مقدمه

امروزه تحقیق در زمینه ژن درمانی به‫عنوان یک عامل بالقوه جهت درمان بیماری­های حیاتی انسان از قبیل سرطان، اختلالات ژنتیکی و غیره به‫سرعت در حال انجام است (1). استفاده از ویروس­ها در ژن رسانی با بازده نسبتا بالایی انجام می­گیرد اما با این‫حال همیشه امکان جهش در این ویروس­ها از نگرانی‫های ژن درمانی می­باشد (2). لذا با توجه به اهمیت ژن درمانی، توسعه یک سیستم بالقوه که از توانایی انتقال ژن به سلول­ها یا بافت خاص در بدن که از لحاظ ایمنی نیز خطرناک نباشد ضروری به‫نظر می­رسد در میان ناقل­های غیر ویروسی انتقال ژن، پلیمرها کاتیونی از قبیل پلی­اتیلن­ایمین        (PEI)، پلی ال لایزین) PLL) و پلی 2-دی متیل امینواتیل متاکریلات (PDMAEMA) به‫دلیل بازده انتقال بالای ژن بارها مورد مطالعه قرار گرفته­اند (5-3). اکثر پلیمرها کاتیونی که در انتقال ژن مورد استفاده قرار می­گیرند زیست تخریب پذیر نبوده و در صورت استفاده در ژن رسانی خطر انباشتگی آنها در بدن وجود دارد (6). از جمله پلیمرهای کاتیونی مورد استفاده در این زمینه می­توان به پلی ال لایزین (PLL) اشاره کرد (7). گروه‫های آمین در این پلیمر دارای بار کاتیونی بالایی می­باشند که می­توانند با بار منفی گروه فسفات در DNA برهمکنش الکترواستاتیک داده و ذراتی بین 10 تا 100 نانومتر بوجود آورند. این ذرات از توانایی بالایی جهت ورود به سلول طی پدیده آندوسیتوز برخوردارند (8). از معایب استفاده از پلی­کاتیون­هایی از قبیل PEI و PLL در انتقال ژن می­توان به سمیت بالا و پایداری کم آن­ها در برابر سیستم ایمنی بدن اشاره کرد (10 و 9). به‫منظور غلبه بر این مشکلات از روش­های متعددی از جمله اتصال کوالانت PEG به پلی­کاتیون­ها استفاده شده است. این عمل سبب افزایش پایداری نانوذرات در سیستم گردش خون می‫شود. با این‫حال وجود زنجیره PEG با ایجاد ممانعت فضایی جهت برهم‫کنش مناسب پلی­کاتیون با DNA، مانع از متراکم شدن مناسب DNA می‫شود (12 و 11). علاوه بر این کمپلکس پلی­کاتیون/DNA در برابر پلی آنیون‫هایی همچون گلیکوزآمینوگلیکان و سولفات دکستران از پایداری پایینی برخوردار است (13 و 9).

استفاده از پلیمرهای زیست تخریب­پذیر از قبیل پلی لاکتیک اسید (PLA) و پلی لاکتیک کوگلایکولیک اسید ( PLGA) به‫دلیل تخریب زیستی و حذف محصول حاصل در چرخه اسید سیتریک، دارای زیست سازگاری مناسبی می­باشند. سرعت تخریب پذیری در پلیمرهای زیست تخریب پذیر با توجه به وزن ملکولی، نوع پلیمر و نسبت پلیمر (در کوپلیمرها) می­تواند از چند روز تا چند سال متغیر باشد (6). اندازه بزرگ ذرات حاصل، بازده کم انکپسولاسیون DNA و تمایل برهمکنش هیدروفوبیک بین پروتئین های پلاسما با این پلیمرها که سبب شناسایی و حذف ذرات توسط سیستم رتیکولواندوتلیال (RES) می‫شود، از جمله موانع کاربرد این پلیمرها در ژن رسانی هستند (14 و 6). اصلاح سطحی پلیمرهای آبگریز از قبیل PLA، توسط پلی اتیلن گلیکول آبدوست و تولید پلیمر دوگانه دوست PLA-PEG علاوه بر کاهش اندازه ذرات حاصل، به دلیل افزایش آبدوستی، انکپسولاسیون DNA  و زمان گردش در خون را در مقایسه با PLA تنها افزایش می­دهد (15). نتایج تحقیقات گذشته نشان داده است پوشش کمپلکس PEI/DNA توسط کوپلیمر PLA-PEG با تشکیل یک هسته آبگریز نفوذ ناپذیر مانع از نفوذ پلی آنیون به کمپلکس PEI/DNA شده و علاوه بر افزایش پایداری کمپلکس تاثیر سمیت PEI را نیز کاهش می­دهد (9). با توجه به بازده بالای پلیمر PLL در انتقال ژن و همچنین زیست­سازگاری، زیست تخریب‫پذیری و پایداری بالای کوپلیمرهای PLA-PEG در برابر سیستم ایمنی بدن، این تحقیق با هدف بررسی راه‫کاری که بتوان از مزایایی پلیمرهای PLL، PEG و PLA به طور توام در ژن رسانی استفاده نمود، انجام گرفت.

