نوع مقاله : علمی - پژوهشی
چکیده
هدف: توانایی داروی رادیواکتیو p 32 برای درمان و کنترل سرطان پستان و بررسی توزیع این رادیو دارو در موشهای مبتلا مورد بررسی این مقاله میباشد.
مواد و روش‌ها: 10تا20 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن از کارسینوژن DMBA به رتهای نژاد SD تحت آزمایش خورانده شد. تومورهای به قطر 10 تا 15میلیمتر برای آزمایش انتخاب شدند. رادیو دارو بر اساس الگوی تهیه شده به تومورهای به فاصله 3 و 5 و 7 روز تزریق گردید. در این فاصله توزیع رادیودارو در بدن موش، توسط دستگاه دتکتوریدورسدیم مورد ارزیابی قرار گرفت. پس از پایان دورهی تیمار حیوان بیهوش و در شرایط استریل تومور را بطور کامل خارج و ودر فرمالین10 درصد قرار داده شد. برشهایی از تومورها با استفاده از دستگاه تیشو پروسسور مورد پردازش و تهیه قرار گرفتند. پس از مراحل پاساژ بافتی و برش‌گیری، نمونه ها از طریق رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین مورد بررسی قرار گرفت.
نتایج: بررسی هیستولوژیک مقاطع تهیه شده از بافتهای توموری موید این مطلب بود که پاتولوژی تومورهای القایی ایجاد شده توسط DMBA در موشهای صحرائی مورد استفاده در این تحقیق، شباهت زیادی با تومورهای پستانی در انسان داشت. 5 روز بعد از تزریق رادیوفسفر مجاری و غدد تومورال توسط باقیماندههای سلولهای اپیتلیال پوشانیده شده بود. بسیاری از سلولها از غشای پایه جدا شده و به داخل حفرههای غددی ریزش پیدا کرده بودند. سلولهای باقیمانده دارای هسته کوچک و کروماتینی متراکم و سیتوپلاسم نیز حالت فشرده و متراکم داشت. مناطق اطراف محل تزریق دارو به شعاع حدود 7 تا 8 میلیمتر تمامی سلولها نکروزه شده و تشکیل حفره ای در داخل تومور داده بودند.
نتیجه گیری: این مشاهدات نفوذ و تاثیر بیشتر تشعشعات ساطع شده از فسفر 32 در بافت توموری را نشان میدهد و چنانچه نقاط تزریق با فاصله مناسب در تومور صورت گیرد توانایی نابودی تومور در زمان کوتاه تری را خواهد داشت.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Modeling Breast Cancer Using Chemical and Radiopharmaceutical Effect of P32 on Related Cancer Cells
چکیده [English]
Aim: In this article, the ability of p < sup>32 radioactive drugs for treatment and control of breast cancer in rat model and also verifying of distribution of drug in rat organs are investigated.
Material and Methods: 10 to 20 mg per kg of DMBA gavaged to SD strain rats. Tumors 15-10 mm in diameter were selected for testing. P32 radioactive drugs injected to developed tumors with interval 3, 5 and 7 days. The distribution of the P32 radioactive drugs in the body of rat were analyzed by NI detector. After the treatment period, animals were anesthetized and the tumor is completely removed under sterile conditions and placed in 10% formalin. Sections of the tumors were obtained and processed using Tissue Processor. After tissue processing and sectioning, the samples were stained with hematoxylin - eosin were examined.
Results: The results obtained from the examining histological sections prepared from tumor tissue confirmed that, the pathology of tumors induced by DMBA in rats used in this study is very similar to human mammary tumors. Five days after injection, we could find tumor's cells and lymph ducts are covered by residual epithelial cells. Many of the cells are separated from the basement membrane and collapsed into the tubular cavity. Rest of the cells has small nuclei, with chromatin condensation mode and cytoplasm was compact and dense. In radius of about 7-8 mm around the site of injection the tumor's cells were necrosis and formed a cavity, inside of tumor.
