نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه آزاد اسلامی واحد اردبیل، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، اردبیل، ایران
2 -دانشگاه آزاد اسلامی واحد اردبیل، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، اردبیل، ایران
چکیده
هدف : مطالعه حاضر با هدف بررسی تاثیر انکپسولهسازی همزمان DNA با نسبتهای متفاوت PLL توسط کوپلیمر PLA-PEG بر افزایش کارایی انتقال ژن به سلولهای پستانداران و خصوصیاتی از قبیل زیست سازگاری، محافظت از DNA در برابر آنزیمهای برشی، سرعت رهایش DNA، اندازه و پتانسیل ذتای ذرات انجام گرفت.
مواد و روشها: نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA با نسبتهای متفاوت PLL، بر اساس تکنیک انتشار حلال تهیه شدند. سپس درصد رهایش DNA، اندازه و پتانسیل ذتای ذرات در بافر سالین فسفات با 4/7pH= مورد بررسی قرار گرفت.
نتایج: با افزایش درصد PLL در نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA اندازه و پتانسیل ذتای ذرات حاصل افزایش یافت. آنالیز ژل الکتروفورز از DNA استخراج شده از نانوذرات PLA-PEG/DNA و PLA-PEG/PLL/DNA پس از تیمار با آنزیمDNasI، بیانگر توانایی کوپلیمر PLA-PEG و PLA-PEG/PLL در محافظت از DNA بود. بررسی فلوسایتومتری و میکروسکوپ فلورسنس تایید کرد که بازده انتقال ژن با افزایش نسبت PLL در نانوذرات PLA-PEG / PLL / DNA بهبود مییابد. علاوه بر این بازده انتقال ژن یک و نیم برابر بیشتر از پروتئین PLL / DNA در محیط سرمی است.
نتیجه گیری: نتایج این تحقیق نشان داد نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA از توانایی بالایی در انتقال ژن به سلولهای MCF-7 در مقایسه با کمپلکس PLL/DNA در محیطهای حاوی سرم برخوردار میباشند.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
Study the effect of PLL polymer on gene delivery efficiency by biodegradable PLA-PEG di-block copolymers
نویسندگان [English]
- SA mosavi sooha 1
- H yaghoubi 2
1 Department of Biology, Ardabil Branch, Islamic Azad University, Ardabil, Iran
2 Department of Biology, Ardabil Branch, Islamic Azad University, Ardabil, Iran
چکیده [English]
Aim: The present study aims to investigate the effect of simultaneous encapsulation of DNA with different ratio of PLL via PLA-PEG copolymer, on gene delivery efficiency into mammalian cells. Some characteristics such as biocompatibility, DNA protecting against restriction enzymes, DNA release rate, size and zeta potential were also investigated.
Material and Methods: PLA-PEG/PLL/DNA nanoparticles with different ratio of PLL were prepared by double emulsion-solvent evaporation technique. Then, the release percentage of DNA and the zeta potential of particles in Phosphate Saline buffer (PH=7) were measured.
Results: Increasing the PLL percentage in the PLA-PEG/PLL/DNA nanoparticles resulted in enhancement of particles size and zeta potential. Gel electrophoresis analysis of DNA extracted from PLA-PEG/DNA and PLA-PEG/PLL/DNA nanoparticles after treatment with DNase I enzyme indicates the ability of PLA-PEG and PLA-PEG/PLL copolymers in DNA protection. The flow cytometry and fluorescent microscopy study confirmed that gene transfer efficiency was improved by increasing the ratio of PLL in PLA-PEG/PLL/DNA nanoparticles. Moreover we found that gene transfer efficiency was one and half fold higher then PLL/DNA complex in the serum medium.
Conclusion: The results showed that PLA-PEG nanoparticles in the serum medium have higher potential gene delivery to the MCF-7 cells in comparison with PLA-PEG/PLL/DNA nanoparticles.
