تاثیر نانو ذرات اکسید روی (ZnO) بر ویژگی‌های جوانه زنی، بیوشیمیایی و فراساختار سلولی گیاه کرچک (L. communisRicinus)

اسپرهم, الهام; سعیدی سار, سکینه; محمودزاده آخرت, هما; هادی, محمدرضا

doi:10.52547/JCT.8.2.151

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

¹ دانشجوی دکتری دامغان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، دامغان، ایران، کدپستی: 3671639998

² دانشگاه فنی و حرفه ای، دانشکده فنی دکتر شریعتی، تهران ، ایران، کدپستی1891816851

³ دانشگاه مشهد، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، مشهد، ایران، کدپستی: 41391735

⁴ دانشگاه مرودشت، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، مرودشت، ایران، کدپستی: 33386849

https://doi.org/10.52547/JCT.8.2.151

چکیده

هدف: این تحقیق به‏منظور مطالعه تاثیر غلظت‌های مختلف نانوذرات اکسید روی بر جوانه زنی، مقدار رنگیزه‌های فتوسنتزی، محتوای قند و بررسی فراساختار برگ گیاه کرچک بود
مواد و روش‌ها: آزمایش در شرایط کشت گلخانه به صورت کاملا تصادفی با 3 تکرار طراحی شد. گیاهان در معرض غلظت‌های مختلف (صفر، 500،100،10 و1000میلی گرم بر لیتر) نانو ذرات اکسید روی قرار گرفتند. ویژگی‌های فراساختاری برگ توسط میکروسکوپ الکترونی TEM در تیمار 1000میلی گرم بر لیتر مطالعه شد.
نتایج: تیمار گیاه با نانواکسید روی در غلظت10 میلی گرم برلیتر سبب افزایش و در غلظت بالاتر از 10 میلی گرم برلیتر به‏طور معنی‏داری سبب کاهش در سرعت و درصد جوانه زنی، طول ریشه‌چه ،ساقه چه و میزان رنگیزه‌های فتوسنتزی شد. میزان قندهای محلول در برگ با افزایش غلظت نانو ذرات افزایش معنی‏داری پیدا کرد. تصاویر میکروسکوپ الکترونی TEM، تجمع نانو ذرات اکسید روی و از هم پاشیدگی دیواره و غشا سلولی و همچنین بد شکلی و کاهش تعداد کلروپلاست‌ها را در تیمار 1000میلی گرم برلیتر در مقایسه با شاهد نشان داد.
نتیجه‌گیری: با کاربرد غلظت‌های فزاینده نانو ذره اکسید روی یک تنش اکسیداتیو در گیاه کرچک بروز می‌کند که به‏دنبال آن پارامترهای جوانه زنی و میزان رنگیزه‌های فتوسنتزی درآن کاهش یافته و آسیب‌های فراساختاری در سلول‌های برگ آن ایجاد می‌شود و گیاه در پاسخ به این تنش میزان قند خود را نیز افزایش می‌دهد.

تازه های تحقیق

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

The Effects of Zinc Oxide (ZnO) Nanoparticles on the Germination, Biochemical and Ultrastructural Cell Characteristics of Ricinus communis

نویسندگان [English]

E Esparham ¹
S Saeidisar ²
H Mahmoodzadeh ³
M. R Hadi ⁴

¹ Ph.D. Student, Department of Biology, Faculty of Science, Damghan University, Damghan, 3671639998, Iran

² Department of agriculture, Dr.Shariaty Technical college, Technical and vocational University, Tehran, 1891816851,Iran

³ Department of Biology, Faculty of Science, Mashhad University, Mashhad, 41391735, Iran.

⁴ Department of Biology, Faculty of Science, Marvdasht University, Marvdasht, 33386849, Iran

چکیده [English]

Aim: The present research attempts to study the effect of different concentrations of zinc oxide (ZnO) nanoparticles on the germination, the amount of photosynthetic pigments and sugar content and analyze the ultrastructure of Ricinus communis plant leaves.
Material and methods: Experiment were performed under controlled greenhouse conditions, and designed completely randomly with three incidents. The plants were exposed to various concentrations (0, 10, 100, 500 and1000) mg/l of zinc oxide nanoparticles. The ultrastructural Characteristics of plant leaves were made with the use of TEM electron microscope in the experimental plants of 1000 mg/l.
Results: Treatment of the plant with (ZnO) Nanoparticels at concentration of 10 mg/l caused increased and higher concentrations significantly reduced the rate and percentage of germination, as well as the radicle and plumule length and the photosynthetic pigments. The amount of soluble sugars in leaves increased significantly with the increase of nanoparticle concentration. The images TEM electron microscope revealed the concentration of zinc oxide nanoparticles and cell membrane rupture, as well as a deformation and decrease of the number of chloroplasts in the1000 mg/l treated plants, compared with the control plants.
Conclusion: The Zn absorption by the plant increases by increasing the concentration of (ZnO) nanoparticles. At high concentrations due to toxicity, germination parameters in the plant decrease, which leads to oxidative stress in the plant. The plant in response to this stress increases its sugar content. In these conditions, the amount of photosynthetic pigments decreased and caused ultrastructural ruptures in plant cells.