Conclusions: These observations showed further penetration and influences of radiation emitted from the phosphor 32 in the tumor tissue based on our injection pattern.
Therefore if given the proper distance of injection within the tumor, destroying the tumor's ability to be on time will be shorter.
کلیدواژه‌ها [English]
- Radiation Therapy
- Breast cancer
- P-32
- DMBA
- Beta radiation
مقدمه
یکی از بیماریهای مهلک دامنگیر انسان سرطان است لذا مطالعه در خصوص روشهای مبارزه با سرطان یکی از عناوین مهم تحقیقات در دنیا محسوب می گردد. استفاده از رادیوداروها در مبارزه با سرطان دارای تاریخچه طولانی است و هم اکنون نیز از این روش برای کنترل و یا درمان سرطان استفاده گستردهای در دنیا و همچنین کشور ایران می گردد. توانائی P32 برای درمان سرطان پستان و بررسی چگونگی توزیع این رادیودارو در موشهای مبتلا مورد بررسی این مقاله می باشد. از پرکاربردترین رادیوداروها می توان به P32 Chromic اشاره نمود (1). P32 یکی از داروهای رادیواکتیو است که دارای تابش 100 درصد بتا با انرژی ماگزیمم1710 کیلو الکترون ولت (متوسط 7/694 کیلو الکترون ولت) و نیمه عمر 3/14 روز و عمق نفوذ 8 میلیمتر می باشد. ذرات این رادیو دارو 600 تا 1300 نانومتر می باشد (2) و از آن دارو بصورت تزریق برای کنترل تومورهای سرطانی استفاده میگردد. عمق نفوذ اشعه بتا حاصل از P32 در بافتهای بدن معادل 6/7 میلیمتر می باشد (3). جذب بالای فسفر در بافتهای استخوانی رادیوداروهای فسفات P32 را به گزینه‌ای بسیار مناسب در تسکین و درمان مبتلایان به سرطان استخوان تبدیل کرده است. از جمله علل استفاده این رادیودارو انتشار کم آن به بافتهای مجاور تومور و همچنین به سایر اندامهای بدن
است که مربوط به اندازه ذرات آن میباشد (4).
بررسی چگونگی تاثیر این دارو در تومورهای القایی ایجاد شده توسط DMBA (7,12-Dimethylbenz(a)anthracene) (2) در حیوانات خانگی مانند موش صحرائی (رت) و خرگوش میتواند راهنمای مناسبی برای کاربرد بهینه آن در انسان باشد. ایجاد تومورهای سطحی و localize به منظور امکان تزریق فسفر رادیواکتیو و سپس مطالعه روند بهبود موشهای مبتلا، بیوپسی و مطالعه تغییرات حاصله در مراحل مختلف، بررسی میزان تجمع دارو در اندام ها و بافت های مختلف موش های مبتلا و تعیین تغییرات بافتی در محل تزریق و نواحی اطراف آن و از بین رفتن احتمال تومورها از اهداف این تحقیق بوده است.
مواد و روش‌ها
108 موش صحرائی از نژاد Sprague Dawley از انستیتو پاستور تهیه گردید (در تمامی مراحل این تحقیق اصول اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی رعایت شده است). بعد از تطبیق پذیری با شرایط محیط (12 ساعت روشنائی و 12 ساعت تاریکی) و رسیدن به وزن حدود 150 گرم، و سن50 تا 54 روزگی حیوانات بطور اتفاقی به 3 گروه به شرح جدول 1 تقسیم گردیدند.