کلیدواژهها [English]
- PLA-PEG
- PLL
- biocompatibility
- DNA release
- gene delivery
مقدمه
امروزه تحقیق در زمینه ژن درمانی بهعنوان یک عامل بالقوه جهت درمان بیماریهای حیاتی انسان از قبیل سرطان، اختلالات ژنتیکی و غیره بهسرعت در حال انجام است (1). استفاده از ویروسها در ژن رسانی با بازده نسبتا بالایی انجام میگیرد اما با اینحال همیشه امکان جهش در این ویروسها از نگرانیهای ژن درمانی میباشد (2). لذا با توجه به اهمیت ژن درمانی، توسعه یک سیستم بالقوه که از توانایی انتقال ژن به سلولها یا بافت خاص در بدن که از لحاظ ایمنی نیز خطرناک نباشد ضروری بهنظر میرسد در میان ناقلهای غیر ویروسی انتقال ژن، پلیمرها کاتیونی از قبیل پلیاتیلنایمین (PEI)، پلی ال لایزین) PLL) و پلی 2-دی متیل امینواتیل متاکریلات (PDMAEMA) بهدلیل بازده انتقال بالای ژن بارها مورد مطالعه قرار گرفتهاند (5-3). اکثر پلیمرها کاتیونی که در انتقال ژن مورد استفاده قرار میگیرند زیست تخریب پذیر نبوده و در صورت استفاده در ژن رسانی خطر انباشتگی آنها در بدن وجود دارد (6). از جمله پلیمرهای کاتیونی مورد استفاده در این زمینه میتوان به پلی ال لایزین (PLL) اشاره کرد (7). گروههای آمین در این پلیمر دارای بار کاتیونی بالایی میباشند که میتوانند با بار منفی گروه فسفات در DNA برهمکنش الکترواستاتیک داده و ذراتی بین 10 تا 100 نانومتر بوجود آورند. این ذرات از توانایی بالایی جهت ورود به سلول طی پدیده آندوسیتوز برخوردارند (8). از معایب استفاده از پلیکاتیونهایی از قبیل PEI و PLL در انتقال ژن میتوان به سمیت بالا و پایداری کم آنها در برابر سیستم ایمنی بدن اشاره کرد (10 و 9). بهمنظور غلبه بر این مشکلات از روشهای متعددی از جمله اتصال کوالانت PEG به پلیکاتیونها استفاده شده است. این عمل سبب افزایش پایداری نانوذرات در سیستم گردش خون میشود. با اینحال وجود زنجیره PEG با ایجاد ممانعت فضایی جهت برهمکنش مناسب پلیکاتیون با DNA، مانع از متراکم شدن مناسب DNA میشود (12 و 11). علاوه بر این کمپلکس پلیکاتیون/DNA در برابر پلی آنیونهایی همچون گلیکوزآمینوگلیکان و سولفات دکستران از پایداری پایینی برخوردار است (13 و 9).
استفاده از پلیمرهای زیست تخریبپذیر از قبیل پلی لاکتیک اسید (PLA) و پلی لاکتیک کوگلایکولیک اسید ( PLGA) بهدلیل تخریب زیستی و حذف محصول حاصل در چرخه اسید سیتریک، دارای زیست سازگاری مناسبی میباشند. سرعت تخریب پذیری در پلیمرهای زیست تخریب پذیر با توجه به وزن ملکولی، نوع پلیمر و نسبت پلیمر (در کوپلیمرها) میتواند از چند روز تا چند سال متغیر باشد (6). اندازه بزرگ ذرات حاصل، بازده کم انکپسولاسیون DNA و تمایل برهمکنش هیدروفوبیک بین پروتئین های پلاسما با این پلیمرها که سبب شناسایی و حذف ذرات توسط سیستم رتیکولواندوتلیال (RES) میشود، از جمله موانع کاربرد این پلیمرها در ژن رسانی هستند (14 و 6). اصلاح سطحی پلیمرهای آبگریز از قبیل PLA، توسط پلی اتیلن گلیکول آبدوست و تولید پلیمر دوگانه دوست PLA-PEG علاوه بر کاهش اندازه ذرات حاصل، به دلیل افزایش آبدوستی، انکپسولاسیون DNA و زمان گردش در خون را در مقایسه با PLA تنها افزایش میدهد (15). نتایج تحقیقات گذشته نشان داده است پوشش کمپلکس PEI/DNA توسط کوپلیمر PLA-PEG با تشکیل یک هسته آبگریز نفوذ ناپذیر مانع از نفوذ پلی آنیون به کمپلکس PEI/DNA شده و علاوه بر افزایش پایداری کمپلکس تاثیر سمیت PEI را نیز کاهش میدهد (9). با توجه به بازده بالای پلیمر PLL در انتقال ژن و همچنین زیستسازگاری، زیست تخریبپذیری و پایداری بالای کوپلیمرهای PLA-PEG در برابر سیستم ایمنی بدن، این تحقیق با هدف بررسی راهکاری که بتوان از مزایایی پلیمرهای PLL، PEG و PLA به طور توام در ژن رسانی استفاده نمود، انجام گرفت.
مواد و روشها
آماده سازی و بررسی خصوصیات نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA: بهمنظور تهیه نانوذرات PLA-PEG /PLL/DNA از تکنیک double emulsion solvent evaporation technique استفاده شد (16) بهطور خلاصه 30 میلی گرم از کوپلیمر PLA-PEG بههمراه مقدار متفاوتی از پلیمر PLL (150، 750، 1500 و 2250 میکروگرم) در یک میلیلیتر کلروفرم حل شد (5، 25، 50 و 75 میکروگرم PLL بر میلیگرم PLA-PEG) سپس بهمدت 30 ثانیه با 2/0 میلیلیتر بافر TE حاوی 250 میکروگرم DNA (پلاسمید pEGFP-N1) و 2 میلیگرم BSA سونیکه شد (Sonicator® XL, Misonix, NY). محلول حاصل با 5/1 میلیلیتر محلول PVA یک درصد ترکیب و بهمدت 2 دقیقه روی یخ سونیکه شد. 25 میلیلیتر از محلول PVA 3/0 درصد توسط سرنگ و بهآرامی به محلول فوقالذکر تزریق گردید سپس بهمنظور حذف کلروفورم بهمدت 3 ساعت در دمای اتاق با دور بالا مخلوط شد. نانوذرات حاصل در 15000 دور بهمدت 1 ساعت جمع آوری شدند سپس سوپرناتانت بهمنظور محاسبه درصد بارگذاری جداسازی شد و میزان DNA موجود در آن توسط دستگاه اسپکتروفتومتری (طول موج nm 260) تعیین و با DNA مورد استفاده در فرآیند بارگذاری مقایسه شد. نانوذرات باقی مانده بهمنظور حذف DNA بارگذاری نشده و PVA سه مرتبه توسط آب استریل مورد شتشو قرار گرفتند سپس توسط روش فریزدرای خشک شدند.
