نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 کارشناس ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشگاه بین‌المللی امام خمینی (ره) قزوین، قزوین، ایران
2 دانشگاه بین المللی امام خمینی(ره) قزوین، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، قزوین، ایران
3 دانشگاه بین‌المللی امام خمینی (ره) قزوین، گروه اصلاح نباتات، قزوین، ایران
چکیده
هدف: هدف از این پژوهش بررسی اثر دو نانو ذره به عنوان الیسیتور بر بیان سه ژن کلیدی این مسیر بود.
مواد و روشها:. به این منظور از غلظتهای 5/0، 75/0 و 1 میلیگرم در لیتر نانواکسیدکبالت و نانواکسید روی استفاده و در زمانهای 8، 24و 48 ساعت پس از تیمار، نمونهبرداری انجام شد.
نتایج: بررسی بیان ژنها به روش SQ-RT-PCR انجام شد. به طورکلی، هر دو الیسیتور مورد استفاده بر بیان ژنها تاثیر داشتند. تاثیر نانواکسید روی بر بیان ژنها بیشتر از نانواکسید کبالت بود. در مورد ژن STR و D4H بیشترین افزایش بیان مربوط به غلظت 5/0 میلیگرم در لیتر و برای ژن DAT غلظت 1 میلیگرم در لیتر نانواکسید روی در بازه زمانی 8 ساعت بود. نانواکسید کبالت در اکثر غلظتها و بازههای زمانی مورد استفاده باعث کاهش بیان ژنهای مورد بررسی شد.
نتیجه گیری: هر دو نانو ذره نانو اکسید کبالت و روی توانستند بر بیان ژنهای کلیدی مسیر وین بلاستین و وین کریستین تاثیر بگذارند.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Evaluating the effect of zinc and cobalt nanoparticles on expression of STR, DAT and D4H genes in periwinkle (Cataranthus roseus) suspenssion culture
نویسندگان [English]
- M Rezaee 1
- Ramin Hosseini 2
- Behvar Asghari 3
1 M.Sc. in Agricultural Biotechnology, Imam Khomeini International University, Qazvin, Iran
2 Agricultural Biotechnology Department, Imam Khomeini International University, Qazvin, Iran
3 Agricultural Biotechnology Department, Imam Khomeini International University, Qazvin, Iran
چکیده [English]
Aim: Effects of two nanoparticles were investigated on the expression of STR, DAT and D4H genes in periwinkle.
Material and Methods: For this purpose, concentrations of 0.5, 0.75 and 1 mg per liter of cobalt and zinc oxide nanoparticles were used. Sampling was carried out at 0, 8, 24 and 48 hours after treatment.
Results: Gene expression analysis was performed by the SQ-RT-PCR method. In general, both elicitors influenced gene expression. But, the effects of zinc oxide nanoparticles on the gene expression were more pronounced than cobalt oxide nanoparticles. The highest expression of STR and D4H genes were occurred in 0.5 mg per liter of zinc oxide nanoparticles after 8 hours treatment, while in the case of DAT gene, it occurred in concentration of 1 mg per liter of this nanoparticle. Moreover, Cobalt oxide nanoparticles in most of the studied concentrations and time intervals caused decreases in gene expression.
Conclusion: Both nanoparticles had significant effects on gene expression of vinblastine and vincristine pathways.
کلیدواژه‌ها [English]
- Catharanthus roseus
- Vinblastine
- vincristine
- Gene expression
- SQ-RT-PCR
- nanoparticles
مقدمه
پروانش با نام علمی Catharanthus roseus از خانواده خرزهره (Apocynaceae) میباشد. این گیاه یکی از مهمترین گیاهان دارویی است که در سطح جهان بهدلیل وجود خاصیت ضدسرطانی شناخته شده است (1). پروانش گیاهی است درختچهای، چندساله که البته در مناطق سرد بهصورت یکساله کشت میشود. منشاء این گیاه مناطق حاره و گرمسیر مانند جنوب هند، اندونزی و ماداگاسکار گزارش شده است و در دشتها و تپههایی که 500 متر از سطح دریا ارتفاع دارند میروید. همچنین رویش این گیاه در قارههای آفریقا، آمریکا، آسیا، استرالیا و بعضی از جزایر اقیانوس آرام نیز گزارش شدهاست (2). بهعلت وجود آلکالوئیدهای ارزشمند در پیکر رویشی و ریشه پروانش، در اکثر فارماکوپهها بهعنوان یک گیاه دارویی بسیار مهم معرفی و خواص آن نیز بیان شده است. این گیاه بهعلت دارا بودن آلکالوئیدهای مهم نظیر وینبلاستین و وینکریستین که هر دو اثر آنتینئوپلازی (ضد تومور) دارند، در صنایع داروسازی اهمیت بسیاری دارد. این مواد در شیمیدرمانی برخی سرطانها نیز کاربرد دارند (3، 4). تاکنون 130 نوع آلکالوئید از این گیاه استخراج شده است که مقدار آن را در پیکر رویشی 2/0 تا 1 