فصلنامه

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه آزاد اسلامی واحد اردبیل، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، اردبیل، ایران

2 -دانشگاه آزاد اسلامی واحد اردبیل، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، اردبیل، ایران

چکیده

هدف : مطالعه حاضر با هدف بررسی تاثیر انکپسوله­سازی همزمان DNA با نسبت­های متفاوت PLL توسط کوپلیمر PLA-PEG بر افزایش کارایی انتقال ژن به سلول­های پستانداران و خصوصیاتی از قبیل زیست سازگاری، محافظت از DNA در برابر آنزیم­های برشی، سرعت رهایش DNA، اندازه و پتانسیل ذتای ذرات انجام گرفت.
مواد و روشها: نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA با نسبت­های متفاوت PLL، بر اساس تکنیک  انتشار حلال تهیه شدند. سپس درصد رهایش DNA، اندازه و پتانسیل ذتای ذرات در بافر سالین فسفات با 4/7pH= مورد بررسی قرار گرفت.
نتایج: با افزایش درصد PLL در نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA اندازه و پتانسیل ذتای ذرات حاصل افزایش یافت. آنالیز ژل الکتروفورز از DNA استخراج شده از نانوذرات PLA-PEG/DNA و PLA-PEG/PLL/DNA پس از تیمار با آنزیمDNasI، بیانگر توانایی کوپلیمر PLA-PEG و PLA-PEG/PLL در محافظت از DNA بود. بررسی فلوسایتومتری و میکروسکوپ فلورسنس تایید کرد که بازده انتقال ژن با افزایش نسبت PLL در نانوذرات PLA-PEG / PLL / DNA بهبود می‫یابد. علاوه بر این بازده انتقال ژن یک و نیم برابر بیشتر از پروتئین PLL / DNA در محیط سرمی است.
نتیجه گیری: نتایج این تحقیق نشان داد نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA از توانایی بالایی در انتقال ژن به سلول­های MCF-7 در مقایسه با کمپلکس PLL/DNA در محیط­های حاوی سرم برخوردار می­باشند.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Study the effect of PLL polymer on gene delivery efficiency by biodegradable PLA-PEG di-block copolymers

نویسندگان [English]

  • SA mosavi sooha 1
  • H yaghoubi 2

1 Department of Biology, Ardabil Branch, Islamic Azad University, Ardabil, Iran

2 Department of Biology, Ardabil Branch, Islamic Azad University, Ardabil, Iran

چکیده [English]

Aim: The present study aims to investigate the effect of simultaneous encapsulation of DNA with different ratio of PLL via PLA-PEG copolymer, on gene delivery efficiency into mammalian cells. Some characteristics such as biocompatibility, DNA protecting against restriction enzymes, DNA release rate, size and zeta potential were also investigated.
Material and Methods: PLA-PEG/PLL/DNA nanoparticles with different ratio of PLL were prepared by double emulsion-solvent evaporation technique. Then, the release percentage of DNA and the zeta potential of particles in Phosphate Saline buffer (PH=7) were measured.
Results: Increasing the PLL percentage in the PLA-PEG/PLL/DNA nanoparticles resulted in enhancement of particles size and zeta potential. Gel electrophoresis analysis of DNA extracted from PLA-PEG/DNA and PLA-PEG/PLL/DNA nanoparticles after treatment with DNase I enzyme indicates the ability of PLA-PEG and PLA-PEG/PLL copolymers in DNA protection. The flow cytometry and fluorescent microscopy study confirmed that gene transfer efficiency was improved by increasing the ratio of PLL in PLA-PEG/PLL/DNA nanoparticles.  Moreover we found that gene transfer efficiency was one and half fold higher then PLL/DNA complex in the serum medium.
Conclusion: The results showed that PLA-PEG nanoparticles in the serum medium have higher potential gene delivery to the MCF-7 cells in comparison with PLA-PEG/PLL/DNA nanoparticles.
 
 

کلیدواژه‌ها [English]

  • PLA-PEG
  • PLL
  • biocompatibility
  • DNA release
  • gene delivery

مقدمه

امروزه تحقیق در زمینه ژن درمانی به‫عنوان یک عامل بالقوه جهت درمان بیماری­های حیاتی انسان از قبیل سرطان، اختلالات ژنتیکی و غیره به‫سرعت در حال انجام است (1). استفاده از ویروس­ها در ژن رسانی با بازده نسبتا بالایی انجام می­گیرد اما با این‫حال همیشه امکان جهش در این ویروس­ها از نگرانی‫های ژن درمانی می­باشد (2). لذا با توجه به اهمیت ژن درمانی، توسعه یک سیستم بالقوه که از توانایی انتقال ژن به سلول­ها یا بافت خاص در بدن که از لحاظ ایمنی نیز خطرناک نباشد ضروری به‫نظر می­رسد در میان ناقل­های غیر ویروسی انتقال ژن، پلیمرها کاتیونی از قبیل پلی­اتیلن­ایمین        (PEI)، پلی ال لایزین) PLL) و پلی 2-دی متیل امینواتیل متاکریلات (PDMAEMA) به‫دلیل بازده انتقال بالای ژن بارها مورد مطالعه قرار گرفته­اند (5-3). اکثر پلیمرها کاتیونی که در انتقال ژن مورد استفاده قرار می­گیرند زیست تخریب پذیر نبوده و در صورت استفاده در ژن رسانی خطر انباشتگی آنها در بدن وجود دارد (6). از جمله پلیمرهای کاتیونی مورد استفاده در این زمینه می­توان به پلی ال لایزین (PLL) اشاره کرد (7). گروه‫های آمین در این پلیمر دارای بار کاتیونی بالایی می­باشند که می­توانند با بار منفی گروه فسفات در DNA برهمکنش الکترواستاتیک داده و ذراتی بین 10 تا 100 نانومتر بوجود آورند. این ذرات از توانایی بالایی جهت ورود به سلول طی پدیده آندوسیتوز برخوردارند (8). از معایب استفاده از پلی­کاتیون­هایی از قبیل PEI و PLL در انتقال ژن می­توان به سمیت بالا و پایداری کم آن­ها در برابر سیستم ایمنی بدن اشاره کرد (10 و 9). به‫منظور غلبه بر این مشکلات از روش­های متعددی از جمله اتصال کوالانت PEG به پلی­کاتیون­ها استفاده شده است. این عمل سبب افزایش پایداری نانوذرات در سیستم گردش خون می‫شود. با این‫حال وجود زنجیره PEG با ایجاد ممانعت فضایی جهت برهم‫کنش مناسب پلی­کاتیون با DNA، مانع از متراکم شدن مناسب DNA می‫شود (12 و 11). علاوه بر این کمپلکس پلی­کاتیون/DNA در برابر پلی آنیون‫هایی همچون گلیکوزآمینوگلیکان و سولفات دکستران از پایداری پایینی برخوردار است (13 و 9).