بهمنظور محاسبه خصوصیات مرفولوژیکی نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA از میکروسکوپ الکترونی نگاره (SEM)(LEO 1430VP) استفاده شد همچنین اندازه و پتانسیل ذتای ذرات حاصل در بافر PBS با pH=7/4 توسط دستگاه DLS (Malvern Instruments, UK) مورد بررسی قرار گرفت.
بررسی اثر محافظتی نانوذرات PLA-PEG/DNA و PLA-PEG/PLL/DNA از DNA در برابر هضم آنزیمی
جهت بررسی پایداری نانوذرات PLA-PEG/DNA و PLA-PEG/PLL/DNA در برابر هضم آنزیمی یک میلیگرم از نانوذرات PLA-PEG/DNA و PLA-PEG/PLL/DNA حاوی مقدار متفاوت از پلیمر PLL (25، 50، و 75 میکروگرم PLL بر میلیگرم PLA-PEG) با آنزیم DNase I (0.2 U/μg DNA) و بافر هضم (Tris-HCl 50 میلی مولار و MgCl2 10 میلیمولار) بهمدت یک ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. کوپلیمر PLA-PEG و پلیمر PLL با اضافه کردن هپارین در غلظت نهایی 1 درصد و نگهداری بهمدت 4 ساعت بر روی انکوباتور شیکردار با دمای 45 درجه سانتیگراد و دور rpm 120، جداسازی شدند. DNA جداسازی شده توسط فریزدراینگ تغلیظ شده و توسط ژل آگارز مورد بررسی قرار گرفت.
سمیت نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA : بهمنظور محاسبه سمیت پلیمر PLL، کمپلکس PLL/DNA و نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA ابتدا سلولهای MCF-7 با تراکم 7000 سلول در هر ویال به پلیتهای 96 خانهای منتقل شدند سپس بهمدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد و دی اکسید کربن 5 درصد نگهداری شدند. به هر یک از چاهکها بهطور جداگانه پلیمر PLL، PLL/DNA و نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA با مقدار متفاوت PLL در سه تکرار اضافه شد سپس مجدادا بهمدت 24 ساعت در شرایط فوق الذکر نگهداری شدند. جهت محاسبه درصد زنده مانی سلولها از تست MTT استفاده شد (17). بدینمنظور محیط کشت رویی سلولها خالی شد و 100 میکرولیتر محلول MTT تهیه شده در بافر سالین فسفات (5 میلیگرم در میلیلیتر) به هرکدام از چاهکها اضافه شد. پلیتها بهمدت 3 ساعت در انکوباتور در دمای 37 درجه سانتیگراد و در شرایط تاریکی نگهداری شدند. محلول MTT از چاهکها خارج شد سپس کریستالهای فومازین تشکیل شده در هر چاهک، توسط 200 میکرولیتر DMSO حل شد و نهایتا جذب نوری هر کدام از نمونهها در طول موج 570 نانومتر اندازهگیری شد.
الگوی رهایش DNA در شرایط درون شیشهای از نانوذراتPLA-PEG/DNA و PLA-PEG/PLL/DNA
یک میلیگرم از هر کدام از نانو ذرت PLA-PEG/DNA و PLA-PEG/PLL/DNA حاوی مقدار متفاوت پلیمر PLL (5، 25، 50 و 75 میکروگرمPLL بر میلیگرم PLA-PEG) در بافر PBS با 4/7pH= و برروی انکوباتور شیکر با دور rpm 100 و دمای 37 درجه سانتیگراد نگهداری شد. نانوذرات در مدت زمانهای مورد نظر (1، 3، 7، 14، 21 و 28 روز) توسط سانتریفوژ جداسازی شد (دور ×g 16602 و مدت زمان 1 ساعت) و مقداری از سوپرناتانت حاصل توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول 260 نانومتر مورد سنجش قرار گرفت.
