نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران مرکز، دانشکده علوم پایه، گروه آموزشی بیوشیمی، تهران، ایران
چکیده
هدف: سرطان یک بیماری تهدید کننده زندگی که توسط تمایز کنترل نشده و تکثیری تعیین شده است. شیمی درمانی روش معمول در درمان سرطان است، اما تومورها اغلب به شیمی درمانی که منجر به عوارض جانبی بسیاری نیز میشود مقاومت نشان میدهند. بسیاری از سموم بیولوژیکی دارای ترکیبات فعال با فعالیت ضد توموری میباشند. این مطالعه جهت جستجوی یک عامل ضد سرطان از زهر مار کبری ایرانی انجام شد.
مواد و روش‌ها: ابتدا زهر مار کبری ایرانی (Naja naja oxiana) لیوفیلیزه و سپس با استفاده از روش BCA تعیین غلظت شد. از روش کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون (FPLC) و تعویض یونی، SDS-PAGE، جهت تخلیص زهر استفاده شد. فعالیت ضد سرطانی فراکشنها توسط تست MTT بر روی سلول Jurkat E6.1) ) بررسی شد.
نتایج: پیک سوم از کروماتوگرام FPLC دارای بیشترین اثر سمیت بود و جهت کروماتوگرافی تعویض یونی انتخاب شد. چهار پیک آنیونی و یک پیک کاتیونی جمع آوری شد. پیک دوم از کروماتوگرافی تعویض آنیونی دارای اثر سمی 1±43 درصد در مقدار5/1 میکروگرم بود. این فراکشن در سلول نرمال سمیتی حدود 1±8 درصد از خود نشان داد (05/0p≤).
نتیجه گیری: ترکیبات ضد سرطان طبیعی مشتق شده از سم Naja naja oxiana میتواند در مبارزه با سرطان کمک کننده باشد. این اولین گزارش از فراکشن ضد سرطان از مار کبری ایرانی با اثر سمیت بر روی سلول Jurkat E6.1 و اثر سمیت کمتر بر روی ی نرمال است.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Evaluation of toxicity and anticancer activity of isolated fraction from the venom of Iranian cobra snake on acute lymphoblastic leukemia cells (Jurkat E6.1)
نویسندگان [English]
- M Barati
- F Davoudi Dahaghani
Department of Biology, Faculty of Basic Science, Biochemistry, Islamic Azad University, Central Tehran Branch, Tehran, Iran.
چکیده [English]
Aim: Cancer is a life threatening disease determined by uncontrolled differentiation and proliferation of cells. Chemotherapy is the conventional method in treatment of cancer, but the tumor often will be resistant to chemotherapy regimen leading to crucial side effects. Many bio-toxins are biologically active compounds with anti-tumor activity. This study was aimed to find an anti-cancer agent from the venom of Iranian cobra snake.
Material and methods: The process of collection, lyophilisation of Iranian cobra (Naja naja oxiana) venom. Protein concentration of Iranian cobra venom was determined by BCA assay. Fast protein liquid chromatography (FPLC), SDS-PAGE, Anion exchange chromatography were used for purification of Iranian cobra venom. Standard cell biology methods were employed to characterize Iranian cobra venom abilities (in vitro) to inhibit Platelet aggregation, adhesion, migration and invasion of tumor cells. Its anti-cancer activity in (Jurkat E6.1) (in vitro) was tested by MTT assay.
Results: Peak 3 of FPLC was active on cell lines and selected for anion exchange chromatography. Four anionic and one cationic fractions collected for anticancer activity. Peak 2 of anion exchange chromatography had the most toxic activity as 43%±1 at 1.5 micrograms. This fraction showed about 8%±1 toxicity on fibroblast cells. (P-value ≤ 0.05)
Conclusion: Natural anti-cancer compounds derived from the Naja naja oxiana venom, can fight against cancer. It is the first report of an anticancer fraction from Iranian cobra with toxicity on Jurkat E6.1 cell line with less toxicity to normal cells.
