نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 کارشناس ارشد بافت شناسی- جنین شناسی، دانشگاه دامغان، دانشکده زیست شناسی، دامغان، ایران
2 استادیار گروه سلولی و ملکولی، دانشگاه دامغان، دانشکده زیست شناسی و پژوهشکده علوم زیستی، دامغان، ایران
چکیده
هدف: در این مطالعه اثر ضد سرطانی CM بر سلولهای MCF7 در شرایط کشت آزمایشگاهی بررسی شد.
مواد و روش‌ها: سلولهای بنیادی چربی از چربی ناحیه شکم خانمهای سزارینی بیمارستان ولایت دامغان و با کسب رضایت نامه استخراج شد. CM از کشت پاساژ چهارم hASCs در مدیوم فاقد سرم پس از 72 ساعت، تهیه شد. سلولهای MCF7 در معرض CM بهمدت 24 و 48 ساعت قرار گرفتند و سپس سرعت تکثیر و میزان بقای سلولها و همچنین بیان ژنهای آپوپتوتیک با روشهای MTT، شمارش سلولی (هموسایتومتر) وRT-PCR بررسی شد.
نتایج: سلولهایی که با CM بهمدت 24 و 48 ساعت تیمار شده بودند، کاهش معنیداری در سرعت تکثیر و میزان بقا در مقایسه با سلولهایی که در محیط حاوی سرم کشت داده شده بودند (کنترل)، نشان دادند. همچنین افزایش معنیداری در بیان ژن کاسپاز 3، در مقایسه با سلولهایی که در محیط حاوی سرم کشت داده شده بودند مشاهده شد. در حالیکه بیان ژن کاسپاز 9 فقط پس از 24 ساعت القا، افزایش معنیداری را نشان داد.
نتیجهگیری: محیط کاندیشنال از طریق فعال کردن کاسپازها، آپوپتوزیس را در سلولهای سرطانی MCF7 القا کرده، سرعت تکثیر و بقا را نیز کاهش داد. بنابراین محیط کاندیشنال بهعنوان مکمل میتواند بههمراه دیگر روشهای درمانی ضد سرطانی بهکار برده شود.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Modulation of MCF7 behavior treated by human adipose stem cells conditioned medium
نویسندگان [English]
- f motaghi 1
- m h 2
- m gh 2
1 -
2 -
چکیده [English]
Aim: In the current study, CM anticancer function of the MCF7 cells was investigated in vitro.
Material and Methods: Adipose stem cells were extracted from the cesarean women’s abdominal fat with their written informed consent at the Velayat hospital, Damghan. CM was prepared for fourth passage of hASCs that was cultured in serum-free medium for 72h. MCF7 cells were exposed to CM for 24 and 48 hours. Then cell proliferation rate, survival and apoptotic gene expression were determined using MTT, cell counting (hemocytometer) and RT-PCR.
Results: CM-treated MCF7 for 24 and 48h, showed a significant decrement in cell proliferation and viability as compared to the cells cultured in medium containing serum (control). In addition, caspase3 gene expression of CM-induced cells was increased significantly at 24 and 48h as compared to the control group. While, CM-treated cells showed a significant increment of caspase9 gene expression after 48h induction.
Conclusion: It was concluded that CM induced apoptosis by activation of caspases and reduced proliferation rate and survival of MCF7 cancer cells. Therefore, it seems that conditioned medium can be used as a supplement with other anti-cancer therapies.
کلیدواژه‌ها [English]
- MCF7
- Conditioned medium
- Proliferation
- Caspase
مقدمه
سرطان پستان شایعترین و دومین سرطان در زنان است، که با متاستاز به نقاط دیگر بدن مثل کبد، مغز، ریه و استخوان منجر به مرگ میشود (1-2). تحقیقات نشان میدهد که طی20 سال اخیر بروز سرطان پستان 50 تا 100 درصد افزایش یافته است. هنوز علت سرطان پستان بهطور کامل شناخته نشده اما عوامل گوناگونی مثل فاکتورهای ژنتیکی، محیطی و هورمونها در ابتلا به سرطان نقش دارند (3). همچنین چاقی با افزایش خطر سرطان پستان در ارتباط است (4). سلولهایMCF7 (Michigan Cancer Foundation-7) مخفف از بنیاد سرطان میشیگان 7 است و برای اولین بار در سال 1970 از تومور پستان یک زن 69 ساله استخراج شد (5-6). این سلولها، در شرایط کشت آزمایشگاهی ساختار منسجمی داشته و چسبندگی بین سلولی محکمی را نشان میدهند (2). این سلولها دارای گیرندههای استروژنی و پروژسترونی هستند و از سرعت تکثیر بسیار بالایی برخوردارند. بهطوریکه تکثیر سلولها میتواند از طریق تیمار با ضد استروژن‌ها مهار شود (2, 6). بیان گیرندههای استروژنی در سطح سلولهای MCF7، باعث شده که این سلولها اغلب به شیمی درمانی پاسخ دهند (2). امروزه پس از برداشتن کل پستان، به‌منظور بازگرداندن فرم طبیعی و حفظ آناتومی ارگان از بافت چربی خود بیمار به محل جراحی پیوند زده میشود (7). از آنجاکه بافت پیوند شده حاوی سلولهای بنیادی است، مشاهده شده ریزمحیطی که این سلولها در محل پیوند ایجاد میکنند میتواند بر سلولهای سرطانی تاثیر گذاشته و مانع از بدخیم شدن آنها شود (7).