جدول 1: گروه بندی رت های مورد استفاده در این تحقیق و مشخصات هر یک از گروهها
|
گروهها |
تعداد رت |
گروه بندی داخلی |
دوز تزریقی |
موارد استفاده |
قطر تومور |
|
کنترل |
36 |
سه گروه 12 تائی |
روغن کنجد 1 میلیگرم |
|
|
|
دریافت کننده DMBA |
36 |
سه گروه 12 تائی |
دوز اولیه (12 سر) دوز ثانویه (12 سر) بدون دریافت رادیودارو (12 سر) |
2 نمونه برای مطالعه هیستوپاتولوژی |
|
|
دریافت کننده DMBA و رادیو دارو |
36 |
سه گروه 12 تائی |
دوز اولیه (12 سر) دوز ثانویه (12 سر) همراه با دریافت رادیودارو(12 سر) |
2نمونه برای مطالعه هیستوپاتولوژی و اندازه گیری روند بهبود سنجش رادیودارو در اندامهای مختلف |
شروع تزریق دارو، قطر تومورحدود 20 میلیمتر |
به گروه دوم و سوم یک دوز 5 میلیگرم از DMBA مخلوط با1 میلیگرم روغن کنجد از راه خوراکی (به عنوان دوز اولیه) داده شد این کار را در طی 1 هفتۀ بعدی تکرار شد (دوز ثانویه). به گروه های کنترل 1 میلیگرم روغن کنجد خورانده شد.
رادیودارو P32 از مرکز پزشکی هستهای تهیه و با توجه به نیم عمر 14 روزه آن در زمانی که قطر تومور در نمونههای گروه سوم به 20 میلیمتر رسیدند از مرکز تومور به سمت حاشیه آن به فاصله 7 میلیمتر تزریق گردید. جهت بررسی اندامهای دریافت کننده رادیودارو به یک گروه موش به تعداد 8 سر به روش درون صفاقی و به یک گروه موش به تعداد 8 سر به روش درون رگی رادیودارو تزریق گردید و با استفاده از دستگاه دتکتور یدورسدیم (NaI) تجمع رادیودارو در اندامهای مختلف اندازه گیری گردید (نمودار1). با استفاده از سیستم اندازهگیری، میزان تابش تومورهای موش زنده در 3 ، 5 و 7 روز پس از تزریق فسفر 32 اندازه گیری که در نمودار 2 نمایش داده شده است. همانطور که در نمودار2 مشخص است فقط موش شماره 3 تا آخرین مرحله اندازه گیری زنده بوده است.
نمودار1: نتایج اندازه گیری تجمع فسفر 32 در اندام های مختلف موش در تزریق داخل رگی ( IV) و داخل صفاقی (IP)با استفاده از آشکار ساز یدور سدیم
نمودار 2: اندازه گیری تابش تومورهای موش زنده در 3 ، 5 و 7 روز پس از تزریق فسفر 32
پس از پایان دورهی تیمار (رسیدن تومور به اندازهی نشان داده شده در شکل 1)، حیوان توسط دی‌اتیل اتر بیهوش شد و ناحیهی اطراف تومور را تراشیدهو پس از شکافتن ناحیه اطراف تومور و در شرایط استریل تومور را بطور کامل خارج کرده و یک قسمت از سه قسمت تومور حاصل در فرمالین 10 درصد قرار داده شد.
شکل1: محل ایجاد تومر بعد از تزریق DMBA (7-12 Dimethylbenz(a)anthracene)
مراحلپاساژبافتی: تومورها با استفاده از دستگاه اتوتکنیکوم (Leica Histokinette) مورد پردازش قرار گرفتند. مراحل با اصلاحات جزئی بر طبق روش کار شرکت سازنده انجام پذیرفت که بطور خلاصه در ادامه بیان میگردد. پس از آب‌گیری بافت توسط الکل با درجات صعودی شفاف سازی نمونه‌ها از الکل با جایگزینی توسط زایلن و سپس آغشته سازی با پارافین صورت گرفت و در انتها نمونه‌ها با حفظ جهت و نظم و ترتیب اولیه در پارافین قالب‌گیری شدند. دو قطعه قالب بر روی سطح صاف شیشه‌ای یا سنگی قرارداده شد و پارافین مذاب به داخل قالب ریخته شد، نمونه‌ها با حفظ جهت در قالب حاوی پارافین قرارداده شدند و مشخصات هر برش نیز روی کاغذ یادداشت و به وسیلهی پارافین داخل قالب بلوک به پارافین چسبانیده شد. بعد از سرد و سفت شدن پارافین، قالب ها با ضربهی مختصری از پارافین جامد حاوی نمونه جدا گردید و قالب ها تا زمان برش‌گیری توسط میکروتوم در یخچال نگهداری شدند.
