مقدمه

در طی 20 سال گذشته سیستم­های بیانی مبتنی بر گیاهان تراریخت به‫عنوان یک سیستم  جایگزین ارزان، ایمن و موثر  برای تولید مقادیر بالای پروتئین­های نوترکیب توجه فراوانی را به خود جلب کرده­اند (1و 2). پیش بینی شده است که این سیستم بتواند جایگزین سیستم­های موجود مبتنی بر میکروارگانیسم­ها، کشت سلول­های حیوانی و یا حیوانات تراریخت شود (3 و 4). بنابراین، گیاهان می­توانند به‫عنوان بیوراکتوری برای تولید انواع پروتئین­های نوترکیب مورد استفاده قرار گیرند (5 و 6). امروزه برخی از آنزیم­ها و پروتئین­های نوترکیب تولید شده در گیاهان به مرحله تجاری رسیده­اند که از آن جمله می­توان به کلاژن نوع 1 انسانی تولید شده در توتون (7)، تریپسین گاوی تولید شده در ذرت (TrypZean, Sigma-Aldrich) (5)، لیزوزیم و لاکتوفرین انسانی تولید شده در برنج (8 و 9) و .... اشاره کرد (5).

امروزه تولید واکسن های خوراکی در  سیستم­های تولید مبتنی بر گیاهان اهمیت پیدا کرده است (2 و 10-15). بیان آنتی­ژن‫ها در بافت­های گیاهی به‫عنوان جایگزین مهمی برای برآوردن نیازهای جهانی به واکسن­های ارزان‫تر، ایمن­تر و با کیفیت­تر مطرح شده­اند. تعداد زیادی واکسن مبتنی بر گیاهان تولید شده­اند که برخی از آن‫ها در مراحل آزمایش­های بالینی قرار دارند. به‫منظور تولید واکسن­های نوترکیب خوراکی در گیاهان انتخاب گیاه میزبان و نوع پیش‫بر برای بیان کارآمد آنتی­ژن در گیاهان از اهمیت زیادی برخوردار است (6). در بین گیاهانی که به‫عنوان بیوراکتور برای تولید واکسن­های خوراکی مورد استفاده قرار گرفته­اند می­توان به توتون، سیب زمینی، گوجه فرنگی، ذرت، برنج، موز، سیب، کاهو و... اشاره نمود. با استفاده از روش­های مهندسی ژنتیک از این گیاهان برای تولید انواع واکسن­های باکتریایی، ویروسی، انگلی و سیستم ایمنی استفاده شده است (4). در اغلب این گیاهان آنتی­ژن‫ها به‫طور هدفمند در بافت‫های خوراکی بیان شده اند. انتخاب نوع پیش‫بر در بیان هدفمند و بالای آنتی­ژن در بافت­های گیاهی از اهمیت بالایی برخوردار است (6). انتخاب پیش‫بر در میزان رونویسی و بیان تراژن موثر بوده و علاوه بر آن بر مرحله بیان، و محل بیان (نوع بافت) هم تاثیر دارد. پیش‫بر عمومی ویروس موزائیک گل کلم (CaMV35S) به دلیل قدرت بالا و بیان دایمی کاربرد زیادی در روش­های مهندسی ژنتیک دارد. اگرچه بیان بالای یک پروتئین نوترکیب از نظر اقتصادی اهمیت زیادی دارد ولی بیان پروتئین در بافت­های غیرهدف گیاهان از نظر کاربردی چندان مطلوب نیست. بنابراین انتخاب پیش‫بری با کارایی بالا و همچنین بیان هدفمند در بافت­ها می­تواند در کارایی تولید واکسن­های نوترکیب در سیستم­های گیاهی بسیار موثر باشد (16 و 17).