سلولهای بنیادی چربی انسانی Adipose-derived stem cells(ASCs) اولین بار توسط Zuk و همکارانش شناسایی شدند (8). فراوانترین و در دسترسترین سلولهای ASCs، از چربی شکم و از طریق لیپوساکشن بهدست میآید که بسیار آسان، امن و بیخطر است و مشکلات اخلاقی و عفونتی را ایجاد نمیکند (7, 9-10). مطالعات اخیر نشان داده هر گرم بافت چربی، ظرفیت تولید سلولهای بنیادی بیشتری در مقایسه با همان میزان از مغزاستخوان یا بند ناف را دارد (1, 11). ASCها به آسانی استخراج میشوند و سرعت تکثیر بالایی دارند، درحالیکه پتانسیل تمایزیشان را حفظ میکنند و چندتوان هستند (1, 11-12) و همچنین خاصیت چسبندگی به کف ظرف کشت را دارند (13). Chen و همکارانش، وجود سیتوکینها در محیط کاندیشنال جمعآوری شده از سلولهای بنیادی مزانشیمی در شرایط هیپوکسی را گزارش دادند. مطالعات نشان داده در محیط کاندیشنال فاکتورهای زیادی ازجمله VEGF، bFGF، EGF، TGF-b، HGF، HGF، PDGF، KGF، TNF و IL-6 وجود دارند (14). این فاکتورها که میکرووزیکول (Microvesicles)، سکروتوم (Secretome) یا اگزوزوم (Exosome) نام دارند، در محیط کشت سلولهای بنیادی شناسایی شده اند که به این محیط، محیط کاندیشنال (CM مخفف Conditioned Medium) میگویند. از آنجا که محیط کاندیشنال فاقد سلول است، از وقوع واکنشهای ایمنی جلوگیری میکند و مشکل رد پیوند نیز وجود ندارد. همچنین محیط کاندیشنال دارای اثر آنتی اکسیدانتی و ضد توموری است (7, 15-16). تعداد سلول، نوع سلول، شرایط کشت، نوع محیط کشت و تعداد پاساژها بر کیفیت محیط کاندیشنال تاثیر میگذارند. محیط کاندیشنال مزیتهای زیادی دارد از جمله اینکه بهراحتی تولید، فریز، بسته بندی شده و قابل انتقال است که بهخاطر این ویژگیها، از محیط کاندیشنال برای تولید دارو استفاده میشود و همچنین نیاز به حفاظت ویژه مثل آنچه که در مورد سلولهای بنیادی باید رعایت شود، را ندارد (16). از طرفی برخلاف سلولهای بنیادی که جوش خورد نشان در محل پیوند، بسیار پایین بوده و احتمال خطر گسترش سرطان در آنها بالاست، محیط کاندیشنال این مشکلها را ندارد. همچنین برای درمان بیماران سریعا در دسترس بوده، بدون آنکه نیازی به جداسازی سلولهای بنیادی از بیمار باشد. البته برای بهدست آوردن محیط کاندیشنال بهتر است از محیط کشت مناسب حاوی ویتامینها، آمینواسیدها، گلوکز و سرم انسانی که از خون انسان بهدست میآید استفاده شود، که در موارد بالینی مناسبتر است (17). تنها نقص محیطکاندیشنال طول عمر کوتاه آن است (16). از کاربردهای درمانی محیط کاندیشنال میتوان به ترمیم زخم (14)، بهبود چین و چروک و پیری زودرس پوست در اثر اشعه ماوراء بنفش (9)، آلوپسی، رشد مو، بهبود اختلالات عصبی، نقصهای دستگاه اسکلتی و ریه، بیماریهای کلیوی، آسیبهای مربوط به کبد، التهاب نورونی (16)، سکتههای مغزی (10) و قلبی (18) اشاره نمود و همچنین بهعنوان محیط مناسبی در بلوغ اووسیت (19) و درمان برخی سرطانها از جمله سرطان پستان اشاره نمود. تحقیقات دیگری نیز نشان داده در سرطان پانکراس، که یک بیماری بسیار تهاجمی و کشنده است، تیمار با محیط کاندیشنال از طریق مهار بقای سلولهای سرطانی و توقف سلولها در مرحله G0/G1 باعث بهبود بیماری میشود. همچنین محیط کاندیشنال توانست میزان بقای سلولهای سرطان کولون و پروستات را نیز مهار کند (20). تیمار با محیط کاندیشنال بهطور موثر تکثیر و بقای سلولهای سرطانی کبد را مهار کرده و باعث آپوپتوزیس میشود (20-21).