تهیهمقاطعبافتیتوسطمیکروتوم: برش‌گیری از بلوکهای پارافینی حاوی نمونه توسط میکروتوم و با ضخامت 3 میکرومتر تهیه شد. سپس جهت رفع چروکیدگی، نمونه‌ها را با شیب 30 درجه و بر روی حمام آب گرم با درجه حرارت 45 درجه سانتیگراد به روی لام که قبلا بر روی آنها چسب آلبومین قرار داده شده بود منتقل گردید. لام‌ها به روی هیتر منتقل و سپس به روی تخته چوبی قرار داده شد و برای مدت 12 ساعت در فور و در دمای 39 درجه سانتیگراد قرارگرفت تا نمونه‌ها کاملا به روی لام بچسبند. از هر بلوک یک لام جهت رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین درنظرگرفته شد تا بمنظور مطالعه و تشخیص پاتولوژی استفاده گردد.
رنگآمیزیمقاطعبافتی هماتوکسیلین- ائوزین :(H&E)قبل از رنگ آمیزی، لام‌ها در دمای 55 درجه سانتیگراد به مدت 1تا 2 ساعت در فور به جهت دپارافینه شدن قرار داده شد و پس از حذف گزیلل و الکل سلولها، از محلول هماتوکسیلین هاریس جهت رنگ آمیزی برش های بافتی استفاده شد. جهت دائمی کردن نمونه‌ها از چسب انتلان بین لام و لامل استفاده گردید و سپس لام‌ها به مدت 12 ساعت در هوای آزاد قرار گرفت تا کاملا خشک شوند.
نتایج
نتایج بدست آمده از بررسی هیستولوژیک مقاطع تهیه شده از بافت های توموری مؤید این مطلب است که پاتولوژی تومورهای ایجاد شده در موشهای صحرائی مورد استفاده در این تحقیق، شباهت زیادی با تومورهای پستانی در انسان دارد. پیش از این نیز Russo (5) گزارش نموده که اکثر تومورهای پستانی القا شده توسط DMBA از نوع ادنوکارسینوما بوده و مشخصات تومورهای پستان انسانی را از نظر رشد وابسته به هورمون و هیستولوژی تقلید میکند و بنابراین مدل حیوانی مناسبی جهت تحقیق در مورد کارسینوژنز تومورهای پستان انسانی می باشد. همچنین مطالعات بیوشیمیایی انجام گرفته در مطالعات پیشین شباهتهای بیشتری را بین این مدل با نمونههای انسانی آشکار نمودهاند (6). با توجه به این یافتهها و با نظر به اینکه ژنوم انسان و رت تا حد زیادی با یکدیگر شباهت دارند، بنابراین از دیدگاه ژنتیکی نیز میبایست شباهتهای زیادی بین تومورهای پستانی ایجاد شده در رت و تومورهای انسانی وجود داشته باشد. چنانکه در شکل2 مشاهده می گردد چهارچوب تشکیلات توموری در نمونه موجود بوده و در برخی مناطق سلولهای توموری دارای هسته بزرگ با سیتوپلاسم مشخص هستند و تعداد سلولهای درحال نکروزکم میباشد. در سایر مناطق ایجاد واکوئلی شدن در داخل سیتوپلاسم سلولهای توموری دال بر نکروز سلولی میباشد. بافت پشتیبان به صورت نرمال (حاوی سلول و رشته بافت همبند) میباشد و در کل نشانه مورفولوژیکی خاصی دال بر آسیب بافت پشتیبان وجود ندارد.