سیب زمینی به‫عنوان یکی از گیاهانی است که در تولید واکسن­های خوراکی مورد استفاده قرار گرفته است (3 و 5 و 18). انتخاب پیش‫بر مناسب برای بیان آنتی­ژن در غده‫های خوراکی گیاه سیب­زمینی می­تواند در تولید واکسن بسیار کارآمد باشد. پاتاتین یکی از پروتئین­های مهم ذخیره­ای در غده­های سیب­زمینی است. پیش‫بر پروتئین­های ذخیره­ای در بذرها و اندام­های تولید مثلی رویشی (مانند غده­ها) گیاهان، پیش‫برهای قدرتمندی هستند که باعث سنتز فراوان پروتئین مربوط در آن بافت یا اندام خاص می­شوند (19 و 20). ژن­های رمز کننده پروتئین پاتاتین به‫دو دسته تقسیم می­شوند: دسته اول (Class I) آن‫هایی هستند که در غده­های در حال تشکیل بیان می­شوند. بیان این دسته از ژن­های پاتاتین در برگ­ها هم توسط سوکروز القا می­شود. دسته دوم ژن‫های پاتاتین (Class II) نه تنها در غده­ها بلکه در ریشه­ها هم بیان می­شوند. بیان این دسته از ژن­ها توسط سوکروز القا نمی­شود (20). بنابراین، استفاده از پیش‫بر ژن­های پاتاتین دسته اول (Class I) می­تواند در بیان اختصاصی پروتئین­های نوترکیب در غده­ها موثر باشد.

قبل از انتقال دایمی یک تراژن به گیاه ارزیابی اجزای سازه ژنی و کارایی بیان آن می­تواند شانس موفقیت تولید گیاه تراریخت و در نتیجه تولید محصول نهایی (واکسن) را افزایش دهد. بدین منظور از روش­های مختلفی استفاده می­شود که معمول­ترین آن‫ها استفاده از بیان موقت با روش اگرواینفیلتریشن است. از این روش برای آنالیز کارکردی ژن­ها و پیش‫برهای مختلف در زمان کوتاه استفاده می­شود (21-24). اگرواینفیلتریشن روشی بسیار ساده و ارزان است و با استفاده از آن می­توان فعالیت ژن را در بافت­های گیاهان مختلف غربالگری کرد (25).

در این پژوهش کارایی پیش‫براختصاصی غده سیب زمینی (پاتاتین- Pat1) در مقایسه با پیش‫بر دایمی CaMV35S با بیان زیرواحد کوچک آنتی­ژن هپاتیت ب HBsAg  در برگ و غده­های گیاه سیب زمینی با استفاده از روش اگرواینفیلتریشن مورد بررسی قرار گرفت.    

مواد و روش‌ها

همسانه­سازی پیشبر Pat: جهت جداسازی پیشبر اختصاصی پاتاتین (Pat1) از گیاه سیب­زمینی (رقم مارفونا)، ابتدا غده­های گیاه سیب­زمینی در شرایط گلخانه کشت شدند. از نمونه­های برگی برای استخراج DNA ژنومی با روش اصلاح شده دلاپورتا استفاده شد (26).

برای جدا کردن پیش‫بر Pat1 از DNA استخراج شده از واکنش زنجیری پلیمراز (PCR) با استفاده از  آنزیمPfu­ پلیمراز و آغازگرهای اختصاصی (F-Pat1: 5′-cggaagcttgagtctagaaatcataatgtt-3′; R-Pat1: 5′- cgcggatccttttgttggtgctttgagcatataac-3′) استفاده شد. شرایط و چرخه­های PCR عبارت بودند از : دمای 94 درجه سانتی‫گراد به‫مدت 4 دقیقه واسرشت­سازی اولیه و 35 چرخه ]  94 درجه سانتی‫گراد، 1 دقیقه، 63 درجه سانتی‫گراد، 1 دقیقه  و 72 درجه سانتی‫گراد ، 1 دقیقه[ و دمای پایانی 72 درجه سانتی‫گراد  به‫مدت 4 دقیقه. آغازگرها بر اساس توالی ژنی موجود در سایت NCBI با شماره دسترسی A0825.1 و با استفاده از نرم افزار Oligo نسخه 6 طراحی شد.

این پیش‫بر بعد از جداسازی و توالی یابی و تایید نهایی با استفاده از آنزیم­های برشی HindIII و BamHI بریده شده و جایگزین پیش‫بر CaMV35 در ناقل دوگانه pBI121 شدند. سازه حاصل pBI-Pat1-Gus نامیده شد.