کلیدواژه‌ها [English]

Ricinus communis
Zinc oxide nanoparticles
germination

اصل مقاله

مقدمه

نانوتکنولوژی یکی از فناوری‌های نوین است که چند سالی است (نزدیک به ده سال) که وارد عرصه‌ی کشاورزی شده است. نانوذرات مجموعه‌های اتمی یا مولکولی با حداقل ابعاد بین 1 تا 100 نانومتر هستند که خواص فیزیکو شیمیایی متفاوتی در مقابله با مواد توده‌ای خود دارند (1). جذب و جابه‫جایی و تجمع نانوذرات بسته به گونه گیاهی و نوع، اندازه، ترکیب شیمیایی، ساختمان و استحکام نانوذرات متفاوت می‌باشد (2). عناصر معدنی ضروری که هر کدام دارای نقش‌های فیزیولوژیکی مشخصی هستند بر اساس غلظت نسبی آن‫ها در بافت‌های گیاهی به عناصر پر مصرف و کم مصرف تقسیم می‌شوند. از آنجایی که اغلب عناصر کم مصرف مانند روی (Zn)، مس (Cu) و کبالت (Co) جزء فلزات سنگین طبقه‌بندی می‌شوند از این رو زمانی‫که غلظت آن‫ها در خاک و بافت‌های گیاهی بالاتر از حد کفایت گیاه باشد به‫علت ایجاد مسمومیت، رشد و عملکرد گیاه را تحت تاثیر قرار می‌دهد (3). نانو ذرات عناصر کم مصرف نیز در غلظت‌های بالا برای سلول زیان‌آور می‌باشند و باعث تنش اکسیداتیو می‌شود و همانند سایر تنش‌های غیر زیستی تولید و تجمع انواع فعال اکسیژن را القا می‌کنند (4 و5). تولید این ترکیبات مانند رادیکال سوپر اکسید (O₂)، پراکسید هیدروژن (H₂O₂) اخیرا مطالعات زیادی در رابطه با سمیت شدید نانوذرات و اثرات مثبت و منفی آن‫ها در گیاهان گزارش شده است (6). از اثرات مثبت می‌توان به اثر دی اکسید تیتانیوم بر رشد گیاه اسفناج نام برد (5) و از اثرات منفی می‌توان به سمیت نانوذره اکسید روی (ZnO) بر روی گیاه آرابیدوپسیس تالیانا اشاره کرد (7). نانوذرات اکسید روی (ZnO) اکسید فلزی است که به‫طور متداول در صنعت کاربردهای زیادی دارد. از جمله در ترکیبات ضد آفتاب، در الکترودها و بیوحس‌گرها، فتوکاتالیز و سلول‌های خورشیدی را می‌توان نام برد. اثرات بالقوه و مضر این نانوذرات بر روی گیاهان وجود دارد (8)، به‫طوری‫که جذب نانوذرات فلزی در اتمسفر پیرامون گیاه توسط برگ‌ها به اثبات رسیده و نشان داده شده که ساختار کرک‌ها و روزنه‌ها تحت تاثیر این نانو ذرات قرار می‌گیرد (9). همچنین تارهای کشنده ریشه در جذب نانو ذرات از محیط‌های خاکی و آبی نقش مهمی را ایفا می‌کنند (10). در این رابطه لین و زینک (11) سمیت گیاهی نانوذرات روی، اکسید روی، آلومینیوم و نانو لوله‌های کربنی چند جداره را در مرحله‌ی جوانه زنی شش گونه گیاه عالی (تربچه و کلزا، چچم، کاهو ذرت و کدو) بررسی کرده‌اند. نتایج آن‫ها نشان داد فقط نانوذرات روی در گیاه چچم و نانوذرات اکسید روی ذرت منجر به کاهش رشد شدند (11). تحقیقات دیگر با اعمال نانوذره اکسید روی در گیاهان چاودار و ذرت مشخص کرد که رشد ریشه و جوانه‌زنی بذر در هر دو گیاه به‫طور معنی‫داری کاهش می‌یابد (12). ماهاجان و همکاران در (13) در تحقیقی غلظت‌های مختلف اکسید روی را به‫شکل معلق در آگار به برنج اضافه کردند و اثر آن را بر روی رشد دانه‌رست‌ها مورد بررسی قرار داده‌اند. نتایج آن‫ها نشان داده است که در بعضی از غلظت‌های نانوذره اکسید روی (ZnO) دانه‌رست‌ها رشد خوبی را نشان می‌دهند ولی غلظت‌های بالای آن باعث کاهش رشد در گیاه می‌شود. آن‫ها همچنین گزارش کردند که نانوذرات اکسید روی (ZnO) اثرات مضری را بر ریشه‌ی برنج در مراحل اولیه‌ی جوانه زنی داشته و باعث جلوگیری از طویل شدن ریشه شده و تعداد آن را کاهش می‌دهد. شایمورات و همکاران (14) نشان داده‌اند که نانوذرات اکسید روی در غلظت50 میلی‌گرم بر لیتر باعث مهار طویل شدن ریشه در گیاه سیر می‌شود. کومار و همکارانش (15) نشان داده‌اند که تیمار نانو ذره اکسید روی (ZnO) بر روی ریشه گیاه سیر (Allium cepa) اثرات سیتوتوکسیک و ژئوتوکسیک را در پی دارد. کرچک با نام علمیL. CommunisRicinusمتعلق به خانواده ٍEuphorbiaceae می‌باشد. کرچک گیاهی یک ساله و دارای ساقه‌ای به ارتفاع 2 متر است ولی در آب و هوای گرم و مساعد به صورت چند ساله با ظاهر درختچه مانند و به ارتفاع 6 متر یا حتی 10 متر و گاهی بیشتر ممکن است دیده شود. مهم‫ترین اسید چرب روغن کرچک، اسید ریسینولیک است که یک اسید چرب هیدروکسی غیر اشباع می‌باشد. سایر اسیدهای چرب موجود در روغن کرچک شامل لینولنیک اسید، اسید پالمتیک می‌باشد. روغن کرچک حاصل از آن به‫عنوان با ارزش‌ترین مواد مسهل و ملین و ضد گرفتگی در پزشکی مورد استفاده قرار می‌گیرد و همچنین روغن این گیاه در صنایع داروسازی و آرایشی دارای کاربردهای فراوانی است (16). با توجه به این‫که تنش‌های غیر زیستی از جمله تنش عناصر سنگین به‫صورت نانو ذرات بر روی گیاه می‌تواند میزان و نوع متابولیت‌های ثانویه و ترکیبات اسیدهای چرب را تحت تاثیر قرار دهد (17) و چون گیاه کرچک یک گیاه دارویی مهم و دارای اسیدهای چرب مهمی است این گیاه انتخاب شد به‫طوری‫که هدف از این تحقیق با توجه به نوظهوری نسبی فناوری نانو و مطالعات اندک در مورد اثرات مضر آن روی سیستم‌های زیستی به‫خصوص گیاهان موجب فراهم نمودن اطلاعاتی در زمینه سمیت نانوذرات فلزات سنگین با بررسی اثرات نانوذرات اکسید روی بر جوانه‌زنی و رشد گیاه کرچک می شود.

