استفاده از الیسیتورها در پژوهش­های مربوط به زیست فناوری متابولیت­های ثانوی گیاهی دو هدف اصلی را دنبال می­کند: نخست کسب یافته­هایی در زمینه مسیرهای بیوسنتزی که منجر به تشکیل و تنظیم متابولیت‏های ثانوی می­شود. دوم افزایش تولید متابولیت‏های ثانوی برای کاربرد تجاری.

در منابع مختلف تقسیم بندی­های متفاوتی برای الیسیتورها آمده است که در ادامه به آنها اشاره می­شود.

الیسیتورهای بیرونی: الیسیتورهایی هستند که از مواد ترشح شده به بیرون سلول مانند پلی­ساکاریدها، پلی‏آمین‏ها و اسیدهای چرب به‏دست می­آیند.

الیسیتورهای درونی: شامل مواد ترشح شده از درون سلول مانند گالاکتورونید و هپتا ـ بتا ـ گلوکوزید هستند.

الیسیتورها بر اساس برهم کنش الیسیتور-گیاه به دو گروه الیسیتورهای عمومی و الیسیتورهای ویژه نژادی تقسیم­بندی می‏‏شوند. الیسیتورهای عمومی باعث القا پاسخ­های دفاعی هم در گیاه میزبان و هم در گیاه غیرمیزبان می‏شوند، در حالی‏که الیسیتورهای ویژه نژادی پاسخ‏های دفاعی مقاومت به بیماری را تنها در میزبان­های ویژه بسته به حضور هم­زمان ژن­های غیربیماری­زا (Avirulence Genes “avr genes”) در پاتوژن و ژن‏های مقاومت (Resistance Genes “R genes”) در گیاه القا می­کنند (28 و 30).

در دیگر دسته­بندی رایج، الیسیتورها براساس طبیعت­شان به الیسیتورهای زیستی (Biotic) و الیسیتورهای غیرزیستی (Abiotic) طبقه­بندی می­شوند:

الف) الیسیتورهای زیستی

الیسیتورهای زیستی مولکول­هایی از پاتوژن­ها یا خود میزبان می­باشند که می­توانند باعث القای پاسخ­های دفاعی شوند. این مولکول­ها به ترکیباتی اطلاق می­شود که به‏وسیله عمل آنزیم­های گیاهی روی دیواره سلولی میکروارگانیسم­ها ساخته می­شوند. الیسیتورهای زیستی همچنین شامل ترکیبات طبیعی هستند که به‏وسیله سلول­های گیاهی در پاسخ به تحریک کننده­های مختلف تولید می­شوند. به‏عنوان نمونه می­توان از عصاره مخمر، ترکیبات پلی ساکاریدی دیواره سلولی، الیگوساکاریدها، پروتئین­ها، گلیکوپروتئین­ها و اسیدهای چرب نام برد (31).

ب) الیسیتورهای غیرزیستی

الیسیتورهای غیرزیستی شامل پرتو فرابنفش، فلزات سنگین، ترکیبات غیرضروری محیط کشت و بسیاری از موارد دیگر می‏گردند. الیسیتورهای غیرزیستی تحریک­کننده­های تولید فیتوآلکسین­ها بوده و از آن­ها در گیاهان زیادی به منظور افزایش متابولیت­های ثانویه استفاده گردیده است (25 و 31). در این مقاله افزایش تولید برخی از متابولیت­های ثانویه در کشت سلول گیاهی با استفاده از الیسیتورهای غیرزیستی مورد بررسی قرار می­گیرد.

مکانیسم تحریک در سلول­های گیاهی

الیسیتوربرای یک گیاه به‏عنوان محرک عمل می­کند که می­تواند پاسخ­های فیزیولوژیکی و مورفولوژیکی و تجمع فیتوالکیسن­ها را در گیاه باعث شود. به‏خوبی معلوم شده است که تیمار گیاهان با الیسیتورهامشابه حمله پاتوژن­های ناسازگار موجب بروز آرایشی از عکس العمل­های دفاعی، از قبیل تجمع مجموعه­ای از متابولیت­های ثانویه دفاعی در گیاه سالم یا در کشت­های سلول گیاهی می‏شوند. مکانیسم دقیق تحریک هنوز به‏طور کامل شناخته نشده است، اما مکانسیم­های مختلفی در این خصوص مانند Ca⁺² پیک، فاکتورهای موثر در پیوستگی غشا سلول، ممانعت یا فعالیت مسیرهای بین سلولی و تغییرات در استرس اسموتیکی پیشنهاد شده­اند. بعضی محققان فرض کرده­اند که الیسیتورهابه یک گیرنده غشای پلاسمایی برای فرآیند تحریک متصل می­شوند. کنش­های اصلی در تحریک سلول­ توسط الیسیتورها، اتصال به گیرنده­های پروتئینی خاص در غشای پلاسمایی، کاهش pH سیتوزول و تولید گونه­های اکسیژن­ واکنشگر و در نهایت فعال شدن رونویسی از ژن­های دخیل در فرآیندهای پاسخ دفاعی سلول است (32) .

انتقال الیسیتورها یا سیگنال­ها در سلول­های گیاهی می­تواند مکانیسم­های سودمندی در تولید متابولیت­های ثانویه را القا کند. در این مکانیسم­ها پیامبرهای ثانویه­ای تولید می­شوند که منجر به فعال­سازی آبشارهای پروتئین کیناز می‏شوند که آن­ها نیز به‏نوبه خود قادرند توانایی بیوسنتزی تولیدات گیاهی خاصی را فعال کنند. یک مکانیسم ممکن است برای تحریک زیستی در گیاهان براساس میان­کنش­های گیرنده الیسیتور خلاصه شود. زمانی‏که گیاه یا سلول گیاهی توسط الیسیتور تحریک می­شود، دسته­ای از واکنش­های بیوشیمیایی در چندین مرحله اتفاق می­افتند که در زیر اشاره می­شوند.

1- اتصال الیسیتور به گیرنده غشای پلاسمایی

2- تغییر در جریانات یونی در طول غشا: جریان یون­هایK⁺، Cl^- و Ca⁺² از فضای خارج سلول یا از ذخایر درون سلولی به سیتوپلاسم

3- تغییر سریع در الگوهای فسفریلاسیون پروتئینی، فعالیت پروتئین کیناز، فعالیت پروتئین G و تحریک پروتئین کیناز فعال شده میتوژن (Mitogen Activated Protein Kinase)

4- سنتز فسفولیپازهای A، C و D (PLA، PLCو PLD) و تولید پیامبرهای ثانویه، اینوسیتول 1 و4 و 5 تری فسفات (Inositol 1,4,5 triphosphate) و دی­اسیل­گلیسرول (Diacylglycerol) که از طریق آزادسازی Ca⁺² درون سلولی و مسیر سیگنالی، اکتادکانوئید و نیتریک­اکساید را واسطه­گری می­کنند.