مواد و روش‌ها

آماده سازی و بررسی خصوصیات نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA: به‫منظور تهیه نانوذرات PLA-PEG /PLL/DNA از تکنیک double emulsion solvent evaporation technique استفاده شد (16) به‫طور خلاصه 30 میلی گرم از کوپلیمر PLA-PEG به‫همراه مقدار متفاوتی از پلیمر PLL (150، 750، 1500 و 2250 میکروگرم) در یک میلی­لیتر کلروفرم حل شد (5، 25، 50 و 75 میکروگرم PLL بر میلی­گرم PLA-PEG) سپس به‫مدت 30 ثانیه با 2/0 میلی­لیتر بافر TE حاوی 250 میکروگرم DNA (پلاسمید  pEGFP-N1) و 2 میلی­گرم BSA سونیکه شد (Sonicator® XL, Misonix, NY). محلول حاصل با 5/1 میلی­لیتر محلول PVA یک درصد ترکیب و به‫مدت 2 دقیقه روی یخ سونیکه شد. 25 میلی­لیتر از محلول PVA 3/0 درصد توسط سرنگ و به‫آرامی به محلول فوق­الذکر تزریق گردید سپس به‫منظور حذف کلروفورم به‫مدت 3 ساعت در دمای اتاق با دور بالا مخلوط شد. نانوذرات حاصل در 15000 دور به‫مدت 1 ساعت جمع آوری شدند سپس سوپرناتانت به‫منظور محاسبه درصد بارگذاری جداسازی شد و میزان DNA موجود در آن توسط دستگاه اسپکتروفتومتری (طول موج nm 260) تعیین و با DNA مورد استفاده در فرآیند بارگذاری مقایسه شد. نانوذرات باقی مانده به‫منظور حذف DNA بارگذاری نشده و PVA سه مرتبه توسط آب استریل مورد شتشو قرار گرفتند سپس توسط روش فریزدرای خشک شدند.

به‫منظور محاسبه خصوصیات مرفولوژیکی نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA از میکروسکوپ الکترونی نگاره (SEM)(LEO 1430VP) استفاده شد همچنین اندازه و پتانسیل ذتای ذرات حاصل در بافر PBS با pH=7/4  توسط دستگاه DLS (Malvern Instruments, UK) مورد بررسی قرار گرفت.

بررسی اثر محافظتی نانوذرات PLA-PEG/DNA و PLA-PEG/PLL/DNA از DNA در برابر هضم آنزیمی

جهت بررسی پایداری نانوذرات PLA-PEG/DNA و PLA-PEG/PLL/DNA در برابر هضم آنزیمی یک میلی­گرم از نانوذرات PLA-PEG/DNA و PLA-PEG/PLL/DNA حاوی مقدار متفاوت از پلیمر PLL  (25، 50، و 75 میکروگرم PLL بر میلی­گرم PLA-PEG) با آنزیم DNase I (0.2 U/μg DNA) و بافر هضم (Tris-HCl 50 میلی مولار و MgCl₂  10 میلی‫مولار) به‫مدت یک ساعت در دمای 37 درجه سانتی­گراد نگه‫داری شدند. کوپلیمر PLA-PEG و پلیمر PLL با اضافه کردن هپارین در غلظت نهایی 1 درصد و نگه‫داری به‫مدت 4 ساعت بر روی انکوباتور شیکردار  با دمای 45 درجه سانتی‫گراد و دور rpm 120، جداسازی شدند. DNA جداسازی شده توسط فریزدراینگ تغلیظ شده و توسط ژل آگارز مورد بررسی قرار گرفت.