مواد و روش‌ها

روش تهیه نانو ذرات اکسید روی (ZnO): میزان 5 گرم نانوذرات اکسید روی (ZnO) از شرکت بازرگانی نوترینو از تهران خریداری شد. برای تهیه‌ی غلظت‌های مختلف، مقدار 001/0 گرم نانو ذرات اکسید روی (ZnO) در 50 میلی‌لیتر آب مقطر به‫حالت سوسپانسیون درآمدند و برای جلوگیری از ایجاد رسوب مواد در آب و تشکیل محلولی همگن، با استفاده از دستگاه اولتراسونیک (مدل 100 w,40KHz ساخت شرکت Heilscher آلمان) به‫مدت 30 دقیقه در دمای 30 درجه سانتی‌گراد در محلول پراکنده شدند. سپس مقدار یک میلی‌لیتر از آن بر روی جایگاه (Cell) دستگاه تعیین انداره ذرات (VASCOPARTICLE SIZE ANALYZER, Company: CORDOUAN) ساخت فرانسه قرار داده شد و اندازه نانوذره اکسید روی (ZnO) تعیین شد. که بر این اساس اندازه ذرات در طول موج 657 نانو متر و دمای 25 درجه‌ی سانتی‌گراد به‫دست آمد به‫طوری‫که میانگین قطر ذرات یا Dmen number :502/49 و شاخص پراکندگی ذرات PDI:0/170 محاسبه شد (شکل 1).

شکل1: اندازه نانوذره اکسید روی (ZnO)

آزمایش پتانسیل Zeta: در ابتدا 001/0 گرم پودر اکسید روی (ZnO) در50 میلی‌لیتر آب دیونیزه دیسپرس (پراکنده) شد. سپس به‫مدت نیم ساعت در حمام اولتراسونیک (با دما 30 سانتی‌گراد) قرار داده شد. سپس هشت میلی‌لیتر از آن بر روی جایگاه دستگاه پتانسیل Zeta (Zeta compact Company :CAD) ساخت فرانسه قرار داده شد و پتانسیل Zeta آن اندازه‌گیری شد که بر این اساس میانگین پتانسیل Zeta نانوذره اکسید روی، 17/17- میلی ولت، در دمای 4/22 درجه‌ی سانتی‌گراد به‫دست آمد ( شکل 2).

شکل2: پتانسیل zeta نانو ذره اکسید روی (ZnO)

مطالعه پراش اشعه (XRD): مطالعه پراش اشعه (X-Ray Diffraction = XRD) در آزمایشگاه مرکزی دانشگاه فردوسی مشهد انجام شد. در این روش با استفاده از پرتو X که در محدوده بین پرتو گاما و ناحیه طول فرابنفش قرار دارد، می‌توان اطلاعاتی در خصوص ساختار، جنس ماده و نیز تعیین مقادیر عناصر به‫دست آورد. به‫طور کلی دو یا سه شکل بلوری در یک نانوذره وجود دارد. اما

درصد آن‫ها با هم متفاوت است. هر نانوذره ممکن است

دارای فازهای اصلی یا فرعی در ساختار خود باشد. در این تحقیق ساختار بلوری نانوذره اکسید روی توسط دستگاهXRD مدل (Company:GNR(Italy)V:40kv,I:30mA) تعیین شد. بر این اساس، نانوذره اکسید روی تک فاز می‌باشد و منطبق با استاندارد pdf.4 است. فاز فرعی و جزئی در این نانوذره مشاهده نشد (شکل 3).

شکل3: بررسی اشعه X نانوذره اکسید روی

تیمار آزمایش: برای بررسی اثر غلظت‌های مختلف نانوذرات اکسید روی بر میزان جوانه‌زنی، رنگیزه‌های