5- تولید گونه­های اکسیژن­ واکنشگر مانند یون سوپراکسید و پراکسید هیدروژن که ممکن است دارای اثرات مستقیم ضدمیکروبی باشند و نیز منجر به تولید مشتقات اسیدچرب فعال زیستی شوند و در اتصال عرضی پروتئین­های غنی از پرولین متصل به دیواره سلول شرکت کنند. پراکسید هیدروژنمی­تواند به‏عنوان یک پیام رسان ثانویه عمل کند و در فعال سازی رونویسی ژن­های دفاعی نقش داشته باشد.

6- اسیدی شدن سیتوپلاسم در اثر غیر فعال شدن H⁺-ATPase، کاهش در قطبیت غشا و افزایش pH خارج سلولی

7- فعال سازی NADPH اکسیداز که باعث تولید ROS و اسیدی شدن سیتوسول می­شود.

8- سازماندهی مجدد غشای سلولی

9- تجمع پروتئین­های مربوط به دفاع یا پروتئین­های مربوط به بیماری­زایی مانند کینازها، گلوکونازها، اندوپلی­گالاکتورونازهایی که منجر به آزاد سازی الیگومرهای پکتیکی پیام دهی می­شوند، گلیکوپروتئین­های غنی از هیدروکسی پرولین و بازدارندهای پروتئازی

10- واکنش حساسیت فوق­العاده (Hypersensitivity) و مرگ سلولی

11- تغییرات ساختمانی در دیواره سلولی (چوبی شدن دیواره سلولی، رسوب کالوس)

12- فعالیت رونویسی ژن­های مربوط به پاسخ دفاعی مانند فنیل­آلانین­ آمونیالاز (Phenylalanine Ammonialyase)، گلوتاتیون ترانسفراز (Glutathione S-transferase) و چالکون سنتاز (Chalcone Synthases). ضمناً مولکول­های دفاعی گیاه مانند تانن­ها و فیتوالکسین 4-2 بعد از تحریک توسط محرک کشف شده­اند.

13- سنتز اسید جاسمونیک و اسید سالیسیک به‏عنوان پیام­رسان­های ثانویه

14- مقاومت اکتسابی سیستمیک (Systemic Acquired Resistance)

آنچه مشخص شده این است که الیسیتورها از طریق گیرنده­های موجود در غشای پلاسمایی دریافت می­شوند و از طریق سیستم­های سیگنالینگ نسخه­برداری و ترجمه (بیان) ژن­های دخیل در بیوسنتز متابولیت­ها را تحت تاثیر قرار می­دهند (33).

نمونه­هایی از کاربرد الیسیتورهای غیرزیستی در تولید متابولیت­های ثانویه گیاهی

 عوامل مختلفی مانند غلظت الیسیتور، سن سلول­ها، نوع محیط کشت، زمان در معرض قراردهی یا افزودن الیسیتور به محیط کشت و مدت زمانی که محیط کشت در معرض الیسیتور قرار می­گیرد، بر تولید متابولیت­های ثانویه تاثیر می­گذارند (34). در بین الیسیتورهای غیرزیستی، الیسیتورهایی که در مقیاس نانو به‏منظور تولید متابولیت‌های ثانوی در کشت سلول­های گیاهی به­کار رفته‌اند دارای جایگاه ارزشمندی می­باشند.

به‏منظور تولید سنگوئینارین و تبائین در سوسپانسیون سلولی مریستم و ریشه گیاه خشخاش از نانو دی­اکسیدتیتانیوم استفاده شد که نتایج حاصل از آن طی 24 ساعت پس از اعمال تیمار افزایش دو آلکالوئید مزبور را تا 1/2 برابر نسبت به شاهد نشان داد (35). همچنین جهت تولید آلوئین در گیاه آلوئه­ورا از دو نانوالیسیتور نقره و دی­اکسیدتیتانیوم استفاده شد و نتایج حاکی از آن بود که دو نانوالیسیتور مذکور طی 48 ساعت پس از اعمال تیمار به­ترتیب باعث افزایش آلوئین به‏میزان 7/43 و 6/11 درصد شدند، اما پس از آن تولید آلوئین تا رسیدن به سطح کنترل کاهش نشان داد (36). اثر نانو نقره بر تقسیم سلولی و شاخص­های میتوزی که خود بر میزان تولید متابولیت­ها موثر می­باشد نیز مورد بررسی قرارگرفته است. در این رابطه محققین از گونه­های گیاهی جنس Allium استفاده کردند و دریافتند که نانونقره به‏صورت معنی­داری شاخص میتوزی را کاهش و دگرگونی ساختاری در کروموزوم را افزایش داد (34 و 35).

اگرچه نانو ذرات به‏راحتی به سیستم بافت گیاهی نفوذ کرده و روی میزان تولید متابولیت­های ثانویه تاثیر مثبت می­گذارند، اما در غلظت­های بالا و حضور طولانی مدت در محیط، به­واسطه کاهش شاخص میتوزی و آزاد کردن یون­های سمی باعث ایجاد مسمومیت سلولی (cytocyctic) می­شوند. چنانکه پیش­تر گفته شد، الیسیتورها در محیط کشت از طریق فعال کردن ژن­های مربوط به مکانیسم­های دفاعی باعث القای تشکیل متابولیت­های ثانویه می­شوند، اما پس از آن پاسخ سلولی نسبت به حضور الیسیتورها (نانوالیسیتورها) منفی بوده و با از بین رفتن نیروی محرک پروتون­ها (Proton-motive force) در عرض غشا، ناپایدار شدن غشا خارجی و آزاد کردن گونه­های اکسیژن­ واکنش‏گر همراه است. گونه­های اکسیژن­ واکنشگر تولید شده ممکن است جزئی از مکانیسم سمیت ژنی (Genotoxic) نانو الیسیتورها باشد که به صورت مستقیم پروتئین­ها را تخریب کرده و یا آنها را برای تجزیه حساس می­کند. در صورت حضور طولانی مدت نانوالیسیتورها در محیط، گونه­های اکسیژن­ واکنش‏گر روی DNA اثر مخرب داشته و منجر به کاهش تولید مواد موثره می­شود (37).

تابش پرتو فرابنفش به­طور معنی­داری باعث افزایش تولید رسوراترول در برگ و میوه و کالوس حاصل از آن­ها و همچنین سوسپانسیون سلولی تعدادی از ارقام انگور گردیده است (38  و 39).