محیط کاندیشنال چربی، تکثیر
سلولهای سرطان پستان MCF7 را نسبت به محیط کاندیشنال بند ناف، با سرعت بیشتری مهار میکند (22). گزارش دیگر مبنی بر آن است که محیط کاندیشنال مغزاستخوان، سرعت تکثیر را در سلولهای MCF7 افزایش میدهد (23). در رابطه با تاثیر محیط کاندیشنال سلولهای ASC انسانی بر سلولهای سرطانی MCF7 گزارشات ضد و نقیضی وجود دارد و هنوز مکانیسم دقیق آن مشخص نشده. لذا در این تحقیق از محیط کاندیشنال سلولهای بنیادی چربی انسانی، به‌منظور کاهش سرعت تکثیر، بقا استفاده شد و همچنین تاثیر محیط کاندیشنال بر بیان ژنهای کاسپاز 3 و 9 در سلولهای MCF7 مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روش‌ها
کشت سلولهای سرطانیMCF-7 : سلولهای سرطانی از انستیتو پاستور تهران خریداری شد و در محیط کشت DMEM-F12 حاوی سرم 10 درصد و در انکوباتور (دمای 37 درجه سانتی‌گراد، رطوبت 95 درصد و CO2 پنج درصد) نگهداری شدند (24-25). زمانیکه تراکم سلولها به 80 درصد میرسید، پاساژ سلولی انجام میشد. زمان تقریبی دو برابر شدن جمعیت این رده از سلولهای سرطانی حدود 38 ساعت بود.
تهیه و جمعآوری محیط کاندیشنال سلولهای بنیادی چربی انسانی: سلولهای بنیادی چربی از بافت چربی زیر جلدی شکم خانمهای سزارینی و با کسب رضایت نامه کتبی تهیه شد. محیط کاندیشنال، از پاساژ چهارم سلولهای بنیادی چربی انسانی جدا شد. با این روش که تعداد 105×5 سلول در یک فلاسک کشت داده شد و پس از آنکه سلولها 70 درصد فلاسک را پر کردند، محیط رویی خارج و دو مرتبه با PBS شستشو داده شد، سپس حدود 5/1 تا 2 میلیلیتر محیط DMEM تازه و فاقد سرم روی سلولها ریخته شد و مجددا فلاسکها به انکوباتور انتقال داده شدند. پس از گذشت 72 ساعت محیط رویی سلولها جمعآوری و بهمدت 5 دقیقه با دور rpm2000 سانتریفوژ شد. سپس محیط بهدست آمده را با فیلتر سرنگی 22/0 میکرومتر فیلتر کرده تا عاری از هرگونه سلول مرده یا قطعات سلولی باشد و به‌منظور استفاده بعدی در فریزر 70- درجه سانتی‌گراد ذخیره شد (13).
ارزیابی زمان دو برابر شدن سلولها با نشانگر MTT: سلولها با تراکم 104×2 در هر خانه پلیت 96 خانه و در 200 میکرولیتر محیط کشت حاوی سرم 10 درصد کشت داده شدند. زمانیکه تراکم سلولی به 70 درصد رسید، سرعت تکثیر سلولها در زمانهای 24 ، 48 و 72 ساعت با روش MTT بررسی شد. در این روش، محیط قبلی خارج شده و بههر کدام از خانهها 100 میکرولیتر محیط کشت بههمراه 10 میکرولیتر محلول MTT , Sigma) mg/ml5( افزوده و بهمدت 4 ساعت در شرایط 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. سپس 85 میکرولیتر از محیط رویی برداشته شده و 50 میکرولیتر DMSO اضافه شد و بهمدت 10 دقیقه انکوبه شده و در نهایت میزان جذب، در طول موج 540 نانومتر با دستگاه ELIZA reader (BioTek) اندازهگیری شد.
گروههای آزمایشی مورد مطالعه در این تحقیق به قرار زیر بود:
محیط کشت: سلولهای MCF7 که در محیط کشت اختصاصی DMEM-F12 و در غیاب سرم کشت داده شدند.