درصد گزارش کردهاند. آلکالوئیدهای پروانش همگی از گروه تریپتوفان میباشند. آلکالوئیدهای وینبلاستین و وینکریستین در برگها ساخته و ذخیره میشوند. مقدار این آلکالوئیدها در این گیاه بسیار کم است. بهعنوان مثال، میتوان از وینکریستین در برگها نام برد که مقدار آن به 003/0 درصد میرسد و یک تن از برگهای خشک پروانش، فقط حاوی 3 گرم از این آلکالوئیدها میباشد (5). وینبلاستین و وینکریستین بهصورت تجاری از مقدار زیادی گیاه پروانش استخراج میشوند (6). یکی از روشهایی که امروزه بیش از هر موضوع دیگر در زمینه بررسی متابولیتهای گیاهی مورد توجه قرار دارد، روش کشت اندام، بافت و سلول گیاهی است. محققین با استفاده از این روش سعی میکنند تا شواهد بیشتری در رابطه با چگونگی بیوسنتز متابولیتها و نیز مکانیسم تنظیمی آن بهدست آورند و با این روشها توانستهاند تولید متابولیتهای ثانویه با ارزش را درگیاهان افزایش دهند (7). برخی از این ترکیبات مانند: دیجی توکسین، شیکونین، عطر جاسمین و داروهای ضد سرطان مانند: وین بلاستین، وین کریستین و تاکسول از ارزش اقتصادی بالایی برخوردارند و قیمت آنها از چند دلار تا چند هزار دلار بهازای هر کیلو تغییر می کند. تولید انبوه و سریع این مواد پیچیده در مقیاس زیاد از طریق روشهای شیمیایی عمدتا مشکل و یا غیرممکن میباشد و از سویی محدودیتهای مختلف مانع تامین این مواد از طبیعت است. استفاده از راهکارهای فناوری زیستی از جمله کشت سوسپانسیون سلولی، کشت اندام (کشت ریشه های موئین و ساقه) راه حلی مناسب برای تولید سریع و انبوه متابولیتهای ثانویه می باشد (8). سوسپانسیون سلولی در گیاه پروانش برای تولید آجمالیسین، کاتارانتیین، سرپنتین و بسیاری از تولیدات دارویی مهم دیگراستفاده شده است (9). الیسیتورهای مختلف قارچی بهمنظور بهبود بخشیدن به تولید ایندول آلکالوئیدها در سوسپانسیون سلولی پروانش آزمایش شدند. نتایج نشان داد که میسلیومهای قارچی مختلف تجمع انواع مختلفی از ایندول آلکالوئیدها (آجمالیسین، سرپنتین و کاتارانتین) را تحریک میکند که 2 الی 5 برابر بیشتر از شاهد است. افزودن الیسیتور در دوزهایی بین 5 تا 30 میلیگرم بر لیتر کربوهیدرات، نتایج مشابهی در تجمع مقدار و تنوع ایندول آلکالوئیدها نشان داد (10). در ده سال اخیر، اطلاعات قابل ملاحظهای از رشد و تولید متابولیتهای ثانویه بهوسیله کشت سلول و بافت پروانش بهدست آمده است (11). بررسی اثر کادمیوم در تولید آجمالیسین در کشت سوسپانسیون سلولی پروانش نشان داد که کادمیوم، سطح رونویسی TDC، غلظت تریپتامین سلولی و تولید آجمالیسین را در سلول افزایش میدهد (12). آنزیم استریکتوسیدین سینتاز (Strictosidine synthase، STR) در مسیر بیوسنتز ترپنوئید ایندول آلکالوئیدها باعث تبدیل تریپتامین و سکولوگانین به استریکتوسیدین میشود که پیشماده تولید تمامی ترپنوئید ایندول آلکالوئیدهاست. همه آلکالوئیدها در یک قسمت از مسیر بیوشیمیایی تا تولید ماده استریکتوسیدین مشترک هستند و از این نقطه، مسیر در گونههای مختلف گیاهی تولیدکننده مواد آلکالوئیدی منشعب میشود (13). D4H (Desacetoxyvindoline-4 hydroxylase) جزو آنزیمهای نهایی در مسیر بیوسنتز ایندول آلکالوئیدهاست. در این مسیر D4H باعث تبدیل دیاستوکسی ویندولین به دیاستیل ویندولین میشود که از پیشمادههای ضروری برای تولید ویندولین است (14). ژن DAT (Deacetyl vindoline-4-O-acetyl transferase) آنزیم استیل کوا را کد میکند. این ژن در آخرین مرحله از مسیر تولید ایندول آلکالوئیدها منجر به تولید ویندولین میشود (15) با توجه به یافتههای علمی صورت گرفته تاکنون گزارشی مبنی بر استفاده از نانوذرات بهمنظور بررسی تأثیر آنها بر بیان ژنهای گیاه پروانش صورت نگرفته است. بنابراین افزایش بیان ژنهای STR، DAT و D4H درگیاه پروانش تحت تأثیر الیسیتورهای نانوکبالت و نانوروی هدف این پژوهش قرارگرفت.
مواد و روشها
گیاه پروانش از گلخانه دانشگاه بین المللی امام خمینی (ره) قزوین تهیه شد. از برگهای نزدیک گل و برگهای جوان بهمنظور تهیه کالوس نمونهبرداری شد. برگها به روش احمدی و همکاران (16) ضدعفونی گردید. از محیط کشت موراشیک و اسکوگ (MS) در سال 1962 بهعنوان محیط کشت پایه جهت کشت برگها، القا کالوس و ایجاد سوسپانسیون سلولی استفاده شد. در این آزمایش از دو هورمون 2,4-D (mg/L 1) و BAP (mg/L 5/0) استفاده شد. برای تهیه سوسپانسیون سلولی، حدود 2 گرم از کالوسها به ارلنهای 500 میلیلیتری دارای 100 میلیلیتر محیط کشت منتقل شدند و در دمای 2 ± 25 درجه سانتیگراد روی شیکر انکوباتور، با شدت 120 دور در دقیقه و در تاریکی قرار گرفتند. تیمار هورمونی مشابه با تیمار کالوسزایی بود.