ترانسفورماسیون سلولهای MCF-7 با استفاده از نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA: سلولهای MCF-7 با تراکم 20000 سلول در میلیلیتر محیط کشت RPMI-1640 حاوی FBS 10 درصد به هریک از چاهکهای پلیتهای 24 خانه ای منتقل شدند سپس بهمدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد و دیاکسید کربن 5 درصد نگهداری شدند. پس از 24 ساعت بههر چاهک بهطور جداگانه یک میلیگرم نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA (pEGFP-N1) حاوی مقدار متفاوت PLL (5، 25، 50 و 75 میکروگرم PLL بر میلیگرم PLA-PEG) در سه تکرار اضافه شد. از DNA پلاسمیدی فاقد پوشش (pEGFP-N1) بهعنوان کنترل منفی، و از PLL/DNA بهعنوان کنترل مثبت استفاده گردید. پس از نگهداری سلولها بهمدت 7 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد و دی اکسید کربن 5 درصد، محیط رویی سلولها با محیط جدید RPMI-1640 حاوی FBS 10 درصد جایگزین شد و بهمدت 48 ساعت در شرایط فوقالذکر نگهداری شد. جهت بررسی تاثیر پلیمر PLL بر کارایی ترانسفکشن نانوذراتPLA-PEG/PLL/DNA از میکروسکوپ فلورسانس و دستگاه فلورسایتومتر استفاده شد.
آنالیز آماری
تمامی فاکتورهای کمی مورد بررسی در این تحقیق با حداقل 3 تکرار انجام گرفت. تجزیه تحلیل آماری با استفاده از نزم افزار SPSS نسخه 16 و از طریق تجزیه واریانس یک طرفه (One-way ANOVA) انجام گرفت. از آزمون چندمرحلهای دانکن در سطح 5 درصد بهمنظور بررسی مقایسه میانگین استفاده شد سپس میانگین هر یک از تیمارها به همراه انحراف استاندارد (Mean ± SD) بیان شد.
نتایج
بررسی خصوصیات نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA (مورفولوژی، اندازه، پتانسیل زتای و بازده انکپسوله سازی)
مورفولوژی نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA (25 میکروگرم PLL در یک میلیگرم PLA-PEG) در شکل 1 نشان داده شده است تصاویر حاصل از میکروسکوپ الکترونی نگاره (SEM) نشان داد. نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA دارای شکل کروی و سطح صاف هستند (شکل 1).
شکل 1: تصویر میکروسکوپ الکترونی نگاره از نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA (25 میکروگرم PLL بر یک میلیگرم PLA-PEG)
در این تحقیق اندازه و پتانسیل ذتای ذرات توسط DLS نشان داد با افزایش میزان PLL در نانوذرات PLA-PEG /PLL/DNA بر اندازه و پتانسیل ذتای ذرات افزوده میشود به نحوی بیشترین اندازه و پتانسیل ذتای ذرات در نانوذرات با 75 میکروگرم PLL در میلیگرم PLA-PEG/PLL/DNA مشاهده شد (بهترتیب 238 نانومتر و mV 12/6) (شکل 2). تاثیر افزایش مقدار PLL بر پتانسیل ذتای نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA در مقایسه با افزایش اندازه ذرات، بیشتر بود به نحوی که با افزایش میزان PLL میزان بار سطحی ذرات از mV 6/10- در نانوذرات بدون PLL (PLA-PEG/DNA) به mV 12/6 در نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاوی 75 میکروگرم PLL بر میلیگرم PLA-PEG، افزایش یافت.
شکل 2: تاثیر PLL بر اندازه و پتانسیل زتا نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA (a-b) گراف حاصل از اندازهگیری اندازه و پتانسیل زتای نانوذرات PLA-PEG/DNA توسط دستگاه DLS؛ (c-d) گراف حاصل از اندازهگیری اندازه پتانسیل زتای نانوذرات PLA-PEG /PLL/DNA حاوی 75 میکروگرم PLL بر میلیگرم PLA-PEG.
تاثیر افزایش مقدار PLL در نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA بر کارایی انکپسوله سازی DNA در شکل 3 نشان داده شده است. نتایج نشان داد بازده انکپسوله سازی DNA توسط کوپلیمر PLA-PEG بدون استفاده همزمان از پلیمر PLL (PLA-PEG/DNA) 19/38 درصد بود. استفاده هم زمان پلیمر PLL بهطور معنیداری میزان انکپسوله سازی DNA را افزایش داد بهطوریکه بیشترین بازده انکپسوله سازی در نسبت 75 میکروگرم PLL در هر میلیگرم نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA مشاهده شد (72/83 درصد) (شکل 3).
شکل 3: تاثیر PLL در انکپسوله سازی DNA درون کوپلیمر PLA-PEG (حروف الفبا نشان دهنده اختلاف معنیداری در سطح 5 درصد میباشد)
پایداری نانوذرات PLA-PEG/DNA و PLA-PEG/PLL/DNA در برابر هضم آنزیمی
شکل 4 پایداری نانوذرات PLA-PEG/DNA و PLA-PEG /PLL/DNA حاوی مقدار متفاوت PLL در برابر هضم آنزیم DNas I نشان می دهد در چاهک اول DNAشاهد تیمار شده با DNase I هیچگونه باندی از DNA مشاهده نشد که بیانگر تخریب کامل DNA توسط آنزیم DNase I میباشد. همچنین تصویربرداری ژل آگارز نشان داد در چاهک 2 DNA پلاسمیدی مقداری با DNase I هضم شده است که احتمالا نشاندهنده عدم پوشش مناسب توسط نانوذره PLA-PEG/DNA می باشد. با مقایسه DNA شاهد با DNA استخراج شده از نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA پس از تیمار با آنزیم DNase I تفاوت قابل ملاحظهای مشاهده نشد که این امر بیانگر توانایی نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA در محافظت از DNA در برابر هضم آنزیمی، در مقایسه با DNA شاهد میباشد (شکل 4).