گیاهی و قند محلول گیاه کرچک این تحقیق در سال 1395 در گلخانه دانشکده علوم دانشگاه آزاد اسلامی واحد مشهد در قالب طرح کاملا تصادفی در سه تکرار انجام شد و در آن اثرات 5 سطح غلظت (صفر،10 ،100 ،500 و1000) میلی‌گرم بر لیتر از نانوذرات اکسید روی (ZnO) بر روی مرحله جوانه‌زنی و گل‫دانی گیاه کرچک (ZnO) بررسی شد. 500گرم بذر گیاه دارویی کرچک از شرکت پاکان بذر اصفهان تهیه شد. در کشت گلدانی، تعداد10 بذر در گلدان‌های دو کیلویی حاوی شن در عمق 2 سانتی‌متری کاشته شد. اولین اسپری برگی نانوذرات اکسید روی در مرحله دو برگی گیاه انجام شد. اسپری‌های بعدی تا دوره 35 روزه، هفته‌ای یک‫بار انجام شد و در انتهای این دوره نمونه‌برداری از برگ‌ها انجام شد و در نهایت میزان رنگیزه‌های فتوسنتزی و قند محلول (که شاخص مهمی در نشان دادن تاثیر عوامل تنش‫زا هستند) در برگ اندازه‌گیری شد. در آزمایش‫های جوانه‌زنی ابتدا بذرهای گیاه کرچک با هیپوکلریت سدیم 7درصد به‫مدت 10 دقیقه استریل شد و سپس با آب مقطر شستشو داده شدند. جهت بررسی جوانه زنی تعداد ده عدد بذر گیاه کرچک بر روی هر کاغذ صافی در هر پتری دیش به‫عنوان یک تیمار (مجموعا 15 پتری دیش) استفاده شد. تیمارهای صفر (شاهد یا کنترل)، 10 ،100 ، 500 و 1000 میلی‫گرم بر لیتر از نانوذرات اکسیدروی به‫میزان 5 میلی‌لیتر به پلیت‌ها اضافه شد. برای اعمال تیمار صفر از آب مقطر استفاده شد. به‫منظور جوانه‌زنی بذر گیاه کرچک، پتریدیش‫ها در دستگاه جوانه زنی بذر با دمای 25 درجه سانتی‌گراد و رطوبت 30 درصد به‫مدت 7 روز نگه‫داری شدند و برای جلوگیری از تبخیر از پارافیلم (مقدار 2 میلی‌لیتر آب مقطر هر روز به پتریدیش‌ها اضافه شد) استفاده گردید. روزانه تعداد بذرهای جوانه زده بررسی و شمارش شدند و در نهایت درصد جوانه زنی و سرعت جوانه‌زنی در روز هفتم به ترتیب بر اساس رابطه‌های زیر محاسبه شدند و سایر صفات از جمله طول ریشه‌چه و ساقه‌چه و وزن تر و خشک دانه رست اندازه‫گیری شد.

درصد جوانه زنی:

Germination Percentage = 100 × GN/SN

=SN تعداد کل بذرهای تحت تیمار

GN = تعداد کل بذرهای جوانه زده

سرعت جوانه زنی:

Germination = Σ Gi / Σ niGi

Gi= تعداد بذرهای جوانه زده در روز i ام

سنجش محتوای کلروفیل و کاروتنوئید برگ: با استفاده از روش آرنون مقدار کلروفیل برگ گیاه کرچک اندازه‌گیری شد. برای این‫منظور200 میلی‌گرم از قطعات برگ گیاه در بوته چینی ریخته شده و با استفاده از 2 تا 3 میلی‌لیتر استن 80 درصد ساییده شد. سپس محلول به لوله سانتریفیوژ منتقل گردید و به‫مدت 10 دقیقه با دور 3500 سانتریفیوژ شد. محلول فوقانی در ارلن ریخته شده و با استن 80 درصد به حجم 25 میلی‌لیتر رسانده شد و در مرحله بعد جذب محلول توسط دستگاه اسپکتوفتومتر (شیماتزو – مدل UV/1100) در طول موج‌های 640،646 و 663 نانومتر اندازه‌گیری شد. سپس با توجه به فرمول‌های زیر میزان کلروفیل a، کلروفیل b ، کلروفیل a+b و کاروتنوئید محاسبه شد (18).

12/25 A(663) - 2/55 A(646))×v/w ×1000) =(gfw/mg) Chla

(20/31 A(646)-4/91 A(663)) ×v/w ×1000= (gfw / mg) Chlb

×v/w ×1000 ((17/76A(646) +7/34 A(663) = (gfw / mg) Chla+b

4/69 A(440) – 0/267 (Chla +b) ×v/w ×1000)= (gfw /mg) کاروتنوئید

A= میزان جذب، V= حجم، W= وزن

سنجش قندهای محلول: سنجش محتوای قند محلول برگ با استفاده از روش فنل سولفوریک (Dubois, et al.,1956) با اندکی تغییرات انجام گرفت. یک‫صد میلی‌گرم از بافت خشک و پودر شده نمونه برگ با چهار میلی‌لیتر از اتانول 80 درصد در یک لوله آزمایش به خوبی مخلوط شد. سپس لوله‌ها به‫مدت بیست دقیقه در حمام آب گرم با دمای 80 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند. جهت حذف کلروفیل و ترکیبات چربی از 5/1 میلی‌لیتر کلروفرم استفاده شد. جهت جدایی بهتر اتانول و کلروفرم در مخلوط و استخراج بهتر قند، مقدار چهار میلی‌لیتر آب دیونیزه نیز افزوده شد. در ادامه با سانتریفیوژ عصاره‌ی حاصل در rpm 500 به‫مدت ده دقیقه محلول دو فازی ایجاد شد. یک میلی‌لیتر از عصاره روئی با یک میلی‌لیتر عصاره‌ی فنل 5 درصد در لوله‌ی آزمایش مخلوط شد و بلافاصله پنج میلی‌لیتر اسید سولفوریک غلیظ بر روی آن افزوده شد. پس از ده دقیقه فاصله‌ی زمانی، مخلوط واکنش به خوبی هم زده شد و به‫مدت نیم ساعت در دمای اتاق نگه‫داری شد. سپس جذب نوری محلول در طول موج 490 نانومتر توسط اسپکتوفتومتر (شیماتزو –مدل UV/1100)، سنجش شد (19).