رسم منحنی رشد و اعمال الیسیتور: برای تعیین پیک رشد سلولها بهمنظور اعمال الیسیتور نمونهبرداری از سلولها هر 3 روز یک بار و در بازههای زمانی 0، 3، 6، 9، 12، 15، 18، 21 و 24 روز انجام گرفت و میزان وزن تر و وزن خشک سلولها اندازهگیری و یادداشت شد. برای اعمال الیسیتورهای روی وکبالت، از محلول مادری که دارای غلظت 1000 میلیگرم در لیتر بود، استوک تهیه شد. پس از این که کشتهای سوسپانسیون سلولی به بیشترین میزان رشد خود رسیدند، نانوذرههای روی و کبالت در غلظتهای 5/0، 75/0 و 1 میلیگرم در لیتر به محیطها اضافه شد. جهت بررسی بیان ژن، محتوای هر ارلن در تیمارهای زمانی 8، 24و 48 ساعت پس از تیمار از صافی عبور داده شد و پس از خارج شدن آب اضافی نمونهها، وزن آنها یادداشت گردید و سپس نمونهها بهمنظور تثبیت بهطور جداگانه در فویل آلومینیومی پیچیده شدند و در ازت مایع قرار گرفتند و تا زمان استخراج RNA در دمای 80- درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
استخراج RNA و ساخت cDNA: استخراج RNA با استفاده از کیت RNX-PLUS ساخت شرکت سیناکلون (تهران، ایران) طبق دستور شرکت سازنده انجام شد. غلظت RNA استخراج شده با استفاده از اسپکتروفتومتر تخمین زده شد و کیفیت آن با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز (5/1 درصد) بررسی شد. برای حذف آلودگی ژنومی از آنزیمΙ DNase ساخت شرکت سینا کلون استفاده شد. cDNA با استفاده از RNAکل، مخلوط dNTP و Oligo-dT Primer (شرکت سیناکلون) ساخته شد. جهت اطمینان از درستی سنتز cDNA ها واکنش PCR با استفاده از آغازگر S rRNA18 انجام شد. سپس تمامی نمونهها روی ژل آگارز 5/1 درصد (w/v) الکتروفورز (شرکت پایا پژوهش، مشهد) شدند. کیفیت و درستی سنتز cDNA پس از عکسبرداری از ژل توسط دستگاه مستند ساز ژل (Gel Documentation System, UVP, USA) تأیید شد.
واکنش زنجیرهای پلیمراز: توالی آغازگر ژنهای STR، D4H بر اساس تحقیق صورت گرفته توسط Wei (4) ساخته شدند. توالی آغازگر برای ژن DAT با استفاده از نرمافزار Oligo5 طراحی شد و از لحاظ عدم اتصال غیراختصاصی و تشکیل دایمر با استفاده ازPrimer blast مورد بررسی و تأیید قرار گرفت (جدول 1).
برای بررسی بیان ژن از روش SQ-RT-PCR استفاده شد. بههمین منظور ابتدا شرایط انجام واکنش PCR برای ژن خانهدار (SrRNA 18) بهینه شد. سپس واکنش PCR برای سایر ژنها در شرایط تعیین شده صورت گرفت. شرایط انجام PCR (Techne, Germany) برای ژن خانهدار از طریق تغییر دمای اتصال، زمان هر چرخه و نیز تعداد چرخههای واکنش بهینه شد. واکنش PCR با استفاده از PCR Master Kit محصول شرکت سیناکلون (تهران، ایران) و آغازگرهای اختصاصی صورت گرفت. برای بررسی محصولات واکنش SQ-RT-PCR از ژل آگارز 5/1 درصد استفاده شد. مقدار 5 میکرولیتر از محصولات PCR روی ژل، بارگذاری و الکتروفورز شد. سپس عکسبرداری از ژل انجام و شدت نسبی باندها با استفاده از نرمافزار ImageJ سنجیده شد. آنالیز دادههای حاصل با استفاده از نرمافزارSPSS در قالب آزمایش فاکتوریل بر پایه طرح کامل تصادفی و با استفاده از آزمون دانکن بررسی شد.
جدول 1: لیست آغازگرهای مورد استفاده جهت بررسی بیان ژن
|
نام ژن و آغازگر |
توالی آغازگر |
طول قطعه (جفت باز) |
|
STRآغازگر رفت |
5'-tgacagtcccgaaggtgtgg-3' |
122 |
|
STRآغازگربرگشت |
5'- cgccgggaacatgtagctct-3' |
|
|
D4Hآغازگر رفت |
5'- taccctgcatgccctcaacc-3' |
121 |
|
D4Hآغازگربرگشت |
5'- ttgaaggccgccaatttgat -3' |
|
|
DATآغازگر رفت |
5'- agaaaccaacggatacgcac-3' |
96 |
|
DATآغازگر برگشت |
5'- tcaaaccctcttctccaacc -3' |
|
|
SrRNA18آغازگر رفت |
5'- gcaacaaaccccgacttctg -3' |
102 |
|
SrRNA18 آغازگربرگشت |
5'- tgcgatccgtcgagttatca -3' |
|
نتایج
تجزیه واریانس بیان ژن STR
مقایسه میانگین دادههای مربوط به بیان ژن STR با استفاده از نانواکسید روی نشان داد که اثر زمان، غلظت و همچنین اثر متقابل زمان و غلظت در سطح 1 درصد معنیدار شد. در مورد نانواکسید کبالت اثر زمان معنیدار نبود و اثر غلظت در سطح 5 درصد و اثر متقابل زمان و غلظت در سطح 1 درصد معنیدار شد (جدول 2 و 3).
