نوع مقاله : علمی - پژوهشی
چکیده
هدف: التهاب آپاندیس (آپاندیسیت) یکی از شایع ترین بیماریهایالتهابی شکمی است.عملکرد بافت آپاندیس بخوبی مشخص نیست. در این مطالعه جهت درک بهتر عملکرد ایمونولوژیک آپاندیس، الگوی فنوتیپیک و عملکردی زیر دسته های لنفوسیتی در بافت آپاندیس بیماران مبتلا به آپاندیسیت و افراد سالم مورد ارزیابی قرار گرفت.
مواد و روشها: نمونههایبافتی و سلولهای تک هستهای آپاندیس از 81 بیمار (با میانگین سنی 5/10±23) که از نظر کلینیکی به آپاندیسیت مشکوک بوده و تحت عمل جراحی قرار گرفته بودند، جمع آوری گردید. بر اساس آزمایشات هیستوپاتولوژیک، 25 بیمار دارای آپاندیس نرمال در حالی که 40 بیمار دارای آپاندیسیت ساپوراتیو و 16 بیمار دارای فرم گانگرنه بودند. خصوصیات فنوتیپی زیر دستهای لنفوسیتی در بافت با روش فلوسیتومتری سه رنگ مورد آنالیز قرار گرفت. پاسخ تکثیری سلولهای تک هسته ای بافت آپاندیس نیز با روش MTT سنجیده شد.
نتایج: در بین گروههای مورد مطالعه فراوانی سلولهای,CD19CD19/DR, HLA-DR در بافت آپاندیس بیماران مبتلا به فرم حاد آپاندیسیت (ساپوراتیو) در مقایسه با افراد واجد آپاندیس نرمال یا بیماران مبتلا به فرم گانگرنبه طور معنیداری بیشتر بود (01/0(p <.در بین گروههای مورد مطالعه میزان پاسخ تکثیری سلولهای بافت آپاندیس فرم ساپوراتیوبه میتوژنهایPHA و LPSدر مقایسه با گروههای دیگر بیشتر بود (01/0(p <.
نتیجه گیری: فنوتیپ و عملکرد لنفوسیتها در بافت آپاندیس نرمال با آپاندیس ملتهب متفاوت است. این نتایج نشان میدهد که بافت آپاندیس با پروفیل لنفوسیتی ویژه ممکن است در جلوگیری از برخی عفونتهایرودهای موثر باشد.
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
Function and Phenotype of Lymphocytes in Normal and Inflamed Appendix in Appendicitis Patients
چکیده [English]
Aim: Appendicitis is one of the most common abdominal inflammatory diseases. The function of appendix is not clearly defined. In this study to understand the immunological function of the appendix, we investigated the function and phenotypic pattern of lymphocyte in appendix of patients with normal and inflamed appendix tissue.
Material and Methods: Appendix tissue and appendiceal mononuclear cells obtained from 81 patients (mean age; 23±10.5), who was clinicallysuspected of having appendicitis were collected. Based on histopathological examination, twenty-five patients had normal appendix while 40 and 16 were diagnosed with suppurative and gangrene appendicitis, respectively. The phenotypic characteristics of lymphocyte subsets in appendix was analyzed using three color-flow cytometry. In addition, the proliferative response of tissue mononuclear cells was assayed by MTT method.
Results: A significant difference (p < 0. 01) was observed in the percentage of CD19/HLA-DR, HLA-DR and CD19 cellsfrom patients suffering from suppurative appendicitis in comparison with the patients having normal appendix or gangrene one. There was also a significant difference (p < 0.01) in the proliferative responses of the appendiceal mononuclear cells to PHA and LPS from pathients with suppurative appendicitis when compare with other groups.
Conclusion: The phenotypic and function of lymphocytes are different between normal and inflamed appendix tissue. These results showed that the appendix tissue with special lymphocyte profile may be effective in preventing or reducing intestinal infections.
کلیدواژهها [English]
- Appendix
- Appendicitis
- Phenotype
- Lymphocytes
- Proliferation
- flow cytometry
مقدمه
آپاندیس در قسمت انتهاییسکوم در هفته هشتم رویانی ظاهر میگردد. آپاندیسدارای منشا مشترک با ایلئوم و کولون بوده و بعد از تولد به علت رشد بیشترسکوم به طرف داخل سمت دریچهایلئوسکال جابجا میگردد. طول آپاندیسمیتواندکمتر از یکسانتیمتر تا بیش از 30 سانتیمترمتغیر باشد. طول اکثرآپاندیسهابین 6 تا 9 سانتیمترمتغیر است (1).
