نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 گروه زیست شناسی، واحد تهران شرق، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
2 گروه زیست شناسی، واحد رودهن، دانشگاه آزاد اسلامی، رودهن، ایران
چکیده
هدف: هدف از این مطالعه بررسی اثرات سمیت سلولی داروی اگزالی پلاتین بر رده سلولی سرطان کولون (HT29) و آنالیز بیان ژنهای آپوپتوزی کاسپاز 3 و 9 میباشد.
مواد و روشها: در این مطالعه، ابتدا سمیت سلولی داروی اگزالیپلاتین بر روی رده سلولی HT29 با استفاده از روش MTT در غلظتهای 100، 50، 25، 5/12، 25/6 و 125/3 میکروگرم در میلی لیتر بررسی شد و غلظت 50 درصد کشندگی (IC50) آن تعیین شد. پس از تیمار سلولها با غلظت IC50، RNA سلولها استخراج شده و به cDNA تبدیل شد و میزان بیان ژنهای آپوپتوزیسی کاسپاز 3 و 9 نسبت به ژن مرجع β-actin با استفاده از روش Real Time PCR بررسی شد.
نتایج: تیمار سلولها در غلظتهای مختلف نشان داد که داروی اگزالی پلاتین در غلظت 100 میکروگرم در میلیلیتر بیشترین اثر سمیت سلولی را دارد که از لحاظ آماری معنیدار میباشد و میزان IC50 µg/ml 6 محاسبه شد. همچنین، نسبت بیان ژنهای آپوپتوزیسی کاسپاز 3 و 9 به ژن مرجع در رده سلولی HT29 تیمار شده با اگزالی پلاتین بهترتیب بهمیزان (001/0p <) 72/0±69/2 و (001/0p <) 56/0±26/3 افزایش یافت.
نتیجه گیری: با توجه به سمیت سلولی و القای فرایند آپوپتوزیس در رده سلولی سرطان کولون توسط داروی اگزالی پلاتین، میتوان نتیجهگیری کرد که داروی اگزالی پلاتین گزینه مناسب جهت درمان سرطان کولون میباشد.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
Cytotoxicity and apoptotic effect of oxaliplatin on colon cancer cell line (HT29) and analysis of caspase 3 and caspase 9 gene expression using Real Time PCR method
نویسندگان [English]
- B Yonesi, 1
- , A Mirzaie 2
- E Aliasgari 1
1 Department of Biology, East Tehran Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
2 Department of Biology, Roudehen Branch, Islamic Azad University, Roudehen, Iran
چکیده [English]
Aim: The aim of this study is investigation of cell toxicity of oxaliplatin on colon cancer cell line and analysis of caspase 3 and 9 apoptotic genes.
Material and methods: In this experimental study, cytotoxicity of oxaliplatin on colon cancer cell line (HT29) was evaluated using MTT method in different concentrations including 100, 50, 25, 12.5, 6.25 and 3.125 µg/mL and the IC50 value was determined. After treatment of HT29 cells with IC50 value, the cells RNA was extracted and converted to cDNA. Subsequently, the expression level of caspase 3 and caspase 9 apoptotic genes comparing to house-keeping gene (β-actin) was measured using Real Time PCR.
Results: Treatment of HT29 cells with various concentrations of oxaliplatin including show that oxaliplatin has the highest cytotoxic effect in 100 µg/mL, which is statistically significant (p < 0.05). In addition to, the IC50 value of oxaliplatin was 6 µg/mL. Moreover, the expression ratio of caspase 3 and 9 genes comparing to β-actin gene in HT29 cells treated with oxaliplatin were up-regulated (2.69±0.72 (p < 0.001), 3.26±0.56 (p < 0.001), respectively).
Conclusion: According to cell toxicity and apoptosis induction in HT29 cells by oxaliplatin, it can be concluded that this drug is an appropriate choice for treating of colon cancer.