استفاده از پلیمرهای زیست تخریب­پذیر از قبیل پلی لاکتیک اسید (PLA) و پلی لاکتیک کوگلایکولیک اسید ( PLGA) به‫دلیل تخریب زیستی و حذف محصول حاصل در چرخه اسید سیتریک، دارای زیست سازگاری مناسبی می­باشند. سرعت تخریب پذیری در پلیمرهای زیست تخریب پذیر با توجه به وزن ملکولی، نوع پلیمر و نسبت پلیمر (در کوپلیمرها) می­تواند از چند روز تا چند سال متغیر باشد (6). اندازه بزرگ ذرات حاصل، بازده کم انکپسولاسیون DNA و تمایل برهمکنش هیدروفوبیک بین پروتئین های پلاسما با این پلیمرها که سبب شناسایی و حذف ذرات توسط سیستم رتیکولواندوتلیال (RES) می‫شود، از جمله موانع کاربرد این پلیمرها در ژن رسانی هستند (14 و 6). اصلاح سطحی پلیمرهای آبگریز از قبیل PLA، توسط پلی اتیلن گلیکول آبدوست و تولید پلیمر دوگانه دوست PLA-PEG علاوه بر کاهش اندازه ذرات حاصل، به دلیل افزایش آبدوستی، انکپسولاسیون DNA  و زمان گردش در خون را در مقایسه با PLA تنها افزایش می­دهد (15). نتایج تحقیقات گذشته نشان داده است پوشش کمپلکس PEI/DNA توسط کوپلیمر PLA-PEG با تشکیل یک هسته آبگریز نفوذ ناپذیر مانع از نفوذ پلی آنیون به کمپلکس PEI/DNA شده و علاوه بر افزایش پایداری کمپلکس تاثیر سمیت PEI را نیز کاهش می­دهد (9). با توجه به بازده بالای پلیمر PLL در انتقال ژن و همچنین زیست­سازگاری، زیست تخریب‫پذیری و پایداری بالای کوپلیمرهای PLA-PEG در برابر سیستم ایمنی بدن، این تحقیق با هدف بررسی راه‫کاری که بتوان از مزایایی پلیمرهای PLL، PEG و PLA به طور توام در ژن رسانی استفاده نمود، انجام گرفت.

مواد و روش‌ها

آماده سازی و بررسی خصوصیات نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA: به‫منظور تهیه نانوذرات PLA-PEG /PLL/DNA از تکنیک double emulsion solvent evaporation technique استفاده شد (16) به‫طور خلاصه 30 میلی گرم از کوپلیمر PLA-PEG به‫همراه مقدار متفاوتی از پلیمر PLL (150، 750، 1500 و 2250 میکروگرم) در یک میلی­لیتر کلروفرم حل شد (5، 25، 50 و 75 میکروگرم PLL بر میلی­گرم PLA-PEG) سپس به‫مدت 30 ثانیه با 2/0 میلی­لیتر بافر TE حاوی 250 میکروگرم DNA (پلاسمید  pEGFP-N1) و 2 میلی­گرم BSA سونیکه شد (Sonicator® XL, Misonix, NY). محلول حاصل با 5/1 میلی­لیتر محلول PVA یک درصد ترکیب و به‫مدت 2 دقیقه روی یخ سونیکه شد. 25 میلی­لیتر از محلول PVA 3/0 درصد توسط سرنگ و به‫آرامی به محلول فوق­الذکر تزریق گردید سپس به‫منظور حذف کلروفورم به‫مدت 3 ساعت در دمای اتاق با دور بالا مخلوط شد. نانوذرات حاصل در 15000 دور به‫مدت 1 ساعت جمع آوری شدند سپس سوپرناتانت به‫منظور محاسبه درصد بارگذاری جداسازی شد و میزان DNA موجود در آن توسط دستگاه اسپکتروفتومتری (طول موج nm 260) تعیین و با DNA مورد استفاده در فرآیند بارگذاری مقایسه شد. نانوذرات باقی مانده به‫منظور حذف DNA بارگذاری نشده و PVA سه مرتبه توسط آب استریل مورد شتشو قرار گرفتند سپس توسط روش فریزدرای خشک شدند.

به‫منظور محاسبه خصوصیات مرفولوژیکی نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA از میکروسکوپ الکترونی نگاره (SEM)(LEO 1430VP) استفاده شد همچنین اندازه و پتانسیل ذتای ذرات حاصل در بافر PBS با pH=7/4  توسط دستگاه DLS (Malvern Instruments, UK) مورد بررسی قرار گرفت.

بررسی اثر محافظتی نانوذرات PLA-PEG/DNA و PLA-PEG/PLL/DNA از DNA در برابر هضم آنزیمی

جهت بررسی پایداری نانوذرات PLA-PEG/DNA و PLA-PEG/PLL/DNA در برابر هضم آنزیمی یک میلی­گرم از نانوذرات PLA-PEG/DNA و PLA-PEG/PLL/DNA حاوی مقدار متفاوت از پلیمر PLL  (25، 50، و 75 میکروگرم PLL بر میلی­گرم PLA-PEG) با آنزیم DNase I (0.2 U/μg DNA) و بافر هضم (Tris-HCl 50 میلی مولار و MgCl2  10 میلی‫مولار) به‫مدت یک ساعت در دمای 37 درجه سانتی­گراد نگه‫داری شدند. کوپلیمر PLA-PEG و پلیمر PLL با اضافه کردن هپارین در غلظت نهایی 1 درصد و نگه‫داری به‫مدت 4 ساعت بر روی انکوباتور شیکردار  با دمای 45 درجه سانتی‫گراد و دور rpm 120، جداسازی شدند. DNA جداسازی شده توسط فریزدراینگ تغلیظ شده و توسط ژل آگارز مورد بررسی قرار گرفت.