آپاندیسیت یکی از شایعترین علل حاد اندیکاسیونهای جراحی شکم در سراسر جهان است. آپاندیسیت عمدتا در دهه دوم و سوم زندگی رخ میدهد. شیوع آن بین سنین 10 تا 19 سال در بالاترین حد است و در این سنین 233 نفر به ازای هر 100000 هزار مبتلا به آپاندیسیت میشوند (2). هنوز علت روشنی برای آپاندیسیت بیان نشده است. برخلاف گذشته کهآپاندیسیک عضو زاید و بدون عملکرد مشخص در نظر گرفته میشد، امروزه یک عضو ایمونولوژیکمیباشدکه به عنوان یک بافت لنفوئیدی ثانویه وابسته به گوارش محسوب میشود(3). مطالعات اپیدمیولوژیک نشان میدهدکه ارتباط بالقوهایبینآپاندکتومی و کاهش ایجادبیماریالتهابی روده از جمله کولیت اولسراتیو وجود دارد (4 و 5). Jo و همکاران (4) با بررسی خصوصیات ایمونولوژیک و هیستولوژیک آپاندیس در بیماران مبتلا به کولیت اولسراتیو نشان دادند که لنفوسیت های موجود در بافت آپاندیس در فازی از فعال شدن وجود دارند که این امر زمینه را برای ایجاد التهاب روده فراهم میکند. به هر حال هنوز نقش آپاندیس و بیماریهای التهاب روده مشخص نشده است و لازم است مطالعات اپیدمیولوژیک و ایمونولوژیک بر روی فنوتیپلنفوسیتهای موجود در این بافت صورت گیرد. در مطالعه حاضر به بررسی عملکرد و فنوتیپلنفوسیتهای موجود در بافت آپاندیس سالم و آپاندیس ملتهب پرداخته شد.
مواد و روشها
در این مطالعه تجربی (مورد- شاهدی)81بیمارکه با تشخیصآپاندیسیت تحت عمل آپاندکتومی قرار گرفتند مورد مطالعه قرار میگرفتند. تمامی بیماران توسط متخصص جراحی معاینه و در پرسشنامه اطلاعات بیماران ثبت شد. معیار ورود به مطالعه: بیماران با شکم حاد که مشکوک به آپاندیسیت بود. بیمارانی که خود تمایل به شرکت نداشتند و بیمارانی که دارای سابقه جراحی شکمی یا مبتلا به بیماریهای عفونی و التهابی و یا سرطان بودند وارد مطالعه نشدند. از تمامیبیمارانشرکتکننده در طرح رضایت نامه اخلاقیکتبی گرفته شد. انجام این تحقیق با کد اخلاقی 2-87-89 مورد تصویب کمیته اخلاق پزشکی دانشگاه علوم پزشکی اراک قرار گرفت.
تهیه سلولهایتکهستهای از بافت آپاندیس:بیماران بر اساس پروتکلهایدرمانی تحت عمل جراحی قرار گرفتند. بلافاصله بافت در اتاق عمل در شرایط استریل به طور طولی برش داده شد و نیمی از آن جهت تشخیص نوع آپاندیسیت به پاتولوژیست ارسال گردید. بر اساس تشخیص پاتولوژیست نوع آپاندیس به سه گروه آپاندیس سالم (نرمال)، آپاندیسیت حاد و گانگرنه طبقه بندی گردید. نیم دیگر در بافر فسفات استریل غوطه ور و به آزمایشگاه منتقل شد. بافت آپاندیس در یک پلیت شیشه ای 30 میلیلیتر استریل حاوی محیط کشت RPMI-1640 توسط تیغ جراحی یا قیچی تیزبه قطعات ریز تبدیل شد. به منظور جداسازی قطعات بافتی هضم نشده،سوسپانسیون سلولی از یک توری سیمی بسیارریز عبورداده شد. سوسپانسیون سلولی دو تا سه بار با محیط کشت بدون سرم جنین گوساله(FCS) به مدت 5 دقیقه در دور g400-300 و دمای 4 درجه سانتی گراد شسته شد. رسوب سلولی بدست آمده در 4 تا 5 میلیلیتر محیط کشت بدون FCS حاوی 5 میلیمولارEDTA(به منظور جلوگیری از اتصال سلولها به یکدیگر و تشکیل کلامپ سلولی) مخلوط گردید. سوسپانسیون سلولی به آرامی بر روی 2 تا 3 میلیلیتر محیط گرادیان فایکول قرار داده شد. مجموعه فوق به مدت 15 دقیقه در دور g600 و دمای 20 درجه سانتیگراد سانتریفیوژگردید. بعد ازسانتریفیوژ، سلولهای با وزن حجمی بالا high density)) که غالبا شامل گلبولهای قرمز بودند در کف لوله رسوب کردند. سلولهای کم چگال(low density) شامل لنفوسیت و منوسیت در فاز بین محیط کشت و محیط گرادیان (interface) باقی ماندند. سلولهای بین فازی توسط پیپت پاستور از روی محیط گرادیان جمع آوری و در داخل یک لوله فالکون تمیز ریخته شد. سلولها 2 تا 3 بار با محیط کشت بدون FCS به مدت 5 دقیقه در دورg400-350 و دمای 4 درجه سانتیگراد شسته شدند. سلولهای تک هستهای بدست آمده در این مرحله جهت سنجش پاسخ تکثیری و فلوسیتومتری مورد استفاده قرار گرفتند.