کلیدواژه‌ها [English]
- Iranian cobra snake venom
- Leukemia
- MTT assay
مقدمه
سالیانه منابع زیادی در پیشگیری، تشخیص و درمان سرطان سرمایه گذاری شده و تمرکز اصلی بسیاری از شرکتهای داروسازی بر توسعه و کشف عوامل ضد سرطان است در حال حاضر بسیاری از محققین در سراسر دنیا ترکیبات ضد سرطانی متنوعی را شناسایی کرده اند که از سموم زیستی جدا شده اند (1).
سرطان خون علت اصلی مرگ مرتبط با سرطان در کودکان است، میزان بروز این نوع سرطان 3/34 مورد در
هر یک میلیون نفر می باشد (2). گزینههای درمان سرطان خون (لوسمی حاد) بهطور اختصاصی در درجهی اول شامل، شیمی درمانی است و گاهی و از پرتو درمانی هم بهعنوان مکمل استفاده کرد. داروهایی که برای شیمی درمانی استفاده میشود علاوه بر ی بدخیم، ی سالم را نیز تحت تاثیر قرار میدهد و بیش از همه بر روی بافتهای فعال و در حال رشد مانند مغز استخوان اثر زیان بخش میگذارد (3). عوارض جانبی سمی و ظهور مقاومت دارویی از مشکلات عمده مواجه با شیمی درمانی است. بسیاری از بیو توکسینها فعالیت ضدتوموری دارند. بعضی مستقیما سلول توموری را از بین می برند و بعضی مانع آنژیوژنز تومور شده و رشد تومور را مهار میکنند (1). این پروتئینها میتوانند سمی یا غیرسمی باشند. زهر مار در In vivo و In vitro اثر مهاری بر روی تومور داشته و ممکن است در درمان سرطان کاربرد داشته باشد (1و4).
القای آپوپتوزیس مهمترین مکانیسم بسیاری از عوامل ضد سرطان است (4). با توجه به اینکه ونوم مار شامل ترکیبات وسیعی است که سبب آپوپتوزیس و متاستاز سلولی میشود، میتوان به توسعهی یک داروی جدید ضد سرطان از ونوم مار در آینده امیدوار بود (1و4).
Disintegrin (یک گروه از پروتئینهای متصل شونده به اینتگرین) که در ونوم بعضی از مارها یافت شده اند در پروسهی کشندگی سلولی و مهاجرت آنها دخالت کرده و در درمان سرطان و مهار متاستاز نقش دارند (5). هدف از این تحقیق جداسازی اجزای زهر مار کبری ایرانی بهروش کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون و تعویض یونی و بررسی اثر ضد سرطانی فراکشنهای بهدست آمده بر رده سلولی سرطان خون Jurkat E6.1 میباشد و اثر فراکشن خالص تر بر تکثیر ی سرطانی نیز بررسی میشود. رده سلولی شاهد HEK-293 بوده و محدوده وزن مولکولی فراکشن موثر با SDS-PAGE مشخص خواهد شد.
مواد و روش‌ها
زهر لیوفیلیزه شدهی مار کبری ایرانی در آزمایشگاه ونوم و بیومولکولهای درمانی انستیتو پاستور موجود بود که بهروشmilking بر طبق توصیه سازمان WHO زهرگیری انجام شده بود (6).
بهمنظور تخلیص زهر مار کبری ایرانی بهروش کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون، ابتدا 200 میلی گرم از زهر خام در 2 میلی لیتر آمونیوم استات (MERK آلمان) mM 20 )8 (pH: حل شد و محلول بهمدت 5 دقیقه با دورg 13000 جهت حذف پارتیکلها سانتریفوژ شد و مقدار پروتئین محلول اندازهگیری شد. متعادل سازی ستون سفاکریل 60/16Sephacryl 200- HR- HiPrep S (شرکت GE آمریکا) (طول 60 سانتیمتر و قطر 1.6 سانتیمتر) از طریق شستشو با بافر آمونیوم استات 20 میلیمولار انجام شد و زهر به دستگاه FPLC (شرکت GE - مدل AKTA10) تزریق شد. کروماتوگرافی با سرعت جریان 1 میلیلیتر در دقیقه انجام شد. فراکشنهای زهر مار کبری ایرانی در طول موج 280 نانومتر و به صورت دستی جمع آوری شدند.