سمیت نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA : به‫منظور محاسبه سمیت پلیمر PLL، کمپلکس PLL/DNA و نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA ابتدا سلول­های MCF-7 با تراکم 7000 سلول در هر ویال به پلیت­های 96 خانه‫ای منتقل شدند سپس به‫مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‫گراد و دی اکسید کربن 5 درصد نگه‫داری شدند. به هر یک از چاهک­ها به‫طور جداگانه پلیمر PLL، PLL/DNA و نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA  با مقدار متفاوت PLL در سه تکرار اضافه شد سپس مجدادا به‫مدت 24 ساعت در شرایط فوق الذکر نگه‫داری شدند. جهت محاسبه درصد زنده مانی سلول­ها از تست MTT استفاده شد (17). بدین‫منظور محیط کشت رویی سلول­ها خالی شد و 100 میکرولیتر محلول MTT تهیه شده در بافر سالین فسفات (5 میلی‫گرم در میلی­لیتر) به هرکدام از چاهک­ها اضافه شد. پلیت­ها به‫مدت 3 ساعت در انکوباتور در دمای 37 درجه سانتی­گراد و در شرایط تاریکی نگه‫داری شدند. محلول MTT از چاهک­ها خارج شد سپس کریستال­های فومازین تشکیل شده در هر چاهک، توسط 200 میکرولیتر DMSO حل شد و نهایتا جذب نوری هر کدام از نمونه­ها در طول موج 570 نانومتر اندازه­گیری شد.

الگوی رهایش DNA در شرایط درون شیشه­ای از نانوذراتPLA-PEG/DNA و PLA-PEG/PLL/DNA

یک میلی­گرم از هر کدام از نانو ذرت PLA-PEG/DNA و PLA-PEG/PLL/DNA حاوی مقدار متفاوت پلیمر PLL (5، 25، 50 و 75 میکروگرمPLL  بر میلی­گرم PLA-PEG) در بافر PBS با 4/7pH= و برروی انکوباتور شیکر با دور rpm 100 و  دمای 37 درجه سانتی­گراد نگه‫داری شد. نانوذرات در مدت زمان­های مورد نظر (1، 3، 7، 14، 21 و 28 روز) توسط سانتریفوژ جداسازی شد (دور ×g 16602  و مدت زمان 1 ساعت) و مقداری از سوپرناتانت حاصل توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول 260 نانومتر مورد سنجش قرار گرفت.

ترانسفورماسیون سلول­های MCF-7 با استفاده از نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA: سلول­های MCF-7 با تراکم 20000  سلول در میلی­لیتر محیط کشت RPMI-1640 حاوی FBS 10 درصد به هریک از چاهک‫های پلیت­های 24 خانه ای منتقل شدند سپس به‫مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد و دی‫اکسید کربن  5 درصد نگه‫داری شدند. پس از 24 ساعت به‫هر چاهک به‫طور جداگانه یک میلی­گرم نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA (pEGFP-N1) حاوی مقدار متفاوت PLL (5، 25، 50 و 75 میکروگرم PLL بر میلی­گرم PLA-PEG) در سه تکرار اضافه شد. از DNA  پلاسمیدی فاقد پوشش (pEGFP-N1) به‫عنوان کنترل منفی، و از PLL/DNA  به‫عنوان کنترل مثبت استفاده گردید. پس از نگه‫داری سلول­ها به‫مدت 7 ساعت در دمای 37 درجه سانتی­گراد و دی اکسید کربن  5 درصد، محیط رویی سلول­ها با محیط جدید RPMI-1640 حاوی FBS 10 درصد جایگزین شد و به‫مدت 48 ساعت در شرایط فوق­الذکر نگه‫داری شد. جهت بررسی تاثیر پلیمر PLL بر کارایی ترانسفکشن نانوذراتPLA-PEG/PLL/DNA از میکروسکوپ فلورسانس و دستگاه فلورسایتومتر استفاده شد.

 

آنالیز آماری

تمامی فاکتورهای کمی مورد بررسی در این تحقیق با حداقل 3 تکرار انجام گرفت. تجزیه تحلیل آماری با استفاده از نزم افزار SPSS نسخه 16 و از طریق تجزیه واریانس یک طرفه (One-way ANOVA) انجام گرفت. از آزمون چندمرحله­ای دانکن  در سطح 5 درصد به‫منظور بررسی مقایسه میانگین استفاده شد سپس میانگین هر یک از تیمارها به همراه انحراف استاندارد (Mean ± SD) بیان شد.

 

نتایج

بررسی خصوصیات نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA (مورفولوژی، اندازه، پتانسیل زتای و بازده انکپسوله سازی)

مورفولوژی نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA  (25 میکروگرم PLL در یک میلی­گرم PLA-PEG) در شکل 1 نشان داده شده است تصاویر حاصل از میکروسکوپ الکترونی نگاره (SEM) نشان داد. نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA  دارای شکل کروی و سطح صاف هستند (شکل 1).