شکل 4: پایداری نانوذرات PLA-PEG/DNA و PLA-PEG /PLL/DNA حاوی مقدار متفاوت PLL در برابر هضم آنزیم DNas I؛ چاهک اول DNA شاهد، چاهک دوم DNA تیمار شده با آنزیم DNas I ، چاهک سوم نانوذرات PLA-PEG/DNA تیمار شده با آنزیم DNas I بهمدت یک ساعت، چاهک 4-6 نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاوی نسبتهای 25، 50 و 75 میکروگرم PLL بر میلیگرم PLA-PEG تیمار شده با آنزیم DNas I بهمدت یک ساعت
سمیت نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA
مقایسه میانگین نتایج حاصل از بررسی سمیت پلیمر PLL، کمپلکس PLL/DNA و نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA توسط تست MTT نشان داد که افزایش غلظت پلیمر PLL بهصورت مجزا ویا در ترکیب با DNA (کمپلکس PLL/DNA) از 5 میکروگرم بر میلیلیتر به 75 میکروگرم بر میلیلیتر بهترتیب درصد
زندهمانی سلولهای MCF-7 را از 23/82 (PLL) و 15/73 (PLL/DNA) به 48/0 (PLL) و 78/0 درصد (PLL/DNA) کاهش داد این درحالی بود که حداکثر کاهش زندهمانی در سلولهای تیمار شده با نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA 03/69 درصد بود که در نانوذرات حاوی 75 میکروگرم بر میلیلیتر PLL مشاهده شد (شکل5).
شکل5: سمیت نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاوی غلظتهای متفاوت PLL
الگوی رهایش DNA از نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA
نتایج مقایسه میانگین رهایش DNA از نانوذرات PLA-PEG/DNA و PLA-PEG/PLL/DNA ، نشان داد با افزایش میزان PLL در نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA درصد بیشتری از DNA انکپسوله شده رهاسازی میگردد. به طوری که کمترین درصد رهایش DNA انکپسوله شده، در نانوذرات PLA-PEG/DNA برابر با 78/17 درصد و بیشترین درصد رهایش DNA انکپسوله شده در نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاوی 75 میکروگرم PLL مشاهده شد (45/82 درصد). همچنین این نتایج نشان داد با افزایش میزان PLL در نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA درصد رهایش انفجاری (24 ساعت اول) افزایش و از درصد رهایش آهسته DNA کاسته میشود (شکل 6).
شکل 6: رهش DNA از نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاوی مقدار متفاوت PLL (0 [PLA-PEG/DNA]، 5، 25، 50، 75 میکروگرم PLL بر میلیگرم PLA-PEG) در زمانهای متفاوت
ترانسفورماسیون سلولهای MCF-7 با استفاده از نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA
توانایی نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA در انتقال و رهایش DNA به سلولهای MCF-7 توسط میکروسکوپ فلورسانس و دستگاه فلورسایتومتر به اثبات رسید (شکل 7). تصویر میکروسکوپ فلورسانس نشان داد در برخی از سلولهای MCF-7 تیمار شده با نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA، نشر سبز رنگ مشاهده شد که نشان دهنده توانایی این نانوذرات در انتقال و رهش DNA درون این سلولها بود این در حالی بود که DNA فاقد پوشش در محیط حاوی سرم از توانایی انتقال به سلولهای MCF-7 برخوردار نبود. نتایج دستگاه فلوسایتومتری نشان داد با افزایش نسبت PLL در نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA بر بازده انتقال ژن افزوده شد اگرچه بیشترین بیان ژن GFP در سلولهای تیمار شده با نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاوی 50 میکروگرم PLL بر میلیگرم PLA-PEG مشاهده شد (88/33 درصد) با این وجود در مقایسه با بازده انتقال ژن توسط نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاوی 75 میکرگرم PLL در میلیگرم PLA-PEG (72/29 درصد) دارای تاثیر معنی داری نبود. همچنین این نتایج نشان داد کمپلکس PLL/DNA از بازده انتقال ژن پایینی در مقایسه با نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاوی 25، 50 و 75 میکروگرم PLL بر میلیگرم PLA-PEG برخوردار است به نحوی که در نسبت های 50 و 75 میکروگرم PLL بر میلیگرم PLA-PEG بازده انتقال ژن در مقایسه با PLL/DNA از 88/18 درصد بهترتیب به 88/33 و 72/29 درصد افزایش یافت (بیش از 5/1 برابر).