تغلیظ و لیوفیلیزاسیون فراکشنهای بهدست آمده از کروماتوگرافی در دستگاه فریز درایر (شرکت Christ آلمان) صورت گرفت.
تعیین مقدار پروتئین نمونهها بر اساس روش BCA و با استفاده از کیت مخصوص BCA (کمپانی Intronbio کره جنوبی) اندازه گیری شد. فراکشنهای تغلیظ شده توسط آب مقطر تزریقی رقیق شد و با بافرهای موجود در کیت مخلوط کرده و درون چاهکهای میکروپلیت 96 خانه ریخته و در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد بهمدت 30 دقیقه قرار داده شد. سپس عدد جذب هر یک از نمونهها در طول موج 562 نانومتر قرائت شد (7).
جهت تعیین محدوده ی وزنی فراکشنهای بهدست آمده، ابتدا فراکشنها را با بافر نمونه مخلوط شده و در مدت زمان 3 تا 5 دقیقه حرارت غیر مستقیم داده و در ژل پلی اکریل آمید با ژل ((Resolving12 درصد و ژل (Stacking) 4 درصد، بر اساس روش لاملی الکتروفورز شدند (8). پس از آماده سازی نمونههای پروتئینی، مقدار 20 میکروگرم از نمونه در هر چاهک دستگاه تانک عمودی (Bio-Rad) تزریق شده و در جریان 30 میلی آمپر بهمدت 3 ساعت الکتروفورز شد. رنگ آمیزی ژل با رنگ کوماسی آبی 250 R صورت گرفت.
بهمنظور تخلیص بیشتر، مقدار یک میلی گرم از فراکشن شماره 3، به دستگاه FPLC (شرکت GE – مدل10 AKTA ) و ستون Mono Q (شرکت GE آمریکا - طول 10 سانتیمتر و قطر 6/1 سانتیمتر) تزریق شد. در این روش از کروماتوگرافی ابتدا پروتئینهایی که جذب ستون آنیونی نشده بودند، از ستون خارج شده و بعد از اینکه این پروتئینها کاملا خارج شدند، بلافاصله شیب غلظت (گرادیان نمک) NaCl از صفر تا 1 مولار با 7pH: بهمدت 60 دقیقه اعمال شد. جذب فراکشنها در طول موج 280 نانومتر قرائت و منحنی جذب آن ثبت شد. کروماتوگرافی نیز با سرعت-جریان 1 میلیلیتر در دقیقه انجام شد. بهمنظور نمک زدایی از فراکشنهای بهدست آمده، از لوله فالکن دیالیز (Milli pore ) استفاده و سپس بهروش فوق لیوفلیزه شد. همچنین اندازهگیری مقدار پروتئین با استفاده از کیتBCA مطابق روش ذکر شده، انجام پذیرفت و الکتروفورز (SDS-PAGE) بر اساس روش لاملی انجام شد.
کشت و نگهداری رده سلولها رده سلول سرطانی Jurkat E6.1 و سلول نرمال293 HEK- از بانـک سلولی انسیتو پاستور ایران تهیه و در محـیط کـشت 1640RPMI (Gibco) حـاوی10 درصد سـرم جنـین گـاوی(FBS)، محلول پنیـسیلین U/ml 100 - استرپتومایسین µg/ml) 100) و mM 2– L گلوتـامین کـشت داده شدند. سپس در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد و در مجاورت 2CO پنج درصد نگهداری و هر سه روز محیط کشت آنها تعویض شد (9و10).