جدول 2: مقایسه میانگین بیان ژن STR تحت تیمارهای مختلف نانواکسید روی در زمانهای مختلف
|
منبع تغییرات (S. O. V) |
درجه آزادی (df) |
مجموع مربعات (SS) |
میانگین مربعات (MS) |
F |
|
زمان |
2 |
462/2033 |
731/1016 |
**094/26 |
|
غلظت |
2 |
671/1500 |
336/750 |
**257/19 |
|
زمان × غلظت |
4 |
551/2416 |
138/604 |
**505/15 |
|
خطا |
18 |
349/701 |
964/38 |
|
|
کل |
26 |
034/6652 |
|
|
**: معنیدار بودن در سطح احتمال 1 درصد
جدول 3: مقایسه میانگین بیان ژن STR تحت تیمارهای مختلف نانواکسید کبالت در زمانهای مختلف
|
منبع تغییرات (S. O. V) |
درجه آزادی (df) |
مجموع مربعات (SS) |
میانگین مربعات (MS) |
F |
|
زمان |
2 |
521/52 |
261/26 |
ns153/4 |
|
غلظت |
2 |
043/12 |
022/6 |
*952/0 |
|
زمان × غلظت |
4 |
005/275 |
751/68 |
**872/10 |
|
خطا |
18 |
827/113 |
324/6 |
|
|
کل |
26 |
396/453 |
|
|
**: معنیدار بودن در سطح احتمال 1 درصد *: معنیدار بودن در سطح احتمال 5 درصد ns: معنیدار نبودن
بررسی بیان ژن STR
مقایسه میانگین دادههای مربوط به بیان ژن STR در زمانها و غلظتهای مختلف نانواکسید روی اختلاف معنیدار در سطح 1 درصد نشان داد. در بازه زمانی 8 ساعت همه تیمارهای غلظتی نانواکسید روی (5/0، 75/. و 1 میلیگرم در لیتر) باعث افزایش بیان ژن STR شدند. بیشترین بیان مربوط به غلظت 5/0 میلیگرم در لیتر و پس از آن غلظتهای 1 و 75/0 میلیگرم در لیتر بود. در زمان 24 ساعت پس از اعمال تیمارها، غلظتهای 5/0 و 1 میلیگرم در لیتر نانواکسید روی باعث افزایش در بیان ژن شدند ولی غلظت 75/0 میلیگرم در لیتر باعث کاهش بیان ژن شد در بازه زمانی 48 ساعت، نانواکسید روی در همه غلظتها باعث افزایش در بیان ژن شد. بیشترین افزایش بیان بهترتیب مربوط به غلظت 5/0، 1 و 75/0 میلیگرم در لیتر بود. نانواکسید کبالت در بازه های زمانی و غلظتهای مختلف اثر چشمگیری از خود نشان نداد. تنها در غلظتهای 5/0 میلیگرم در لیتر و 8 ساعت و غلظت 75/0 میلیگرم در لیتر و 24 ساعت باعث افزایش جزئی در بیان ژن شد.
میزان بیان ژن STR و مقایسه میانگین تیمارهای مختلف از نظر شدت نسبی باند برای این ژن در تمام زمانها تحت تأثیر نانواکسید روی و کبالت در شکل 1 آمده است.
شکل 1: مقایسه میانگین تیمارهای مختلف از نظر شدت نسبی باند برای ژن STR در تمام زمانها، بعد از اعمال الیسیتورها
* حروف متفاوت نشانگر تفاوت معنیدار در آزمون دانکن است.
تجزیه واریانس بیان ژن DAT
مقایسه میانگین دادههای مربوط به بیان ژن DAT با استفاده از نانواکسید روی نشان داد که اثر زمان و همچنین اثر متقابل زمان و غلظت معنیدار شد ولی اثر غلظت معنیدار نشد. در مورد نانواکسید کبالت اثر زمان، غلظت و اثر متقابل زمان و غلظت در سطح 1 درصد معنیدار شد (جدول4 و 5).
جدول 4: مقایسه میانگین بیان ژن DAT تحت تیمارهای مختلف نانواکسید روی در زمانهای مختلف
|
منبع تغییرات (S. O. V) |
درجه آزادی (df) |
مجموع مربعات (SS) |
میانگین مربعات (MS) |
F |
|
زمان |
2 |
835/832 |
417/416 |
**799/16 |
|
غلظت |
2 |
736/160 |
368/80 |
ns242/3 |
|
زمان × غلظت |
4 |
206/331 |
802/82 |
*340/3 |
|
خطا |
18 |
195/446 |
789/24 |
|
|
کل |
26 |
972/1770 |
|
|
**: معنیدار بودن در سطح احتمال 1 درصد *: معنیدار بودن در سطح احتمال 5 درصد ns: معنیدار نبودن
جدول 5: مقایسه میانگین بیان ژن DAT تحت تیمارهای مختلف نانواکسید کبالت در زمانهای مختلف
|
منبع تغییرات (S. O. V) |
درجه آزادی (df) |
مجموع مربعات (SS) |
میانگین مربعات (MS) |
F |
|
زمان |
2 |
789/1 |
894/0 |
**730/6 |
|
غلظت |
2 |
204/10 |
102/5 |
**393/38 |
|
زمان × غلظت |
4 |
047/44 |
012/11 |
**859/82 |
|
خطا |
18 |
392/2 |
133/0 |
|
|
کل |
26 |
432/58 |
|
|
**: معنیدار بودن در سطح احتمال 1 درصد
بررسی بیان ژن DAT
در زمان 8 ساعت بعد از اعمال تیمار، نانواکسید روی در همه غلظتها باعث افزایش بیان ژن شد. بیشترین افزایش بیان بهترتیب مربوط به غلظتهای 1، 5/0 و غلظت75/0 میلیگرم در لیتر بود. در بازه زمانی 24 ساعت، هر سه غلظت مورد استفاده نانواکسید روی بیان ژن DAT را افزایش دادند. بیشترین بیان مربوط به غلظت 5/0 و پس از آن بهترتیب مربوط به غلظتهای 1 و 75/0 میلیگرم در لیتر بود. در زمان 48 ساعت پس از اعمال تیمارها، همه تیمارهای نانواکسید روی بیان ژن DAT را افزایش دادند. غلظت 5/0 میلیگرم در لیتر بیشترین تأثیر را بر بیان این ژن داشت. نانواکسید کبالت بیان ژن DAT را نسبت به شاهد کاهش داد تنها در غلظت 75/0 میلیگرم در لیتر پس از 8 ساعت و غلظت 1 میلیگرم در لیتر پس از 24 ساعت بیان ژن را تا حد کمی افزایش داد ولی غلظتها و بازه های زمانی دیگر بر بیان ژن DAT تأثیر منفی داشتند (شکل 2).