شکل 7: ترانسفکشن سلولهای MCF-7 توسط کمپلکس PLL/DNA و نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA؛ (a-c) بهترتیب تصویر میکروسکوپ فلورسنس از سلولهای شاهد، تیمار شده با کمپلکس PLL/DNA و نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاوی 50 میکروگرم PLL بر میلیگرم PLA-PEG؛ (d-f) بهترتیب میکروگراف فلوسایتومتری از سلولهای شاهد، تیمار شده با کمپلکس PLL/DNA و نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاوی 50 میکروگرم PLL بر میلیگرم PLA-PEG؛ (g) بازده ترانسفکشن در سلولهای MCF-7 توسط نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA
بحث
انتقال اسید نوکلئیک به سلولها و همچنین بافتهای آسیب دیده با هدف ژندرمانی و درمان ژنهای جهش یافته و معیوب، و یا از طریق انتقال siRNA با هدف جلوگیری از بیان ژنهای مضر پنچرهای نو بهسوی درمان بسیاری از بیماریها گشوده است. نانووکتورهای کاتیونی از قبیل PLL از بازده بالایی جهت انتقال ژن به سلولهای یوکاریوتی برخوردارند با این وجود یکی از موانع استفاده بالینی از این نانوناقلها در انتقال نوکلوئیک اسید، سمیت نسبتا بالای این ناقلها میباشد (16). لذا تحقیق بر روی پلیمرهای با زیست تخریب پذیر و زیست سازگار مناسب، میتواند نتایج امیدوار کنندهای را جهت استفاده بالینی نانوناقلها در ژندرمانی در پی داشته باشد. پلیمرهای چند قطعهای حاوی قطعات آبدوست و آبگریز در محیطهای آبی تشکیل میسلهای پایداری را میدهند که از توانایی بالایی در انتقال و محافظت از داروهای انکپسوله شده، از قبیل DNA، RNA، پپتید، پروتئین و غیره، در برابر عوامل مخرب بیرونی برخوردار هستند (6). توانایی کوپلیمرهای قطعه درکنترل رهش دارو، از طریق ترکیب قطعات متفاوت و همچنین تغییر وزن ملکولی هر یک از این قطعات، از دیگر تحقیقات انجام شده در سالهای اخیر بوده است (9). با وجود مزایایی متعدد کوپلیمرهای زیستتخریب پذیر از قبیل PLA-PEG ، بازده پایین این نانووکتورها در انتقال ژن، استفاده از این کوپلیمرها را در ژندرمانی با محدودیت روبهرو ساخته است.
با توجه به مزایایی ذکر شده پلیمرهای PLA-PEG از قبیل زیستسازگاری، زیست تخریبپذیری و همچنین توانایی در کنترل رهش تدریجی دارو، همچنین با توجه به بازده بالایی انتقال ژن توسط PLL و نظر به اینکه تاکنونی تحقیقی به منظور بررسی تاثیر استفاده همزمان از پلیمر PLL و کوپلیمر PLA-PEG بر بازده انتقال ژن و همچنین زیست سازگاری، سرعت رهش، بازده انکپسولاسیون و غیره انجام نگردیده است لذا این تحقیق با هدف بررسی استفاده همزمان از پلیمر PLL و کوپلیمر PLA-PEG جهت انتقال ژن به سلولهای MCF-7 انجام گرفت چون با بهدست آورن رابطه بین نسبت پلیمر PLL و کوپلیمرPLA-PEG در نانوذرات PLA-PEG/PLL بر خصوصیات مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی و همچنین بازده انتقال ژن میتوان در آینده میسلهایی با بازده انتقال مناسب، سمیت کم و اندازه مورد نظر، با کاربردهای درمانی متفاوت تولید نمود.
اهمیت مورفولوژی ذرات در انتقال و رهش ژن و دارو هم بهصورت تجربی و هم به صورت محاسباتی مشخص شده است نتایج این تحقیقات نشان داده است نانوذراتی که دارای ساختار کروی هستند از توانایی بیشتری در انتقال دارو نسبت به سایر نانوذرات برخوردارند (19 و 18). مورفولوژی نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاصل از میکروسکوپ الکترونی نگاره نشان داد که نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA دارای شکل کروی و سطح صاف هستند. اندازه و پتانسیل ذتای ذرات از دیگر فاکتورهای مهم در دارو و ژن رسانی است به گونهای که در برخی از سلولها تنها ذرات زیر میکرومتر قادر به انتقال هستند. (21 و 20). کاهش اندازه ذرات علاوه بر افزایش بازده انتقال ژن، امکان شناسایی آنها را توسط سیستم رتیکولواندوتلیال کاهش داده، و بدین ترتیب سبب افزایش طول عمر ذرات، در سیستم گردش خون میشود (22). تعیین بار سطحی ذرات جهت پیشبینی پایداری آنها در سیستم گردش خون، خودتجمعی و بازده انتقال ژن ضروری به نظر میرسد. افزایش بار کاتیونی ذرات علاوه بر ایجاد دافعه بین ذرات همبار و جلوگیری ازخود تجمعی آنها، با برهمکنش الکترواستاتیک ذرات با غشای سلولی سبب افزایش بازده انتقال ژن میگردد (23). با افزایش میزان PLL در نانوذرات PLA-PEG /PLL/DNA بر اندازه و پتانسیل ذتای ذرات افزوده میشود به نحوی بیشترین اندازه و پتانسیل ذتای ذرات در نانوذرات با 75 میکروگرم PLL در میلیگرم PLA-PEG/PLL/DNA مشاهده شد. تاثیر افزایش مقدار PLL بر پتانسیل ذتای نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA در مقایسه با افزایش اندازه ذرات، بیشتر بود به نحوی که با افزایش میزان PLL میزان بار سطحی ذرات از mV 6/10- در نانوذرات بدون PLL به mV 12/6 در نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاوی 75 میکروگرم PLL بر میلیگرم PLA-PEG، افزایش یافت.