محیط کشت و سرم: سلولهای MCF7 که در محیط کشت اختصاصی و حاوی سرم 10درصد کشت داده شدند.
محیط کاندیشنال: سلولهای MCF7 که در محیط کاندیشنال سلولهای بنیادی چربی انسانی قرار گرفته بودند.
محیط کاندیشنال و سرم: سلولهای MCF7 که در محیط کاندیشنال حاوی سرم 10درصد کشت داده شدند.
ارزیابی میزان بقا سلولهای MCF7 با روش هموسایتومتری: سلولهای MCF7 تریپسینه شده و با تراکم 104 سلول در میلیلیتر در هر خانهی پلیت 96 خانه‌‌ای کشت داده شد. انکوباسیون در 37 درجه سانتی‌گراد صورت گرفت، تا جایی که میزان تراکم سلولی به حدود 80 درصد رسید. سوسپانسیون سلولی به نسبت مساوی با رنگ تریپان بلو مخلوط شد (ده میکرولیتر سوسپانسیون سلولی و ده میکرولیتر تریپان بلو) و شمارش سلولی بهوسیله میکروسکوپ نوری انجام شد. تریپان بلو با تخریب غشا در سلولهای مرده نفوذ میکند. از اینرو سلولهای مرده به رنگ آبی و سلولهای زنده بیرنگ دیده میشوند. سپس میزان حیات سلولی بر اساس فرمول (میانگین سلولهای رنگ نشده × 10000 × درجه رقت = تعداد کل سلولهای زنده) محاسبه شد.
بررسی بیان ژنها با روش RT-PCR
استخراج RNA: ابتدا استخراج RNA بر اساس کیت RNAX Plus صورت گرفت. غلظت RNA بهدست آمده با استفاده از جذب نوری در طول موج 260 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر اندازهگیری شد. هم چنین کیفیت RNA نیز با الکتروفورز ژل آگارز بررسی شد.
سنتز DNAمکمل (cDNA): این مرحله با توجه به دستورالعمل کیت ساخت cDNA نوع Fermentas-K1622 انجام شد. ابتدا یک میکروگرم RNA (معادل 10 میکرولیتر) بههمراه یک میکرولیتر الیگوپرایمر در میکروتیوپ ریخته و بهمدت 5 دقیقه در دمای 70 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد. سپس با افزودن بافر واکنش X5، dNTP و مهارکننده ریبونوکلئاز به محلول فوق، بهمدت 5 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد قرار گرفت. با اضافه کردن آنزیم Reverse transcriptase 60 دقیقه در دمای 42 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد و درنهایت 10 دقیقه در دمای 70 درجه سانتی‌گراد قرار گرفت.
بررسی بیان ژن ها با روشPCR: واکنش PCR در حجم 25 میکرولیتر انجام شد. برای اطمینان از توزیع یکسان مواد، ابتدا مخلوط مستر همهی اجزا آماده شد و سپس همراه با الیگوپرایمر و cDNA به میکروتیوپ منتقل شد. PCR در دستگاه ترمال سایکلر به اینصورت انجام شد: 2 دقیقه در 94 درجه، دمای 94 و 72 درجه سانتی‌گراد هر کدام 30 ثانیه. پس از اتمام 30 سیکل، 10 دقیقه در 72 درجه سانتی‌گراد قرار گرفت.
دمای Annealing بر اساسTm پرایمرها تعیین میشود. (Tm پرایمر ژنهای کاسپاز 3 و کاسپاز 9 بهترتیب 60 و 56 درجه سانتی‌گراد تعیین شد. از ژن GAPDH بهعنوان ژن کنترل داخلی استفاده شد. برای مشخص شدن تکثیر قطعه مورد نظر و بیان ژن، محصول PCR بهروش الکتروفورز با ژل آگارز 5/1 درصد بررسی شد. تمامی ژلهای آگارز تهیه شده با استفاده از دستگاه نمایشگر ژل بررسی شدند. تصویر ژلهای محصولاتPCR با نرم افزار ImageJ بررسی شد (26-27).
پرایمرهای مورد استفاده در این تحقیق، در جدول1 آورده شده است. پرایمرها به‌صورت لیوفلیزه از شرکت سیناژن تهیه گردید و براساس دستور ساخت شرکت سازنده تهیه شدند. به‌منظور آمادهسازی پرایمرها برای استفاده در واکنش به غلظت 10 پیکومولار بهترتیب زیر عمل شد:
1- افزودن مقدار آب تزریقی ذکرشده در چارت پرایمرها بههر تیوپ حاوی پرایمر
2- اسپین بهمدت چند دقیقه تا کاملا حل شود.
