی در دفاع سلولی، تبدیل رادیکالهای سوپر اکسید به H2O2 و O2 را بهعهده دارد (41). افزایش تولید H2O2 متعاقبا توسط فعالیت سمیتزدایی پراکسیدازها و یا کاتالاز خنثی میشود (42). افزایش فعالیت آنزیمهای پاکسازی کننده ROS ها بهمیزان زیادی با تحمل گیاه به تنش شوری ارتباط دارد (43). آنزیم CAT نسبت به APX تمایل کمتری به حذف H2O2 دارد و در حضور غلظتهای بالای H2O2 فعالیت میکند، اما APX بهدلیل تمایل بیشتر در غلظتهای پایین H2O2 عمل می نماید. بنابراین بهنظر میرسد که غلظت H2O2 در تعیین مقدار فعالیت هر یک از آنزیمهای آنتی اکسیدانت و نوع آنزیم غالب موثر باشد (44). در مطالعه حاضر بهطور متوسط در تنش شوری هورمون اکسین موجب افزایش فعالیت بیشتر آنزیمهای CAT و APX شد. بنابراین بخشی از تحمل به شوری گیاه تنباکو میتواند نتیجه عمل این آنزیمها در حضور اکسین باشد. البته راه کارههای دیگری نیز در افزایش تحمل به شوری در گیاه وجود دارد از جمله افزایش میزان پرولین و سایر آنتی اکسیدانتهای غیر آنزیمی را میتوان نام برد. علاوه براین از آنجاییکه اکسین موجب بیوسنتز اتیلن میشود و اتیلن نیز از مسیرهای متنوعی در میزان تحمل گیاه به تنش موثر است (45). بنابراین با توجه به پیچیدکی تنش شوری در گیاه بهنظر میرسد گیاه تنباکو مجموعهای از مسیر مختلف را برای مقابله با شوری بهکار میگیرد.
نتیجهگیری
در این پژوهش بهمنظور بررسی اثر اکسین بر گیاهچههای تنیاکو (Nicotiana plumbaginifolia) در تنش شوری، گیاهچهها تحت تنش شوری و تیمار IAAقرار گرفتند و برخی از شاخصهای فیزیولوژیکی شامل شاخصهای بیوشیمیایی و رشد و نموی بررسی شدند. تیمار اکسین در گیاهچههای تحت تنش شوری اثرات فیزیولوژیکی خود را نشان داد. در تنش شوری افزایش H2O2، پرولین، آنتی اکسیدانتهایی مانند کاتالاز،سوپراکسیددیسموتاز و آسکوربات پراکسیداز مشاهده شد. کاهش رنگیزههای فتوسنتزی، کربوهیدرات و پروتئین کل مشاهده شد. اما در گیاهچههای تحت تنش شوری و تیمار اکسین، اکسین باعث افزایش میزان پرولین شد. اکسین باعث کاهشH2O2 ، کاهش رنگیزههای فتوسنتزی و کربوهیدرات محلول و افزایش نسبی فعالیت آنزیمهایی مانند سوپراکسید دیسموتاز و آسکوربات پراکسیداز و کاتالاز شد.
- Pacurar DI, Perrone I, Bellini C. Auxin is a central player in the hormone cross talks that control adventitious rooting. Physiologia plantarum. 2014; 151(1):83-96.
- Le Gall H, Philippe F, Domon JM, Gillet F, et al. Cell wall metabolism in response to abiotic stress. Plants. 2015; 4(1): 112-66.
- Munns R, James RA, Läuchli A. Approaches to increasing the salt tolerance of wheat and other cereals. Journal of experimental botany. 2006; 57(5): 1025-43.
- Pencik A, Simonovik B, Petersson SV, Henykova E, et al. Regulation of auxin homeostasis and gradients in Arabidopsis roots through the formation of the indole-3-acetic acid catabolite 2-oxindole-3-acetic acid. The Plant Cell. 2013; 25(10): 3858-3870.
- Sponchiado BN, White JW, Castillo JA, Jones PG. Root growth of four common bean cultivars in relation to drought tolerance in environments with contrasting soil types. Experimental Agriculture. 1989; 25(2): 249-57.