استفاده از اسید سالیسیلیک و محرک­های قارچی روی تولید تاکسول در سوسپانسیون سلولی گیاه سرخدار (Taxus bacata) موثر بوده است. نتایج مطالعات در این خصوص نشان داده است که ترکیب اسید سالیسیک و محرک قارچی روی بیوماس سلول­های گیاه مزبور تاثیر نداشته، اما موجب تولید بیشترین میزان تاکسول شده­اند (40). همچنین در آزمایش دیگری با افزودن پیش­ماده­های موالونات و ان-بنزوئیل گلیسین به کشت سوسپانسیون سلولی گیاه سرخدار میزان تولید تاکسول تا 3 برابر افزایش یافت (41).

تولید 6-متوکسی پودوفیلوتوکسین در کشت سلول یکی از گونه­های وحشی جنس کتان (Linum nodiflorum) تحت تاثیر متیل جاسمونات به‏میزان ده برابر افزایش یافت (36). کاربرد متیل جازمونات همچنین توانسته است تولید رسوراترول را در برگ و میوه و کالوس حاصل از آن­ها و همچنین سوسپانسیون سلولی تعدادی از ارقام انگور به‏میزان قابل توجهی افزایش دهد (42 و 43).

نیترات نقره (AgNO₃) و کلرید کادمیوم (CdCl₂) موجب تحریک تولید تروپان­آلکالوئید­­های اسکوپولامین و هیوسیامین از طریق کشت ریشه­های موئین گیاه تاتوره معطر (Bragmansia candida) شده و باعث افزایش تولید این آلکالوئید­ها شده­اند (44).

 در آزمایشی از سطوح مختلف نیتروژن و بنزیل آدنین به‏منظور تولید آلوئین از گیاه آلوئه­ورا استفاده شد و پس از 12 ماه میزان آلوئین نه تنها با کاربرد هر یک از دو الیسیتور فوق به‏تنهایی افزایش یافت، بلکه کاربرد هم‏زمان آن­ها نیز دارای اثرات متقابل مثبت بود و موجب افزایش بیشتر میزان آلوئین شد (45).

گزارش‏ها نشان داده­اند که با اضافه کردن قندها به‏منظور بهینه­سازی عناصر غذایی محیط کشت، میزان تولید متابولیت ثانویه بالا رفته است (46). در این رابطه، وقتی به­جای 5/2 درصد ساکارز در کشت سلولی گیاه حسن یوسف به‏میزان 5/7 درصد استفاده شد، عملکرد رزمارینیک اسید معادل 4 برابر افزایش یافت.

به‏دلیل اهمیت اقتصادی و افزایش تقاضا برای تولید متابولیت­های ثانویه، محققین به‏دنبال روش­هایی برای تولید هرچه بیشتر و با کیفیت­تر این ترکیبات هستند. بیوتکنولوژی قادر است کارآیی گیاهان دارویی را جهت تولید دارو افزایش دهد. کشت سلول، بافت و اندام­های گیاهی و بهره­گیری از الیسیتورها امکان تولید سریع و انبوه متابولیت­های با اهمیت را فراهم می­سازد. استفاده از الیسیتورها روش مناسبی به‏منظور تولید هر چه بیشتر متابولیت­های ثانوی در شرایط درون شیشه­ای می­باشد. به‏نظر می‏رسد ترکیبات فعال الیسیتورها نقش موثری در القای پاسخ­های دفاعی و افزایش تولید متابولیت­های ثانوی دارند. الیسیتورها بیان ژن را در گیاهان تحت تاثیر قرار داده و با از بین بردن سدهای مهارآنزیمی یا دست‏کاری مسیر آنزیم­ها باعث تغییر در سطح تولید متابولیت­ها می­گردند. همچنین از این طریق می­توان سطح آنزیم­های موثر در مسیر بیوسنتز را اندازه­گیری و جهت کنترل مسیرهای بیوسنتز آنها را شناسایی کرد و روش­های جدیدی در کنترل و تولید متابولیت­ها ارائه نمود.

منابع

1. Sarin R. Useful Metabolites from plant tissue cultures. Biotechnol. 2005; (4): 79-93.

2. Patel H, Krishnamurthy R. Elicitors in plant tissue culture. J. Pharmacog & Phytochem. 2013; 2(2): 60-65.

3. Reynolds, T. Aloe chemistry. In Reynolds T(Ed), the genus Aloe, CRC Press, Boca Raton. Florida, USA. 2004; 39-74.

4. Facchini PJ, St-Pierre B. Synthesis and trafficking of alkaloid biosynthetic enzymes. Curropin in Plant Biol. 2005; 8: 657-666.

5. Zaho J, Davis LC, Verpoorte R. Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites. Biotech Advances. 2005; 23(4), 283-333.

6. Furze JM, Rhodes MJ, Parr AJ, Robins RJ, et al. Abiotic factors elicit sesquiterpenoid phytoalexin production but not alkaloid production in transformed root cultures of Datura stramonium. Plant Cell Reports. 1991; 10(3): 111-114.

7. Smetanska I. Production of secondary metabolites using plant cell culture. Advances in Biochem Eng Biotech. 2008; 111: 187-228.

8. Rao SR, Ravishankar GA. Plant cell cultures: chemical factories of secondary metabolites. Biotech Advances. 2002; 20 (2): 101-153.

9. Dewick PM.Medicinal natural products. A biosynthetic approach. Second edition,Wiley. 2002; 7: 121-140.

10. Taiz L, Zeiger E. Plant physiology, 4^th Ed. Sinauer Associates Inc. Sunderland, Massachusetts.USA; 2006; 260-287.

11. Sangwan NS, Farooqi AH, Shabih F, Sangwan RS. Regulation of essential oil production in plants. Plant Growth Regul. 2011; 34:21-34.

12. Yin L, Cheng Ying w, Espinasse B, Colman A, et al. More than the Irons: The effects of silver nanoparticles on Lolium multiform. Environ Sci & Technol. 2011; 45(1): 2360-2367.

13. Anterola AM, Jeon JH, Davin LB.Transcriptional control of monolignol biosynthesis in Pinus taeda. J Biol Chem. 2002; 227(21): 18272-18280.

14. Zhao JL, Zhou LG, Wu JY. Effects of biotic and abiotic elicitors on cell growth and tanshinone accumulation in Salvia miltiorrhiza cell cultures. Applied Microb & Biotech. 2010; 87(1): 137-144.

15. Mulabagal V, Tsay HS. Plant cell cultures, an alternative and efficient source for the production of biologically important secondary metabolites. Int J of Applied Sci & Eng. 2004; 2(1): 29-48.