اثرسمیت سلولی فراکشنهای بهدست آمده از کروماتوگرافی (ژل فیلتراسیون و تعویض یونی) بر روی ی سرطانی Jurkat E6.1 و شاهد رده 293-HEK بررسی شد. برای این منظور هنگامیکه حداقل 70 درصد ی سرطانی Jurkat E6.1 و ردهی شاهد در فلاسک کشت به رشد کامل رسیدند، بهکمک تریپسینEDTA- از کف فلاسک جدا شده و سانتریفوژ شد. پس از شمارش ی زنده در سوسپانسیون سلولی توسط لام نئوبار، تعداد 104×2 سلول به هر چاهک میکروپلیت 96 خانه منتقل شد و یک گروه کنترل نیز در نظر گرفته شد. مقادیر مختلف از هر فراکشن کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون و تعویض یونی بهترتیب (125- 97 /0) و (6- 04/0) میکروگرم بههر یک از چاهکهای گروه تست اضافه شد پس از انکوباسیون 24 ساعته جذب فراکشن ها در طول موج 570 نانومتر توسط ( دستگاه Epoch شرکت BioTek آمریکا) ثبت شد و به اینترتیب فراکشن موثر و دارای بیشترین اثر سیتوتوکسیک انتخاب شد.
بررسی اثر سیتوتوکسیسیتی فراکشن کاندید بـهروش رنـگ سـنجی، بـا استفاده از MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) انجام شد (20). اساس ایـن روش بر پایهی فعالیت آنزیم سوکـسینات دهیـدروژنـاز میتوکنـدریایی ی زنده استواراست، که در این روش محلول زرد رنگ MTT بـه کریستالهای بنفش رنگ فورمازان تبدیل میشود و پس از حل کردن درDMSO میتوان آنها را در دستگاه الایزا ریـدر مـــورد ســـنجش قـــرار داد (11).
برای هر غلظت از فراکشن کاندید، 3 تکرار انجام شد و درصد سمیت سلولی در گروه کنترل منفی 100 در نظر گرفته شد و از فرمول زیر محاسبه صورت گرفت (12و13).
آنالیز آماری
نتایج بر اساس میانگین± انحراف معیار با استفاده از از نرم افزار آماری16 SPSS گزارش و رسم نمودار ها با نرم افزار Excel انجام شد. جهت بررسی و تجزیه و تحلیل آماری داده ها از آزمون student t-test استفاده شد (05/0> p)
نتایج
در مرحلهی اول تخلیص، نتایج کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون 200 میلی گرم زهر مار کبری ایرانی در (شکل 1) نشان داده شده است. به اینصورت که 6 فراکشن مجزا بهترتیب وزن مولکولی در مدت زمان 130 دقیقه از ستون خارج و جمع آوری شدند (شکل 1).
شکل 1: فراکشنهای بهدست آمده از کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون زهر مار کبری ایرانی. 6 فراکشن با شدت جریان 1میلی لیتر در دقیقه مشاهده و جمع آوری شد. ستون مورد استفاده سفاکریل (S-200) و باقر آمونیوم استات 20 mM بود.
نتیجهی الکتروفورز (SDS-PAGE) و تعیین وزن مولکولی فراکشن هدف تخلیص شده و پروتئین استاندارد به کار گرفته شده در محدودهی وزنی 9 تا 170 کیلو دالتون جهت تعیین وزن مولکولی با استفاده از ژل 12
درصد در (شکل2) نشان داده شده است. فراکشنهای اول دارای وزن مولکولی بیشتر و فراکشن انتهایی دارای وزن مولکولی کمتر نشان دهندهی این مهم بود که پروتئین و پپتیدهایی با وزن مولکولی متفاوت در ساختار ونوم مار کبری وجود داشت (شکل 2).
شکل2: تعیین وزن زهر خام مار کبری ایرانی و فراکشنهای حاصل از کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون زهر بهروش
SDS-PAGE با استفاده از ژل پلی آکریل آمید 12 درصد
بررسی اثر سمیت سلولی فراکشنهای بهدست آمده از FPLC با استفاده از تست MTT در (شکل 3) قابل مشاهده است. در این تست فراکشن شماره 3 حاصل از
کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون در مقدار 125 میکروگرم دارای بیشترین اثر سمیت بر روی ردهی سلولی Jurkat E6.1 کشت داده شده بود (شکل 3).
شکل3: بررسی اثر سمیت فراکشن های حاصل از کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون و زهر خام مار کبری ایرانی بهروش MTTرا نشان میدهد. فراکشن 3(F3) دارای بیشترین میزان اثر سمی نسبت به دیگر فراکشنها بر روی رده ی سلولی Jurkat E6.1 بود. مقادیر موجود در نمودار معادل Mean ±SD (05/0p≤) است.