کلیدواژهها [English]
- Oxaliplatin
- Colon cancer
- Cytotoxicity
- Apoptosis
مقدمه
سرطان یک بیماری پیچیده است که توسط تکثیر سلولی کنترل نشده و فرار سلولها از سیستم ایمنی ایجاد میشود و سبب هموار کردن راههای تهاجم سلولی و متاستاز میشود. سرطان یک مشکل عمده بهداشت عمومی در همه جهان است و از هر 4 مورد مرگ، 1 مورد مربوط به سرطان است (۱). سرطان روده بزرگ یا سرطان کولون سومین سرطان شایع در دنیا میباشد، بهطوریکه در ایالات متحده درصد بالایی از مرگ و میر را بهخود اختصاص داده است. بر طبق آمار سازمان بهداشت جهانی سرطان کولون سومین سرطان شایع در مردان و دومین سرطان رایج در زنان در سال 2016 بوده است (۲). میزان زنده ماندن افراد دارای متاستاز سرطان کولون بهمدت 5 سال است، بهطوریکه این بیماران به داروهای ضدسرطان نیز مقاومت پیدا میکنند (۳). در سالهای اخیر بهعلت افزایش شیوع مرگ و میر ناشی از سرطان و نقص روشهای شیمی درمانی و رادیو درمانی در فرمهای پیشرفته سرطان، نیاز به یافتن شیوههای جدید برای کنترل سرطان احساس میشود (۴). انتخاب نوع روش درمانی براساس مرحله بندی بیماری انجام می شود و جراحی درمان قطعی در مراحل اولیه بیماری میباشد. امروزه از روشهای شیمی درمانی و گاها رادیوتراپی در مراحل خاصی از بیماری سرطان کولون استفاده میشود (۵). در خصوص نوع رژیم درمانی و داروهای مصرفی و نیز زمان استفاده از آن تحقیقات مختلفی در مراکز جراحی سرطان در سرتاسر دنیا در حال انجام است (۶). داروی اگزالی پلاتین داروی نسل سوم پلاتینوم ضدسرطان است که جهت درمان سرطان کولون پیشرفته استفاده میشود. اگزالی پلاتین با از بین بردن سلولهای سرطانی و کند کردن رشد تومور عمل میکند اما مکانیسم دقیق مرگ سلول های سرطانی بهطور کامل مشخص نیست (۷). برخی مطالعات نشان میدهد که اگزالی پلاتین تحت واکنش های غیرآنزیمی در محلولهای فیزیولوژیک از طریق لیگاند اگزالات ناپایدار به مشتقات فعال تبدیل میشود. چندین گونه ناپایدار شامل Monoaquo و diaquo DACH پلاتینوم با پیوند کووالانسی به ماکرومولکولها متصل میشوند و سبب مرگ سلولها میشوند (۸). همچنین این دارو پیوند متقاطع داخل زنجیرهای و بین زنجیرهای با DNA تشکیل میدهند. پیوندها بین موقعیت N7 و دو گوانین مجاور (GG، آدنین- گوانین مجاور (AG)و گوانینهای جدا شده توسط نوکلئوتید (GNG) تشکیل میشود. این پیوندها باعث مهار تقسیم و رونویسی DNA میشوند. اگزالی پلاتین بهطور انتخابی مانع سنتز دئوکسی ریبونوکلئوتید اسید (DNA) میشود، بهطوریکه مقدار گوانین و سیتوزین بستگی به مقدار اگزالی پلاتین تجویزی دارد (۹).
مطالعات نشان میدهد که یکی از مکانیسمهایی که داروی اگزالی پلاتین رشد سلول های سرطانی روده بزرگ را مهار میکند، آپوپتوزیس است. آپوپتوز یس مرگ فیزیولوژیک سلولی است که در شرایط طبیعی سبب حذف سلولهای پیر، آسیب دیده و مضر میشود و برای تکامل و هوموستازی بافتی ضروری است. آپوپتوزیس در ترمیم و نوسازی بافتی و نیز حذف سلولهای T خود واکنشگر نقش دارد (۱۰). هرگونه اختلال در روند آپوپتوزیس، منجر به بیماری میشود که میتواند ناشی از کاهش مرگ سلولی باشد که منجر به ایجاد و رشد سلولهای سرطانی و یا اختلالات خود ایمنی میشود (۱۱). بهطور معمول داروهای شیمیدرمانی سبب القای آپوپتوزیس و تغییر بیان ژنهای آپوپتوزیس در سلولهای سرطانی می شوند. آپوپتوز مرگ فیزیولوژیک سلولی است و در طی تحریکات خاصی اتفاق میافتد، در حالیکه نکروز مرگ پاتولوژیک سلول بوده و در طی آسیب های شدید به سلول از قبیل هیپوکسی و هیپرترمی این نوع مرگ سلولی اتفاق می افتد. در فرایند آپوپتوزیس سلول چروکیده و کوچک میشود در حالیکه در نکروز سلول متورم و بزرگ میشود. ارگانلهای سیتوپلاسمی در فرایند آپوپتوزیس دست نخورده باقی میمانند در حالیکه در نکروز تخریب میشوند (۱۲).
گسترش روز افزون سـرطان کولون و مـشکلات فـراوان ناشی از آن از یک سو و عدم موفقیت کافی روشهای درمـانی رایج و سنتی در مبارزه اختصاصی بـا آن موجـب توجـه ویـژه محققین نسبت به روشهای درمانی هدفمند گشته است (۱۳). بنابراین، هدف از این مطالعه بررسی اثرات سمیت سلولی داروی اگزالیپلاتین بر روی رده سلولی سرطان کولون (HT29) و آنالیز بیان ژنهای آپوپتوزی کاسپاز 3 و 9 میباشد.
مواد و روشها
داروی اگزالی پلاتین و کشت سلول
داروی اگزالی پلاتین (Eloxatin®; Sanofi, France) با مشخصات وزن مولی g/mol 2858/397 با فرمول شیمیایی C8H14N2O4Pt تهیه شد. همچنین، رده سلولی سرطان کولون (HT29 cell line) از بانک سلولی انستیتو پاستور ایران با کد NCBI C135 خریداری شد. ابتدا سلولها در محیط کشت RPMI1640 (Biosera, USA) غنی شده با 1 (v/v) پنیسیلین ـ استرپتومایسین و 10 درصد سرم جنین گاوی (Fetal Bovine Serum: FBS) کشت داده شدند و در دمای 37 درجه سانتیگراد و 5 درصد رطوبت قرار داده شدند.