16. Bladi A, Dixit VK. Yield enhancement Strategies for artemisinin production by suspension culture of Artemisia annua. Bioresource Technol. 2008; (99): 4609-4614.

17. Roberts SC, Shuler ML. Large-scale plant cell culture. Current Opinion in Biotech. 1997; (8): 154-159.

18. Matkowski A. Plant in vitro culture for the production of antioxidants. A review. Biotech Advance. 2008; (26): 548-560.

19. Saadat SS, Piri Kh, Esna-Ashari M, Gholami M, et al. Production and Realease of Tropane Alkaloids from Deadly Nighushade (Atropa belladonna L.) in Hydroponic Condition. Plant Production Tech. 2011; (11): 25-32.

20.Dellapenna D. Plant Metabolic Engineering . Plant Physiol. 2000; 125:160-163.

21. Bourgaud F, Gravot A, Goniter E. Production of plant secondary metabolites. Plant Science. 2002; 161(5): 839-851.

22. Dhawan OP, Lavania UC. Enhancing the productivity of secondary metabolites via induced polyploidy: a review. Euphytica. 1996; 87: 81 - 9.

23. Jasus-Gonzalez LDE, Weathers PJ. Tetraploid Artemisia annua hairy roots produce more artemisinin than diploid. Plant Cell Reports. 2003; 21(8): 809-813.

24. Niimi  H, Watenabe M,  Serizawa  H, et al. Amiprophosmethyl- induced  efficient  in vitro production of polyploids in Raphano brassica with the aid of aminoethoxyvinylyglycine (AVG) in the culture medium. Breeding Science.2015; 65(5):396-402.

25. Zhao DX, Fu CX, Han YS, Lu DP. Effects of elicitation on jaceosidin and hispidulin production in cell suspension cultures of Saussurea medusa. Process Biochem. 2005; 40(2): 739-745.

26.  Radman R, Saez T, Bucke C, Keshavarz T. Elicitation of plants and microbial cell systems. Biotech & Applied Biochem. 2003; 37(1): 91-102.

27. Ramachandra CT, Srinivasa Rao P. Processing of Aloe vera Leaf Gel :A Review .Am J Agric & Bio Sci. 2008; 3(2): 502-51.

27. Zhang C, Yan Q, Cheuk WK, Wu J. Enhancement of tanshinone production in Salvia miltiorrhiza hairy root culture by Ag+ elicitation and nutrient feeding. Planta Medica. 2004; 70(2): 147-151.

28. Zhang C, Yan Q, Cheuk WK, Wu J. Enhancement of tanshinone production in Salvia miltiorrhiza hairy root culture by Ag+ elicitation and nutrient feeding. Planta Medica. 2004; 70(2): 147-151.

29. Howlett B. Secondary metabolites toxins and nutrition of plant pathogenic Fungi. Current Opinion in Biotech. 2006; 9(4): 371-375.

30. Zhang Y, Mian MR, Bouton JH. Recent Molecular and Genomics Studies on Stress Tolerance of Forage and Turf Grasses. Crop Science. 2006; 46: 497-511.

31. Choi HK, Yun JH, Kim SL, Son JS, et al. Enhanced production of paclitaxel by semi-continuous batch process (SCBP) in suspension culture of Taxus chinensis. Enzyme and Micro Tech. 2001; 29: 583-586.

32. Pitta-Alvarez SI, Spollansky TC, Giulietti AM. The influence of different biotic and abiotic nitrogen metabolism of growing spinach. Biol Trace Element Res. 2000; 110(2): 179-190.

33. Lee-Sae N, Kerdchoechuen O, Laohakunjit N. Effect of ammonium nitrate on cell growth and production of phenolic compounds in cell suspension cultures of Vitis vinifera. Aric Sci l. 2011; 42(2): 249-252.

34. Bota C, Deliu C. The effect of copper sulphate on the production of flavonoids in Digitalis lanata cell cultures. Farmacia. 2011; 59(1): 113-118.

35. Khodayari M, Omidi M, Boushehri AK, Yazdani D, et al. Effect of biotic and nano elicitors on enhancement of alkaloids in Papaver somniferum L. Iranian J Hort Sci. 2014; 14(45): 287-295.

36. Raei M, Angaji SAH, Omidi M, Khodayari M. Effect of abiotic elicitors on tissue culture of Aloe vera. Int J Biosci. 2014; 5(1): 74-81.

37. Lok CN, Ho C, Chen R, He QY, et al. Proteomics analysis of the mode of antibacterial action of silver nanoparticles. J Proteomic Res. 2007; 5(4): 916-24.

38. Esna-Ashari M, Mahmoudi Pour A. Ultra violet irradiation enhances resveratrol production in organs and cell suspension cultures of two Iranian grape cultivars. Food. 2010; 1: 23-26.

39. Esna-Ashari A, Mahmoudi Pour A, Karami O. The effect of UV irradiation on resveratrol production in leaf and fruit of two Iranian grape (Vitis vinifera L.) cultivars. Iranian J Hort Sci. 2008; 1: 2-10.

40. Long-Jiang Y, Wen-Zhi L, Wen-Min Q, Hui-Bi Xu. Effects of Salicylic acid on fungal elicitor-induced membrane-lipid peroxidation and Taxol production in cell suspension cultures of TaxusChinensis. J Process Biochem. 2010; 370: 477-482.

41. Cusido RM, Palazon J, Bonfill M, Navia Osorio A, et al. Improved paclitaxel and baccatin III production suspension culture of Taxus media. Biotech Progress. 2002; 18(3): 418-423.

42. Esna-Ashari M, Mahmoudi Pour A. Effect of methyl jasmonate on resveratrol production in organs and cell suspension cultures of two Iranian grapevine (Vitis vinifera L.) cultivars. J Hort Sci & Biotech. 2011; 6(8): 557-562.

43. Esna-Ashari M, Mahmoudi Pour A, Karami O, Hesari M. Changes in the amount of resveratrol in leaf and fruit and the possible effect of methyl jasmonate on it in two Iranian grape (Vitis vinifera L.) cultivars. J Sci & Tech Agric & Nat Reso. 2008; (45): 571-579.

44. Radman R, Saez T, Bucke  C, Keshavarz T. Elicitation of plant and microbial systems. Biotech & Applied Biochem. 2003; 37: 91-102.

45. Hazrati S, Tahmasebi Z, Babaei A. Enhancaing yield and aloin concentration of Aloe vera plants by stimutaneous application of N and benzyladenine. J Med Plant Res. 2010; 6(10): 1834-1841.

46. Misava M. Production of useful plant metabolites. In: Flechter A, editors. Adv. Biochem.Eng.Biotechnol. Berlin:springer-verlag. 1985; 59-88.