شکل2: تصویری از تومور 3 روز بعد از تزریق رادیوفسفر:32. (رنگ آمیزی هماتوکسیلینهاریس و بزرگنمایی با ابژکتیوx 40)، (A: سلولهای چربی، B: بافت همبند،C: سلولهای تومور، D: فیبروبلاست، E: واکوئل سازی سلولهای توموری)
در شکل3 که 5 روز بعد از تزریق رادیوفسفرتهیه شده است مشاهده می گردد که مجاری و غدد تومورال توسط باقیماندههای سلولهای اپیتلیال پوشیده شده است و بسیاری از سلولها از غشای پایه جدا شدهاند و به داخل حفرههای غددی ریزش پیدا کردهاند. سلولهای باقیمانده دارای هسته کوچک با کروماتینی متراکم و سیتوپلاسم نیز حالت فشرده و متراکم دارد که مجموعا طرحی شبیه به آپوپتوزیس بوجود آوردهاند. هر چند ظاهر سلولی با تعاریف مربوط به نکروز سلولی منطبق نمی باشد ولی به نظر میرسد که سلولها بر اثر تاثیرات رادیودارو در حال از بین رفتن باشند.
شکل3: تصویری از تومور 5 روز بعد از تزریق رادیوفسفر32. (رنگ آمیزی هماتوکسیلین هاریس و بزرگنمایی با ابژکتیوx 40)(A: سلولهای اپیتلیال، B: سلول اپی تلیال نکروزی، C:فیبروبلا ست، D: ماکروفاژ، E: بافت پشتیبان متورم)
در شکل4 نیز مراحل توضیح داده شده در فوق، با پیشرفت بیشتری را نشان می دهد و فلشها نکروز شدن کامل سلولهای اپی تلیال و بقایای حاصل از آن میباشد. لازم به ذکر است این نواحی، نواحی نزدیک به منطقه نفوذ رادیودارو می باشد و مناطق اطراف محل تزریق دارو به شعاع حدود 7 تا 8 میلیمتر تمامی سلولها نکروزه شده و تشکیل حفرهای در داخل تومور دادهاند.
شکل4: تصویری از تومور 7 روز بعد از تزریق رادیوفسفر32. (رنگ آمیزی هماتوکسیلین هاریس و بزرگنمایی با ابژکتیوx 40)(A: نکروز کامل سلولهای اپی تلیال ترشحی و مجرایی و باقی ماندن بقایا در محل، B: بافت پشتیبان بسیار متورم همراه با سلولهای فیبروبلاست، C: حضوراندک سلولهای التهابی)
این مشاهدات نشاندهنده نفوذ و تاثیر بیشتر تشعشعات ساطع شده از فسفر 32 در بافت توموری را نشان می دهد و چنانچه نقاط تزریق با فاصله مناسب در تومور تزریق گردد توانایی نابودی تومور در زمان کوتاه تری را خواهد داشت. بررسی های این تحقیق نشان داد که در دو روش تزریقی یعنی تزریق صفاقی و تزریق وریدی میزان جذب فسفر 32 در بسیاری از اندامها از جمله رحم، قلب، چربی داخل شکم، و جمجمه مشابه بود ولی بر اساس روش تزریق تجمع این رادیودارو در صفاق و ریه متفاوت دیده می شد که به ترتیب مربوط به تزریق داخل صفاقی و تزریق وریدی بود ( نمودار های 1و2). تفاوت های جزیی نیز قابل مشاهده بود ازجمله اینکه در هنگام تزریق رادیودارو از طریق ورید تجمع آن در خون، استخوان دست و کبد بیشتر از روش تزریق داخل صفاقی بوده است. ولی در تزریق داخل صفاقی تجمع این رادیودارو در روده بزرگ، طحال و روده کوچک بیشتر دیده می شد. از نظر هیستوپاتولوژیکی محل تزریق دارو به شعاع حدود 7 تا 8 میلیمتر باعث مرگ سلولهای توموری شده بود و در حاشیه آن نیز تغییراتی ازجمله هستک های بزرگ و برجسته و الگوی کروماتینی وزیکولی مشاهده گردید. لازم به ذکر است که تمامی رت های گروه دوم این تحقیق تومورهای سرطانی پستانی را سه ماه بعد از خوراندن DMBA بروز دادند و هیچ یک علائمی دال بر کوچک شده تومور و یا بهبودی نشان ندادند، لذا در بیشتر موارد جهت جلوگیری از زجر کشیدن حیوان آنها را با استفاده از اتاقهای مرگ حاوی اتر اشباع شده از بین برده و در موارد دیگر خود بر اثر ابتلا به بیماری از بین رفتند.