پس از بررسی تست سمیت فراکشن سوم حاصل از FPLC، تخلیص مجدد با استفاده از کروماتوگرافی تعویض یونی و ستون Mono Q انجام شد و نتایج در شکل 4
نشان داده شده است. در این مرحله 4 فراکشن در محدودهی آنیونی مشاهده و جمع آوری شد. پیکهای محدودهی کاتیونی نیز جدا سازی شد.
شکل4: فراکشنهای بهدست آمده با روش کروماتوگرافی تعویض یونی (ستون Mono Q) در مدت زمان 100 دقیقه و با استفاده از بافر Tris-Hcl 20Mm و NaCl 1M جمع آوری شدند.
پس از جدا سازی فراکشنهای حاصل از کروماتوگرافی تعویض یونی و انجام لیوفیلیزاسیون، با استفاده از روش
الکتروفورزSDS-PAGE وزن مولکولی فراکشن هدف (F2) در حدود 47 کیلو دالتون بر آورد شد و بهصورت باند تک در شکل 5 قابل مشاهده است.
|
47kDa |
شکل5: الکتروفورز SDS-PAGE فراکشنF2 حاصل ازکروماتوگرافی تعویض یونی با استفاده از ژل پلی آکریل آمید12 درصد را نشان میدهد.
اثر سمیت سلولی فراکشنهای بهدست آمده از کروماتوگرافی تعویض یونی نشان داد که فراکشن F2 در
مقدار 5/1 میکروگرم بیشترین اثر را بر روی ردهی سلولی Jurkat E6.1 داشت. نتایج در شکل 6 آمده است.
شکل6 :نتایج تست بررسی اثر سمیت سلولی (MTT ) فراکشنهای بهدست آمده از کروماتوگرافی تعویض یونی فراکشن 3 F بر روی سلولهای سرطانی رده Jurkat E6.1 . فراکشن 2 (F2) در مقدار 5/1 میکروگرم بیشترین اثر را از خود نشان داد. داده های موجود در نمودار معادل Mean ±SD (P ≤ 0.05) است.
بررسی اثر سمیت سلولی (توکسیسیته ) فراکشن F2 بهدست آمده ازکروماتوگرافی تعویض یونی بر ردهی ی شاهد HEK-293 و ردهی سلولی Jurkat E6.1 در شکل 7 آمده است. در این بررسی مشخص شد که فراکشن F2 دارای کمترین اثر سمی بهمیزان 8 درصد بر روی ردهی سلولی شاهد بود.
شکل7: مقایسه درصد سمیت سلولی فراکشن 2 F در تست MTT بر رده سلول سرطانی Jurkat E6.1 و سلول شاهد 293 HEK- انسانی. اطلاعات موجود در نمودار معادل Mean ±SD (05/0p≤) است.
یافتههای حاصل از ارزیابی اثر فراکشن F2 حاصل از کروماتوگرافی تعویض یونی در مقادیر مختلف 6 تا 18/0
میکروگرم بر روی سلول نرمال 293HEK- و ی سرطانی Jurkat E6.1 در شکل7 بیانگر این مهم است که فراکشن 2F بر روی سلولهای سرطانی Jurkat E6.1 در مقدار 5/1 میکروگرم، دارای اثر سایتوتوکسیسیتی قویتر و بهمیزان 43 درصد بود.
بحث
سرطان تقسیم نا متقارن سلولهای بدن است. سلولهای سرطانی از ساز وکارهای عادی تقسیم و رشد سلولها جدا میافتند. سرطان پس از آسیب ژنتیکی به DNA گسترش مییابد. این آسیب ژنتیکی بر روی عملکرد طبیعی سلول از جمله تکثیر سلولی مرگ سلولی برنامه ریزی شده (آپوپتوزیس) و ترمیم DNA تاثیر میگذارد و در نهایت منجر به تولید تومور میشود که آن قسمت را از کار می اندازد و به قسمتهای دیگر نیز متاستاز میدهد (14). آمارهایی که توسط NCI و انجمن سرطان آمریکا در سال 2015 برآورده شده است، سالانه 5/2 نفر در هر 100.000 نفر مبتلا به سرطان لوسمی حاد می شوند که از این میزان درصد ابتلا جنس مذکر نسبت به مونث 52 درصد در مقابل 48 درصد میباشد. میزان شیوع سرطان ALL در آمریکا و اقیانوسیه بیشتر از مناطق آسیایی و شرق اروپا می باشد ( 15و 19).