استفاده از الیسیتورها در پژوهش­های مربوط به زیست فناوری متابولیت­های ثانوی گیاهی دو هدف اصلی را دنبال می­کند: نخست کسب یافته­هایی در زمینه مسیرهای بیوسنتزی که منجر به تشکیل و تنظیم متابولیت‏های ثانوی می­شود. دوم افزایش تولید متابولیت‏های ثانوی برای کاربرد تجاری.

در منابع مختلف تقسیم بندی­های متفاوتی برای الیسیتورها آمده است که در ادامه به آنها اشاره می­شود.

الیسیتورهای بیرونی: الیسیتورهایی هستند که از مواد ترشح شده به بیرون سلول مانند پلی­ساکاریدها، پلی‏آمین‏ها و اسیدهای چرب به‏دست می­آیند.

الیسیتورهای درونی: شامل مواد ترشح شده از درون سلول مانند گالاکتورونید و هپتا ـ بتا ـ گلوکوزید هستند.

الیسیتورها بر اساس برهم کنش الیسیتور-گیاه به دو گروه الیسیتورهای عمومی و الیسیتورهای ویژه نژادی تقسیم­بندی می‏‏شوند. الیسیتورهای عمومی باعث القا پاسخ­های دفاعی هم در گیاه میزبان و هم در گیاه غیرمیزبان می‏شوند، در حالی‏که الیسیتورهای ویژه نژادی پاسخ‏های دفاعی مقاومت به بیماری را تنها در میزبان­های ویژه بسته به حضور هم­زمان ژن­های غیربیماری­زا (Avirulence Genes “avr genes”) در پاتوژن و ژن‏های مقاومت (Resistance Genes “R genes”) در گیاه القا می­کنند (28 و 30).

در دیگر دسته­بندی رایج، الیسیتورها براساس طبیعت­شان به الیسیتورهای زیستی (Biotic) و الیسیتورهای غیرزیستی (Abiotic) طبقه­بندی می­شوند:

الف) الیسیتورهای زیستی

الیسیتورهای زیستی مولکول­هایی از پاتوژن­ها یا خود میزبان می­باشند که می­توانند باعث القای پاسخ­های دفاعی شوند. این مولکول­ها به ترکیباتی اطلاق می­شود که به‏وسیله عمل آنزیم­های گیاهی روی دیواره سلولی میکروارگانیسم­ها ساخته می­شوند. الیسیتورهای زیستی همچنین شامل ترکیبات طبیعی هستند که به‏وسیله سلول­های گیاهی در پاسخ به تحریک کننده­های مختلف تولید می­شوند. به‏عنوان نمونه می­توان از عصاره مخمر، ترکیبات پلی ساکاریدی دیواره سلولی، الیگوساکاریدها، پروتئین­ها، گلیکوپروتئین­ها و اسیدهای چرب نام برد (31).

ب) الیسیتورهای غیرزیستی

الیسیتورهای غیرزیستی شامل پرتو فرابنفش، فلزات سنگین، ترکیبات غیرضروری محیط کشت و بسیاری از موارد دیگر می‏گردند. الیسیتورهای غیرزیستی تحریک­کننده­های تولید فیتوآلکسین­ها بوده و از آن­ها در گیاهان زیادی به منظور افزایش متابولیت­های ثانویه استفاده گردیده است (25 و 31). در این مقاله افزایش تولید برخی از متابولیت­های ثانویه در کشت سلول گیاهی با استفاده از الیسیتورهای غیرزیستی مورد بررسی قرار می­گیرد.

مکانیسم تحریک در سلول­های گیاهی

الیسیتوربرای یک گیاه به‏عنوان محرک عمل می­کند که می­تواند پاسخ­های فیزیولوژیکی و مورفولوژیکی و تجمع فیتوالکیسن­ها را در گیاه باعث شود. به‏خوبی معلوم شده است که تیمار گیاهان با الیسیتورهامشابه حمله پاتوژن­های ناسازگار موجب بروز آرایشی از عکس العمل­های دفاعی، از قبیل تجمع مجموعه­ای از متابولیت­های ثانویه دفاعی در گیاه سالم یا در کشت­های سلول گیاهی می‏شوند. مکانیسم دقیق تحریک هنوز به‏طور کامل شناخته نشده است، اما مکانسیم­های مختلفی در این خصوص مانند Ca⁺² پیک، فاکتورهای موثر در پیوستگی غشا سلول، ممانعت یا فعالیت مسیرهای بین سلولی و تغییرات در استرس اسموتیکی پیشنهاد شده­اند. بعضی محققان فرض کرده­اند که الیسیتورهابه یک گیرنده غشای پلاسمایی برای فرآیند تحریک متصل می­شوند. کنش­های اصلی در تحریک سلول­ توسط الیسیتورها، اتصال به گیرنده­های پروتئینی خاص در غشای پلاسمایی، کاهش pH سیتوزول و تولید گونه­های اکسیژن­ واکنشگر و در نهایت فعال شدن رونویسی از ژن­های دخیل در فرآیندهای پاسخ دفاعی سلول است (32) .

انتقال الیسیتورها یا سیگنال­ها در سلول­های گیاهی می­تواند مکانیسم­های سودمندی در تولید متابولیت­های ثانویه را القا کند. در این مکانیسم­ها پیامبرهای ثانویه­ای تولید می­شوند که منجر به فعال­سازی آبشارهای پروتئین کیناز می‏شوند که آن­ها نیز به‏نوبه خود قادرند توانایی بیوسنتزی تولیدات گیاهی خاصی را فعال کنند. یک مکانیسم ممکن است برای تحریک زیستی در گیاهان براساس میان­کنش­های گیرنده الیسیتور خلاصه شود. زمانی‏که گیاه یا سلول گیاهی توسط الیسیتور تحریک می­شود، دسته­ای از واکنش­های بیوشیمیایی در چندین مرحله اتفاق می­افتند که در زیر اشاره می­شوند.

1- اتصال الیسیتور به گیرنده غشای پلاسمایی

2- تغییر در جریانات یونی در طول غشا: جریان یون­هایK⁺، Cl^- و Ca⁺² از فضای خارج سلول یا از ذخایر درون سلولی به سیتوپلاسم

3- تغییر سریع در الگوهای فسفریلاسیون پروتئینی، فعالیت پروتئین کیناز، فعالیت پروتئین G و تحریک پروتئین کیناز فعال شده میتوژن (Mitogen Activated Protein Kinase)

4- سنتز فسفولیپازهای A، C و D (PLA، PLCو PLD) و تولید پیامبرهای ثانویه، اینوسیتول 1 و4 و 5 تری فسفات (Inositol 1,4,5 triphosphate) و دی­اسیل­گلیسرول (Diacylglycerol) که از طریق آزادسازی Ca⁺² درون سلولی و مسیر سیگنالی، اکتادکانوئید و نیتریک­اکساید را واسطه­گری می­کنند.