بحث
همانطور که اشاره شد بعد از تزریق رادیوفسفر مشاهده گردید که مجاری و غدد تومورال توسط باقیمانده های سلولهای اپیتلیال پوشانده شده و اکثر سلولها از غشای پایه جدا شدهاند و به داخل حفرههای غددی ریزش پیدا کرده بودند. سلولهای باقیمانده دارای هسته کوچک با کروماتینی متراکم و سیتوپلاسم نیز حالت فشرده و متراکم داشت. این تغییرات از بین رفتن سلولهای توموری تا شعاع 7 تا 8 میلیمتری محل تزریق رادیودارو را نشان می دهد. ازنظر هیستوپاتولوژیکی محل تزریق دارو به شعاع حدود 7 تا 8 میلیمتر باعث مرگ سلولهای توموری شده بود و در حاشیه آن نیز تغییراتی ازجمله هستک های بزرگ و برجسته و الگوی کروماتینی وزیکولی مشاهده گردید. بر طبق مطالعات انجام شده رادیودارو P32 از محل تزریق به بافت های مجاور و جریان خون منتقل نمی شود (2 و 7). ولی مطالعه این تحقیق نشان داد 5 روز بعد از تزریق، رادیودارو در تومور می توان اثر آنرا در جریان خون و مغز استخوان اندازه گیری نمود.
نتیجه گیری
چنانچه نقاط تزریق با فاصله مناسب حدود 7 تا 8 میلی متر در تومور صورت گیرد توانایی نابودی تومور در زمان کوتاهتری را خواهد داشت. جهت نابودی سلولهای حاشیه ای تومور محاسبه دقیق محل تزریق پیشنهاد و همزمان شیمی درمانی نیز بسیار موثر خواهد بود.
تشکر و قدردانی
بدینوسیله از زحمات آقای فراهانی کارشناس آزمایشگاه که ما را در مراحل مختلف این مقاله کمک و یاری نمودند تشکر و قدردانی می گردد. لازم به ذکر است که طرح مذکور با استفاده از حمایتهای مالی حوزه معاونت پژوهش و فناوری دانشگاه اراک انجام شده است.
- Zhang DS, Liu L, Jin LD, Wan ML, et al. Effect of phosphorus -32 aglass microspheres on human hepatocellular carcinoma in nude mice. World J Gastroenterol 2004;10:10551-4.
- Firusian N, Dempke W. An early phase II study of intratumoral P-32 Chromic phosphate injection therapy for patients with. Refractory Solid Tumors & Solitary metastasis. Cancer, Feb 1999; 85 (4), 480- 987.
- Bomford CK, Kunkler IH. Radiation physics, therapy and oncology. In Walter & Miller's Textbook of Radiotherapy. 6th ed. New York: Chuchill Livigstone; 2002. P. 246.
- Order SE, ASiegel JA, Principato R, Zerger LE, et al. Selective tumor irradiation by infusional brachytherapy in nonresectable pancreatic cancer: a phase I study. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1996; 36(5): 1117-26.
5. Russo J, Russo IH. Atlas and Histologic Classification of Tumors of the Rat Mammary Gland. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 2000; 5(2): 187-200.
6. Hamta A, Shariatzadeh SMA, Solimani M. Verification of some cancer markers and blood factors in DBMA induced breast cancer on SD rats. Journal of Behbod. 2012; 15(3): 200-207.[Persian]
7. Mccrea VR, Cornes P. The potential of intratumoural unsealed radioaetine Source therapy Eur J Nocl Med 2001; 28: 2867-9.
)