بررسی سمیت سلولی
بهمنظور بررسی اثرات کشندگی سلولی داروی اگزالی پلاتین بر روی رده سلولی HT29 از روش رنگ سنجی MTT (Sigma Aldrich, Germany ) استفاده شد. غلظتهای 100، 50، 25، 5/12، 25/6 و 125/3 میکروگرم در میلیلیتر از دارو در فاصله زمانی 24 ساعت بر روی رده سلولی HT29 تیمار شد. بعد از گذشت زمان فوق، محتوای چاهکهای پلیت 96 خانهای به دقت خارج شد و به آن رنگ MTT (Microculture Tetrazolium Test) اضافه شد و بهمدت 4 ساعت تحت شرایط CO2 5 درصد و دمای 37 درجه سانتیگراد نگه داشته شد. سپس رنگ MTT، جداسازی شد و کریستالهای فورمازان تولید شده بهوسیله سلول های زنده در ایزوپروپانول حل شد. در نهایت جذب نمونه ها با استفاده از دستگاه قرائت گر الایزا (ELISA reader, Oraganon Teknika، هلند) در طول موج 570 نانومتر قرائت شد و میزان کشندگی سلول توسط فرمول زیر محاسبه شد:
100´(جذب نوری سلولهای کنترل بر جذب نوری سلول های تیمار شده)= میزان بقای سلولی
همچنین میزان دوز 50 درصد کشندگی (IC50 یاHalf maximal inhibitory concentration) نیز محاسبه شد.
اندازه گیری بیان ژنهای کاسپاز 3 و 9
میزان بیان ژنهای آپوپتوزیسی کاسپاز 3 و 9 در سلولهای HT29 تیمار شده با داروی اگزالی پلاتین با استفاده از روش Real Time PCR کمی نسبی (qRT-PCR) سنجیده شد. در ابتدا کل RNA سلولهای تیمار شده و نشده با استفاده از کیت استخراج RNA (کیاژن،آمریکا) طبق دستورالعمل آن استخراج شد و غلظت آن به وسیله دستگاه فتونانومتر(IMPLEN GmbH، آلمان) اندازهگیری شد. ساخت مولکولهای DNA مکمل باکیت Revert AidTM First strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas، لیتوانی) انجام گرفت که در آن مخلوط واکنش حاوی 5 میکرولیتر بافر واکنش x5، یک میکروگرم RNA، 5/0 میکرولیتر آغازگر شش نوکلئوتیدی تصادفی، 5/0 میکرلیتر آغازگر الیگوdT، دو میکرولیتر مخلوط داکسی نوکلئوتید تری فسفات (10 میلیمولار)، یک میکرولیتر مهارکننده آنزیم RNase (20 واحد در میکرولیتر)، یک میکرولیتر آنزیم رونوشت بردار معکوس و آب مقطر دو بار تقطیر (تا حجم نهایی 20 میکرولیتر) (Fermentas، لیتوانی) بود. برنامه دمایی- زمانی بهصورت 25 درجه سانتیگراد بهمدت 5 دقیقه (برای اتصال آغازگر)، 42 درجه سانتیگراد بهمدت 60 دقیقه (ساخت cDNA)، 70 درجه سانتیگراد بهمدت 5 دقیقه (غیر فعال شدن رونوشت بردار معکوس) و 4 درجه سانتی گراد بهمدت 5 دقیقه انجام گرفت. پرایمرهای مورد استفاده برای ژنهای هدف کاسپاز 3 و 9 بوده و ژن β-actin بهعنوان کنترل داخلی مورد استفاده قرار گرفت. توالی آغازگرهای جلویی و برگشتی ژن هدف کاسپاز 3 بهصورت 5'- ATGGGAGCAAGTCAGTGGAC -3' جلویی، دمای 68 درجه سانتی گراد و 5'- CGTACCAGAGCGAGATGACA -3' برگشتی، دمای 3/65 درجه سانتیگراد بود. توالی آغازگرهای جلویی و برگشتی ژن هدف کاسپاز 9 به صورت 5'- GGCGGAGCTCATGATGTCTGTG -3' جلویی، دمای 67 درجه سانتی گراد و 5'- TTCCGGTGTGCCATCTCCATCA -3' برگشتی، دمای 3/66 درجه سانتی گراد و برای ژن مرجع β-actin به صورت 5'- TCCTCCTGAGCGCAAGTAC -3' جلویی، دمای 9/66 درجه سانتی گراد و 5'- CCTGCTTGCTGATCCACATCT -3' برگشتی، دمای 4/63 درجه سانتیگراد است. در نهایت واکنش Real Time PCR با استفاده از دستگاه Light cycler (Bioneer، کره) با شرایط دمایی 95 درجه سانتی گراد: 1 دقیقه، 95 درجه سانتیگراد 15 ثانیه، 60 درجه سانتیگراد 60 ثانیه انجام گرفت.
بررسی قطعه قطعه شدن DNA
جهت بررسی آزمون قطعه قطعه شدن DNA که نشان دهنده آپوپتوزیس است، ابتدا سلولهای سرطانی HT29 با غلظت IC50 داروی اگزالی پلاتین تیمار شدند و پس از 24 ساعت با محلول PBS سلول ها شستشو داده شدند و سپس تریپسینه شدند. سوسپانسیون سلولی را در g 400 سانتریفیوژ کرده و به رسوب حاصله 600 میکرولیتر بافر لیز کننده (100mM EDAT، 400mM NaCl، 10mM Tris-Hcl) و 10 میکرولیتر محلول RNAase (4mg/mL) اضافه شد و سپس در دور g 18000 در دمای اتاق بهمدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. محلول رویی را جمع آوری کرده و به آن 600 میکرولیتر ایزوپروپانول اضافه کرده و بهمدت 15 دقیقه بر روی یخ انکوبه شد و مجددا در دور g 18000 بهمدت 20 دقیقه سانتریفیوژ کرده و رسب حاصله با 600 میکرولیتر اتانول 70 درصد شستشو داده شد. رسوب حاصل را در دمای اتاق خشک کرده و در 200 میکرولیتر بافر Tris-EDTA 10mM حل گردید. به دنبال آن DNA حاصله در ژل آگارز 2 درصد در ولتاژ 100 بهمدت 1 ساعت الکتروفورز شد و با دستگاه Gel document مشاهده شد.