5- تولید گونه­های اکسیژن­ واکنشگر مانند یون سوپراکسید و پراکسید هیدروژن که ممکن است دارای اثرات مستقیم ضدمیکروبی باشند و نیز منجر به تولید مشتقات اسیدچرب فعال زیستی شوند و در اتصال عرضی پروتئین­های غنی از پرولین متصل به دیواره سلول شرکت کنند. پراکسید هیدروژنمی­تواند به‏عنوان یک پیام رسان ثانویه عمل کند و در فعال سازی رونویسی ژن­های دفاعی نقش داشته باشد.

6- اسیدی شدن سیتوپلاسم در اثر غیر فعال شدن H⁺-ATPase، کاهش در قطبیت غشا و افزایش pH خارج سلولی

7- فعال سازی NADPH اکسیداز که باعث تولید ROS و اسیدی شدن سیتوسول می­شود.

8- سازماندهی مجدد غشای سلولی

9- تجمع پروتئین­های مربوط به دفاع یا پروتئین­های مربوط به بیماری­زایی مانند کینازها، گلوکونازها، اندوپلی­گالاکتورونازهایی که منجر به آزاد سازی الیگومرهای پکتیکی پیام دهی می­شوند، گلیکوپروتئین­های غنی از هیدروکسی پرولین و بازدارندهای پروتئازی

10- واکنش حساسیت فوق­العاده (Hypersensitivity) و مرگ سلولی

11- تغییرات ساختمانی در دیواره سلولی (چوبی شدن دیواره سلولی، رسوب کالوس)

12- فعالیت رونویسی ژن­های مربوط به پاسخ دفاعی مانند فنیل­آلانین­ آمونیالاز (Phenylalanine Ammonialyase)، گلوتاتیون ترانسفراز (Glutathione S-transferase) و چالکون سنتاز (Chalcone Synthases). ضمناً مولکول­های دفاعی گیاه مانند تانن­ها و فیتوالکسین 4-2 بعد از تحریک توسط محرک کشف شده­اند.

13- سنتز اسید جاسمونیک و اسید سالیسیک به‏عنوان پیام­رسان­های ثانویه

14- مقاومت اکتسابی سیستمیک (Systemic Acquired Resistance)

آنچه مشخص شده این است که الیسیتورها از طریق گیرنده­های موجود در غشای پلاسمایی دریافت می­شوند و از طریق سیستم­های سیگنالینگ نسخه­برداری و ترجمه (بیان) ژن­های دخیل در بیوسنتز متابولیت­ها را تحت تاثیر قرار می­دهند (33).

نمونه­هایی از کاربرد الیسیتورهای غیرزیستی در تولید متابولیت­های ثانویه گیاهی

 عوامل مختلفی مانند غلظت الیسیتور، سن سلول­ها، نوع محیط کشت، زمان در معرض قراردهی یا افزودن الیسیتور به محیط کشت و مدت زمانی که محیط کشت در معرض الیسیتور قرار می­گیرد، بر تولید متابولیت­های ثانویه تاثیر می­گذارند (34). در بین الیسیتورهای غیرزیستی، الیسیتورهایی که در مقیاس نانو به‏منظور تولید متابولیت‌های ثانوی در کشت سلول­های گیاهی به­کار رفته‌اند دارای جایگاه ارزشمندی می­باشند.

به‏منظور تولید سنگوئینارین و تبائین در سوسپانسیون سلولی مریستم و ریشه گیاه خشخاش از نانو دی­اکسیدتیتانیوم استفاده شد که نتایج حاصل از آن طی 24 ساعت پس از اعمال تیمار افزایش دو آلکالوئید مزبور را تا 1/2 برابر نسبت به شاهد نشان داد (35). همچنین جهت تولید آلوئین در گیاه آلوئه­ورا از دو نانوالیسیتور نقره و دی­اکسیدتیتانیوم استفاده شد و نتایج حاکی از آن بود که دو نانوالیسیتور مذکور طی 48 ساعت پس از اعمال تیمار به­ترتیب باعث افزایش آلوئین به‏میزان 7/43 و 6/11 درصد شدند، اما پس از آن تولید آلوئین تا رسیدن به سطح کنترل کاهش نشان داد (36). اثر نانو نقره بر تقسیم سلولی و شاخص­های میتوزی که خود بر میزان تولید متابولیت­ها موثر می­باشد نیز مورد بررسی قرارگرفته است. در این رابطه محققین از گونه­های گیاهی جنس Allium استفاده کردند و دریافتند که نانونقره به‏صورت معنی­داری شاخص میتوزی را کاهش و دگرگونی ساختاری در کروموزوم را افزایش داد (34 و 35).

اگرچه نانو ذرات به‏راحتی به سیستم بافت گیاهی نفوذ کرده و روی میزان تولید متابولیت­های ثانویه تاثیر مثبت می­گذارند، اما در غلظت­های بالا و حضور طولانی مدت در محیط، به­واسطه کاهش شاخص میتوزی و آزاد کردن یون­های سمی باعث ایجاد مسمومیت سلولی (cytocyctic) می­شوند. چنانکه پیش­تر گفته شد، الیسیتورها در محیط کشت از طریق فعال کردن ژن­های مربوط به مکانیسم­های دفاعی باعث القای تشکیل متابولیت­های ثانویه می­شوند، اما پس از آن پاسخ سلولی نسبت به حضور الیسیتورها (نانوالیسیتورها) منفی بوده و با از بین رفتن نیروی محرک پروتون­ها (Proton-motive force) در عرض غشا، ناپایدار شدن غشا خارجی و آزاد کردن گونه­های اکسیژن­ واکنش‏گر همراه است. گونه­های اکسیژن­ واکنشگر تولید شده ممکن است جزئی از مکانیسم سمیت ژنی (Genotoxic) نانو الیسیتورها باشد که به صورت مستقیم پروتئین­ها را تخریب کرده و یا آنها را برای تجزیه حساس می­کند. در صورت حضور طولانی مدت نانوالیسیتورها در محیط، گونه­های اکسیژن­ واکنش‏گر روی DNA اثر مخرب داشته و منجر به کاهش تولید مواد موثره می­شود (37).

تابش پرتو فرابنفش به­طور معنی­داری باعث افزایش تولید رسوراترول در برگ و میوه و کالوس حاصل از آن­ها و همچنین سوسپانسیون سلولی تعدادی از ارقام انگور گردیده است (38  و 39).