 

 

 

 

 

شکل 1: تصویر میکروسکوپ الکترونی نگاره از نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA (25 میکروگرم PLL بر یک میلی­گرم PLA-PEG)

 

 

در این تحقیق اندازه و پتانسیل ذتای ذرات توسط DLS نشان داد با افزایش میزان PLL در نانوذرات PLA-PEG /PLL/DNA بر اندازه و پتانسیل ذتای ذرات افزوده می‫شود به نحوی بیشترین اندازه و پتانسیل ذتای ذرات در نانوذرات با 75 میکروگرم PLL در میلی­گرم PLA-PEG/PLL/DNA مشاهده شد (به‫ترتیب 238 نانومتر و mV 12/6) (شکل 2). تاثیر افزایش مقدار PLL بر پتانسیل ذتای نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA در مقایسه با افزایش اندازه ذرات، بیشتر بود به نحوی که با افزایش میزان PLL میزان بار سطحی ذرات از mV 6/10- در نانوذرات بدون PLL (PLA-PEG/DNA) به mV 12/6 در نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاوی 75 میکروگرم PLL بر میلی­گرم PLA-PEG، افزایش یافت.

 

 

 

 

 

شکل 2: تاثیر PLL بر اندازه و پتانسیل زتا نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA (a-b) گراف حاصل از اندازه­گیری اندازه و پتانسیل زتای نانوذرات PLA-PEG/DNA توسط دستگاه DLS؛ (c-d) گراف حاصل از اندازه­گیری اندازه پتانسیل زتای نانوذرات PLA-PEG /PLL/DNA حاوی 75 میکروگرم PLL بر میلی‫گرم PLA-PEG.

 

 

تاثیر افزایش مقدار PLL در نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA بر کارایی انکپسوله سازی DNA در شکل 3 نشان داده شده است. نتایج نشان داد بازده انکپسوله سازی DNA توسط کوپلیمر PLA-PEG بدون استفاده همزمان از پلیمر PLL (PLA-PEG/DNA) 19/38 درصد بود. استفاده هم زمان پلیمر PLL به‫طور معنی‫داری میزان انکپسوله سازی DNA را افزایش داد به‫طوری‫که بیشترین بازده انکپسوله سازی در نسبت 75 میکروگرم PLL در هر میلی­گرم نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA  مشاهده شد (72/83 درصد) (شکل 3).

 

 

 

 

 

 

شکل 3: تاثیر PLL در انکپسوله سازی DNA درون کوپلیمر PLA-PEG (حروف الفبا نشان دهنده اختلاف معنی­داری در سطح 5 درصد می‫باشد)

 

پایداری نانوذرات PLA-PEG/DNA و PLA-PEG/PLL/DNA در برابر هضم آنزیمی

شکل 4 پایداری نانوذرات PLA-PEG/DNA و PLA-PEG /PLL/DNA حاوی مقدار متفاوت PLL در برابر هضم آنزیم DNas I نشان می دهد در چاهک اول  DNAشاهد تیمار شده با DNase I هیچ­گونه باندی از DNA مشاهده نشد که بیانگر تخریب کامل DNA توسط آنزیم DNase I می­باشد. همچنین تصویربرداری ژل آگارز نشان داد در چاهک 2 DNA پلاسمیدی مقداری با DNase I هضم شده است که احتمالا نشان‫دهنده عدم پوشش مناسب توسط نانوذره PLA-PEG/DNA می باشد. با مقایسه DNA شاهد با DNA استخراج شده از نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA پس از تیمار با آنزیم DNase I تفاوت قابل ملاحظه­ای مشاهده نشد که این امر بیانگر توانایی نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA در محافظت از DNA در برابر هضم آنزیمی، در مقایسه با  DNA شاهد می­باشد (شکل 4).

 

 

 

 

 

 

شکل 4: پایداری نانوذرات PLA-PEG/DNA و PLA-PEG /PLL/DNA حاوی مقدار متفاوت PLL در برابر هضم آنزیم DNas I؛ چاهک اول DNA شاهد، چاهک دوم DNA تیمار شده با آنزیم DNas I ، چاهک سوم نانوذرات PLA-PEG/DNA تیمار شده با آنزیم DNas I به‫مدت یک ساعت، چاهک 4-6 نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاوی نسبت‫های 25، 50 و 75 میکروگرم PLL بر میلی­گرم PLA-PEG تیمار شده با آنزیم DNas I به‫مدت یک ساعت

 

 

سمیت نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA

مقایسه میانگین نتایج حاصل از بررسی سمیت پلیمر PLL، کمپلکس PLL/DNA و نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA توسط تست MTT نشان داد که افزایش غلظت پلیمر PLL به‫صورت مجزا ویا در ترکیب با DNA (کمپلکس PLL/DNA) از 5 میکروگرم بر میلی­لیتر به 75 میکروگرم بر میلی­لیتر به‫ترتیب درصد

 

زنده­مانی سلول­های MCF-7 را از 23/82 (PLL) و 15/73 (PLL/DNA) به 48/0 (PLL) و 78/0 درصد (PLL/DNA) کاهش داد این درحالی بود که  حداکثر کاهش زنده­مانی در سلول­های تیمار شده با نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA 03/69 درصد بود که در نانوذرات حاوی 75 میکروگرم بر میلی­لیتر PLL مشاهده شد (شکل5).

 

 

 

 

 

شکل5: سمیت نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاوی غلظت­های متفاوت PLL

 

الگوی رهایش DNA از نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA

نتایج مقایسه میانگین رهایش DNA از نانوذرات PLA-PEG/DNA و PLA-PEG/PLL/DNA ، نشان داد با افزایش میزان PLL در نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA درصد بیشتری از DNA انکپسوله شده رهاسازی می­گردد. به طوری که کمترین درصد رهایش DNA انکپسوله شده، در نانوذرات PLA-PEG/DNA برابر با 78/17 درصد و بیشترین درصد رهایش DNA انکپسوله شده در نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاوی 75 میکروگرم PLL مشاهده شد (45/82 درصد). همچنین این نتایج نشان داد با افزایش میزان PLL در نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA درصد رهایش انفجاری (24 ساعت اول) افزایش و از درصد رهایش آهسته DNA کاسته می‫شود (شکل 6).