آنالیز آماری
داههای جمعآوری شده با استفاده از نرم افزار آماری SPSS و آزمون آماری آنالیز واریانس یکطرفه تجزیه و تحلیل شدند. اطلاعات بهصورت mean±standard deviation (SD) نمایش داده شده و 05/0p< معنیدار در نظر گرفته شد.
نتایج
تیمار سلول هایHT29 با داروی اگزالی پلاتین در مدت زمان 24 ساعت
تیمار سلول هایHT29 با غلظتهای مختلف µg/ml125/3، 25/6، 5/12، 25، 50، 100 از داروی اگزالی پلاتین با استفاده از تست MTT طی مدت 24 ساعت انجام شد. نتایج نشان داد که داروی اگزالیپلاتین در غلظتهای µg/ml100بیشترین مهار تکثیر سلولی را داشته اند که از لحاظ آماری معنیدار بوده است (001/0p<). میزان IC50 برای داروی اگزالی پلاتین در مدت زمان 24 ساعت µg/ml 6 محاسبه شد. بر اساس تست آماری آنالیز واریانس یکطرفه گروههای تست با گروه کنترل مورد مقایسه قرار گرفته است. نتایج حاصل از بقای سلولها در مدت زمان 24 ساعت در شکل 1 نشان داده شده است.
شکل 1: درصد بقای سلول های HT29 در برابر غلظتهای مختلف داروی اگزالی پلاتین در مدت زمان 24 ساعت. نتایج بهصورت درصد بقا در مقایسه با نمونههای کنترل گزارش شده است (*:05/0 p< ، **:01/0 p< ، *** 001/0p< : n=3).
پروفایل (mRNA) بیانی ژنهای مورد مطالعه در سلولهای HT29 تیمار شده با داروی اگزالی پلاتین
آنالیز تغییر بیان ژنهای آپوپتوزی کاسپاز 3 و 9 در سلول HT29 تیمار شده با غلظت 50 درصد (IC50) بعد از 24 ساعت با روش Real Time PCR انجام شد. تکثیر اختصاصی قطعات ژنی مورد نظر، عدم جفت شدن آغازگرها و عدم تکثیر قطعات غیراختصاصی برای هر ژن با
استفاده از منحنی ذوب تعیین شد، بهطوریکه رنگ سبز متعلق به ژن بتا-اکتین، رنگ زرد متعلق به ژن کاسپاز 3 و رنک قرمز متعلق به ژن کاسپاز 9 می باشد (شکل 2 و 3).
شکل 2: نمودار حاصل از تکثیر ژنهای β-actin، کاسپاز 3 و 9. همانطور که در تصویر مشاهده میشود تکثیر و میزان فلورسنت نمونهها از سیکل 14 به بعد بهصورت لگاریتمی افزایش یافته است.
شکل 3: آنالیز منحنی ذوب ژنهای β-actin، کاسپاز 3 و کاسپاز 9. رنگ سبز متعلق به ژن بتا-اکتین، رنگ زرد متعلق به ژن کاسپاز 3 و رنک قرمز متعلق به ژن کاسپاز 9 میباشد.
در این مطالعه، اختلاف چرخههای آستانه بهدست آمده از نمونههای مورد آزمایش (سلولهای تیمار شده با دارو) و نمونههای کنترل (سلولهای تیمار نشده با دارو) محاسبه و میزان بیان ژن با استفاده از فرمول ΔΔCt (نسبت ژن هدف به ژن مرجع (β-actin) از طریق 2 –ΔΔCt) محاسبه شد. نسبت بیان ژنهای کاسپاز 3 و 9 به ژن مرجع β-actin در رده سلولی سرطانی HT29 تیمار شده با دارو بهترتیب بهمیزان (001/0p<) 72/0±69/2 و (001/0p<) 56/0±26/3 طی 24 ساعت افزایش یافت (شکل 4).
شکل 4: نمودار بیان ژنهای بتا-اکتین، کاسپاز 3 و کاسپاز 9. همانطور که در تصویر مشاهده میشود تغییر بیان ژنهای کاسپاز 3 و 9 نسبت به ژن مرجع بتا-اکتین معنیدار میباشد. (*:05/0 p< ، **:01/0< p ، *** 001/0p< : n=3).
آزمون قطعه قطعه شدن DNA
نتایج حاصل از تیمار سلولهای سرطانی HT29 با غلظت IC50 داروی اگزالی پلاتین نشان داد که این دارو موجب القا قطعه قطعه شدن DNA ژنومی سلولهای سرطانی می شود. قطعه قطعه شدن DNA ژنومی که از خصوصیت سلولهای آپوپتوتیک است، بر روی ژل آگارز 2 درصد تایید شد (شکل 5). همانطور که در تصویر مشاهده میشود داروی اگزالی پلاتین قادر به القا برش DNA در نواحی بین کروموزومی است که در مقایسه با نمونه کنترل (سلول تیمار نشده) اثری بر روی DNA ژنومی نداشته است.