آماده‌سازی نمونه برای مطالعه‌ی میکروسکوپ الکترونی گذاره (TEM): نمونه‌های برگ تازه (1 میلی‌متر مربع) با گلوتار آلدهید 6 درصد در بافر کاکودیلات سدیم 1/0 مولار با pH برابر 5/7 به‫مدت شش ساعت در چهار درجه سانتی‌گراد تثبیت شدند و سپس با تترا اکسید اسمیوم 1 درصد به‫مدت دو ساعت در چهار درجه‌ی سانتی‌گراد، در غلظت های مختلف الکل (30،50، 70 و100 درصد)، آبگیری شده و سپس از نسبت‌های مختلف رزین و پروپیلن اکساید (3به1،1به 1و1به 3 ) برای نفوذ رزین استفاده شد. پس از نفوذ رزین، نمونه‌ها قالب‌گیری شدند و در 60 درجه سانتی‌گراد به‫مدت 48 ساعت قرار گرفتند. ابتدا برش‌های نیمه نازک تهیه شدند و پس از شناسایی اولیه، برش‌های نازک با ضخامت 80- 60 نانومتر تهیه و بر روی صفحات مشبک (GRID) 300مش قرار گرفتند. سپس رنگ‌آمیزی نمونه‌ها با استات اورانیل 1 درصد به‫مدت 20 دقیقه و با سیترات سرب2 درصد به‫مدت شش دقیقه انجام گردید و در نهایت نمونه‌ها توسط میکروسکوپ گذاره مدل LF0912 مشاهده و عکس‌برداری صورت گرفت.

آنالیز آماری

داده‌های جمع‌آوری شده در همه‌ی آزمایش‌ها توسط نرم افزار MINITAB و با روش آنالیز واریانس یک‫طرفه مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفتند. مقایسه‌ی میانگین‌ها با آزمون دانکن در سطح احتمال 05/0 p≤ انجام شد.

نتایج

اثر نانوذرات اکسید روی (ZnO) بر پارامترهای جوانه زنی

اثر غلظت‌های مختلف نانوذرات اکسید روی (ZnO) بر درصد جوانه‌زنی دانه رست‌های کرچک مورد بررسی قرار گرفت از نظر آماری درصد جوانه‌زنی در سطح 05/0 p≤ معنی‌دار بود. بیشترین درصد جوانه‌زنی در تیمار 10 میلی‫گرم بر لیتر مشاهده شد که نسبت به شاهد، تیمار 100، تیمار 500 و تیمار 1000 میلی گرم بر لیتر به‫ترتیب 56/28، 42/46، 7/60 درصد افزایش نشان می‌دهد (شکل4).

از طرف دیگر اثر غلظت‌های مختلف نانوذرات اکسید روی(ZnO) بر سرعت جوانه‌زنی دانه رست‌های کرچک نشان می‌دهد که در بالاترین غلظت نانوذرات اکسید روی(ZnO) کمترین سرعت جوانه‌زنی کسب شد که نسبت به شاهد 68/66 درصد کاهش معنی‫دار نشان می‌دهد (شکل5) ولی در غلظت 10میلی گرم بر لیتر دارای بیشترین سرعت جوانه‌زنی است که نسبت به شاهد 6/10 درصد افزایش را نشان می‌دهد.

شکل 4: اثر غلظت‌های مختلف نانوذرات اکسید روی بر درصد جوانه‌زنی دانه رست‌های کرچک.

*حروف مشابه نشان دهنده غیر معنی‌دار بودن در سطح 5% در آزمون LSD می‌باشد. مقادیر، میانگین سه تکرار ± خطای استاندارد (خطوط بار بر روی ستون‌ها) می‌باشد.

شکل 5: اثر غلظت‌های مختلف نانوذرات اکسید روی (ZnO) بر سرعت جوانه‌زنی دانه رست‌های کرچک.

همچنین نتایج نشان داد که طول ریشه‌چه با افزایش غلظت نانوذرات به‫طور معنی‌داری کاهش پیدا می‌کند. بیشترین طول ریشه‌چه (23/3 سانتی‌متر) در غلظت 10میلی گرم بر لیتر نانو ذره اکسید روی (ZnO) کسب گریده است که در حدود 1/25 درصد نسبت به شاهد

افزایش نشان می‌دهد و کمترین طول ریشه‌چه (7/0 سانتی‌متر) در غلظت 1000میلی گرم بر لیتر به‫دست آمده است که بیشترین کاهش طول ریشه‌چه در حدود 34/68 درصد نسبت به شاهد را نشان می‌دهد (شکل6).

شکل6: اثر غلظت‌های مختلف نانوذرات اکسیدروی (ZnO) بر طول ریشه‌چه (بر حسب سانتی‌متر) در دانه‌رست‌های کرچک.

*حروف مشابه نشان دهنده غیر معنی‌دار بودن در سطح 5 درصد در آزمون LSD می‌باشد. مقادیر، میانگین سه تکرار ± خطای استاندارد (خطوط بار بر روی ستون‌ها) می‌باشد.

از طرف دیگر، نتایج نشان داد که با افزایش غلظت نانوذرات اکسید روی (ZnO) یک روند کاهشی در طول ساقه‌چه مشاهده می‌شود (شکل 7) و بیشترین طول ساقه در تیمار10 میلی‌گرم بر لیتر آن کسب شد که یک افزایش 12/15 درصدی را نسبت به شاهد نشان می‌دهد. بیشترین اثر کاهشی در تیمار 1000میلی گرم بر لیتر با 32/27 درصد کاهش نسبت به گیاه شاهد به‫دست آمد.

شکل 7. اثر غلظت‌های مختلف نانوذرات اکسید روی (ZnO) بر طول ساقه‌چه (بر حسب سانتی‌متر) دانه‌رست‌های کرچک.

* حروف مشابه نشان دهنده غیر معنی‌دار بودن در سطح 5% در آزمون LSD می‌باشد. مقادیر، میانگین سه تکرار ± خطای استاندارد (خطوط بار بر روی ستون‌ها) می‌باشد.