 

 

 

 

 

شکل 6: رهش DNA از نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاوی مقدار متفاوت PLL (0 [PLA-PEG/DNA]، 5، 25، 50، 75 میکروگرم PLL بر میلی­گرم PLA-PEG) در زمان­های متفاوت

 

 

ترانسفورماسیون سلول­های MCF-7 با استفاده از نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA

توانایی نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA در انتقال و رهایش DNA به سلول­های MCF-7 توسط میکروسکوپ فلورسانس و دستگاه فلورسایتومتر به اثبات رسید (شکل 7). تصویر میکروسکوپ فلورسانس نشان داد در برخی از سلول­های MCF-7 تیمار شده با نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA، نشر سبز رنگ مشاهده شد که نشان دهنده توانایی این نانوذرات در انتقال و رهش DNA درون این سلول­ها بود این در حالی بود که  DNA فاقد پوشش در محیط حاوی سرم از توانایی انتقال به سلول­های MCF-7 برخوردار نبود. نتایج دستگاه فلوسایتومتری نشان داد با افزایش نسبت PLL در نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA بر بازده انتقال ژن افزوده شد اگرچه بیشترین بیان ژن GFP در سلول­های تیمار شده با نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاوی 50 میکروگرم PLL بر میلی­گرم PLA-PEG مشاهده شد (88/33 درصد) با این وجود در مقایسه با  بازده انتقال ژن توسط نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاوی 75 میکرگرم PLL در میلی­گرم PLA-PEG (72/29 درصد) دارای تاثیر معنی داری نبود. همچنین این نتایج نشان داد کمپلکس PLL/DNA از بازده انتقال ژن پایینی در مقایسه با نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاوی 25، 50 و 75 میکروگرم PLL بر میلی­گرم PLA-PEG برخوردار است به نحوی که در نسبت های 50 و 75 میکروگرم PLL بر میلی­گرم PLA-PEG بازده انتقال ژن در مقایسه با PLL/DNA از 88/18 درصد به‫ترتیب به 88/33 و 72/29 درصد افزایش یافت (بیش از 5/1 برابر).

 

 

 

 

 

شکل 7: ترانسفکشن سلول­های MCF-7 توسط کمپلکس PLL/DNA و نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA؛ (a-c) به‫ترتیب تصویر میکروسکوپ فلورسنس از سلول­های شاهد، تیمار شده با کمپلکس PLL/DNA و نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاوی 50 میکروگرم PLL بر میلی­گرم PLA-PEG؛ (d-f) به‫ترتیب میکروگراف فلوسایتومتری از سلول­های شاهد، تیمار شده با کمپلکس PLL/DNA و نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاوی 50 میکروگرم PLL بر میلی­گرم PLA-PEG؛ (g) بازده ترانسفکشن در سلول­های MCF-7 توسط نانوذرات  PLA-PEG/PLL/DNA

 

 

 

بحث

 

انتقال اسید نوکلئیک به سلول­ها و همچنین بافت­های آسیب دیده با هدف ژن­درمانی و درمان ژن­های جهش یافته و معیوب، و یا از طریق انتقال siRNA با هدف جلوگیری از بیان ژن­های مضر پنچره­ای نو به‫سوی درمان بسیاری از بیماری­ها گشوده است. نانووکتورهای کاتیونی از قبیل PLL از بازده بالایی جهت انتقال ژن به سلول­های یوکاریوتی برخوردارند با این وجود یکی از موانع استفاده بالینی از این نانوناقل­ها در انتقال نوکلوئیک اسید، سمیت نسبتا بالای این ناقل­ها می­باشد (16). لذا تحقیق بر روی پلیمرهای با زیست تخریب پذیر و زیست سازگار مناسب، می­تواند نتایج امیدوار کننده­ای را جهت استفاده بالینی نانوناقل­ها در ژن­درمانی در پی داشته باشد. پلیمرهای چند قطعه­ای حاوی قطعات آبدوست و آبگریز در محیط‫های آبی تشکیل میسل­های پایداری را می­دهند که از توانایی بالایی در انتقال و محافظت از داروهای انکپسوله شده، از قبیل DNA، RNA، پپتید، پروتئین و غیره، در برابر عوامل مخرب بیرونی برخوردار هستند (6). توانایی کوپلیمرهای قطعه درکنترل رهش دارو، از طریق ترکیب قطعات متفاوت و همچنین تغییر وزن ملکولی هر یک از این قطعات، از دیگر تحقیقات انجام شده در سال­های اخیر بوده است (9). با وجود مزایایی متعدد کوپلیمرهای زیست­تخریب پذیر از قبیل PLA-PEG ، بازده پایین این نانووکتورها در انتقال ژن، استفاده از این کوپلیمرها را در ژندرمانی با محدودیت روبه­رو ساخته است.

با توجه به مزایایی ذکر شده پلیمرهای PLA-PEG  از قبیل زیست­سازگاری، زیست تخریب­پذیری و همچنین توانایی در کنترل رهش تدریجی دارو، همچنین با توجه به بازده بالایی انتقال ژن توسط PLL و نظر به اینکه تاکنونی تحقیقی به منظور بررسی تاثیر استفاده هم‫زمان از پلیمر PLL و کوپلیمر PLA-PEG بر بازده انتقال ژن و همچنین زیست سازگاری، سرعت رهش، بازده انکپسولاسیون و غیره انجام نگردیده است لذا این تحقیق با هدف بررسی استفاده همزمان از پلیمر PLL و کوپلیمر PLA-PEG جهت انتقال ژن به سلول­های MCF-7 انجام گرفت چون با به‫دست آورن رابطه بین نسبت پلیمر PLL و کوپلیمرPLA-PEG در نانوذرات PLA-PEG/PLL بر خصوصیات مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی و همچنین بازده انتقال ژن می­توان در آینده میسل­هایی با بازده انتقال مناسب، سمیت کم و اندازه مورد نظر، با کاربردهای درمانی متفاوت تولید نمود.