وجود گروه کربوکسیل در قطعات PLA، و همچنین گروه فسفات موجود در فسفات DNA میتواند از دلایل پتانسیل منفی در نانوذات PLA-PEG/DNA باشد. افزایش میزان PLL با خنثی سازی بار منفی DNA و PLA سبب افزایش پتانسیل ذتای نانوذرات میشود.
انکپسوله سازی ماکروملکولهای آبدوست از قبیل DNA بهدلیل بار منفی و آبدوستی زیاد درون هسته آبگریز از قبیل PLA مشکل میباشد با اینحال تکنیکهای متفاوتی جهت افزایش بازگذاری DNA گزارش شده است (9). باتوجه به وجود بار منفی در گروه فسفات DNA و همچنین گروه کربوکسیل در PLA، شاید بتوان یکی از دلایل افزایش بازده انکپسوله سازی DNA در حضور PLL را خنثی سازی بار منفی DNA در اثر برهمکنش با PLL و در نتیجه کاهش دافعه بین DNA و قطعه PLA دانست.
یکی از مشکلات انتقال ژن به سلولهای پستانداران چه در شرایط زنده و چه در شرایط آزمایشگاهی تخریب DNA توسط آنزیم های محدود کننده میباشد. بهطوریکه گزارش شده است در انتقال ژن از مسیر وابسته به آندوسیتوز بیش از 99 درصد DNA وارد شده به سلول توسط مکانیزم دفاعی سلول از بین میرود (25 و 24).
نتایج تحقیقات گذشته نشان داده است پلیکاتیونها در اثر کمپلکس با DNA ممانعت فیزیکی جهت اتصال آنزیمهای محدود کننده ایجاد کرده و بدینترتیب DNA را از هضم توسط این آنزیمها محافظت مینمایند (27 و 26). همچنین Abebe و همکاران (9) گزارش کردند که پوشش PEI/DNA توسط کوپلیمر PLLA-PEG-PLLA مانع از رهاسازی زودهنگام DNA از PEI، در برابر پلی آنیونها موجود در محیط میگردند آنها پیشنهاد کردند لایه نفوذ ناپذیر PLA از نفوذ پلی آنیونها به کمپلکس PEI/DNA ممانعت میکند. لذا با توجه به نتایج حاصل از تحقیقات مشابه بهنظر میرسد فشرده سازی و کاهش سطح تماس DNA توسط کوپلیمر PLA-PEG و پلیمر PLL مانع از اتصال آنزیمهای محدود کننده و همچنین برخورد مستقیم امواج فراصوت با DNA میشود.
تعاملهای الکترواستاتیکی پلیمرهای کاتیونی و سطح آنیونی سلولی، از اهمیت بسیار بالایی برای جذب کمپلکسهای DNA-نانوحامل به درون سلولها برخوردار است. اما این برهمکنشهای غشایی بهنظر میرسد که از لحاظ سمیت نیز مهم باشد چرا که باعث آسیب مستقیم به سلولهای هدف میشوند (22). پوشاندن گروههای سطحی بهطور موفقیت آمیزی برای کاهش سمیت نانوناقلها کاتیونی استفاده شده است. برای مثال اتصال کوالانسی یک گروه اسید اوریک یا پلیاتیلنگلیکول به سطح نانوناقلها میتواند سمیت آنها را کاهش دهد (28) با این وجود اتصال کوالانت PEG در برهمکنش مناسب DNA با پلیمر اختلال ایجاد میکند و مانع از فشرده سازی مناسب DNA میشود (30 و 29).