شکل 2: مقایسه میانگین تیمارهای مختلف از نظر شدت نسبی باند برای ژن DAT در تمام زمانها، بعد از اعمال الیسیتورها
* حروف متفاوت نشانگر تفاوت معنیدار در آزمون دانکن است.
تجزیه واریانس بیان ژن D4H
مقایسه میانگین دادههای مربوط به بیان ژن D4H با استفاده از نانواکسید روی نشان داد که اثر زمان، غلظت و همچنین اثر متقابل زمان و غلظت معنیدار شد. در مورد نانواکسید کبالت اثر زمان معنیدار نبود و اثر غلظت و اثر متقابل زمان و غلظت در سطح 1 درصد معنیدار شد (جدول6 و 7).
جدول 6: مقایسه میانگین بیان ژن D4H تحت تیمارهای مختلف نانواکسید روی در زمانهای مختلف
|
منبع تغییرات (S. O. V) |
درجه آزادی (df) |
مجموع مربعات (SS) |
میانگین مربعات (MS) |
F |
|
زمان |
2 |
870/625 |
935/312 |
**376/13 |
|
غلظت |
2 |
725/14/1494 |
362/747 |
**944/31 |
|
زمان × غلظت |
4 |
010/318 |
503/79 |
*398/3 |
|
خطا |
18 |
126/421 |
396/23 |
|
|
کل |
26 |
731/2859 |
|
|
**: معنیدار بودن در سطح احتمال 1 درصد *: معنیدار بودن در سطح احتمال 5 درصد
جدول 7: مقایسه میانگین بیان ژن D4H تحت تیمارهای مختلف نانواکسید کبالت در زمانهای مختلف
|
منبع تغییرات (S. O. V) |
درجه آزادی (df) |
مجموع مربعات (SS) |
میانگین مربعات (MS) |
F |
|
زمان |
2 |
942/3 |
971/1 |
ns201/1 |
|
غلظت |
2 |
907/68 |
454/34 |
**994/20 |
|
زمان × غلظت |
4 |
181/108 |
045/27 |
**480/16 |
|
خطا |
18 |
540/29 |
641/1 |
|
|
کل |
26 |
571/210 |
|
|
**: معنیدار بودن در سطح احتمال 1 درصد ns: معنیدار نبودن
بررسی بیان ژن D4H
در مورد نانواکسید روی در زمان 8 ساعت پس از اعمال تیمار، هر سه غلظت 5/0، 75/0 و 1 میلیگرم در لیتر بیان ژن D4H را افزایش دادند. بیشترین افزایش مربوط به غلظت 5/0 میلیگرم در لیتر بود در بازه زمانی 24 ساعت، نانواکسید روی در غلظت 75/0 باعث کاهش بیان ژن D4H شد و در دو غلظت دیگر بیان ژن را افزایش داد. در بازه زمانی 48 ساعت، نانواکسید روی در هر سه غلظت، بیان ژن D4H را افزایش داد و بیشترین بیان مربوط به غلظت 5/0 میلیگرم در لیتر بود. نانواکسید کبالت بیان ژن را در تمام غلظت ها و بازههای زمانی یا اثری بر بیان ژن نشد یا اثر کاهشی داشت (شکل 3).
شکل 3: مقایسه میانگین تیمارهای مختلف از نظر شدت نسبی باند برای ژن D4H در تمام زمانها، بعد از اعمال الیسیتورها
* حروف متفاوت نشانگر تفاوت معنیدار در آزمون دانکن است.
بحث
در این مطالعه مشخص شد که هر سه ژن STR، DAT وD4H تحت تأثیر نانوذرات قرار میگیرند. Liu و همکاران (1) در مطالعهای به بررسی اثرات UV روی تولید آلکالوئیدها و همچنین تأثیرآن روی بیان ژنهای درگیر در مسیر تولید ترپنوئید ایندول آلکالوئیدها در برگ پروانش پرداختند. در مطالعه آنها برای بررسی بیان ژنها از SQ-RT-PCR استفاده شد. تفاوت معنیداری در بیان ژنهای TDC، STR، D4H و DAT بین نمونههای تیمار و شاهد مشاهده شد. بیان ژن STR در زمان 72 ساعت پس از تیمار افزایش و بیان این ژن در زمانهای 6، 12و 24 ساعت پس از تیمار کاهش یافت. بیان ژنهای DAT و D4H در زمان 12 و 72 ساعت پس از تیمار افزایش و در سایر زمانها کاهش یافت. نتایج این پژوهش نیز مشخص کرد که نانواکسید روی، بیان ژن STR را در همه غلظتها افزایش داد. تنها استثنا در این مورد غلظت 75/0 میلی گرم در لیتر پس از 24 ساعت بود که باعث کاهش بیان شد. نانواکسید کبالت اثر متفاوتی از خود نشان داد. بهطوریکه باعث کاهش معنیدار در بیان ژن شد. درست در نقطه مقابل نانو اکسید روی، نانو اکسید کبالت در غلظت 75/0 میلی گرم در لیتر پس از 24 ساعت باعث افزایش بیان ژن STR شد اما این کاهش بیان معنیدار نبود. در مورد ژن DAT، هر دو نانو ذره اکسید روی و کبالت رفتارهای مشابه مورد ژن STR از خود نشان دادند. یعنی نانو اکسید روی توانست بیان ژن STR را افزایش دهد اما در مورد نانواکسید کبالت باعث کاهش بیان ژن DAT شد. نانو اکسید روی توانست بیان ژن STR را در چند غلظت تا شدت نسبی 60 بالا ببرد اما این افزایش برای ژن DAT ، تا شدت نسبی حدود 40 بود. یعنی اثر نانواکسید روی بر ژن STR بیشتر از اثر آن بر ژن DAT بود. اما بههر صورت نانو اکسید کبالت در هر دو مورد بیان ژنهای STR و DAT را کاهش داد. مشابه با ژن DAT، نانو ذره اکسید روی در همه غلظتها بیان ژن D4H را افزایش داد. اما تنها در زمان 24 ساعت و غلظت 75/0 باعث کاهش بیان این ژن شد. مانند دو ژن