شکل 5: تصویر ژل الکتروفورز از تست قطعه قطعه شدن DNA برای نشان دادن آپوپتوزیس. 1: مارکر DNA، 2: نمونه DNA کنترل، 3: نمونه DNA تیمار شده با دارو. همانطور که مشاهده میشود نمونه DNA تیمار شده با دارو اگزالی پلاتین قطعه قطعه شده است که نشانگر القا فرایند آپوپتوزیس میباشد.
بحث
خاصیت ضد سرطانی داروهای ضدسرطانی از چندین سال قبل مشخص شده است و بههمین دلیل استفاده از داروهای مناسب جهت درمان سرطان از اهمیت بالایی برخوردار شده است (15-14). با توجه به این که تغییرات ژنتیکی زیادی مورد نیاز است تا فرم سرطانی یک سلول ایجاد شود و بهعلت اینکه ایجاد بسیاری از سرطانها جنبه ارثی دارد، استفاده از موادی که بتوانند فرایند متاستازی را مهار کنند مورد توجه میباشد. یعنی اگرچه نمیتوان از ایجاد تومور اولیه جلوگیری کنیم، ولی این امکان وجود
دارد که جلوی فرایند متاستازی که علت اصلی مرگ و میر بیماران سرطانی میباشد، گرفته شود (19-16). سلولهای سرطانی از مرگ برنامه ریزی شده سلول یا آپوپتوزیس فرار میکنند که یکی از دلایل آن تغییر در بیان ژنهایی است که در تنظیم این فرآیند دخیل میباشند. بیشتر عوامل ضدسرطانی آثار درمانی خودشان را با القای مرگ سلولی برنامه ریزی شده اعمال میکنند (21-20). القای مرگ برنامه ریزی شده یکی از مهمترین روشها در از بین بردن بدون عارضه سلولهای سرطانی است (۲۲). در این مطالعه، با استفاده از روش رنگ سنجی MTT نشان داده شد که داروی اگزالی پلاتین دارای اثر کشندگی وابسته به دوز در سلول های سرطانی کولون میباشد. امروزه مراکز مطالعات سرطان در جستجوی عوامل ضد سرطان با ضریب اطمینان بالاتر و قابلیت پذیرش بیشتر برای بیماران میباشند. در این میان درمانهای هدفدار شده با اهداف مولکولی که در رشد و یا پیشرفت تومور مداخله میکنند اختصاصیت بالایی به سلولهای توموری دارند و پنجره درمانی جدیدی با کاهش سمیت را به روی علم باز کرده اند (۲۳). علاوه بر این میتوان در ترکیب با عوامل شیمی درمانی سایتوتوکسیک برای فعالیت ضد سرطانی بیشتر از عوامل سینرژیسم و یا مازاد استفاده کرد (۲۴). تاکنون مطالعات مختلفی در جهت استفاده از داروی اگزالی پلاتین در درمان انواع سرطانها انجام شده است که نتایج این مطالعات با مطالعات ما همسو بوده است. Shisheng Tan و همکاران (۲۵) اثرات سمیت سلولی داروی اگزالی پلاتین را بههمراه ترکیب 3-متیل آدنین مورد بررسی قرار دادند. در این مطالعه با استفاده از روش MTT اثرات سمیت سلولی داروی فوق الذکر را مورد مطالعه قرار دادند. نتایج این مطالعه نشان داد که داروی اگزالی پلاتین قابلیت سمیت سلولی قابل توجهی در رده سلولی سلولی CT26 (سرطان کولون) دارد. همچنین نتایج نشان داد که این دارو فرایند آپوپتوز و اتوفاژی را القا میکند. Teixeira SF و همکاران (۲۶) اثرات سمیت سلولی داروی اگزالی پلاتین را بههمراه پیریدینیل کربوکساماید را بر روی رده سلولی سرطان ریه (NCI-H1299) مورد مطالعه قرار دادند. نتایج این مطالعه نشان داد که سمیت سلولی ترکیب فوق وابسته به دوز است و توانایی القا آپوپتوز را دارد. همچنین مطالعه دیگری، ارزیابی آنتی اکسیدانتی و ضد سرطانی نانوژلهای حاوی داروی اگزالی پلاتین روی سلولهای سرطان کولون (HT29) را نشان دادند. نتایج این پژوهش پتانسیل بالای نانوژلها در کاهش 39/16 درصدی زنده ماندن رده سلولی سرطان کولون را نشان داد (۲۷).