استفاده از اسید سالیسیلیک و محرک­های قارچی روی تولید تاکسول در سوسپانسیون سلولی گیاه سرخدار (Taxus bacata) موثر بوده است. نتایج مطالعات در این خصوص نشان داده است که ترکیب اسید سالیسیک و محرک قارچی روی بیوماس سلول­های گیاه مزبور تاثیر نداشته، اما موجب تولید بیشترین میزان تاکسول شده­اند (40). همچنین در آزمایش دیگری با افزودن پیش­ماده­های موالونات و ان-بنزوئیل گلیسین به کشت سوسپانسیون سلولی گیاه سرخدار میزان تولید تاکسول تا 3 برابر افزایش یافت (41).

تولید 6-متوکسی پودوفیلوتوکسین در کشت سلول یکی از گونه­های وحشی جنس کتان (Linum nodiflorum) تحت تاثیر متیل جاسمونات به‏میزان ده برابر افزایش یافت (36). کاربرد متیل جازمونات همچنین توانسته است تولید رسوراترول را در برگ و میوه و کالوس حاصل از آن­ها و همچنین سوسپانسیون سلولی تعدادی از ارقام انگور به‏میزان قابل توجهی افزایش دهد (42 و 43).

نیترات نقره (AgNO₃) و کلرید کادمیوم (CdCl₂) موجب تحریک تولید تروپان­آلکالوئید­­های اسکوپولامین و هیوسیامین از طریق کشت ریشه­های موئین گیاه تاتوره معطر (Bragmansia candida) شده و باعث افزایش تولید این آلکالوئید­ها شده­اند (44).

 در آزمایشی از سطوح مختلف نیتروژن و بنزیل آدنین به‏منظور تولید آلوئین از گیاه آلوئه­ورا استفاده شد و پس از 12 ماه میزان آلوئین نه تنها با کاربرد هر یک از دو الیسیتور فوق به‏تنهایی افزایش یافت، بلکه کاربرد هم‏زمان آن­ها نیز دارای اثرات متقابل مثبت بود و موجب افزایش بیشتر میزان آلوئین شد (45).

گزارش‏ها نشان داده­اند که با اضافه کردن قندها به‏منظور بهینه­سازی عناصر غذایی محیط کشت، میزان تولید متابولیت ثانویه بالا رفته است (46). در این رابطه، وقتی به­جای 5/2 درصد ساکارز در کشت سلولی گیاه حسن یوسف به‏میزان 5/7 درصد استفاده شد، عملکرد رزمارینیک اسید معادل 4 برابر افزایش یافت.

به‏دلیل اهمیت اقتصادی و افزایش تقاضا برای تولید متابولیت­های ثانویه، محققین به‏دنبال روش­هایی برای تولید هرچه بیشتر و با کیفیت­تر این ترکیبات هستند. بیوتکنولوژی قادر است کارآیی گیاهان دارویی را جهت تولید دارو افزایش دهد. کشت سلول، بافت و اندام­های گیاهی و بهره­گیری از الیسیتورها امکان تولید سریع و انبوه متابولیت­های با اهمیت را فراهم می­سازد. استفاده از الیسیتورها روش مناسبی به‏منظور تولید هر چه بیشتر متابولیت­های ثانوی در شرایط درون شیشه­ای می­باشد. به‏نظر می‏رسد ترکیبات فعال الیسیتورها نقش موثری در القای پاسخ­های دفاعی و افزایش تولید متابولیت­های ثانوی دارند. الیسیتورها بیان ژن را در گیاهان تحت تاثیر قرار داده و با از بین بردن سدهای مهارآنزیمی یا دست‏کاری مسیر آنزیم­ها باعث تغییر در سطح تولید متابولیت­ها می­گردند. همچنین از این طریق می­توان سطح آنزیم­های موثر در مسیر بیوسنتز را اندازه­گیری و جهت کنترل مسیرهای بیوسنتز آنها را شناسایی کرد و روش­های جدیدی در کنترل و تولید متابولیت­ها ارائه نمود.

منابع

1. Sarin R. Useful Metabolites from plant tissue cultures. Biotechnol. 2005; (4): 79-93.

2. Patel H, Krishnamurthy R. Elicitors in plant tissue culture. J. Pharmacog & Phytochem. 2013; 2(2): 60-65.

3. Reynolds, T. Aloe chemistry. In Reynolds T(Ed), the genus Aloe, CRC Press, Boca Raton. Florida, USA. 2004; 39-74.

4. Facchini PJ, St-Pierre B. Synthesis and trafficking of alkaloid biosynthetic enzymes. Curropin in Plant Biol. 2005; 8: 657-666.

5. Zaho J, Davis LC, Verpoorte R. Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites. Biotech Advances. 2005; 23(4), 283-333.

6. Furze JM, Rhodes MJ, Parr AJ, Robins RJ, et al. Abiotic factors elicit sesquiterpenoid phytoalexin production but not alkaloid production in transformed root cultures of Datura stramonium. Plant Cell Reports. 1991; 10(3): 111-114.

7. Smetanska I. Production of secondary metabolites using plant cell culture. Advances in Biochem Eng Biotech. 2008; 111: 187-228.

8. Rao SR, Ravishankar GA. Plant cell cultures: chemical factories of secondary metabolites. Biotech Advances. 2002; 20 (2): 101-153.

9. Dewick PM.Medicinal natural products. A biosynthetic approach. Second edition,Wiley. 2002; 7: 121-140.

10. Taiz L, Zeiger E. Plant physiology, 4^th Ed. Sinauer Associates Inc. Sunderland, Massachusetts.USA; 2006; 260-287.

11. Sangwan NS, Farooqi AH, Shabih F, Sangwan RS. Regulation of essential oil production in plants. Plant Growth Regul. 2011; 34:21-34.

12. Yin L, Cheng Ying w, Espinasse B, Colman A, et al. More than the Irons: The effects of silver nanoparticles on Lolium multiform. Environ Sci & Technol. 2011; 45(1): 2360-2367.

13. Anterola AM, Jeon JH, Davin LB.Transcriptional control of monolignol biosynthesis in Pinus taeda. J Biol Chem. 2002; 227(21): 18272-18280.

14. Zhao JL, Zhou LG, Wu JY. Effects of biotic and abiotic elicitors on cell growth and tanshinone accumulation in Salvia miltiorrhiza cell cultures. Applied Microb & Biotech. 2010; 87(1): 137-144.

15. Mulabagal V, Tsay HS. Plant cell cultures, an alternative and efficient source for the production of biologically important secondary metabolites. Int J of Applied Sci & Eng. 2004; 2(1): 29-48.