Alshamsan و همکاران (17) در تحقیق مشابه گزارش کردند پوشش PEI توسط PLGA سبب کاهش معنیدار سمیت PLGA-PEI در مقایسه با PEI میشود آنها یکی از دلایل این کاهش سمیت را رهش کم PEI در سلولها در هنگام بررسی سمیت PEI و PLGA-PEI دانستند با توجه به اینکه در این تحقیق 82/75 درصد از DNA انکپسوله شده در نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاوی 75 میکروگرم PLL بر میلیگرم PLA-PEG ، در 24 ساعت اول پس از تیمار با بافر فسفات رهاسازی شد. لذا بهنظر نمیرسد رهش دیرهنگام باعث کاهش سمیت PLL باشد. تحقیقات گذشته در زمینه بررسی علت سمیت پلیمرهای کاتیونی بر سلولهای پستانداران، نشان داد ایجاد حفره و نازک شدن غشای سلولی در اثر برهمکنش غشای سلولی با پلیکاتیونها علت اصلی سمیت این پلیمرها میباشد (4 و 3). لذا بهنظر میرسد یکی از دلایل کاهش سمیت نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA در مقایسه با PLL و PLL/DNA، کاهش سطح تماس PLL با غشای سلولی باشد.
توانایی کوپلیمرهای حاوی قطعات PLA و PEG در کنترل رهش دارو در تحقیقات متعددی به اثبات رسیده است (31 و 9). این ویژگی میتوان در درمان برخی از بیماریها از قبیل بیماری لکه زدی شبکیه که نیاز به سطح پایداری از کورتیکواستروئیدها در ناحیه مورد درمان میباشد، مطلوب باشد (32). نتایج این تحقیق نشان داد رهایش DNA از نانوذرات PLA-PEG/DNA و PLA-PEG/PLL/DNA، ابتدا به صورت انفجاری و سپس بهصورت آهسته رخ داد. بهطوری که بیش از 50 درصد از DNA رهاسازی شده در مدت زمان 28 روز، در 24 ساعت اول رهاسازی شد.
تاثیر استفاده همزمان از پلیمرهای آبدوست بههمراه پلیمرهای قطعهای متشکل از قطعات آبدوست و آبگریز بر افزایش سرعت رهایش DNA به اثبات رسیده است. ایجاد کانالهای آبی درون ماتریکس توسط پلیمرهای آبدوست، یکی از عوامل افزایش سرعت رهایش DNA گزارش شده است (17 و 16). نتایج این تحقیق نشان داد با افزایش نسبت PLL در نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA درصد رهایش انفجاری افزایش و از درصد رهش آهسته کاسته شد. با توجه به نتایج این تحقیق به نظر میرسد بتوان با تغییر نسبت پلیمر PLL بر کوپلیمر PLA-PEG سرعت و الگوی رهایش DNA را بسته به هدف مورد نظر کنترل نمود.
انتقال DNA فاقد پوشش به درون سلول، بهدلایلی از جمله اندازه و پتانسیل سطحی نامناسب، هضم زود هنگامDNA توسط مکانیزم دفاعی سلول طی انتقال درون سلولی وتحت سلولی و غیره مشکل میباشد (25 و 24).
نانوحامل های کاتیونی از قبیل PLL و لیپوزومهای کاتیونی تمایل به جذب آنیونی پروتئینهای موجود در سرم دارند که این عمل علاوه بر رهایش زودهنگام DNA، سبب بزرگتر شدن ذرات شده و عبور این وکتورها را از غشا و یا ارائه ژن به هسته را با محدودیت روبرو میکند. همچنین برهمکنش این وکتورها با پروتئینهای پلاسما سبب شناسایی سریع آنها توسط سیستم ایمنی بدن شده و موجب حذف سریع آنها و در نتیجه کاهش بازده انتقال ژن در شرایط زنده میگردد (9 و 6). نتایج این تحقیق نشان داد نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA در محیط حاوی سرم از توانایی بالایی جهت انتقال ژن به سلولهای MCF-7 برخوردارند. وجود PEG به عنوان پوسته خارجی در این نانوذرات مانع از تعاملات غیر اختصاصی با سرم شده و تجمع ذرات را به حداقل میرساند (33).
نتیجه گیری
هدف از انجام تحقیق حاضر پیشنهاد یک سیستم میسلی چند کاره جهت انتقال ژن بود که مزایایی پلیمرهای کاتیونی، زیست تخریب پذیر و دوگانه دوست را بهطور توام داشته باشد. نتایج تحقیق حاضر نشان داد استفاده همزمان از پلیمرهای PLL و PLA-PEG علاوه بر کاهش سمیت PLL و بهبود رهایشDNA از کوپلیمرPLA-PEG، از DNA در برابر آسیبهای ناشی از هضم آنزیمی محافظت مینماید. علاوه براین نتایج این تحقیق نشان داد نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA از توانایی بالایی در انتقال ژن به سلولهای MCF-7 در مقایسه با کمپلکس PLL/DNA در محیطهای حاوی سرم برخوردار میباشند.
تشکر و قدردانی
این مقاله نتیجه پایان نامه کارشناسی ارشد می باشد. نویسندگان این مقاله از مسئولین محترم دانشگاه آزاد اسلامی واحد اردبیل بهخاطر فراهم کردن امکانات انجام این تحقیق و نیز از تمام کسانی که در انجام این پروژه همکاری و حمایت نمودند، کمال تشکر و قدردانی را دارند.