سمیت نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA : به‫منظور محاسبه سمیت پلیمر PLL، کمپلکس PLL/DNA و نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA ابتدا سلول­های MCF-7 با تراکم 7000 سلول در هر ویال به پلیت­های 96 خانه‫ای منتقل شدند سپس به‫مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‫گراد و دی اکسید کربن 5 درصد نگه‫داری شدند. به هر یک از چاهک­ها به‫طور جداگانه پلیمر PLL، PLL/DNA و نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA  با مقدار متفاوت PLL در سه تکرار اضافه شد سپس مجدادا به‫مدت 24 ساعت در شرایط فوق الذکر نگه‫داری شدند. جهت محاسبه درصد زنده مانی سلول­ها از تست MTT استفاده شد (17). بدین‫منظور محیط کشت رویی سلول­ها خالی شد و 100 میکرولیتر محلول MTT تهیه شده در بافر سالین فسفات (5 میلی‫گرم در میلی­لیتر) به هرکدام از چاهک­ها اضافه شد. پلیت­ها به‫مدت 3 ساعت در انکوباتور در دمای 37 درجه سانتی­گراد و در شرایط تاریکی نگه‫داری شدند. محلول MTT از چاهک­ها خارج شد سپس کریستال­های فومازین تشکیل شده در هر چاهک، توسط 200 میکرولیتر DMSO حل شد و نهایتا جذب نوری هر کدام از نمونه­ها در طول موج 570 نانومتر اندازه­گیری شد.

الگوی رهایش DNA در شرایط درون شیشه­ای از نانوذراتPLA-PEG/DNA و PLA-PEG/PLL/DNA

یک میلی­گرم از هر کدام از نانو ذرت PLA-PEG/DNA و PLA-PEG/PLL/DNA حاوی مقدار متفاوت پلیمر PLL (5، 25، 50 و 75 میکروگرمPLL  بر میلی­گرم PLA-PEG) در بافر PBS با 4/7pH= و برروی انکوباتور شیکر با دور rpm 100 و  دمای 37 درجه سانتی­گراد نگه‫داری شد. نانوذرات در مدت زمان­های مورد نظر (1، 3، 7، 14، 21 و 28 روز) توسط سانتریفوژ جداسازی شد (دور ×g 16602  و مدت زمان 1 ساعت) و مقداری از سوپرناتانت حاصل توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول 260 نانومتر مورد سنجش قرار گرفت.

ترانسفورماسیون سلول­های MCF-7 با استفاده از نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA: سلول­های MCF-7 با تراکم 20000  سلول در میلی­لیتر محیط کشت RPMI-1640 حاوی FBS 10 درصد به هریک از چاهک‫های پلیت­های 24 خانه ای منتقل شدند سپس به‫مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد و دی‫اکسید کربن  5 درصد نگه‫داری شدند. پس از 24 ساعت به‫هر چاهک به‫طور جداگانه یک میلی­گرم نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA (pEGFP-N1) حاوی مقدار متفاوت PLL (5، 25، 50 و 75 میکروگرم PLL بر میلی­گرم PLA-PEG) در سه تکرار اضافه شد. از DNA  پلاسمیدی فاقد پوشش (pEGFP-N1) به‫عنوان کنترل منفی، و از PLL/DNA  به‫عنوان کنترل مثبت استفاده گردید. پس از نگه‫داری سلول­ها به‫مدت 7 ساعت در دمای 37 درجه سانتی­گراد و دی اکسید کربن  5 درصد، محیط رویی سلول­ها با محیط جدید RPMI-1640 حاوی FBS 10 درصد جایگزین شد و به‫مدت 48 ساعت در شرایط فوق­الذکر نگه‫داری شد. جهت بررسی تاثیر پلیمر PLL بر کارایی ترانسفکشن نانوذراتPLA-PEG/PLL/DNA از میکروسکوپ فلورسانس و دستگاه فلورسایتومتر استفاده شد.

آنالیز آماری

تمامی فاکتورهای کمی مورد بررسی در این تحقیق با حداقل 3 تکرار انجام گرفت. تجزیه تحلیل آماری با استفاده از نزم افزار SPSS نسخه 16 و از طریق تجزیه واریانس یک طرفه (One-way ANOVA) انجام گرفت. از آزمون چندمرحله­ای دانکن  در سطح 5 درصد به‫منظور بررسی مقایسه میانگین استفاده شد سپس میانگین هر یک از تیمارها به همراه انحراف استاندارد (Mean ± SD) بیان شد.

نتایج

بررسی خصوصیات نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA (مورفولوژی، اندازه، پتانسیل زتای و بازده انکپسوله سازی)

مورفولوژی نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA  (25 میکروگرم PLL در یک میلی­گرم PLA-PEG) در شکل 1 نشان داده شده است تصاویر حاصل از میکروسکوپ الکترونی نگاره (SEM) نشان داد. نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA  دارای شکل کروی و سطح صاف هستند (شکل 1).