اثر نانوذرات اکسید روی (ZnO) بر پارامترهای بیوشیمیایی

نتایج نشان داد که میزان کلروفیل a در غلظت‌های بالای نانوذرات اکسید روی (ZnO) به‫طور معنی‌داری کاهش می‌یابد. با این وجود، میزان کلروفیل a در غلظت 10 میلی‫گرم بر لیتر آن نسبت به شاهد 25 درصد افزایش نشان داد (شکل8). نتایج مربوط به کلروفیل b مشابهت زیادی با نتایج کلرفیلa دارد، به‫طوری‫که در غلظت‌های بالای نانوذرات اکسید روی (ZnO) اثرات کاهشی در میزان کلروفیل b مشاهده می‌شود و کمترین مقدار

کلروفیل b در غلظت 1000 میلی‫گرم بر لیتر با 3/68 کاهش نسبت به شاهد مشاهده گردید، هر چند بیشترین مقدار این رنگدانه در غلظت 10 میلی‌گرم بر لیتر با 85/25 درصد افزایش نسبت به شاهد بدست آمد (شکل 8). به‫علاوه نتایج نشان داد که غلظت پایین نانوذرات اکسید روی (ZnO) اثر تحریکی در مقدار کلروفیل a+b نشان می‌دهد. به‫طوری‫که در تیمار 10 میلی‌گرم بر لیتر آن نزدیک به 47/25 درصد افزایش معنی‌دار نسبت به شاهد مشاهده شد در صورتی‫که غلظت بالای آن اثر کاهشی در مقدار کلروفیل a+b نسبت به شاهد را نشان می‌دهد (شکل 8).

شکل8: اثر غلظت‌های مختلف نانوذرات اکسید روی (ZnO) بر محتوی انواع کلروفیل (بر حسب میلی‌گرم آن در گرم وزن تر برگ) در دانه‌رست‌های کرچک.

*حروف مشابه نشان دهنده غیر معنی‌دار بودن در سطح 5% در آزمون LSD می باشد. مقادیر، میانگین سه تکرار ± خطای استاندارد (خطوط بار بر روی ستون‌ها) می‌باشد.

از طرف دیگر، نتایج نشان داد که با افزایش غلظت نانوذرات اکسید روی (ZnO) از غلظت 100 تا 1000 میلی‫گرم بر لیتر میزان کاروتنوئیدها یک روند کاهشی را نشان می‌دهد هرچند در غلظت 10 میلی‌گرم

بر لیتر افزایش معنی‌داری در میزان کاروتنوئیدها نسبت به شاهد مشاهده می‌شود (شکل 9).

شکل 9:اثر غلظت های مختلف نانوذرات اکسید روی (ZnO) بر میزان کاروتنوئیدها (بر حسب میلی‫گرم آن در گرم وزن تر برگ) در دانه رست‫های کرچک.

از سوی دیگر، نتایج نشان داد که میزان قندهای محلول در برگ با افزایش غلظت نانوذرات اکسید روی (ZnO) افزایش می‌یابد. به طوری که میزان قندهای محلول در برگ در غلظت 1000میلی‌گرم بر لیتر نزدیک به 4/66 افزایش و در غلظت10میلی‌گرم بر لیتر در حدود 5/22 درصد افزایش را نسبت به شاهد نشان می‌دهند (شکل 10).

شکل10: اثر غلظت‌های مختلف نانوذرات اکسید روی (ZnO) بر میزان قندهای محلول (بر حسب میلی‌گرم آن در گرم وزن خشک برگ) در دانه‌رست‌های کرچک

اثر نانوذرات اکسید روی (ZnO) بر فرا ساختار برگ گیاه کرچک

تاثیر غلظت‌های مختلف نانوذره اکسید روی بر فراساختار گیاه کرچک توسط میکروگراف‌های الکترونی حاصل از بررسی فراساختارهای سلول‌های برگ گیاه کرچک تحت تیمار 1000میلی گرم بر لیترنانوذره اکسید روی (ZnO) با استفاده از میکروسکوپ الکترونی TEM در شکل 11 نشان داده شده است. از هم پاشیدگی دیواره سلولی و تجمع نانوذرات اکسید روی بر روی دیواره نسبت به شاهد به وضوح نمایان است (تصویر Aو B). غشای سلولی نیز دچار از هم پاشیدگی شده است (تصویر B). در برخی از اندامک‌های سلولی خصوصا کلروپلاست تحت تاثیر تیمار 1000میلی گرم بر لیتر دچار تغییرات ساختاری شده و در مقایسه با شاهد دفرمه و غیر طبیعی مشاهده شدند. همچنین تعداد کلروپلاست‌ها در گروه تحت تیمار نسبت به شاهد کمتر شده است (C و D).

شکل11: اثر نانوذرات اکسید روی (ZnO) بر برگ گیاه کرچک

A * گیاه کنترل. B تجمع نانوذرات اکسید روی در تیمار PPM 1000 . C گیاه کنترل. شکل و تعداد کلروپلاست. D تغییر شکل و تعداد کلروپلاست در تیمارPPM1000.

بحث

در این پژوهش تاثیر نانوذرات اکسید روی (ZnO) بر گیاه کرچک در سه قسمت مورد بحث قرار گرفت.