اهمیت مورفولوژی ذرات در انتقال  و رهش ژن و دارو هم به‫صورت تجربی و هم به صورت محاسباتی مشخص شده است نتایج این تحقیقات نشان داده است نانوذراتی که دارای ساختار کروی هستند از توانایی بیشتری در انتقال دارو نسبت به سایر نانوذرات برخوردارند (19 و 18). مورفولوژی نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA  حاصل از میکروسکوپ الکترونی نگاره  نشان داد که  نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA  دارای شکل کروی و سطح صاف هستند. اندازه و پتانسیل ذتای ذرات از دیگر فاکتورهای مهم در دارو و ژن رسانی است به گونه­ای که در برخی از سلول­ها تنها ذرات زیر میکرومتر قادر به انتقال هستند. (21 و 20). کاهش اندازه ذرات علاوه بر افزایش بازده انتقال ژن، امکان شناسایی آن­ها را توسط سیستم رتیکولواندوتلیال کاهش داده، و بدین ترتیب سبب افزایش طول عمر ذرات، در سیستم گردش خون می‫شود (22). تعیین بار سطحی ذرات جهت پیش­بینی پایداری آن­ها در سیستم گردش خون، خودتجمعی و بازده انتقال ژن ضروری به نظر می­رسد. افزایش بار کاتیونی ذرات علاوه بر ایجاد دافعه بین ذرات هم­بار و جلوگیری ازخود تجمعی آن­ها، با برهمکنش الکترواستاتیک ذرات با غشای سلولی سبب افزایش بازده انتقال ژن می­گردد (23). با افزایش میزان PLL در نانوذرات PLA-PEG /PLL/DNA بر اندازه و پتانسیل ذتای ذرات افزوده می­شود به نحوی بیشترین اندازه و پتانسیل ذتای ذرات در نانوذرات با 75 میکروگرم PLL در میلی­گرم PLA-PEG/PLL/DNA مشاهده شد. تاثیر افزایش مقدار PLL بر پتانسیل ذتای نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA در مقایسه با افزایش اندازه ذرات، بیشتر بود به نحوی که با افزایش میزان PLL میزان بار سطحی ذرات از mV 6/10- در نانوذرات بدون PLL  به mV 12/6 در نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاوی 75 میکروگرم PLL بر میلی­گرم PLA-PEG، افزایش یافت.

وجود گروه کربوکسیل در قطعات PLA، و همچنین گروه فسفات موجود در فسفات DNA می­تواند از دلایل پتانسیل منفی در نانوذات PLA-PEG/DNA باشد. افزایش میزان PLL با خنثی سازی بار منفی DNA و PLA سبب افزایش پتانسیل ذتای نانوذرات می­‫شود.

انکپسوله سازی ماکروملکول­های آبدوست از قبیل DNA به‫دلیل بار منفی و آبدوستی زیاد درون هسته آبگریز از قبیل PLA مشکل می­باشد با این‫حال تکنیک­های متفاوتی جهت افزایش بازگذاری DNA گزارش شده است (9). باتوجه به وجود بار منفی در گروه فسفات DNA و همچنین گروه کربوکسیل در PLA، شاید بتوان یکی از دلایل افزایش بازده انکپسوله سازی DNA در حضور PLL را خنثی سازی بار منفی DNA در اثر برهمکنش با PLL و در نتیجه کاهش دافعه بین DNA و قطعه PLA دانست.

یکی از مشکلات انتقال ژن به سلول­های پستانداران چه در شرایط زنده و چه در شرایط آزمایشگاهی تخریب DNA توسط آنزیم های محدود کننده می­باشد. به‫طوری‫که گزارش شده است در انتقال ژن از مسیر وابسته به آندوسیتوز بیش از 99 درصد DNA وارد شده به سلول توسط مکانیزم دفاعی سلول از بین می‌رود (25 و 24).

نتایج تحقیقات گذشته نشان داده است پلی­کاتیون­ها در اثر کمپلکس با DNA ممانعت فیزیکی جهت اتصال آنزیم­های محدود کننده ایجاد کرده و بدین‫ترتیب DNA را از هضم توسط این آنزیم‫ها محافظت می­نمایند (27 و 26). همچنین Abebe و همکاران (9) گزارش کردند که پوشش PEI/DNA توسط کوپلیمر PLLA-PEG-PLLA مانع از رهاسازی زودهنگام DNA از PEI، در برابر پلی آنیون‫ها موجود در محیط می‫گردند آن‫ها پیشنهاد کردند لایه نفوذ ناپذیر PLA از نفوذ پلی آنیون‫ها به کمپلکس PEI/DNA ممانعت می‫کند. لذا با توجه به نتایج حاصل از تحقیقات مشابه به‫نظر می­رسد فشرده سازی و کاهش سطح تماس DNA توسط کوپلیمر PLA-PEG و پلیمر PLL مانع از اتصال آنزیم­های محدود کننده و همچنین برخورد مستقیم امواج فراصوت با DNA می‫شود.

تعامل­های الکترواستاتیکی پلیمرهای کاتیونی و سطح آنیونی سلولی، از اهمیت بسیار بالایی برای جذب کمپلکس­های DNA-نانوحامل به درون سلول­ها برخوردار است. اما این برهمکنش­های غشایی به‫نظر می­رسد که از لحاظ سمیت نیز مهم باشد چرا که باعث آسیب مستقیم به سلول­های هدف می­شوند (22). پوشاندن گروه­های سطحی به‫طور موفقیت آمیزی برای کاهش سمیت نانوناقل­ها کاتیونی استفاده شده است. برای مثال اتصال کوالانسی یک گروه اسید اوریک یا پلی­اتیلن­گلیکول به سطح نانوناقل­ها می­تواند سمیت آن­ها را کاهش دهد (28) با این وجود اتصال کوالانت PEG در برهم‫کنش مناسب DNA  با پلیمر اختلال ایجاد می­کند و مانع از فشرده سازی مناسب DNA می­‫شود (30 و 29).