شکل 1: تصویر میکروسکوپ الکترونی نگاره از نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA (25 میکروگرم PLL بر یک میلی­گرم PLA-PEG)

در این تحقیق اندازه و پتانسیل ذتای ذرات توسط DLS نشان داد با افزایش میزان PLL در نانوذرات PLA-PEG /PLL/DNA بر اندازه و پتانسیل ذتای ذرات افزوده می‫شود به نحوی بیشترین اندازه و پتانسیل ذتای ذرات در نانوذرات با 75 میکروگرم PLL در میلی­گرم PLA-PEG/PLL/DNA مشاهده شد (به‫ترتیب 238 نانومتر و mV 12/6) (شکل 2). تاثیر افزایش مقدار PLL بر پتانسیل ذتای نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA در مقایسه با افزایش اندازه ذرات، بیشتر بود به نحوی که با افزایش میزان PLL میزان بار سطحی ذرات از mV 6/10- در نانوذرات بدون PLL (PLA-PEG/DNA) به mV 12/6 در نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاوی 75 میکروگرم PLL بر میلی­گرم PLA-PEG، افزایش یافت.

شکل 2: تاثیر PLL بر اندازه و پتانسیل زتا نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA (a-b) گراف حاصل از اندازه­گیری اندازه و پتانسیل زتای نانوذرات PLA-PEG/DNA توسط دستگاه DLS؛ (c-d) گراف حاصل از اندازه­گیری اندازه پتانسیل زتای نانوذرات PLA-PEG /PLL/DNA حاوی 75 میکروگرم PLL بر میلی‫گرم PLA-PEG.

تاثیر افزایش مقدار PLL در نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA بر کارایی انکپسوله سازی DNA در شکل 3 نشان داده شده است. نتایج نشان داد بازده انکپسوله سازی DNA توسط کوپلیمر PLA-PEG بدون استفاده همزمان از پلیمر PLL (PLA-PEG/DNA) 19/38 درصد بود. استفاده هم زمان پلیمر PLL به‫طور معنی‫داری میزان انکپسوله سازی DNA را افزایش داد به‫طوری‫که بیشترین بازده انکپسوله سازی در نسبت 75 میکروگرم PLL در هر میلی­گرم نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA  مشاهده شد (72/83 درصد) (شکل 3).

شکل 3: تاثیر PLL در انکپسوله سازی DNA درون کوپلیمر PLA-PEG (حروف الفبا نشان دهنده اختلاف معنی­داری در سطح 5 درصد می‫باشد)

پایداری نانوذرات PLA-PEG/DNA و PLA-PEG/PLL/DNA در برابر هضم آنزیمی

شکل 4 پایداری نانوذرات PLA-PEG/DNA و PLA-PEG /PLL/DNA حاوی مقدار متفاوت PLL در برابر هضم آنزیم DNas I نشان می دهد در چاهک اول  DNAشاهد تیمار شده با DNase I هیچ­گونه باندی از DNA مشاهده نشد که بیانگر تخریب کامل DNA توسط آنزیم DNase I می­باشد. همچنین تصویربرداری ژل آگارز نشان داد در چاهک 2 DNA پلاسمیدی مقداری با DNase I هضم شده است که احتمالا نشان‫دهنده عدم پوشش مناسب توسط نانوذره PLA-PEG/DNA می باشد. با مقایسه DNA شاهد با DNA استخراج شده از نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA پس از تیمار با آنزیم DNase I تفاوت قابل ملاحظه­ای مشاهده نشد که این امر بیانگر توانایی نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA در محافظت از DNA در برابر هضم آنزیمی، در مقایسه با  DNA شاهد می­باشد (شکل 4).

شکل 4: پایداری نانوذرات PLA-PEG/DNA و PLA-PEG /PLL/DNA حاوی مقدار متفاوت PLL در برابر هضم آنزیم DNas I؛ چاهک اول DNA شاهد، چاهک دوم DNA تیمار شده با آنزیم DNas I ، چاهک سوم نانوذرات PLA-PEG/DNA تیمار شده با آنزیم DNas I به‫مدت یک ساعت، چاهک 4-6 نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاوی نسبت‫های 25، 50 و 75 میکروگرم PLL بر میلی­گرم PLA-PEG تیمار شده با آنزیم DNas I به‫مدت یک ساعت