همانطور که اشاره شد نتایج این مطالعه نشان داد که اثر کشندگی دارو بر روی سلولها، بستگی به غلظت دارو دارد. نتیجه گیری کلی نشان داد که داروی اگزالی پلاتین اثرات مهاری برروی سلولهای سرطانی از خود نشان میدهند که این پدیده بهدلیل اثر مستقیم آنها برروی سامانه تنفسی سلول در میتوکندری میباشد. بهطور کلی القای مرگ برنامه ریزی شده سلولی یکی از رویکردهای جذاب در حوزه پزشکی به شمار میرود. مسیر مرگ سلولی میتواند شامل فعال سازی رویدادهای پروآپوپتوتیک اندامک میتوکندری در سلول باشد که با آزاد سازی سیتوکروم c از آن آغاز میشود. علاوه بر این اثرات داروی اگزالی پلاتین در افزایش بیان ژن پروتئاز کاسپاز 3 و 9 در سلولهای سرطانی و القای مرگ برنامه ریزی شده سلولی در مطالعات مختلف نشان داده شده است. بنابراین با توجه به میزان فعالیت بالای میتوکندری در فرایند تنفس سلولهای سرطانی نسبت به سلولهای طبیعی، بستر مناسبی برای داروی اگزالی پلاتین جهت تخریب سلولهای سرطانی فراهم میشود (28). یکی دیگر از اهداف این مطالعه بررسی میزان بیان ژنهای آپوپتوزی کاسپاز 3 و 9 بود. نتایج این مطالعه نشان داد که بعد از تیمار سلولهای HT29 با داروی اگزالی پلاتین، بیان ژنهای آپوپتوزیسی نسبت به ژن مرجع افزایش بیان چشمگیری داشتند که نشان دهنده القای پدیده آپوپتوزیس در سلولهای سرطان کولون میباشد. از آنجاکه فعالیت ژن های کاسپاز 3 و 9 در اثر تیمار با داروی اگزالی پلاتین افزایش مییابد، بهنظر میرسد که سیتوکروم C رها شده بهدرون سیتوزول به همراه کاسپاز 3 و 9 کمپلکس پروتئینی آپوپتوزوم را تشکیل میدهد و موجب القای آپوپتوزیس شده است. بدیهی است که شناسایی اهمیت الگوی بیان این ژن در پاسخ بهفعالیت متاستازی داروهای ضد سرطانی حائز اهمیت است. بنابراین بررسیهای بیشتری برای اثبات این که آیا پروفایل بیانی mRNA این ژن میتواند مدرکی باشد برای نقش آن در پیش گویی دقیق تر و اختصاصی پاسخ سرطان به درمان ضروری است (29).
نتایج بهدست آمده از این مطالعه استفاده درمانی داروی اگزالی پلاتین را در سلولهای سرطانی کولون نشان داد. طبق این بررسیها مطالعات بالینی روی مدل حیوانی و انسانی برای تایید اثر دارو ضروری میباشد. بنابراین استفاده از نانوژلهای حاوی دارو در افزایش بیان برخی ژنهای پروآپوپتوزیسی میتواند موثر باشد. میتوان براساس این تحقیق و تحقیقات پیشین نتیجه گرفت که داروی اگزالی پلاتین اثرات ضد سرطانی قدرتمندی بر سلولهای سرطانی دارد و مشتقات این ترکیب در آینده می تواند نقش مهمی در درمان این نوع از سرطانها بازی کنند. بنابراین درصورتی که پروسه بالینی این دارو تایید شود، این دارو میتوانند در موارد بالینی برای بیماران مبتلا به سرطان کولون بهکار گرفته شوند. مطالعه حاضر در مدل آزمایشگاهی از سلولهای رده سرطانی کولون انجام گرفت که اثرات ضد سرطان را نشان داد. پیشنهاد میشود برای تایید اثرات ضد سرطان داروی اگزالی پلاتین در بدن موجود زنده، مطالعه تاثیر آن روی مدل حیوانی و انسانی انجام گیرد.
بهدلیل خواص ضدسرطانی داروی اگزالی پلاتین، مطالعه اثرات ضد سرطانی در سطح پروتئوم از رده سرطانی کولون برای اکتشافات بیشتر پیشنهاد میشود. قابلیت طراحی لیگاندهای اختصاصی در سطح نانوذرات بارگذاری شده با دارو، برای گیرندههای خاص با بیان زیاد در سطح سلولهای سرطانی، توانایی هدفگیری نانوذرات را در رسیدن بهمحل تومور افزایش میدهد و امکان آزادسازی دارو در ناحیه سرطانی مورد نظر را بالا خواهد برد. بنابراین تغییرات سطحی نانوذرات قابلیت هدفگیری اختصاصی و دقیق تر آنها را میسر میسازد. لذا اعمال این تغییرات بر سطح نانوذره و بررسی میزان اثر بخشی آنها در سیستمهای انتقال دارو، قابلیت تحقیق و پیگیری دارند.
نتیجهگیری
با توجه به نتایج این مطالعه که سمیت سلولی و القا فرایند آپوپتوزیس در رده سلولی سرطان کولون توسط داروی اگزالی پلاتین نشان داده شد، میتوان نتیجه گیری کرد که داروی اگزالی پلاتین گزینه مناسب جهت درمان سرطان کولون میباشد.
تشکر و قدردانی
بدینوسیله از تلاش همکاران دانشگاه آزاد اسلامی و جناب آقای آرین رحیمی و تمام کسانیکه در انجام این پروژه همکاری کردهاند، تشکر و قدرانی مینماییم.
منابع
- Fass L. Imaging and cancer: a review. Mol Oncol. 2008; 2(2): 115-52.
- Carini F, Mazzola M, Rappa F, Jurjus A. Colorectal Carcinogenesis: Role of Oxidative Stress and Antioxidants. Anticancer Res. 2017; 37(9): 4759-4766.
- Dahan L, Sadok A, Formento JL, Seitz JF, Kovacic H. Modulation of cellular redox state underlies antagonism between oxaliplatin and cetuximab in human colorectal cancer cell lines. Br J Pharmacol. 2009; 158(2): 610–620.