سنتز توالی­ اختصاصی HBsAg برای سیب زمینی و ساخت سازه های  pBI-Pat-HBP و pBI-35S-HBP

توالی نوکلئوتیدی آنتی‫ژن HBsAg از سایت NCBI برای سیب­زمینی با استفاده از نرم افزار OPTIMIZER (http://genomes.urv.es/OPTIMIZER) بهینه­سازی کدنی شد. به‫منظور افزایش کارایی بیان ژن و هدف­گیری در شبکه اندوپلاسمی توالی قطعات KOZAK و SEKDEL به آن اضافه شد. همچنین جایگاه­های اختصاصی برای آنزیم­های BamHI و SacI در ابتدا و انتهای توالی اضافه شد (شکل 1). توالی­های طراحی شده توسط شرکت Millgene فرانسه سنتز شده و به‫صورت کلون­شده در وکتورهای pMAT  تحویل گرفته شد (شکل 1).

به‫منظور ساخت سازه­های ژنی pBI-PatHBP و pBI-35SHBP که به‫ترتیب در آن‫ها ژن بهینه­سازی شده HBsAg برای سیب­زمینی تحت کنترل پیش‫بر اختصاصی غده (Pat1) و پیش‫بر دایمی CaMV35S قرار دارند ژن  HBsAg جایگزین ژن gus در سازه­های pBI-35S-Gus (pBI121) و pBI-Pat1-Gus شد. بدین‫منظور ژن gus توسط آنزیم­های BamHI و SacI از سازه‫های فوق خارج و سپس قطعه 720 جفت بازی HBP در همان جایگاه برشی وارد شد. سازه­ها با روش هضم اختصاصی با آنزیم­های برشی و همچنین PCR تایید شدند. سازه­های نهایی با استفاده از روش انجماد- ذوب به اگروباکتریوم A. tumefacience LBA4404 منتقل شدند.

HBs-PO

gcgga tcc acc atg gaa aat att act tct gga ttt ctt gga cct ctt ctt gtt ttg caa gct gga tct ttt ttg ttg act aga atc ctt act att cca caa agt ctt gat tcg tgg tgg act tct ctt aat ttt ctt gga gga act act gtt tgt ctt gga caa aat tcg caa tct cca act tct aat cat tct cca act tct tgt cct cca act tgt cct gga tat cgt tgg atg tgt ctt cgt cgt ttt att att ttt ctt ttt att ctt ctt ctt tgt ctt att ttt ttg ttg gtt ctt ctt gat tat caa gga atg ttg cct gtt tgt cct ctt att cca gga tct tct act act agt act gga cca tgt aga act tgt act act cct gct caa gga act tct atg tat cct tct tgt tgt tgt act aaa cct tcg gat gga aat tgt act tgt att cct att cca tct tct tgg gct ttt gga aaa ttt ctt tgg gaa tgg gct tct gct cgt ttt tct tgg ctt agt ttg ctt gtt cca ttt gtt caa tgg ttt gtt gga ctt tct cct act gtt tgg ctt tct gtt att tgg atg atg tgg tat tgg gga cca agt ctt tat agt att ttg agt cct ttt ttg cca ctt ttg cca att ttt ttt tgt ctt tgg   gtt tat att tct gaa aaa gat gaa ctt taa gag ctc acc

شکل 1: توالی نوکلئوتیدی اصلاح­شده آنتی­ژن HBsAg برای گیاه سیب­زمینی (HBs-PO) (بالا) و ناقل پلاسمیدی حاوی قطعه سنتز شده (پایین)

ارزیابی بیان موقت و سنجش  آنتی ژن HBsAg

برگ­ها و غده­های گیاه سیب­زمینی به قطعات کوچک 1 سانتی­متری برش خورده و در سوسپانسیون اگروباکتریوم­ حاوی سازه­های pBI-Pat-HBP و pBI-35S-HBP به‫طور جداگانه غوطه­ور شدند. علاوه بر محیط LB از محیط  Infection (محیط ½ MS) هم به‫عنوان محیط سوسپانسیون باکتریایی برای تیمار استفاده شد. بدین‫منظور کشت شبانه باکتریایی در محیط LB با استفاده از سانتریفوژ رسوب داده شد و سپس در حجم برابری از محیط ½ MS حل شد. به‫منظور نفوذ بهتر باکتری‫ها در نمونه­های گیاهی از دسیکاتور تحت خلا به‫مدت 15 دقیقه استفاده شد. این کار 3 بار انجام شد. نمونه­ها به ظروف پتری حاوی سه لایه کاغذ صافی استریل منتقل شده و به‫مدت 4 روز در تاریکی قرار گرفتند. 