بررسی پاسخ تکثیری: به منظور بررسی میزان تکثیر سلولی،سلولهای تک هستهای بدست آمده از بافت آپاندیس در مرحله قبلی یک سوسپانسیون با غلظت106×2-5/1 سلول بر میلیلیتر در محیط کشت حاوی 10 درصدFCS تهیه شد. میزان تکثیر سلولی، در پلیتهای میکروتیتراسیون96خانه به وسیله سنجشMTT ارزیابی شد. در هر حفره از پلیت 96 حفره ای، مقدار 100 میکرولیتر از سوسپانسیون سلولی فوق به صورت سه تائی ((triplicate ریخته شد و رقتهای 2000000، 1000000، 500000، 250000، 125000 و 62500 سلولی تهیه شد. به تمام حفره ها بجز کنترل مقدار 1 میکروگرم در میلیلیتر فیتوهماگلوتنین- آ (PHA) و یا لیپوپلیساکارید(5 میکروگرم در میلی لیتر)اضافه شد و میکروپلیتها در انکوباتور کشت سلول انکوبه گردیدند. بعد از 72 ساعت 10 میکرولیتر MTT(3-(4,5-dimethylthiazol–2)-2,5diphenyl tetrazolium) به غلظت 5 میلیگرم در میلیلیتر(Sigma-Aldrich, USA)به تمام حفرهها اضافه و به مدت 4 ساعت در انکوباتور کشت سلول انکوبه گردیدند (محلول استوکMTT با غلظت 5 میلیگرم در میلیلیتر در PBSبا pH حدود 8/6 تهیه شد و در 4 تا 8 درجه سانتیگراد و دور از نور نگهداری شد). سپس مقدار 100 میکرولیتر محلول SDS-HCl، به عنوان حلال کریستالهای ارغوانی فورمازان، به حفره ها اضافه و با سمپلربه خوبی مخلوط شد و بعد از 30 دقیقه در انکوباتور دمای 37 درجهسانتیگرادانکوبه گردید. سپس رنگ حاصل در 545 نانومتر قرائت شد.
بررسی مارکرهای سطحی با روش فلوسیتومتری: در این مطالعه از روش فلوسیتومتری مستقیم و چند رنگ (سه رنگ) جهت بررسی مارکرهای سطحی استفاده شد. سلولهای تک هسته ای بدست آمده از بافت آپاندیس با غلظت یک میلیون سلول در میلیلیتر در بافر فسفات سالین تهیه شد. جهت تعیین هر یک از مارکرها 100 میکرولیتر از سوسپانسیون سلولی در لولههای مربوطه ریخته شد و مقدار 1 تا 5 میکرولیتر از آنتی بادیهای منوکلونال ضد مارکرهایCD3, CD4, CD8, CD19, CD5, HLA-DR ( شرکت Bioscience– آمریکا) اضافه گردید. نمونه ها به مدت 30 تا 45 دقیقه در تاریکی و دمای 4 درجهسانتیگرادانکوبه شد. نمونهها دو بار با بافر فسفات شستشو داده شده و بلافاصله توسط دستگاه فلوسیتومتری سه رنگ , USA) (BD-FACSCaliburTMاز نظر مارکر های سطحی مورد بررسی قرار گرفتند.
تجزیه و تحلیل داده ها: اطلاعات به دست آمده از پرسشنامهها و نتایج آزمایشگاهی با استفاده از نرم افزار SPSS و روشهای آماری مناسب مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. جهت توزیع نرمال بودن داده ها از آزمون کای- دو استفاده شد. جهت مقایسه میانگین متغییر ها در بین گروههای مورد مطالعه از آزمون T- test استفاده شد. سطح معنیداری با (05/0(p<در نظر گرفته شد.