4.Valdivieso M, Kujawa AM, Jones T, Baker LH. Cancer survivors in the United States: a review of the literature and a call to action. Int J Med Sci. 2012; 9(2): 163-73.
5. Urruticoechea A, Alemany R, Balart J, Villanueva A, Viñals F, Capellá G. Recent advances in cancer therapy: an overview. Curr Pharm Des. 2010; 16(1): 3-10.
6.Shannon AM1, Williams KJ. Antiangiogenics and radiotherapy. J Pharm Pharmacol. 2008; 60(8): 1029-36.
7. Alcindor T, Beauger N. Oxaliplatin: a review in the era of molecularly targeted therapy. Curr Oncol. 2011; 18(1): 18-25.
8. Raez LE, Kobina S, Santos ES. Oxaliplatin in first-line therapy for advanced non-small-
cell lung cancer. Clin Lung Cancer. 2010; 11(1): 18-24.
9. Stordal B, Pavlakis N, Davey R. Oxaliplatin for the treatment of cisplatin-resistant cancer: a systematic review. Cancer Treat Rev. 2007; 33(4): 347-57.
10. Elmore S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol. 2007; 35(4): 495-516.
11. Saraste A, Pulkki K. Morphologic and biochemical hallmarks of apoptosis. Cardiovasc Res. 2000; 45(3): 528-37.
12. Pistritto G, Trisciuoglio D, Ceci C, Garufi A, D'Orazi G. Apoptosis as anticancer mechanism: function and dysfunction of its modulators and targeted therapeutic strategies. Aging (Albany NY). 2016; 8(4): 603-19.
13. Hopkins BD, Goncalves MD, Cantley LC. Obesity and Cancer Mechanisms: Cancer Metabolism. J Clin Oncol. 2016: 10; 34(35): 4277-4283.
14. De Rosa M, Pace U, Rega D, Costabile V, Duraturo F, Izzo P, Delrio P. Genetics, diagnosis and management of colorectal cancer (Review). Oncol Rep. 2015; 34(3): 1087-96.
15. Nussbaumer S, Bonnabry P, Veuthey JL, Fleury-Souverain S. Analysis of anticancer drugs: a review. Talanta. 2011: 15; 85(5): 2265-89.
16. Ali I, Haque A, Wani WA, Saleem K, Al Za'abi M. Analyses of anticancer drugs by capillary electrophoresis: a review. Biomed Chromatogr. 2013; 27(10): 1296-311.
17. Kratz F, Müller IA, Ryppa C, Warnecke A. Prodrug strategies in anticancer chemotherapy. Chem Med Chem. 2008; 3(1): 20-53.
18. Leah M. Cook, Douglas R. Hurst, Danny R. Welch. Metastasis Suppressors and the Tumor Microenvironment. Semin Cancer Biol. 2011; 21(2): 113–122.
19. Toni Celià-Terrassa, Yibin Kang. Distinctive properties of metastasis-initiating cells. Genes Dev. 2016: 15; 30(8): 892–908.
20. Darren F, Peter T, Mitchell V, Nicholas DP. Cosford KV. Inducing death in tumor cells: roles of the inhibitor of apoptosis proteins. F1000Res. 2017; 6: 587.
21. Carl D. Bortner, John A. Cidlowski. Ion channels and apoptosis in cancer. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2014; 19; 369(1638).
22. Zhenyi S, Zuozhang Y, Yongqing X, Yongbin C, Qiang Y. Apoptosis, autophagy, necroptosis, and cancer metastasis. Mol Cancer. 2015; 14(1): 14: 48.
23. Li-Xia Feng, Min Li, Yong-Jun Liu, Shao-Mei Yang, Na Zhang. Synergistic enhancement of cancertherapy usinga combination of ceramide and docetaxel. Int J Mol Sci. 2014; 15(3): 4201–4220.
24. Zhang N. Ceramide: Therapeutic potential in combination therapy for cancer treatment. Curr Drug Metab. 2015; 17(1): 37-51.
25. Shisheng T, Xingchen P, Wen P, Yinglan Z, Yuquan W. Enhancement of oxaliplatin-induced cell apoptosis and tumor suppression by 3-methyladenine in colon cancer. Oncol Lett. 2015; 9(5): 2056–2062.
26. Teixeira SF, de Azevedo RA, Silva AC, Braga RC. Evaluation of cytotoxic effect of the combination of a pyridinyl carboxamide derivative and oxaliplatin on NCI-H1299 human non-small cell lung carcinoma cells. Biomed Pharmacother. 2016; 84: 1019-1028.
27. Zeng C, Yu F, Yang Y, Cheng X, Preparation and evaluation of oxaliplatin thermosensitive liposomes with rapid release and high stability. PLoS One. 2016 14; 11(7): e0158517.
28. MacKenzie SH, Clark AC. Targeting cell death in tumors by activating caspases. Curr Cancer Drug Targets. 2008; 8(2): 98-109.
29. Leah M. Cook, Douglas R. Hurst, Danny R. Welch. Metastasis suppressors and the tumor microenvironment. Semin Cancer Biol. 2011; 21(2): 113–122.
- Fass L. Imaging and cancer: a review. Mol Oncol. 2008; 2(2): 115-52.
- Carini F, Mazzola M, Rappa F, Jurjus A. Colorectal Carcinogenesis: Role of Oxidative Stress and Antioxidants. Anticancer Res. 2017; 37(9): 4759-4766.