اثر نانوذرات اکسید روی (ZnO) بر پارامترهای جوانه‌زنی

به‫نظر می‌رسد که غلظت پایین نانوذره اکسید روی (ZnO) یک اثر مثبتی در درصد و سرعت جوانه‌زنی وجود دارد. به‫طوری‫که غلظت 10 میلی‌گرم بر لیتر بیشترین تاثیر را بر افزایش سرعت و درصد جوانه‌زنی داشت، ولی با افزایش غلظت این نانوذره این فاکتورها، کاهش پیدا کرد و در غظت 1000 میلی‫گرم بر لیتر بیشترین تاثیر کاهشی را در درصد و سرعت جوانه زنی نشان داد. علت دقیق این اثرات شناخته شده نیست اما احتمالا به‫دلیل غلظت‌ بالاتر

روی در دانه‌ها هنگام تیمار با غلظت کم نانوذرات اکسید روی نسبت به شاهد است. در تیمارهای بالاتر از 10 میلی‌گرم بر لیتر احتمالا به‫دلیل ایجاد تنش اکسیداتیو اثرات منفی بر روی این فاکتورها مشاهده می‌شود به طوری‌که غلظت 1000میلی گرم بر لیتر بیشترین تاثیر کاهشی در پارامترهای مذکور داشت. پوشش بذر نقش مهمی را در حفاظت از جنین در برابر عوامل خارجی دارد و می‌تواند خاصیت نفوذپذیری انتخابی هم داشته باشد. اگرچه آلاینده‌ها آشکارا اثرات بازدارنده‌ای روی رشد ریشه دارند و اگر به درون پوشش بذر وارد نشوند ممکن است نتوانند بر جوانه‌زنی تاثیر بگذارند. ریشه‌چه پس از نفوذپذیری پوسته‌ی بذر مستقیما با نانوذرات تماس پیدا می‌کنند، بنابراین طویل شدن ریشه‌ی گیاهان، واکنشی وابسته به دوز خواهد داشت زیرا، اولین هدف در برابر آلاینده‌ها می‌باشد، بنابراین علایم سمیت در ریشه‌ها نسبت به ساقه بیشتر است. اگرچه سمیت نانوذرات ناشناخته است، این موضوع شدیدا به ترکیب شیمیایی و سطح نانوذرات وابسته است (11). اگر جذب آب توسط بذر دچار اختلال گردد و یا جذب به آرامی صورت گیرد، فعالیت‌های متابولیکی جوانه‌زنی در داخل بذر به‫آرامی انجام خواهد شد و در نتیجه مدت زمان لازم برای خروج ریشه‌چه از بذر افزایش یافته و سرعت جوانه‌زنی کاهش می‌یابد (20). در این رابطه گزارش شده است که نانوذره اکسید روی (ZnO) بر روی گیاه چاودار در غظت 35 میلی گرم بر لیتر و ذرت در غلظت 15 تا 25 میلی‫گرم بر لیتر از جوانه‌زنی بذرهای آن‫ها ممانعت به‫عمل می‌آورد (11). لین و زینک (11) اثرات نانوذرات اکسید روی (ZnO) و روی (Zn) در جوانه‌زنی بذر زعفران و آزمون طویل شدن ریشه‌چه را مورد مطالعه قرار داده‌اند. نتایج آن‫ها نشان می‌دهد که نانوذرات روی (Zn) و اکسید روی (ZnO) باعث مهار قابل توجه جوانه‌زنی بذر و رشد ریشه در گیاهان مذکور می‌شود که با نتایج پژوهش حاضر مطابقت دارد. نتایج پژوهش حاضر نشان داد که بهترین غلظت برای رشد ریشه چه و ساقه‌چه تیمار 10میلی‫گرم بر لیتر میباشد و با افزایش غلظت اثر کاهشی در طول ریشه‌چه و ساقه‌چه مشاهده شد. اعمال نانوذرات روی (Zn) و کبالت (Co) بر روی طول ریشه‌های گیاه سیر (Allium cepa) نشان می‌دهد هر دو نوع نانوذره سبب کاهش قابل توجه در طول ریشه می‌شوند. با این‫حال سمیت نانوذرات اکسید روی (ZnO) از کبالت (Co) بیشتر است به طوری که به سرعت به‫درون ریشه‌ها نفوذ کرده و متابولیسم سلولی و مراحل تقسیم سلولی و مواد ژنتیکی را تحت تاثیر قرار می‌دهد که این سمیت نانوذرات را می‌توان، به ترکیب شیمیایی، مواد شیمیایی، ساختار و اندازه ذرات در سطح نانوذرات نسبت داد (21). کومار و همکاران (12) نشان دادند که نانوذرات اکسید روی (ZnO) باعث ممانعت از طول ریشه و کاهش تعداد ریشه‌های گیاه برنج می‌شوند که این امر به سمییت نانوذرات اکسید روی (ZnO) اشاره دارد. در تحقیقی دیگر تعداد ریشه‌ها مشابه طول ریشه‌ها در گیاه برنج، تحت تاثیر غلظت‌های (10، 100، 500 و 1000 میلی گرم بر لیتر) نانو اکسید روی(ZnO) قرار گرفته است و نتایج آن‫ها نشان می‌دهد که در غلظت پایین یعنی 10 میلی گرم بر لیتر بیشترین میزان تعداد ریشه مشاهده شده است و با افزایش غلظت این نانو ذره تعداد ریشه به‫شدت کاهش پیدا می‌کند که این موضوع میزان سمیت نانو اکسید روی (ZnO) را به ریشه‌های برنج آشکار می‌سازد (8). این یافته‌ها با نتایج حاضر همسویی دارد.