- Fahad S, Hussain S, Matloob A, Khan FA, et al. Phytohormones and plant responses to salinity stress: a review. Plant Growth Regulation. 2015; 75(2): 391-404.
- Pencik A, Simonovik B, Petersson SV, Henykova E, et al. Regulation of auxin homeostasis and gradients in Arabidopsis roots through the formation of the indole-3-acetic acid catabolite 2-oxindole-3-acetic acid. The Plant Cell. 2013; 25(10): 3858-70.
- Pitann B, Schubert S, Mühling KH. Decline in leaf growth under salt stress is due to an inhibition of H+‐pumping activity and increase in apoplastic pH of maize leaves. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 2009; 172(4): 535-43.
- Zolman BK, Bartel B. An Arabidopsis indole-3-butyric acid-response mutant defective in PEROXIN6, an apparent ATPase implicated in peroxisomal function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2004; 101(6): 1786-91.
10. Guilfoyle T, Hagen G, Ulmasov T, Murfett J. How does auxin turn on genes?. Plant physiology. 1998; 118(2): 341-7.
11.Strader LC, Chen GL, Bartel B. Ethylene directs auxin to control root cell expansion. The Plant Journal. 2010; 64(5): 874-84.
12. Velikova V, Yordanov I, Edreva A. Oxidative stress and some antioxidant systems in acid rain-treated bean plants: protective role of exogenous polyamines. Plant science. 2000; 151(1): 59-66.
13. Bates LS, Waldren RP, Teare ID. Rapid determination of free proline for water-stress studies. Plant and soil. 1973; 39(1): 205-7.
14. Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PT, et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical chemistry. 1956; 28(3): 350-6.
15. Lichtenthaler HK. [34] Chlorophylls and carotenoids: pigments of photosynthetic Ecotoxicology and environmental safety. 2005; 60(3): 324-49.
16.biomembranes. InMethods in enzymology; 1987; (350-382).
17. Aebi H. Catalase in vitro. InMethods in enzymology. 1984 ;105: 121-126.
18. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry. 1976; 72(1-2): 248-54.
19. Nakano Y, Asada K. Purification of ascorbate peroxidase in spinach chloroplasts; its inactivation in ascorbate-depleted medium and reactivation by monodehydroascorbate radical. Plant and cell physiology. 1987; 28(1): 131-40.
20. Beauchamp C, Fridovich I. Superoxide dismutase: improved assays and an assay applicable to acrylamide gels. Analytical biochemistry. 1971 ; 44(1): 276-87.
21. Jaleel CA, Manivannan PA, Wahid A, Farooq M, Al-Juburi HJ, et al. Drought stress in plants: a review on morphological characteristics and pigments composition. Int. J. Agric. Biol. 2009; 11(1): 100-5
22. Doğan M. Antioxidative and proline potentials as a protective mechanism in soybean plants under salinity stress. African Journal of Biotechnology. 2011; 10(32): 5972-8.
23. Wang Y, Nii N. Changes in chlorophyll, ribulose bisphosphate carboxylase-oxygenase, glycine betaine content, photosynthesis and transpiration in Amaranthus tricolor leaves during salt stress. The Journal of Horticultural Science and Biotechnology. 2000; 75(6): 623-7.
24. Askari H, Edqvist J, Hajheidari M, Kafi M, Salekdeh GH. Effects of salinity levels on proteome of Suaeda aegyptiaca leaves. Proteomics. 2006; 6(8): 2542-54.
25. Ashraf MP, Harris PJ. Potential biochemical indicators of salinity tolerance in plants. Plant science. 2004; 166(1): 3-16.
26. Parida AK, Das AB. Salt tolerance and salinity effects on plants: a review. Woodward AW, Bartel B. Auxin: regulation, action, and interaction. Annals of botany. 2005; 95(5): 707-35.
27. Shao HB, Chu LY, Lu ZH, Kang CM. Primary antioxidant free radical scavenging and redox signaling pathways in higher plant cells. International Journal of Biological Sciences. 2008; 4(1): 8.
28. Ivanchenko MG, den Os D, Monshausen GB, Dubrovsky JG, Bednářová A, Krishnan N. Auxin increases the hydrogen peroxide (H2O2) concentration in tomato (Solanum lycopersicum) root tips while inhibiting root growth. Annals of botany. 2013; 112(6): 1107-16.