3- افزودن آب تزریقی تا غلظت نهایی به 10 پیکومولار برسد.
جدول 1: مشخصات پرایمرهای مورد استفاده برایPCR
|
Gene size |
Sequence |
Primer |
|
100 bp |
5´-TCTCATGCTGCAGAGGGTAC-3´ |
CAspAse3-f |
|
5´-TAATTCAATTGCAACTACCTGAC-3´ |
CAspAse3-r |
|
|
113 bp |
5´-CTGCTTAGGGTCGCTAATGC-3´ |
CAspAse9-f |
|
5´-GGGCCCTGGCCTTATGATG-3´ |
CAspAse9-r |
|
|
258 bp |
5´- GCTGGGGCTCATTTGCAGG-3´ |
GAPDH-f |
|
5´ –CGGAGGGGCCATCCACAGT-3´ |
GAPDH-r |
نتایج
مورفولوژی سلولها در شرایط کشت آزمایشگاهی:
سلولهایMCF7 در محیط کشت ظاهری چندوجهی و یا تقریبا کروی داشته، به شکل کلونیهایی که از تراکم سلولی بالایی برخوردار میباشند رشد میکنند. سلولها از سرعت تکثیر بسیار بالایی برخوردار بودند، بهطوریکه هسته سلولها و حتی تقسیم هستهها به‌وضوح در آنها مشاهده میشد (شکل 1-الف).
در (شکل 1-ب) نیز پاساژ چهارم سلولهای ASCs انسانی مشاهده میشود که ظاهر دوکی شکلی دارند و کاملا به کف ظرف کشت چسبیدهاند و سلولهای شناور به شکل کروی میباشند.
شکل1: بررسی سلولها در شرایط کشت آزمایشگاهی با میکروسکوپ اینورت. سلولها را در پاساژهای بالا نشان میدهد که به شکل کلونیهایی متشکل از سلولهای چندوجهی و یا کروی شکل میباشند و به کف فلاسک کشت چسبیده اند (فلش)، سلولهای مرده نیز به صورت شناور میباشند (سر فلش).
بررسی میانگین سلولهای MCF7 زنده پس از القا با محیط کاندیشنال
در این تحقیق میانگین سلولهای MCF7 زنده، پس از القا با محیط کاندیشنال در زمانهای 24، 48 و 72 ساعت مورد بررسی قرار گرفت. با توجه به (نمودار 1)، میانگین تعداد سلولهای MCF7 زنده که بهمدت 24 ساعت در معرض محیط کاندیشنال قرار گرفته بودند، کاهش معنیداری را در مقایسه با سلولهایی که در محیط DMEM حاوی سرم 10 درصد کشت داده شده بودند، نشان داد. بهطوریکه اختلاف معنیداری بین سلولهایی که در معرض محیط کاندیشنال بودند و سلولهایی که در محیط کشت فاقد سرم بودند، مشاهده نشد. تعداد سلولهای MCF7 زنده که در محیط کاندیشنال، مدت 48 ساعت قرار گرفته بودند، کاهش معنیداری را نسبت به سلولهایی که در محیط حاوی سرم بودند نشان داد. درحالیکه در این گروه تعداد سلولهای زنده در محیط کاندیشنال نسبت به سلولهایی که در محیط بدون سرم کشت داده شده بودند، افزایش معنیداری را نشان داد. همچنین افزایش معنیداری در تعداد سلولهای MCF7 زندهای که در محیط کاندیشنال بهمدت 72 ساعت کشت داده شده بودند در مقایسه با سلولهایی که در محیط بدون سرم بودند مشاهده شد. همچنین در این گروه اختلاف معنیداری بین دو گروه CM و سلولهای کشت شده در محیط حاوی سرم مشاهده نشد.
نمودار 1: میانگین سلولهای MCF7 زنده پس از القا با محیط کاندیشنال (حروف غیر مشابه، معنیدار بودن و حروف مشابه غیر معنیدار بودن را نشان میدهند.)
محیط کشت: سلولهای سرطانی که در محیط کشت بدون سرم قرار داده شدند.
محیط کشت و سرم: سلولهای سرطانی که در محیط کشت حاوی سرم بودند.
محیط کاندیشنال: سلولهای سرطانی که در محیط کاندیشنال فاقد سرم قرار گرفته بودند.
محیط کاندیشنال و سرم: سلولهای سرطانی که در محیط کاندیشنال حاوی سرم کشت داده شدند.
سرعت تکثیر سلولهای MCF7 پس از القا با محیط کاندیشنال بهمدت 24، 48 و 72 ساعت
سرعت تکثیر سلولهای MCF7 القاء شده با محیط کاندیشنال با روش MTT بررسی شد.