دیگر نانواکسید کبالت بیان ژن D4H را نیز کاهش داد. نتایج شعبانی و همکاران (17) مشخص کرد که بیان ژن DAT در اثر تیمار با اتیلن در 6 ساعت پس از تیمار 2/5 برابر شاهد بود. پس از 12 ساعت میزان بیان این ژن به نصف شاهد رسید. در 24 ساعت بعد از تیمار، میزان بیان در مقایسه با شاهد افزایش 4/1 برابری را نشان داد. در 48 ساعت میزان بیان این ژن افزایش 05/1 را نسبت به شاهد نشان داد. در زمان 72 ساعت سطح بیان این ژن کاهش و به 8/0 شاهد خود رسید. این یافتهها با نتایج این پژوهش در زمانهای 8، 24 و 48 ساعت توسط نانواکسید روی برای ژن DAT مشابه بود که بیان این ژن افزایش یافت. بیشترین میزان بیان ژن DAT مطابق نتایج شعبانی و همکاران (17) در زمان 6 ساعت پس از تیمار بود که این نتیجه با نتایج این پژوهش مطابقت داشت که بیشترین میزان بیان این ژن در زمان 8 ساعت پس از تیمار یعنی ساعتهای اولیه پس از تیمار بود. در تحقیق دیگری بررسی بیان ژن DAT در ریشههای موئین پروانش نشان داد که لاینهای مختلف ریشه موئین در مقایسه با کشتهای ریشه موئین شاهد، سطح بیان بیشتری از ژن DAT را دارند (18). بررسی اثرات متیل جاسمونیک اسید (MeJA) بر متابولیسم ترپنوئید ایندول آلکالوئیدها (TIAs) و بیان ژن در گیاهچههای پروانش نشان داد که ترپنوئید ایندول آلکالوئیدها تغییرات معنیداری در مقدار و زمان القا نشان میهند. بیشترین میزان بیان ژن D4H در زمان 5/0 ساعت بعد از تیمار و غلظت 2 میلیمولاربود که نزدیک دو برابر شاهد بود. افزایش معنیدار در بیان ژن STR در زمان 3 ساعت بعد از تیمار بود که این افزایش در زمانهای 6، 12 و 24 ساعت نیز ادامه داشت. بعد از 24 ساعت بیان این ژن کاهش داشت (4). در این مطالعه نیز مشخص شد که ژن STR در زمان 48 ساعت توسط نانو اکسید روی افزایش بیان داشت که با نتایج Wei (4) مغایرت داشت. در تحقیق دیگری Zhang و همکاران (19) تأثیر نانوذرات نقره را بر افزایش تولید متابولیتهای ثانویه در گیاه Artemisia annua بررسی کردند. نانوذرات نقره بهعنوان الیسیتور به محیط کشت ریشههای موئین این گیاه افزوده شد. در این مطالعه محتوای آرتمیزینین از mg/g 67/1 وزن خشک به mg/g 86/2 تغییر یافت. آنها به این نتیجه رسیدند که از نانوذرات نقره میتوان بهعنوان یک الیسیتور موثر برای تولید متابولیتهای ثانویه در گیاهان استفاده کرد. با توجه به این یافتهها و نتایج قبلی بهنظر میرسد که افزایش در بیان این ژنها تحت تأثیر الیسیتورهای مورد استفاده، ناشی از این امر باشد که گیاه برای مقابله با تنش از راهکار افزایش تولید متابولیت ثانویه استفاده میکند. متابولیتهای ثانویه دارای عملکردهای اکولوژیکی مهم در گیاه هستند. محققین با استفاده از افزایش تولید متابولیت ثانویه سعی میکنند تا شواهد بیشتری در رابطه با چگونگی بیوسنتز متابولیتها و نیز مکانیسم تنظیمی آن بهدست آورند. مطالعات Dutta و همکاران (14) در بررسی همبستگی بین بیان ژنهای مسیر ترپنوئید ایندول آلکالوئید (TIAs ) و تولید و تجمع آلکالوئیدها نشان داد که همبستگی مثبتی بین فراوانی رونویسی و تجمع آلکالوئیدهای مربوطه در ژنوتیپهای مختلف وجود دارد. بهدلیل محدودیتهای بیولوژیکی و تکنولوژی، کشت سلولی گیاه پروانش هنوز نمیتواند بهصورت تجاری برای تولید آلکالوئیدهای مهم دارویی مثل وینبلاستین، کاتارانتین، آجمالیسین و سرپنتین بهکار گرفته شود. مقدار کم این ترکیبات در کشت سلولی یکی از محدودیتهای اصلی است. بنابراین بسیاری از روشها برای بهبود تولید ایندول آلکالوئیدها در کشت سلولی پروانش استفاده میشود (10). مطالعه حاضر در جهت افزایش بیان ژنهای STR، DAT و D4H نیز در راستای تحقق این اهداف است. هر سه این ژنها در پاسخ به تنشها افزایش بیان نشان میدهند و در بالا بردن زیست ساخت آلکالوئیدهایی مانند ویندولین نقش دارند. بهعنوان نمونه Mao Jun و Fang (20) توانستند با انتقال ژن Bax واکنش فوق حساسیت در گیاه پروانش ایجاد کنند و در نتیجه باعث افزایش بیان ژن STR شوند. در مطالعه دیگری (21) دو ژن D4H و DAT در گیاه پروانش تحت تنش خشکی افزایش یافتند. همچنین افزایش بیان این دو ژن با بالا رفتن ویندولین در گیاه پروانش همراه بود (22). وجود الیسیتور در محیط میتواند بهعنوان یک عامل تنشی برای گیاه عمل کرده و سبب افزایش فعالیت سیستم دفاعی گیاه در غلظتهای مختلف الیسیتور و در نتیجه باعث تحریک بیان برخی ژنها و تولید متابولیتهای ثانویه گیاه شود.