29. Delauney AJ, Hu CA, Kishor PB, Verma DP. Cloning of ornithine delta-aminotransferase cDNA from Vigna aconitifolia by trans-complementation in Escherichia coli and regulation of proline biosynthesis. Journal of Biological Chemistry. 1993; 268(25): 18673-8.
30. Iqbal N, Umar S, Khan NA, Khan MI. A new perspective of phytohormones in salinity tolerance: regulation of proline metabolism. Environmental and Experimental Botany. 2014; 100: 34-42.
31. Kuznetsov VV, Shevyakova NI. Stress responses of tobacco cells to high temperature and salinity. Proline accumulation and phosphorylation of polypeptides. Physiologia Plantarum. 1997; 100(2): 320-6.
32.Skopelitis DS, Paranychianakis NV, Paschalidis KA, Pliakonis ED, et al. Abiotic stress generates ROS that signal expression of anionic glutamate dehydrogenases to form glutamate for proline synthesis in tobacco and grapevine. The Plant Cell. 2006; 18(10): 2767-81.
33.Dmitriev A, Djatsok J, Grodzinsky D. The role of Ca 2+ in elicitation of phytoalexin synthesis in cell culture of onion (Allium cepa L.). Plant cell reports. 1996; 15(12): 945-8.
34. Orabi SA, Salman SR, Shalaby MA. Increasing resistance to oxidative damage in cucumber (Cucumis sativus L.) plants by exogenous application of salicylic acid and paclobutrazol. World Journal of Agricultural Sciences. 2010; 6(3): 252-9.
35. Santos CV. Regulation of chlorophyll biosynthesis and degradation by salt stress in sunflower leaves. Scientia Horticulturae. 2004; 103(1): 93-9.
36. Ohto MA, Hayashi S, Sawa S, Hashimoto-Ohta A, Nakamura K. Involvement of HLS1 in sugar and auxin signaling in Arabidopsis leaves. Plant and cell physiology. 2006; 47(12): 1603-11.
37. Murakeözy ÉP, Nagy Z, Duhazé C, Bouchereau A, Tuba Z. Seasonal changes in the levels of compatible osmolytes in three halophytic species of inland saline vegetation in Hungary. Journal of Plant Physiology. 2003; 160(4): 395-401.
38. Parida A, Das AB, Das P. NaCl stress causes changes in photosynthetic pigments, proteins, and other metabolic components in the leaves of a true mangrove, Bruguiera parviflora, in hydroponic cultures. Journal of Plant Biology. 2002; 45(1): 28-36.
39. Parihar P, Singh S, Singh R, Singh VP, Prasad SM. Effect of salinity stress on plants and its tolerance strategies: a review. Environmental Science and Pollution Research. 2015; 22(6): 4056-75.
40.Chinnusamy V, Jagendorf A, Zhu JK. Understanding and improving salt tolerance in plants. Crop Science. 2005;45(2):437-48.
41. Raza SH, Athar HR, Ashraf M, Hameed A. Glycinebetaine-induced modulation of antioxidant enzymes activities and ion accumulation in two wheat cultivars differing in salt tolerance. Environmental and Experimental Botany. 2007; 60(3): 368-76.
42. Foyer CH, Noctor G. Redox sensing and signalling associated with reactive oxygen in chloroplasts, peroxisomes and mitochondria. Physiologia plantarum. 2003; 119(3): 355-64.
43. Gossett DR, Banks SW, Millhollon EP, Lucas MC. Antioxidant response to NaCl stress in a control and an NaCl-tolerant cotton cell line grown in the presence of paraquat, buthionine sulfoximine, and exogenous glutathione. Plant Physiology. 1996; 112(2): 803-9.
44. Mittova V, Guy M, Tal M, Volokita M. Response of the cultivated tomato and its wild salt-tolerant relative Lycopersicon pennellii to salt-dependent oxidative stress: increased activities of antioxidant enzymes in root plastids. Free radical research. 2002; 36(2): 195-202.
45. Nounjan N, Nghia PT, Theerakulpisut P. Exogenous proline and trehalose promote recovery of rice seedlings from salt-stress and differentially modulate antioxidant enzymes and expression of related genes. Journal of plant physiology. 2012; 169(6): 596-604.