نمونه­های تیمار شده لیوفیلایز شده و سپس در  بافر استخراج پروتئین (0.05M NaHPO4 PH 7.5, 0.15M NaCl, 1 mM EDTA, 0.3% Tween 20, and 4mM PMSF) ساییده شده و به‫مدت یک شب در4 درجه سانتی­گراد قرار گرفتند. نمونه­ها به‫مدت 20 دقیقه با دور 35000 سانتریفیوژ شدند. روشناور حاوی پروتئین جهت اندازه­گیری مقدار آنتی­ژن HBsAg در آزمون الایزا مورد استفاده قرار گرفت. آزمون الایزا با استفاده از کیت HBsAg ONE شرکت DIA-PRO ایتالیا و دستورالعمل مربوط انجام شد. جذب نمونه­ها با استفاده از دستگاه الایزا در طول موج 450 نانومتر اندازه‫گیری شد. مقدار تولید آنتی­ژن HBsAg براساس کنترل مثبت و منفی کیت الایزا محاسبه شد.

آنالیز آماری

آزمایش­ها بر پایه طرح کاملا تصادفی و  با سه تکرار انجام شد. تجزیه و تحلیل داده­ها با نرم افزار SPSS صورت گرفت. همچنین مقایسه میانگین داده­ها با استفاده از آزمون دانکن در سطح احتمال 1 درصد انجام شد.

نتایج

یکی از مزایای سیستم بیان موقت اگرواینفیلتریشن در مقایسه با تولید گیاهان تراریخت، بیان بالای پروتئین­های نوترکیب در آنها است (27).  این امر به‫دلیل حذف "اثرات مکانی" در سیستم بیان موقت است چون در این سیستم تراژن به‫طور تصادفی وارد مناطقی از ژنوم هسته­ای که دارای فعالیت­های رونویسی نامعلومی هستند نمی­شود. زمان کوتاهتر و سطوح بالای انباشت پروتئین­های نوترکیب، سیستم بیان موقت را پلتفرمی برای تولید ترکیبات دارویی در گیاهان تبدیل کرده است. علاوه برآن سیستم­های بیان موقت روشی سریع و ارزان برای بررسی کارایی اجزای ژن‫ها به‫حساب می­آیند (27).

دستیابی به بیان بالای پروتئین­های نوترکیب در گیاهان تراریخت به‫عوامل مختلفی بستگی دارد که از آن جمله می‫توان به ترجیح کدونی، بیان پایدار و کارامد ژن خارجی و ... اشاره نمود. با این وجود، چگونگی، زمان و محل بیان ژن به‫وسیله مجموعه­ای از مکانیسم­های کنترلی تنظیم می‫شود. پیش‫برها به‫عنوان یکی از عوامل تنظیمی اصلی نقش مهمی در بیان ژن دارند. بنابراین، قبل از انتقال دایمی یک سازه ژنی به گیاهان، بررسی کارایی اجزای سازه به‫ویژه پیش‫برها و ژن هدف بسیار اهمیت دارد. در این مطالعه کارایی پیش‫بر اختصاصی غده پاتاتین و ژن اصلاح کدون شده HBsAg برای سیب­زمینی در سیستم بیان موقت مورد بررسی قرار گرفته است.

ساز­ه­های ژنی  

ژن­ سنتزی اصلاح شده HBsAg برای سیب زمینی با هضم توسط آنزیم­های BamHI و SacI از پلاسمیدهای pMA-T حاوی HBsAg (شکل 1) جدا شده و در جایگاه­های برشی مناسب خود در ناقل های دوگانه pBI121، pBIPat1GUS جایگزین ژن Gus شدند. به‫منظور درستی همسانه­سازی، سازه­های جدید با روش­های هضم آنزیمی و PCR با پرایمرهای اختصاصی تایید شدند (شکل 2 و 3). سازه­های جدید به‫ترتیب pBI35S-HBP و pBIPat-HBP نامیده شدند (شکل 4).

شکل 2: تائید سازه pBI-35S-HBT (الف) و pBI-Pat1-HBP (ب) با هضم آنزیمی. 1 (الف) و 3 (ب) نشانگر مولکولی تعیین اندازه DNA (GeneRuler DNA Ladder, Thermo Fisher Scientific)، 2 (الف) و 4 (ب) هضم آنزیمی با دو آنزیم BamHI و SacI ؛ 3 (الف) و 1 (ب) هضم آنزیمی سازه با دو آنزیم HindIII و EcoRI، 4 (الف) و 2 (ب)- هضم آنزیمی با دو آنزیم HindIII و BamHI .