محققین در پی رسیدن به ترکیبات و فرمولاسیونهایی هستند که بتواند جایگزین این نوع داروهای شیمیائی و کاهش عوارض جانبی آنها شوند. یک استراتژی مهم جهت توسعه داروهای ضد سرطان، مطالعه عوامل ضد سرطان بهدست آمده از منابع طبیعی است (16و21). از گذشته بهطور سنتی بشر میداند که از زهر جانوران سمی از جمله مار میتواند دارو تهیه کند. پژوهشگران در چند دهه اخیر دست به تحقیقات مختلفی جهت دست یابی به فراکشن خالص ضد سرطانی زده اند. اکثر این فراکشنها دارای اثر سمی بر سلولهای سرطانی بودند اما مشکل این تحقیقات این بود که این فراکشنهای پپتیدی یا پروتئینی دارای اثر سمی بر سلولهای نرمال بدن بودند. این ویژگی زهر، تحقیقات مرتبط با سرطان را با چالش مواجه کرد و کیفیت تحقیقات در این زمینه را کاهش داد.
ونوم بعضی مارها حاوی مولکول Disintegrin است که دارای ساختارهای مختلف و ویژگیهای خاص هستند که ابتدا از ونوم مارهای Viperidae جدا شد و بعدها در ونوم مارهای دیگر نیز دیده شد (5 و 20). Disintegrinهای موجود در زهر مارها دارای افینیتی بالایی جهت چسبیدن به اینتگرینها میباشند. اینتگرینها مولکولهای پروتئینی هستند که بهطور طبیعی در سطح سلولهای متحرک بدن وجود داشته و ابزار حرکتی آنها میباشند. این مولکولها را میتوان در غشای پلاسمایی نوتروفیل، مونوسیت، سلولهای اندوتلیال و سایر سلولها یافت. تجمع اینتگرین بر روی سلولهای عادی بسیار کمتر از سلولهای متحرک است. در بعضی از سرطانها بیان ژن اینتگرینها بهصورت نابهجا افزایش مییابد و لذا سلول بهصورت غیرطبیعی میتواند دارای ویژگی تحرک بوده و از بستر خود جدا شده و به مناطق اطراف مهاجرت کند (22 و 23). وجود این مولکولها در زهر خانواده کبری ثابت شده و لذا این تحقیق جهت جستجوی یک فراکشن ضد متاستاز با خاصیت ضد سرطانی هدف گذاری شد. مریم کاکنج و همکاران (17) در دانشگاه شهید بهشتی مطالعاتی را بر روی سم گرزه مار انجام دادند. در این مطالعه با استفاده از تست MTT مشخص شد که سم خالص گرزه مار بر روی سلولهای بند ناف ورید اندوتلیال انسانی (HUVECS) اثر کشندگی دارد. در حالیکه در مطالعهی حاضر با استفاده از تست MTT بر روی سلول نرمال (شاهد) اثر کشندگی دیده شد و بر روی سل لاین سرطان خون Jurkat E6.1 تا مقدار 04/0 میکروگرم دیده شد. همچنین در این مطالعه که بر روی سلولهای (HUVECS) انجام دادند تغییرات مورفولوژیک سلولها در زیر میکروسکوپ مشاهده شد. در حالیکه در تحقیق حاضر، این تغییرات مشاهده نشد. همچنین در طی مطالعه ای که توسط کولیپارا و همکاران (18) صورت گرفت و اثرات NK cells های فعال شده توسط سم را بر روی سل لاینهای A549 و NCI-H 460 سرطان ریه صورت گرفت که سبب مهار قابل توجهی در رشد سلولهای سرطانی ریه و ممانعت از اتصال به DNA و آزاد سازی سایتوکاینها و گرانولها که منجر به جلوگیری از پرولیفراتیو سلولها و آپوپتوزیس می شود را نشان داد لیکن بهدلیل عدم استفاده از سلول نرمال شاهد نمیتوان نتیجهای جامع از این تحقیقات بهمنظور دست یابی به اطلاعات دست یابی به اطلاعات تکمیلی جهت انجام مطالعات فاوماکولوژیک بهدست آورد.