Alshamsan و همکاران (17) در تحقیق مشابه گزارش کردند پوشش PEI توسط PLGA سبب کاهش معنی­دار سمیت PLGA-PEI در مقایسه با PEI می­‫شود آنها یکی از دلایل این کاهش سمیت را رهش کم PEI در سلول­ها در هنگام بررسی سمیت PEI و PLGA-PEI دانستند با توجه به اینکه در این تحقیق 82/75 درصد از DNA انکپسوله شده در نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاوی 75 میکروگرم PLL بر میلی­گرم PLA-PEG ، در 24 ساعت اول پس از تیمار با بافر فسفات رهاسازی شد. لذا به‫نظر نمی­رسد رهش دیرهنگام باعث کاهش سمیت PLL باشد. تحقیقات گذشته در زمینه بررسی علت سمیت پلیمرهای کاتیونی بر سلول­های پستانداران، نشان داد ایجاد حفره و نازک شدن غشای سلولی در اثر برهم‫کنش غشای سلولی با پلی­کاتیون­ها علت اصلی سمیت این پلیمرها می­باشد (4 و 3). لذا به‫نظر می­رسد یکی از دلایل کاهش سمیت نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA در مقایسه با PLL و PLL/DNA، کاهش سطح تماس PLL با غشای سلولی باشد.

توانایی کوپلیمرهای حاوی قطعات PLA و PEG در کنترل رهش دارو در تحقیقات متعددی به اثبات رسیده است (31 و 9). این ویژگی ­می­توان در درمان برخی از بیماری­ها از قبیل بیماری لکه زدی شبکیه که نیاز به سطح پایداری از کورتیکواستروئیدها در ناحیه مورد درمان می­باشد، مطلوب باشد (32). نتایج این تحقیق نشان داد رهایش DNA از نانوذرات PLA-PEG/DNA و PLA-PEG/PLL/DNA، ابتدا به صورت انفجاری و سپس به‫صورت آهسته رخ داد. به­طوری که بیش از 50 درصد از DNA رهاسازی شده در مدت زمان 28 روز، در 24 ساعت اول رهاسازی شد.

تاثیر استفاده هم‫زمان از پلیمرهای آبدوست به‫همراه پلیمرهای قطعه­ای متشکل از قطعات آبدوست و آبگریز بر افزایش سرعت رهایش DNA به اثبات رسیده است. ایجاد کانال­های آبی درون ماتریکس توسط پلیمرهای آبدوست، یکی از عوامل افزایش سرعت رهایش DNA گزارش شده است (17 و 16). نتایج این تحقیق نشان داد با افزایش نسبت PLL در نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA درصد رهایش انفجاری افزایش و از درصد رهش آهسته کاسته شد. با توجه به نتایج این تحقیق به نظر می­رسد بتوان با تغییر نسبت پلیمر PLL بر کوپلیمر PLA-PEG سرعت و الگوی رهایش DNA را بسته به هدف مورد نظر کنترل نمود.

انتقال DNA فاقد پوشش به درون سلول، به‫دلایلی از جمله اندازه و پتانسیل سطحی نامناسب، هضم زود هنگامDNA  توسط مکانیزم دفاعی سلول طی انتقال درون سلولی وتحت سلولی و غیره مشکل می­باشد (25 و 24).

نانوحامل های کاتیونی از قبیل PLL و لیپوزوم­های کاتیونی تمایل به جذب آنیونی پروتئینهای موجود در سرم دارند که این عمل علاوه بر رهایش زودهنگام DNA، سبب بزرگتر شدن ذرات شده و عبور این وکتورها را از غشا و یا ارائه ژن به هسته را با محدودیت روبرو می­کند. همچنین برهمکنش این وکتورها با پروتئین­های پلاسما سبب شناسایی سریع آن­ها توسط سیستم ایمنی بدن شده و موجب حذف سریع آن‫ها و در نتیجه کاهش بازده انتقال ژن در شرایط زنده می­گردد (9 و 6). نتایج این تحقیق نشان داد نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA در محیط حاوی سرم از توانایی بالایی جهت انتقال ژن به سلول­های MCF-7 برخوردارند. وجود PEG به عنوان پوسته خارجی در این نانوذرات مانع از تعاملات غیر اختصاصی با سرم شده و تجمع ذرات را به حداقل می‫رساند (33).

 

نتیجه گیری

هدف از انجام تحقیق حاضر پیشنهاد یک سیستم میسلی چند کاره جهت انتقال ژن بود که مزایایی پلیمرهای کاتیونی، زیست تخریب پذیر و دوگانه دوست را به‫طور توام داشته باشد. نتایج تحقیق حاضر نشان داد استفاده هم‫زمان از پلیمرهای PLL و PLA-PEG علاوه بر کاهش سمیت PLL و بهبود رهایشDNA از کوپلیمرPLA-PEG، از DNA در برابر آسیب­های ناشی از هضم آنزیمی محافظت می­نماید. علاوه براین نتایج این تحقیق نشان داد نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA از توانایی بالایی در انتقال ژن به سلول­های MCF-7 در مقایسه با کمپلکس PLL/DNA در محیط­های حاوی سرم برخوردار می­باشند.

 

تشکر و قدردانی

این مقاله نتیجه پایان نامه کارشناسی ارشد می باشد. نویسندگان این مقاله از مسئولین محترم دانشگاه آزاد اسلامی واحد اردبیل به‫خاطر فراهم کردن امکانات انجام این تحقیق و نیز از تمام کسانی که در انجام این پروژه همکاری و حمایت نمودند، کمال تشکر و قدردانی را دارند.