در این پژوهش نیز نانو اکسید روی باعث افزایش بیان ژنهای STR، DAT و D4H شد که میتوان بنا بر اطلاعات ذکر شده انتظار بالا رفتن میزان متابولیتهای ثانویهای مانند وین بلاستین و وین کریستین را نیز داشت.
تشکر و قدردانی
این پژوهش با کمک مالی گروه بیوتکنولوژی دانشگاه بین المللی امام خمینی (ره) انجام شد که بدین وسیله قدر دانی میشود.
منابع
- Liu Y, Zhao D, Zu YT, Jiang, Y, et al. Effects of low light on terpenoid indole alkaloid accumulation and related biosynthetic pathway gene expression in leaves of Catharanthus roseus seedlings. Botanical Studies. 2010; 52: 191-196.
- Mujib A, Ilah A, Aslam J, Fatima S, et al. Catharanthus roseus alkaloids: application of biotechnology for improving yield. Plant Growth Regulation. 2012; 68 (2): 111-127.
- Omid Beigi R. Production and Processing of Medicinal Plants. Astan Ghods Razavi Publications. 2005;3(15): 81-93.
- Wei S. Methyl jasmonic acid induced expression pattern of terpenoid indole alkaloid pathway genes in Catharanthus roseus seedlings. Plant Growth Regulation. 2010; 61 (3): 243-251.
- Liu DH, Ren WW, Cui LJ, Zhang LD, et al. Enhanced accumulation of catharanthine and vindoline in Catharanthus roseus hairy roots by overexpression of transcriptional factor ORCA2. African Journal of Biotechnology. 2011; 10 (17): 3260-3268.
- Vanisree M, Lee CY, LO SF, Nalawade SM, et al. Studies on the production of some important secondary metabolites from medicinal plants by plant tissue cultures. Botanical Bulletin of Academia Sinica. 2004; 45(1): 1-22.
- Esmaeil Zadeh- Behabadi S, Sharifi M. Increasing plant secondary metabolites using bioelicitors. Cell and Tissue. 2013; 4 (2) 119-128.
- Omidi M, Farzin N. Biotechnologic strategies for enhancing medicinal plants efficiency. 2009; Regional Conference on Drug and Food.
- Ramani S, Jayabaskaran C. Enhanced catharanthine and vindoline production in production in suspension cultures of Catharanthus roseus by ultraviolet-B light. Journal of Molecular Signaling. 2008; 3: 90. Doi: 10.1186/1750-2187-3-9.
- Zhao J, Zhu WH, Hu Q, HE XW. Enhanced indole alkaloid production in suspension compact callus clusters of Catharanthus roseus: impacts of plant growth regulators and sucrose. Plant Growth Regulation. 2001; 33(1): 33-41.
- Moreneo PR, Poulsen C, Van Der Heiden R, Verpoorte R. Effects of elicitation on different metabolic pathways in Catharanthus roseus (L.) G. Don cell suspension cultures. Enzyme and Microbial Technology. 1996; 18(2): 99-107.
- Zheng Z, Wu M. Cadmium treatment enhances the production of alkaloid secondary metabolites in Catharanthus roseus. Plant Science. 2004; 166(2): 507-514.
- Facchini P J. Alkaloid biosynthesis in plants: biochemistry, cell biology, molecular regulation, and metabolic engineering applications. Annual Review of Plant Biology. 2001; 52(1): 29-66.
- Dutta A, Batra J, Pandey-Rai S, Singh HD, et al. Expression of terpenoid indole alkaloid biosynthetic pathway genes corresponds to accumulation of related alkaloids in Catharanthus roseus (L.). Planta. 2005; 220(3): 376-383.
- Makhzoum A, Pett-Paly G, Pierre BS, Bernards MA. Functional analysis of the DAT gene promoter using transient Catharanthus roseus and stable Nicotiana tabacum transformation systems. Plant Cell Reports. 2011; 30(7): 1173-1182.
- Ahmadi J, Mohammadi R, Garoosi G, Hosseini R. Callogenesis and cell suspension optimisation in periwinkle (Catharantus roseus). Agricultural Biotechnology. 2012; 4(1): 1-18.
- Shabani M, Farsi M, Mir-Samsi_Kakhki A. Investigation on the effect of ethylene on the expression of DAT, G10H, T16H and AVLBS in periwinkle (Catharanthus roseus). Modern Genetics. 2013; 9(2): 151-160.
- Magnotta M, Murata J, Chen J, De Luca V. Expression of deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase in Catharanthus roseus hairy roots. Phytochemistry. 2007; 68(14): 1922-1931.
- Zhang B, Zheng LP, Li WY, Wang JW. Stimulation of artemisinin production in Artemisia annua hairy roots by Ag-SiO2 core-shell nanoparticles.Current Nanoscience. 2013; 9(3): 363-370.