همانطور که در (نمودار 2) مشاهده میشود، کاهش معنیدار میزان OD در سلولهای MCF7 تحت القا با محیط کاندیشنال در مقایسه با سلولهای کشت داده شده در محیط حاوی سرم در زمانهای 24 و 48 ساعت مشاهده شد که نشاندهنده سرعت تکثیر پایین سلولها در محیط کاندیشنال است. در حالیکه، اختلاف معنیداری بین دو گروه مذکور و سلولهایی که در محیط بدون سرم کشت داده شده بودند، مشاهده نشد. از طرفی پس از 72 ساعت، افزایش معنیداری در سلولهایی که در محیط کاندیشنال بودند در مقایسه با سلولهایی که در محیط بدون سرم و محیط حاوی سرم کشت داده شده بودند، مشاهده شد.
نمودار 2: بررسی سرعت تکثیر در MCF7 پس از القا با محیط کاندیشنال پس از 24 ، 48 و 72 ساعت با روشMTT . بررسی میزان بیان ژنهای کاسپاز 3 و 9 با استفاده از تکنیک PCR. بیان ژن کاسپاز 3، پس از القا با محیط کاندیشنال در زمانهای 24 ، 48 و 72 ساعت
شکل 2: تصویر ژل آگارز محصول PCR ژن کاسپاز 3 در گروههای مورد مطالعه. اندازه محصول PCR ژن کاسپاز 3،bp 100 است. ژن GAPDH بهعنوان رفرنس داخلی جهت نرمال کردن به کار رفت. اندازه ژن bp 258 است.
با آزمون آنالیز واریانس یک طرفه و تست Tukey بیان ژن کاسپاز 3 در گروههای مورد مطالعه مقایسه شد.
همانطور که در (نمودار 3) مشاهده میشود، افزایش معنیدار در بیان ژن کاسپاز 3 در سلولهایی که در معرض محیط کاندیشنال بهمدت 24 ساعت قرار گرفتند نسبت به سلولهایی که در محیط حاوی سرم کشت داده شده بودند مشاهده شد. در حالیکه اختلاف معنیداری بین دو گروه محیط کشت و محیط کاندیشنال مشاهده
نشد. افزایش معنیداری در بیان ژن کاسپاز 3 در سلولهایی که بهمدت 48 ساعت درمعرض محیط کاندیشنال قرار گرفتند نسبت به سلولهایی که در محیط کشت حاوی سرم کشت داده شده بودند، مشاهده شد. از طرفی بیان ژن مربوطه کاهش معنیداری در سلولهایی که در معرض محیط کاندیشنال بودند نسبت به سلولهایی که در محیط کشت بدون سرم بودند نشان داد. همچنین کاهش معنیداری در بیان ژن کاسپاز 3 در سلولهایی که درمعرض محیط کاندیشنال بهمدت 72 ساعت قرار گرفتند نسبت به سلولهایی که در محیط فاقد سرم بودند، مشاهده شد. درحالیکه اختلاف معنیداری بین سلولهایی که در محیط کاندیشنال و سلولهایی که در محیط کشت حاوی سرم بودند، مشاهده نشد.
نمودار 3: مقایسه بیان ژن کاسپاز 3 در سلولهای تحت القا محیط کاندیشنال پس از 24 ، 48 و 72 ساعت
بیان ژن کاسپاز 9، پس از القاء با محیط کاندیشنال در زمانهای 24، 48 و 72 ساعت اندازه محصول PCR ژن کاسپاز 9،bp 113 است.
ژن GAPDH بهعنوان رفرنس داخلی جهت نرمالایز کردن به کار رفت. اندازه ژن bp 258 است.
شکل 3: تصویر ژل آگارز محصول PCR ژن کاسپاز 9 در گروههای مورد مطالعه
افزایش معنیداری در بیان ژن کاسپاز 9 در سلولهایی که درمعرض محیط کاندیشنال بهمدت 24 ساعت قرار گرفتند نسبت به سلولهایی که در محیط حاوی سرم بودند، مشاهده شد. در حالیکه اختلاف معنیداری در بین گروههای محیط کاندیشنال و محیط کشت مشاهده نشد. همانطور که در (نمودار 4) مشاهده میشود، اختلاف معنیداری در بیان ژن کاسپاز 9 در سلولهایی که درمعرض محیط کاندیشنال بهمدت 48 و 72 ساعت قرار گرفته بودند، بین هیچکدام از گروهها مشاهده نشد.