تاثیر نانوذرات اکسید روی (ZnO) بر پارامترهای بیوشیمیایی

نتایج به‫دست آمده از این تحقیق نشان داد که تیمار در غلظت 10 میلی گرم بر لیتر باعث افزایش کلروفیل a، کلروفیل b ،کلروفیل a+b و کارتنوئیدها شده و با افزایش غلظت سبب کاهش پارامترهای مذکور شد. در پژوهشی در سال 2007 اثرات نانو ذرات آهن در گیاه ذرت مورد بررسی قرارگرفت. نتایج آن‫ها نشان داد که کلروفیل a با افزایش میزان نانو ذرات آهن در محیط کشت کاهش می‌یابد. بهترین شاخص برای کارایی فتوسنتز نسبت کلروفیل a/b است که اطلاعات غیر مستقیمی را در مورد گیرنده های سیستم فتوسنتزی (LHCII) واقع در غشای کلروپلاست فراهم می‌کند. این پژوهشگران فرض کردند اکسید آهن فراهم شده از طریق نانو ذرات آهن می‌تواند با واکنش احیا در پدیده‌ی فتوسنتز درگیر باشد و تیمار بیش از حد آن سبب ایجاد تنش اکسیداتیو می‫شود و می‌تواند در ساختار آنزیم به‫کار رفته و در مراحل مختلف فتوسنتز تاثیرگذار باشد (22). در این رابطه اثرات نانو

ذرات نقره بر محتوی کلروفیل (a وb) وکارتنوئیدها درگیاهان ذرت و لوبیا در سال 2012 مورد بررسی قرار گرفته است. نتایج آن‫ها نشان می دهد که محتوی کلروفیل a در غلظت‫های پائین نانو ذره نقره در ذرت و لوبیا افزایش پیدا می‌کند در حالی‫که در غلظت‌های بالای آن محتوی کلروفیل و کارتنوئیدها کاهش پیدا می کند (23). که با نتایج پژوهش حاضر مطابقت دارد. احتمالا یکی از دلایل کاهش محتوی کلروفیل a،b و a+b در غلظت‌های بالا، ایجاد تنش اکسیداتیو و تخریب آن‫ها به‫وسیله‌ انواع اکسیژن فعال (ROS) است (24). از طرف دیگر، نتایج این تحقیق نشان داد که با افزایش غلظت نانوذره اکسید روی (ZnO) محیط، مقدار قندهای محلول نیز افزایش پیدا می‌کند. برخی از تحقیقات نشان داده است که با افزایش غلظت فلزات سنگین، میزان تعادل آب درون سلولی دچار اختلال شده و سبب تغییرات فراساختاری در اندامک‌های سلولی و آنزیم‌های مسیر متابولیسم قندها می‌شود و با افزایش غلظت فلزات سنگین میزان فعالیت آنزیم اینورتاز کاهش می‌یابد. به‫دنبال کاهش میزان انتقال آب به برگ‌ها و تجمع این عناصر سنگین در سلول، میزان کربوهیدرات‌ها در برگ‌ها افزایش می‌یابد. از این‫رو ممکن است افزایش قندها یک نوع مکانیسم تطابقی و سازگار یافته برای حفظ و نگه‫داری پتانسیل اسمزی تحت تنش نانوذره اکسید روی باشد. تجمع کربوهیدرات‌ها در حفظ غشای سلولی و تنظیم اسمزی موثر است (25و26) که با نتایج پژوهش حاضر مطابقت دارد.

اثر نانوذرات اکسید روی (ZnO) بر فرا ساختارمیکروسکوپی برگ گیاه کرچک

ساده‌ترین راه برای تعیین موقعیت نانوذرات در بافت گیاه استفاده از میکروسکوپ الکترونی گذاره است. نتایج زو و همکاران (27) نشان می‫دهد که با افزایش غلظت نانوذرات مس، تجمع درون سلولی افزایش می‌یابد. نتایج پژوهش شامارا و همکاران (28) در رابطه با افزایش غلظت نانوذرات نقره و افزایش تجمع درون سلولی با نتایج پژوهش فوق هم‫سویی دارد. بر خلاف جانوران، جلبک‌ها و قارچ‌ها و گیاهان دارای دیواره‌ی سلولی هستند که مکانی برای واکنش و ممانعت از ورود نانوذرات است. فقط نانوذرات با اندازه‌ی کوچکتر از منافذ دیواره‌ی سلولی می‌توانند عبور کنند. تجمعات نانوذرات غلظت‌های بالا در سلول‌های گیاهی ناشی از فرآیندهای جذب اضافی توسط دیواره و غشا سلول شامل تبادلات یونی، انتشار تسهیل شده و انتقال فعال است (29). تصاویر میکروسکوپ الکترونی آسیب سلول‌های برگ به غشا، دیواره‌ی سلولی و کلروپلاست را نسبت به گروه شاهد نشان می‌دهد. احتمالا علت این آسیب تجمع بالای نانوذرات اکسید روی و ایجاد تنش اکسیداتیو و نتیجه‌ی آن ممانعت از رشد گیاه کرچک می‌باشد. بعد از ورود نانوذرات به سلول‌ها آن‌ها از طریق پلاسمادسماتا از یک سلول به سلول دیگر انتقال می‌یابند (30). گاهی تجمع نانوذرات ممکن است در نتیجه‌ی انسداد منافذ و کانال‌ها رخ دهد (30)، از این رو تحقیق بیشتری مورد نیاز است تا ارزیابی دقیق تری صورت گیرد.

نتیجه‌گیری

نتایج این پژوهش نشان داد که در غلظت کم، نانوذره اکسید روی (10میلی‫گرم بر لیتر) سبب افزایش سرعت و درصد جوانه زنی، طول ریشه‌چه، ساقه‌چه و رنگیزه ها شامل کلروفیل a، b ، a+b وکاروتنوئید و همچنین افزایش میزان قند محلول برگ گیاه کرچک در مقایسه با گیاه شاهد شد. به طور کلی می‌توان گفت که استفاده از غلظت‌های پائین نانوذره اکسید روی (ZnO) سبب افزایش و بهبود در رشد گیاه و در سطوح بالا احتمالاً به علت ایجاد تنش اکسیداتیو و همچنین سمیت شدید نانوذره اکسید روی می‌تواند اثر بازدارنده بر روی مرحله جوانه زنی گیاه کرچک داشته باشد.

تشکر و قدردانی