16. Bladi A, Dixit VK. Yield enhancement Strategies for artemisinin production by suspension culture of Artemisia annua. Bioresource Technol. 2008; (99): 4609-4614.

17. Roberts SC, Shuler ML. Large-scale plant cell culture. Current Opinion in Biotech. 1997; (8): 154-159.

18. Matkowski A. Plant in vitro culture for the production of antioxidants. A review. Biotech Advance. 2008; (26): 548-560.

19. Saadat SS, Piri Kh, Esna-Ashari M, Gholami M, et al. Production and Realease of Tropane Alkaloids from Deadly Nighushade (Atropa belladonna L.) in Hydroponic Condition. Plant Production Tech. 2011; (11): 25-32.

20.Dellapenna D. Plant Metabolic Engineering . Plant Physiol. 2000; 125:160-163.

21. Bourgaud F, Gravot A, Goniter E. Production of plant secondary metabolites. Plant Science. 2002; 161(5): 839-851.

22. Dhawan OP, Lavania UC. Enhancing the productivity of secondary metabolites via induced polyploidy: a review. Euphytica. 1996; 87: 81 - 9.

23. Jasus-Gonzalez LDE, Weathers PJ. Tetraploid Artemisia annua hairy roots produce more artemisinin than diploid. Plant Cell Reports. 2003; 21(8): 809-813.

24. Niimi  H, Watenabe M,  Serizawa  H, et al. Amiprophosmethyl- induced  efficient  in vitro production of polyploids in Raphano brassica with the aid of aminoethoxyvinylyglycine (AVG) in the culture medium. Breeding Science.2015; 65(5):396-402.

25. Zhao DX, Fu CX, Han YS, Lu DP. Effects of elicitation on jaceosidin and hispidulin production in cell suspension cultures of Saussurea medusa. Process Biochem. 2005; 40(2): 739-745.

26.  Radman R, Saez T, Bucke C, Keshavarz T. Elicitation of plants and microbial cell systems. Biotech & Applied Biochem. 2003; 37(1): 91-102.

27. Ramachandra CT, Srinivasa Rao P. Processing of Aloe vera Leaf Gel :A Review .Am J Agric & Bio Sci. 2008; 3(2): 502-51.

27. Zhang C, Yan Q, Cheuk WK, Wu J. Enhancement of tanshinone production in Salvia miltiorrhiza hairy root culture by Ag+ elicitation and nutrient feeding. Planta Medica. 2004; 70(2): 147-151.

28. Zhang C, Yan Q, Cheuk WK, Wu J. Enhancement of tanshinone production in Salvia miltiorrhiza hairy root culture by Ag+ elicitation and nutrient feeding. Planta Medica. 2004; 70(2): 147-151.

29. Howlett B. Secondary metabolites toxins and nutrition of plant pathogenic Fungi. Current Opinion in Biotech. 2006; 9(4): 371-375.

30. Zhang Y, Mian MR, Bouton JH. Recent Molecular and Genomics Studies on Stress Tolerance of Forage and Turf Grasses. Crop Science. 2006; 46: 497-511.

31. Choi HK, Yun JH, Kim SL, Son JS, et al. Enhanced production of paclitaxel by semi-continuous batch process (SCBP) in suspension culture of Taxus chinensis. Enzyme and Micro Tech. 2001; 29: 583-586.

32. Pitta-Alvarez SI, Spollansky TC, Giulietti AM. The influence of different biotic and abiotic nitrogen metabolism of growing spinach. Biol Trace Element Res. 2000; 110(2): 179-190.

33. Lee-Sae N, Kerdchoechuen O, Laohakunjit N. Effect of ammonium nitrate on cell growth and production of phenolic compounds in cell suspension cultures of Vitis vinifera. Aric Sci l. 2011; 42(2): 249-252.

34. Bota C, Deliu C. The effect of copper sulphate on the production of flavonoids in Digitalis lanata cell cultures. Farmacia. 2011; 59(1): 113-118.

35. Khodayari M, Omidi M, Boushehri AK, Yazdani D, et al. Effect of biotic and nano elicitors on enhancement of alkaloids in Papaver somniferum L. Iranian J Hort Sci. 2014; 14(45): 287-295.

36. Raei M, Angaji SAH, Omidi M, Khodayari M. Effect of abiotic elicitors on tissue culture of Aloe vera. Int J Biosci. 2014; 5(1): 74-81.

37. Lok CN, Ho C, Chen R, He QY, et al. Proteomics analysis of the mode of antibacterial action of silver nanoparticles. J Proteomic Res. 2007; 5(4): 916-24.

38. Esna-Ashari M, Mahmoudi Pour A. Ultra violet irradiation enhances resveratrol production in organs and cell suspension cultures of two Iranian grape cultivars. Food. 2010; 1: 23-26.

39. Esna-Ashari A, Mahmoudi Pour A, Karami O. The effect of UV irradiation on resveratrol production in leaf and fruit of two Iranian grape (Vitis vinifera L.) cultivars. Iranian J Hort Sci. 2008; 1: 2-10.

40. Long-Jiang Y, Wen-Zhi L, Wen-Min Q, Hui-Bi Xu. Effects of Salicylic acid on fungal elicitor-induced membrane-lipid peroxidation and Taxol production in cell suspension cultures of TaxusChinensis. J Process Biochem. 2010; 370: 477-482.

41. Cusido RM, Palazon J, Bonfill M, Navia Osorio A, et al. Improved paclitaxel and baccatin III production suspension culture of Taxus media. Biotech Progress. 2002; 18(3): 418-423.

42. Esna-Ashari M, Mahmoudi Pour A. Effect of methyl jasmonate on resveratrol production in organs and cell suspension cultures of two Iranian grapevine (Vitis vinifera L.) cultivars. J Hort Sci & Biotech. 2011; 6(8): 557-562.

43. Esna-Ashari M, Mahmoudi Pour A, Karami O, Hesari M. Changes in the amount of resveratrol in leaf and fruit and the possible effect of methyl jasmonate on it in two Iranian grape (Vitis vinifera L.) cultivars. J Sci & Tech Agric & Nat Reso. 2008; (45): 571-579.

44. Radman R, Saez T, Bucke  C, Keshavarz T. Elicitation of plant and microbial systems. Biotech & Applied Biochem. 2003; 37: 91-102.

45. Hazrati S, Tahmasebi Z, Babaei A. Enhancaing yield and aloin concentration of Aloe vera plants by stimutaneous application of N and benzyladenine. J Med Plant Res. 2010; 6(10): 1834-1841.

46. Misava M. Production of useful plant metabolites. In: Flechter A, editors. Adv. Biochem.Eng.Biotechnol. Berlin:springer-verlag. 1985; 59-88.