نمودار 4: مقایسه بیان ژن کاسپاز 9 در سلولهای تحت القا محیط کاندیشنال. پس از 24 ، 48 و 72 ساعت
بحث
سرطان با ترکیبی از روشهای شیمی‌درمانی، رادیوتراپی، ایمونوتراپی و جراحی درمان میشود. اما این درمانها محدودیتهای خودشان را دارند و نمیتوانند بهطور اختصاصی سلولهای سرطانی را هدف قرار دهند و همچنان میزان مرگ و میر در بیماران مبتلا به سرطان بالا میباشد که خود حکایت از ناکارآمدی این راهکارهای درمانی است (28).
MSC ها در ریز محیط تومور، در دو نقش سلولهای پیش توموری و سلولهای ضد توموری ظاهر میشوند. اینکه MSC ها کدام نقش را ایفا کنند بستگی به فاکتورهای بسیاری دارد از آن جمله میتوان به انواع MSC، منبع استخراج آنها، نوع رده سلول سرطانی مورد بررسی، داخل بدن یا شرایط آزمایشگاهی، فاکتورهای ترشح شده توسط MSCها، تعاملات بین MSCها، سلولهای ایمنی میزبان و سلولهای سرطانی اشاره نمود
(28). MSC ها همچنین میتوانند خاصیت ضد تکثیری و آپوپتوزی را در سلولهای سرطانی القا کنند و مانع تکثیر سلولهای سرطانی شوند (29-30). اگر چه سلول درمانی، تا حدودی علائم بالینی بیمار را بهبود میبخشد ولی با توجه به از بین رفتن تعداد زیادی از سلولها در محل پیوند و بهعلاوه، خطر بالقوه ایجاد سرطان بعد از پیوند، توجه بسیاری از محققین به استفاده از محیط کاندیشنال (CM) معطوف شد(17).
درک بهتر ویژگیهای محیط کاندیشنال کمک مهمی به انتخاب استراتژی استفاده درمانی از این محیط میکند. استفاده از CM در مقایسه با سلولهای بنیادی چندین مزیت دارد، به طوریکه CM به آسانی تهیه، فریز، بسته‌بندی و حمل‌ونقل میشود. علاوه بر این بهدلیل اینکه CM عاری از سلول است نیاز به مطابقت اهدا کننده و دریافت کننده برای جلوگیری از مشکلات رد پیوند وجود ندارد. همچنینCM محتوای سیتوکینها و فاکتورهای رشد متفاوت و عوامل ترمیم بافتی متنوع است، که بهوسیله سلولهای بنیادی ترشح شدهاند. در نهایت محیط کاندیشنال بهعنوان کاندید مناسبی برای این تحقیق انتخاب شد.
اخیرا CM در مطالعات پیش بالینی بهعنوان یک جایگزین برای درمانهای متعدد سلولی از جمله بهبود زخم استفاده میشود (14). بههمین جهت، دراین پژوهش از محیط کاندیشنال مشتق از سلولهای بنیادی چربی زیر جلدی انسانی استفاده شده است. در این مطالعه تلاش بر این بود که اثر محیط کاندیشنال بر تکثیر، بقا و مرگ و میزان بیان ژنهای کاسپاز 3 و 9 در سلولهای سرطانی MCF7 بررسی شود.
در تحقیقی که درسال 2015 انجام شد، برای درمان بیماری ملانوما، که یک تومور بدخیم پوستی است، از محیط کاندیشنال استفاده گردید، lee و همکاران (13) مشاهده کردند که سرعت تکثیر سلولهای رده B16 تومور ملانوم کاهش یافته و سلولها در فاز G1 تقسیم سلولی متوقف شدند. همچنین حجم تومور در بیمارانی که با CM تیمار شده بودند نسبت به گروه کنترل کاهش معنیداری را نشان‌داد. همچنین yu و همکاران (31) مشاهده کردند که درمان با محیط کاندیشنال در سرطان مثانه باعث افزایش آپوپتوزیس در سلولهای سرطانی شده و مهاجرت و تکثیر سلولها را نیز کاهش داد. تحقیقات دیگری نیز توسط کاسین(Cousin) و همکاران (20) انجام شده بود، نشان داد، تیمار با محیط کاندیشنال در سرطان پانکراس که یک بیماری بسیار تهاجمی و کشنده است، از طریق مهار بقای سلولهای سرطانی و افزایش تعداد سلولها در مراحل G0/G1 باعث بهبود بیماری گردید. همچنین محیط کاندیشنال توانست میزان زنده ماندن سلولهای سرطان کولون و پروستات را نیز مهار کند.