سمیت نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA

مقایسه میانگین نتایج حاصل از بررسی سمیت پلیمر PLL، کمپلکس PLL/DNA و نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA توسط تست MTT نشان داد که افزایش غلظت پلیمر PLL به‫صورت مجزا ویا در ترکیب با DNA (کمپلکس PLL/DNA) از 5 میکروگرم بر میلی­لیتر به 75 میکروگرم بر میلی­لیتر به‫ترتیب درصد

زنده­مانی سلول­های MCF-7 را از 23/82 (PLL) و 15/73 (PLL/DNA) به 48/0 (PLL) و 78/0 درصد (PLL/DNA) کاهش داد این درحالی بود که  حداکثر کاهش زنده­مانی در سلول­های تیمار شده با نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA 03/69 درصد بود که در نانوذرات حاوی 75 میکروگرم بر میلی­لیتر PLL مشاهده شد (شکل5).

شکل5: سمیت نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاوی غلظت­های متفاوت PLL

الگوی رهایش DNA از نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA

نتایج مقایسه میانگین رهایش DNA از نانوذرات PLA-PEG/DNA و PLA-PEG/PLL/DNA ، نشان داد با افزایش میزان PLL در نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA درصد بیشتری از DNA انکپسوله شده رهاسازی می­گردد. به طوری که کمترین درصد رهایش DNA انکپسوله شده، در نانوذرات PLA-PEG/DNA برابر با 78/17 درصد و بیشترین درصد رهایش DNA انکپسوله شده در نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاوی 75 میکروگرم PLL مشاهده شد (45/82 درصد). همچنین این نتایج نشان داد با افزایش میزان PLL در نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA درصد رهایش انفجاری (24 ساعت اول) افزایش و از درصد رهایش آهسته DNA کاسته می‫شود (شکل 6).

شکل 6: رهش DNA از نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاوی مقدار متفاوت PLL (0 [PLA-PEG/DNA]، 5، 25، 50، 75 میکروگرم PLL بر میلی­گرم PLA-PEG) در زمان­های متفاوت

ترانسفورماسیون سلول­های MCF-7 با استفاده از نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA

توانایی نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA در انتقال و رهایش DNA به سلول­های MCF-7 توسط میکروسکوپ فلورسانس و دستگاه فلورسایتومتر به اثبات رسید (شکل 7). تصویر میکروسکوپ فلورسانس نشان داد در برخی از سلول­های MCF-7 تیمار شده با نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA، نشر سبز رنگ مشاهده شد که نشان دهنده توانایی این نانوذرات در انتقال و رهش DNA درون این سلول­ها بود این در حالی بود که  DNA فاقد پوشش در محیط حاوی سرم از توانایی انتقال به سلول­های MCF-7 برخوردار نبود. نتایج دستگاه فلوسایتومتری نشان داد با افزایش نسبت PLL در نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA بر بازده انتقال ژن افزوده شد اگرچه بیشترین بیان ژن GFP در سلول­های تیمار شده با نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاوی 50 میکروگرم PLL بر میلی­گرم PLA-PEG مشاهده شد (88/33 درصد) با این وجود در مقایسه با  بازده انتقال ژن توسط نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاوی 75 میکرگرم PLL در میلی­گرم PLA-PEG (72/29 درصد) دارای تاثیر معنی داری نبود. همچنین این نتایج نشان داد کمپلکس PLL/DNA از بازده انتقال ژن پایینی در مقایسه با نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاوی 25، 50 و 75 میکروگرم PLL بر میلی­گرم PLA-PEG برخوردار است به نحوی که در نسبت های 50 و 75 میکروگرم PLL بر میلی­گرم PLA-PEG بازده انتقال ژن در مقایسه با PLL/DNA از 88/18 درصد به‫ترتیب به 88/33 و 72/29 درصد افزایش یافت (بیش از 5/1 برابر).

شکل 7: ترانسفکشن سلول­های MCF-7 توسط کمپلکس PLL/DNA و نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA؛ (a-c) به‫ترتیب تصویر میکروسکوپ فلورسنس از سلول­های شاهد، تیمار شده با کمپلکس PLL/DNA و نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاوی 50 میکروگرم PLL بر میلی­گرم PLA-PEG؛ (d-f) به‫ترتیب میکروگراف فلوسایتومتری از سلول­های شاهد، تیمار شده با کمپلکس PLL/DNA و نانوذرات PLA-PEG/PLL/DNA حاوی 50 میکروگرم PLL بر میلی­گرم PLA-PEG؛ (g) بازده ترانسفکشن در سلول­های MCF-7 توسط نانوذرات  PLA-PEG/PLL/DNA

بحث