لیانگ ژانگ و لیجون وی (24)، مطالعه ای بر روی مار Agkistrodonacutus و بررسی روند القای آپوپتوزیس در سرطان دهانه ی رحم انجام دادند و به نتایج قابل قبول و اثر مطلوب سم مار بر روند القای آپوپتوزیس بر سلولهای سرطانی دهانه ی رحم دست یافتند. با اینحال بهدلیل عدم استفاده از سلول نرمال شاهد، نمیتوان نتیجهای جامع از این تحقیقات بهمنظور دستیابی به اطلاعات تکمیلی جهت انجام مطالعات فارماکولوژیک، بهدست آورد.
OnsZakraui و همکاران (25) به بررسی اثر لبئین حاصل از ونوم مار Marcroviperalebetina روی سلولهای سرطانی کولون انسانی بهصورت In vivo و In vitroپرداختند. در این بررسی نتایج مشابهی مشاهده شد و لبئین که نوعی دیس اینتگرین میباشد باعث مرگ 56 درصدی سلول و القای آپوپتوزیس، کاهش چسبندگی و مهاجرت سلولی در سلولهای174 LS و همچنین مانع گسترش آدنو کارسینومای کولون انسانی در موش شد.
در پژوهشی دیگر آنتونی ساویولا و همکاران (26) اثر Tzabcanin استخراج شده از سم مار زنگی آسیای میانه (C.simustzabcan) را روی سلولهای سرطانی ملانوما 375 A- و ریه 549 A- مورد بررسی قرار دادند. در این مطالعه اثر سایتوتوکسیسیتی قابل ملاحظه ای مشاهده نشد. Tzabcanin در بروز اثر ضد چسبندگی نیز با شکست مواجه شده ولی توانست در ممانعت از مهاجرت سلولی موفق عمل کند.
نتایج مطالعهی ما بر روی زهر مار کبری ایرانی نشان داد که فراکشنهای بهدست آمده از کروماتوگرافی تعویض یونی دارای اثرات ضد سرطانی بهصورت اثر سمیت سلولی و کشندگی بر روی سلولهای سرطان خون Jurkat E6.1است، در حالیکه بر سلولهای نرمال ، دارای حداقل اثرات سمیت سلولی است و با توجه به یافتههای حاصل از این مطالعه پیشنهاد میشود که فعالیت ضد سرطانی و القای آپوپتوزیس پروتئین نوترکیب حاصل از فراکشن هدف و همچنین انجام مطالعه در مرحلهی In vivo و اثر فراکشن فعال بر روی مدل حیوانی در ادامهی فرآیند بررسی شود.
نتیجه گیری
با توجه به نتایج نشان داده شده از سمیت 43 درصدی بر روی سلولهای سرطان Jurkat E6.1و اثر سمیت کم (8 درصد) فراکشن2 Fحاصل از کروماتوگرافی تعویض یونی بر رده ی سلولهای شاهد، میتوان بیان داشت که فراکشن بهدست آمده دارای اثر سیتوتوکسیک و کشندگی قابل ملاحظه ای بر روی سلول Jurkat E6.1 بوده است. بنابراین در شرایطی که بتوان داروی ضد سرطان از زهر مار کبری ایرانی بهدست آورد با کمترین عارضه و در یک دوره درمانی مناسب میتواند موجب نابودی سلولهای سرطانی شود.
تشکر و قدردانی
این پژوهش در آزمایشگاه ونوم و بیومولکولهای درمانی (بخش بیوتکنولوژی) انستیتو پاستور ایران انجام شده است. بدین وسیله از راهنمایی و حمایت جناب آقای دکتر کامران پوشنگ باقری و سرکار خانم رویا میرزایی دانشجوی دکتری سم شناسی قدردانی میشود.
)