در این تحقیق سلولهای MCF7 در معرض محیط کاندیشنال قرار گرفتند، نتایج حاصل از شمارش سلولهای MCF7 زندهای که در شرایط کشت آزمایشگاهی بهمدت 24 و 48 ساعت در معرض محیط کاندیشنال قرار گرفته بودند، کاهش معنیداری را در مقایسه با سلولهایی که در محیط کشت DMEM-F12 حاوی سرم کشت داده شده بودند، نشان دادند. بهطوری که در زمان 24 و 48 ساعت، محیط کاندیشنال توانسته بود میزان سلولهای زنده را به حدی کاهش دهد که دیگر اختلاف معنیداری با سلولهایی که در معرض محیط بدون سرم کشت داده شده بودند نشان ندادند. بنابراین محیط کاندیشنال، بدون حضور سرم باعث مرگ سلولهای سرطانی شده بود. ولی در زمان 72 ساعت محیط کاندیشنال همانند محیط سرمدار عمل کرد و نتوانسته بود میزان سلولهای زنده را در مقایسه با سلولهایی که در محیط سرمدار کشت داده شده بودند، کاهش دهد و همانند سرم عمل کرده بود.
بیماری گلیوم یک تومور مغزی شایع است که در حالت بسیار تهاجمی رشد کرده و به بافت مجاور نفوذ میکند. درمانهای فعلی این بیماری: جراحی، پرتودرمانی و شیمی‌درمانی است اما این موارد به‌ندرت دارای خواص درمانی هستند (22, 32). در این تحقیق که توسط یانگ (yang) و همکارانش (22) انجام شد، استفاده از محیط کاندیشنال باعث افزایش کاسپازهای 3 و 9 شده و درنتیجه باعث افزایش آپوپتوز در این سلولها شده است. بهطوریکه تیمار با محیط کاندیشنال باعث افزایش تعداد سلولها در فاز G0/G1 شد. همچنین در سرطان ریه و رکتوم نیز تیمار با محیط کاندیشنال باعث کاهش تکثیر سلولها شد.
سرطان کبد اغلب در مراحل پیشرفته تشخیص داده میشود و بسیار تهاجمی است. کاسین و همکاران (20-21) نشان دادند که تیمار با محیط کاندیشنال بهطور مؤثر زنده ماندن، تکثیر و تقسیم سلولی را مهار کرده و باعث القای آپوپتوزیس در سلولهای تومور کبد شد. آپوپتوزیس فرم فعال مرگ سلولی است که نقش اساسی در تکوین و بقا از طریق از بین بردن سلولهای آسیب
دیده و یا ناخواسته دارد (33). آپوپتوزیس با فعالیت کاسپازهای آغازگر شروع میشود و متعاقبا کاسپازهای اجرایی را فعال میکنند (34). اخیرا توجه به اهمیت آپوپتوزیس در پیشرفت تومور و درمان متمرکز شده و گزارش شد، آپوپتوز نقش مهمی در حذف سلولهای تومور اولیه (Pre-neoplastic cells) بازی میکند و در نتیجه از پیشرفت بیماری جلوگیری میکند (25).
تحقیقاتی که توسط یانگ و همکاران (22) انجام شد در سرطان پستان مشاهده شده که تیمار با محیط کاندیشنال باعث کاهش تکثیر سلولهای سرطانی MCF7 میشود. محیط کاندیشنال حاوی فاکتورهایی است که منجر به افزایش حساسیت شیمیایی سلولهای سرطان پستان نسبت به داروهای شیمیایی میشود. همچنین اینترفرون موجود در محیط کاندیشنال یک سیتوکین چند منظوره است که فعالیت ضد توموری دارد و رشد تومور را مهار و آپوپتوز را القا کرده و باعث میگردد سلولها در فاز G0/G1 باقی بمانند (35).
نتایج بهدست آمده در این تحقیق نیز نشان داد که، کاهش تعداد سلولهای سرطانی پس از القا با محیط کاندیشنال بهمدت 24 و 48 ساعت احتمال دارد در اثر بیان ژنهای کاسپاز 3 و 9 بوده باشد.
نتیجه گیری
سرعت تکثیر و میزان بقای سلولهای سرطانی MCF7 پس از القاء با محیط کاندیشنال سلولهای بنیادی چربی انسانی بهمدت 24 و 48 ساعت کاهش یافت. همچنین آپوپتوزیس با بیان ژنهای کاسپاز 3و 9 در سلولهای سرطانی القا شده، تحریک شد.
تشکر و قدردانی
این مقاله حاصل بخشی از پایان نامه خانم فاطمه متقی مریدانی، کارشناس ارشد بافت شناسی جنین شناسی از دانشگاه دامغان بود. بدین وسیله از دانشکده زیست شناسی و پژوهشکده علوم زیستی دانشگاه دامغان بهخاطر پرداخت هزینه مواد، وسایل و در اختیار گذاشتن امکانات آزمایشگاهی تشکر وقدردانی میشود.
)