- Dahan L, Sadok A, Formento JL, Seitz JF, Kovacic H. Modulation of cellular redox state underlies antagonism between oxaliplatin and cetuximab in human colorectal cancer cell lines. Br J Pharmacol. 2009; 158(2): 610–620.
4.Valdivieso M, Kujawa AM, Jones T, Baker LH. Cancer survivors in the United States: a review of the literature and a call to action. Int J Med Sci. 2012; 9(2): 163-73.
5. Urruticoechea A, Alemany R, Balart J, Villanueva A, Viñals F, Capellá G. Recent advances in cancer therapy: an overview. Curr Pharm Des. 2010; 16(1): 3-10.
6.Shannon AM1, Williams KJ. Antiangiogenics and radiotherapy. J Pharm Pharmacol. 2008; 60(8): 1029-36.
7. Alcindor T, Beauger N. Oxaliplatin: a review in the era of molecularly targeted therapy. Curr Oncol. 2011; 18(1): 18-25.
8. Raez LE, Kobina S, Santos ES. Oxaliplatin in first-line therapy for advanced non-small-
cell lung cancer. Clin Lung Cancer. 2010; 11(1): 18-24.
9. Stordal B, Pavlakis N, Davey R. Oxaliplatin for the treatment of cisplatin-resistant cancer: a systematic review. Cancer Treat Rev. 2007; 33(4): 347-57.
10. Elmore S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol. 2007; 35(4): 495-516.
11. Saraste A, Pulkki K. Morphologic and biochemical hallmarks of apoptosis. Cardiovasc Res. 2000; 45(3): 528-37.
12. Pistritto G, Trisciuoglio D, Ceci C, Garufi A, D'Orazi G. Apoptosis as anticancer mechanism: function and dysfunction of its modulators and targeted therapeutic strategies. Aging (Albany NY). 2016; 8(4): 603-19.
13. Hopkins BD, Goncalves MD, Cantley LC. Obesity and Cancer Mechanisms: Cancer Metabolism. J Clin Oncol. 2016: 10; 34(35): 4277-4283.
14. De Rosa M, Pace U, Rega D, Costabile V, Duraturo F, Izzo P, Delrio P. Genetics, diagnosis and management of colorectal cancer (Review). Oncol Rep. 2015; 34(3): 1087-96.
15. Nussbaumer S, Bonnabry P, Veuthey JL, Fleury-Souverain S. Analysis of anticancer drugs: a review. Talanta. 2011: 15; 85(5): 2265-89.
16. Ali I, Haque A, Wani WA, Saleem K, Al Za'abi M. Analyses of anticancer drugs by capillary electrophoresis: a review. Biomed Chromatogr. 2013; 27(10): 1296-311.
17. Kratz F, Müller IA, Ryppa C, Warnecke A. Prodrug strategies in anticancer chemotherapy. Chem Med Chem. 2008; 3(1): 20-53.
18. Leah M. Cook, Douglas R. Hurst, Danny R. Welch. Metastasis Suppressors and the Tumor Microenvironment. Semin Cancer Biol. 2011; 21(2): 113–122.
19. Toni Celià-Terrassa, Yibin Kang. Distinctive properties of metastasis-initiating cells. Genes Dev. 2016: 15; 30(8): 892–908.
20. Darren F, Peter T, Mitchell V, Nicholas DP. Cosford KV. Inducing death in tumor cells: roles of the inhibitor of apoptosis proteins. F1000Res. 2017; 6: 587.
21. Carl D. Bortner, John A. Cidlowski. Ion channels and apoptosis in cancer. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2014; 19; 369(1638).
22. Zhenyi S, Zuozhang Y, Yongqing X, Yongbin C, Qiang Y. Apoptosis, autophagy, necroptosis, and cancer metastasis. Mol Cancer. 2015; 14(1): 14: 48.
23. Li-Xia Feng, Min Li, Yong-Jun Liu, Shao-Mei Yang, Na Zhang. Synergistic enhancement of cancertherapy usinga combination of ceramide and docetaxel. Int J Mol Sci. 2014; 15(3): 4201–4220.
24. Zhang N. Ceramide: Therapeutic potential in combination therapy for cancer treatment. Curr Drug Metab. 2015; 17(1): 37-51.
25. Shisheng T, Xingchen P, Wen P, Yinglan Z, Yuquan W. Enhancement of oxaliplatin-induced cell apoptosis and tumor suppression by 3-methyladenine in colon cancer. Oncol Lett. 2015; 9(5): 2056–2062.
26. Teixeira SF, de Azevedo RA, Silva AC, Braga RC. Evaluation of cytotoxic effect of the combination of a pyridinyl carboxamide derivative and oxaliplatin on NCI-H1299 human non-small cell lung carcinoma cells. Biomed Pharmacother. 2016; 84: 1019-1028.
27. Zeng C, Yu F, Yang Y, Cheng X, Preparation and evaluation of oxaliplatin thermosensitive liposomes with rapid release and high stability. PLoS One. 2016 14; 11(7): e0158517.
28. MacKenzie SH, Clark AC. Targeting cell death in tumors by activating caspases. Curr Cancer Drug Targets. 2008; 8(2): 98-109.
29. Leah M. Cook, Douglas R. Hurst, Danny R. Welch. Metastasis suppressors and the tumor microenvironment. Semin Cancer Biol. 2011; 21(2): 113–122.