1.Wirth T, Ylä-Herttuala, S. Gene therapy used in cancer treatment. Biomedicines. 2014; 2(2): 149-162.
2. Hacein-Bey-Abina S, Von Kalle C, Schmidt M, McCormack MP, et al. LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1. Science. 2003; 302(5644): 415-421.
3. Hong S, Leroueil PR, Janus EK, Peters JL, et al. Interaction of polycationic polymers with supported lipid bilayers and cells: nanoscale hole formation and enhanced membrane permeability. Bioconjugate chemistry. 2006; 17(3): 728-734.
4. Hong S, Bielinska AU, Mecke A, Keszler B, et al. Interaction of poly (amidoamine) dendrimers with supported lipid bilayers and cells: hole formation and the relation to transport. Bioconjugate chemistry. 2004; 15(4): 774-782.
5. Agarwal S, Zhang Y, Maji S, Greiner A. PDMAEMA based gene delivery materials. Materials Today. 2012; 15(9): 388-393.
6. Zou W, Liu C, Chen Z, Zhang N. Preparation and characterization of cationic PLA-PEG nanoparticles for delivery of plasmid DNA. Nanoscale research letters. 2009; 4(9): 982.
7. Xia J, Chen J, Lin L, Guo Z, et al. Sulfathiazole grafted PEG-PLL as pH-sensitive shielding system for cationic gene delivery. Polymer Bulletin. 2016; 73(12): 3503-3511.
8. Merkel OM, Urbanics R, Bedőcs P, Rozsnyay Z, et al. In vitro and in vivo complement activation and related anaphylactic effects associated with polyethylenimine and polyethylenimine-graft-poly (ethylene glycol) block copolymers. Biomaterials. 2011; 32(21): 4936-4942.
9. Abebe DG, Kandil, R, Kraus T, Elsayed M, et al. Three Layered Biodegradable Micelles Prepared by Two Step Self Assembly of PLA PEI PLA and PLA PEG‐PLA Triblock Copolymers as Efficient Gene Delivery System. Macromolecular bioscience. 2015; 15(5): 698-711.
10.  Moret I, Peris JE, Guillem VM, Benet M, et al. Stability of PEI–DNA and DOTAP–DNA complexes: effect of alkaline pH, heparin and serum. Journal of Controlled Release. 2001; 76(1):169-181.
11. Rackstraw BJ, Martin AL, Stolnik S, Roberts CJ., et al. Microscopic Investigations into PEG− Cationic Polymer-Induced DNA Condensation. Langmuir. 2001; 17(11): 3185-3193.
12. Petersen H, Fechner PM, Martin AL, Kunath K, et al. Polyethylenimine-graft-poly (ethylene glycol) copolymers: influence of copolymer block structure on DNA complexation and biological activities as gene delivery system. Bioconjugate chemistry. 2002; 13(4): 845-854.
13. Ruponen M, Rönkkö S, Honkakoski P, Pelkonen J,et al. Extracellular glycosaminoglycans modify cellular trafficking of lipoplexes and polyplexes. Journal of Biological Chemistry. 2001; 276(36): 33875-33880.
14.  Perez C, Sanchez A, Putnam D, Ting D, et al. Poly (lactic acid)-poly (ethylene glycol) nanoparticles as new carriers for the delivery of plasmid DNA. Journal of controlled Release. 2001; 75(1): 211-224.
15. Riley T, Govender T, Stolnik S, Xiong CD, et al. Colloidal stability and drug incorporation aspects of micellar-like PLA–PEG nanoparticles. Colloids and surfaces B: Biointerfaces. 1999; 16(1): 147-159.
16. Patil Y, Panyam J. Polymeric nanoparticles for siRNA delivery and gene silencing. International journal of pharmaceutics. 2009; 367(1): 195-203.
17. Alshamsan A, Haddadi A, Hamdy S, Samuel J, et al. STAT3 silencing in dendritic cells by siRNA polyplexes encapsulated in PLGA nanoparticles for the modulation of anticancer immune response. Molecular pharmaceutics. 2010; 7(5): 1643-1654.
18. Fan LT, Singh S. K. Diffusion-ontrolled release. In Controlled Release (pp. 9-88). 1989; Springer Berlin Heidelberg.
19. Venkataraman S, Hedrick JL, Ong ZY, Yang C, et al. The effects of polymeric nanostructure shape on drug delivery. Advanced drug delivery reviews. 2011; 63(14): 1228-1246.
20. Bala I, Hariharan S, Kumar MR. PLGA nanoparticles in drug delivery: the state of the art. Critical Reviews™ in Therapeutic Drug Carrier Systems. 2004; 21(5): 25-31.
21. Panyam J, Labhasetwar V. Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to
 
cells and tissue. Advanced drug delivery reviews. 2003; 55(3): 329-347.
22. Chen J, Tian B, Yin X, Zhang Y, et al. Preparation, characterization and transfection efficiency of cationic PEGylated PLA nanoparticles as gene delivery systems. Journal of Biotechnology. 2007; 130(2): 107-113.
23. Shim G, Kim MG, Park JY, Oh Y. K. Application of cationic liposomes for delivery of nucleic acids. Asian journal of pharmaceutical sciences. 2013; 8(2): 72-80.
24. Kichler A, Leborgne C, Coeytaux E, Danos O. Polyethyleniminemediated gene delivery: a mechanistic study. The journal of gene medicine. 2001; 3(2): 135-144.
25. Ogris M, Wagner E. Targeting tumors with non-viral gene delivery systems. Drug Discovery Today. 2002; 7(8): 479-485.
26. Navarro G, de ILarduya CT. Activated and non-activated PAMAM dendrimers for gene delivery in vitro and in vivo. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 2009; 5(3): 287-297.
27. Bielinska AU, Kukowska-Latallo JF, Baker JR. The interaction of plasmid DNA with polyamidoamine dendrimers: mechanism of complex formation and analysis of alterations induced in nuclease sensitivity and transcriptional activity of the complexed DNA. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Structure and Expression. 1997; 1353(2): 180-190.
28. Wen Y, Pan S, Luo X, Zhang W, et al. PEG-and PDMAEG-graft-modified branched PEI as novel gene vector: synthesis, characterization and gene transfection. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 2010; 21(8-9): 1103-1126.
29. Kamiya H, Akita H, Harashima H. Pharmacokinetic and pharmacodynamic considerations in gene therapy. Drug discovery today. 2003; 8(21): 990-996.
30. Salcher EE, Wagner E. Chemically programmed polymers for targeted DNA and siRNA transfection. In Nucleic Acid Transfection (pp. 227-249). 2010; Springer Berlin Heidelberg.
31. Anaraki NA, Rad LR, Irani M, Haririan I. Fabrication of PLA/PEG/MWCNT electrospun nanofibrous scaffolds for