شکل 3: تائید سازه­های پلاسمیدی با آزمون PCR با استفاده از پرایمرهای اختصاصی HBsAg. 1- نشانگر مولکولی تعیین اندازه DNA (GeneRuler DNA Ladder, Thermo Fisher Scientific)، 2- کنترل منفی آب، 3- کنترل مثبت (سازه pMA-T). 4- pBI-35S-HBP 5- pBI-Pat1-HBP

شکل 4: نقشه سازه­های pBI-Pat-HBP و pBI-35S-HBP. RB و LB- بترتیب ناحیه سرحد مرزی راست و چب، P-nos- پیشبر نئوپالین سنتاز، nptII- ژن مقاومت به کانامایسین، T-nos- پایانبر نئوپالین سنتاز، Pat1 و 35S به‫ترتیب پیشبرPatatin و CaMV35S، HBP – توالی آنتی ژن HBsAg و HindIII، BamHI و EcoRI آنزیم­های برشی.

بیان HBsAg

سنجش میزان بیان آنتی­ژن پروتئینی HBsAg در بافت‫های برگی و غده­ای سیب زمینی نشان داد که بیان این آنتی ژن تحت کنترل پیشبر CaMV35S در همه بافت­های برگی و غده­ای اتفاق می­افتد (شکل 5) و از این جهت تفاوت معنی­داری بین بافت­های مختلف مشاهده نمی­شود. میزان بیان آنتی­ژن در بافت­های غده در دو

محیط تلقیح مختلف یکسان است که این وضعیت در برگ­ها هم قابل مشاهده بود. با توجه به غیر اختصاصی بودن پیش‫بر CaMV35 این نتیجه دور از انتظار نیست. پیش‫بر CaMV35S یک پیشبر دایمی است که ژن­های تحت کنترل آن در همه بافت­ها  و در همه شرایط بیان می­شوند (28).

شکل 5: میزان بیان آنتی­ژن HBsAg تحت کنترل پیشبر CaMV35s در سازه ژنی pBI-35S-HBP با استفاده از اگرواینفیلتریشن در بافت­ها و محیط­های تلقیح مختلف. PT- غده سیب زمینی، PL- برگ سیب زمینی. AM- محیط تلقیح اگروباکتریوم، IM، محیط تلقیح آلوده­سازی. حروف متفاوت نشان­دهنده معنی­دار بودن میانگین­ها در سطح اطمینان 95 درصد است.  

بررسی بیان آنتی­ژن واکسنی HBsAg تحت کنترل پیش‫بر اختصاصی غده پاتاتین نشان داد که این پیش‫بر باعث بیان آنتی­ژن در غده­های سیب زمینی می­شود (شکل 6). کارایی بیان این پیشبر مشابه پیشبر عمومی CaMV35S است چون میزان بیان آنتی­ژن توسط هر دو پیش‫بر حدود 3 میکروگرم/گرم وزن تر غده­ها است. همان­گونه که در شکل 6 مشاهده می­شود پیش‫بر پاتاتین با وجود اختصاصی بودن، بیان آنتی ژن HBsAg را در

برگ­های گیاهان سیب­زمینی هم القا می­نماید، هر چند میزان بیان در برگ­ها بسیارکمتر از غده­ها است. براساس گزارش­های موجود پیش‫بر پاتاتین کلاس I به‫عنوان یک پیش‫بر اختصاصی غده شناخته شده است اما در سایر اندام­های گیاه سیب زمینی مانند برگ­ها، ساقه­ها و ریشه‫ها هم تا حدی باعث بیان ژن­ها می­شود (29-31). از طرف دیگر گزارش شده است که ساکارز باعث القای پیش‫بر پاتاتین نوع I در برگ­ها می­شود (20).

شکل 6: میزان بیان آنتی­ژن HBsAg تحت کنترل پیشبر Pat1 در سازه ژنی pBI-Pat1-HBP با استفاده از اگرواینفیلتریشن در بافت­ها و محیط­های تلقیح مختلف. PT- غده سیب زمینی،PL- برگ سیب زمینی، AM- محیط تلقیح اگروباکتریوم، IM، محیط تلقیح آلوده­سازی. حروف متفاوت نشان­دهنده معنی­داربودن میانگین­ها در سطح احتمال 95 درصد است.