- Jun X, Fang D. Enhancing terpenoid indole alkaloid production by inducible expression of mamalian Bax in Catharanthus roseus cells. Science in China. 2007; 50(2): 234-241.
- Mokhtari A, Ahmadi J, Mafakheri S. The expression profile of D4H and DAT genes in Catharanthus roseus in response to drought, salinity and alycylic acid. Iranian Journal of Genetics and Plant Breeding. 2013; 2(2): 38-46.
Wang X, Pan Y, Chang B, Ho Y, et al. Ethylene induced vinblastine accumulation is related to activated expression of downstream TIA pathway genes in Catharanthus roseus. BioMed Research International. vol. 2016, Article ID 3708187, 8 pages, 2016. doi:10.1155/2016/3708187.
- Liu Y, Zhao D, Zu YT, Jiang, Y, et al. Effects of low light on terpenoid indole alkaloid accumulation and related biosynthetic pathway gene expression in leaves of Catharanthus roseus seedlings. Botanical Studies. 2010; 52: 191-196.
- Mujib A, Ilah A, Aslam J, Fatima S, et al. Catharanthus roseus alkaloids: application of biotechnology for improving yield. Plant Growth Regulation. 2012; 68 (2): 111-127.
- Omid Beigi R. Production and Processing of Medicinal Plants. Astan Ghods Razavi Publications. 2005;3(15): 81-93.
- Wei S. Methyl jasmonic acid induced expression pattern of terpenoid indole alkaloid pathway genes in Catharanthus roseus seedlings. Plant Growth Regulation. 2010; 61 (3): 243-251.
- Liu DH, Ren WW, Cui LJ, Zhang LD, et al. Enhanced accumulation of catharanthine and vindoline in Catharanthus roseus hairy roots by overexpression of transcriptional factor ORCA2. African Journal of Biotechnology. 2011; 10 (17): 3260-3268.
- Vanisree M, Lee CY, LO SF, Nalawade SM, et al. Studies on the production of some important secondary metabolites from medicinal plants by plant tissue cultures. Botanical Bulletin of Academia Sinica. 2004; 45(1): 1-22.
- Esmaeil Zadeh- Behabadi S, Sharifi M. Increasing plant secondary metabolites using bioelicitors. Cell and Tissue. 2013; 4 (2) 119-128.
- Omidi M, Farzin N. Biotechnologic strategies for enhancing medicinal plants efficiency. 2009; Regional Conference on Drug and Food.
- Ramani S, Jayabaskaran C. Enhanced catharanthine and vindoline production in production in suspension cultures of Catharanthus roseus by ultraviolet-B light. Journal of Molecular Signaling. 2008; 3: 90. Doi: 10.1186/1750-2187-3-9.
- Zhao J, Zhu WH, Hu Q, HE XW. Enhanced indole alkaloid production in suspension compact callus clusters of Catharanthus roseus: impacts of plant growth regulators and sucrose. Plant Growth Regulation. 2001; 33(1): 33-41.
- Moreneo PR, Poulsen C, Van Der Heiden R, Verpoorte R. Effects of elicitation on different metabolic pathways in Catharanthus roseus (L.) G. Don cell suspension cultures. Enzyme and Microbial Technology. 1996; 18(2): 99-107.
- Zheng Z, Wu M. Cadmium treatment enhances the production of alkaloid secondary metabolites in Catharanthus roseus. Plant Science. 2004; 166(2): 507-514.
- Facchini P J. Alkaloid biosynthesis in plants: biochemistry, cell biology, molecular regulation, and metabolic engineering applications. Annual Review of Plant Biology. 2001; 52(1): 29-66.
- Dutta A, Batra J, Pandey-Rai S, Singh HD, et al. Expression of terpenoid indole alkaloid biosynthetic pathway genes corresponds to accumulation of related alkaloids in Catharanthus roseus (L.). Planta. 2005; 220(3): 376-383.
- Makhzoum A, Pett-Paly G, Pierre BS, Bernards MA. Functional analysis of the DAT gene promoter using transient Catharanthus roseus and stable Nicotiana tabacum transformation systems. Plant Cell Reports. 2011; 30(7): 1173-1182.
- Ahmadi J, Mohammadi R, Garoosi G, Hosseini R. Callogenesis and cell suspension optimisation in periwinkle (Catharantus roseus). Agricultural Biotechnology. 2012; 4(1): 1-18.
- Shabani M, Farsi M, Mir-Samsi_Kakhki A. Investigation on the effect of ethylene on the expression of DAT, G10H, T16H and AVLBS in periwinkle (Catharanthus roseus). Modern Genetics. 2013; 9(2): 151-160.
- Magnotta M, Murata J, Chen J, De Luca V. Expression of deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase in Catharanthus roseus hairy roots. Phytochemistry. 2007; 68(14): 1922-1931.
- Zhang B, Zheng LP, Li WY, Wang JW. Stimulation of artemisinin production in Artemisia annua hairy roots by Ag-SiO2 core-shell nanoparticles.Current Nanoscience. 2013; 9(3): 363-370.
- Jun X, Fang D. Enhancing terpenoid indole alkaloid production by inducible expression of mamalian Bax in Catharanthus roseus cells. Science in China. 2007; 50(2): 234-241.
- Mokhtari A, Ahmadi J, Mafakheri S. The expression profile of D4H and DAT genes in Catharanthus roseus in response to drought, salinity and alycylic acid. Iranian Journal of Genetics and Plant Breeding. 2013; 2(2): 38-46.
Wang X, Pan Y, Chang B, Ho Y, et al. Ethylene induced vinblastine accumulation is related to activated expression of downstream TIA pathway genes in Catharanthus roseus. BioMed Research International. vol. 2016, Article ID 3708187, 8 pages, 2016. doi:10.1155/2016/3708187.
)