نتایج
مشخصات دموگرافیکگروههای مورد مطالعه
مشخصات بیماران مورد مطالعه بر اساس اشکال آپاندیسیت و توزیع جنس در گروهها در جدول 1 ذکر شده است.
جدول1: توزیع سنی در گروههای مورد مطالعه
تعداد |
زن |
مرد |
اشکال آپاندیس |
25 |
15 |
10 |
نرمال |
40 |
19 |
21 |
ساپوراتیو |
16 |
6 |
10 |
گانگرنه |
با بررسی درصد گلبولهای سفید و همچنین درصد نوتروفیل، لنفوسیت و ائوزینوفیل در بین گروههای مورد مطالعه مشخص گردید که از نظر آماری تفاوت معنی داری بین گروهها وجود ندارد (جدول2).
جدول2: میانگین سنی و درصد لکوسیتی در خون محیطی تمامی بیماران مورد مطالعه.
*N.S: Not significant, **:Std. Deviation
نوع آپاندیس |
|
سن |
گلبول سفید |
نوتروفیل |
لنفوسیت |
ائوزینوفیل |
Normal |
Mean |
20.1667 |
14.0778 |
78.1667 |
25.0000 |
2.1667 |
|
S.D** |
9.48218 |
3.56545 |
6.38242 |
38.56088 |
1.29479 |
Suppurative |
Mean |
22.8000 |
12.0867 |
79.4333 |
15.6667 |
1.7333 |
|
S.D |
10.35041 |
3.25722 |
9.08460 |
8.07864 |
0.82768 |
Gangrene |
Mean |
27.0909 |
15.1636 |
79.4545 |
16.3636 |
1.2727 |
|
S.D |
12.55750 |
3.79533 |
6.75816 |
5.74931 |
0.46710 |
p. value |
|
N.S* |
N.S |
N.S |
N.S |
N.S |
بررسی مارکرهای سطحی در بافت آپاندیس
نتایج حاصل از بررسی مارکرهای سطحی با روش فلوسیتومتری در بافت آپاندیس نشان داد که 40 تا 50 درصد لنفوسیت ها دارای مارکرCD19بودند (نمودار1). با مقایسه بین اشکال مختلف آپاندیس مشخص شد که تفاوت معنی داری (01/0 (p< در درصد سلولهایCD19 بین گروههای مورد مطالعه وجود داشت از نظر آماری درصد سلولهای CD19 بین گروه دارای آپاندیس سالم در مقایسه با گروه واجد آپاندیسیت حاد کمتر بود. در حالی که تفاوتی معنی داری در درصد سلولهای CD3 بین گروهها وجود نداشت. همچنین تفاوت معنی داری(001/0(p<در درصد سلولهایCD19/HLA-DR در بین گروه های مورد مطالعه مشاهده شد(جدول3).
نتایج نشان داد که در آپاندیسیت ساپوراتیو درصد سلولهای واجد مارکر های CD19 و HLA-DR در مقایسه با فرم گانگرنه بیشتر بود. در حالی که در فرم گانگرنه درصد سلولهای با فنوتیپCD3/CD4 بطور معنی داری بیشتر از فرم ساپوراتیو
بود (جدول3)
بررسی فنوتیپی سلولهای بافت آپاندیس در دو گروه نرمال و ساپوراتیو نشان از کاهش معنی دار (05/0 (p<سلولهای CD3/CD4 در بافت آپاندیسیت فرم ساپوراتیو در مقایسه با نرمال داشت. آنالیز آماری نشان داد که بین فنوتیپ سلولی در بافت آپاندیس سالم و گانگرن تفاوت معنی داری وجود ندشت (جدول3).
مقایسه تکثیر سلولی در خون محیطی و بافت آپاندیس
نتایج بررسی میزان تکثیر سلولی تحریک شده با فیتوهماگلوتنین(PHA) نشان داد که میزان تکثیر سلولی در فرم ساپوراتیو تفاوت معنیداری (02/0p=) با سایر گروههاداشت.همچنین میزان تکثیر سلولی تحریک شده با لیپوپلی ساکارید (LPS) نشان داد که میزان تکثیر سلولی در آپاندیس ساپوراتیو تفاوت معنی داری (012/0p=) در میزان تکثیر سلولی با سایر گرو هها مشاهده شد (نمودار2).
نمودار1: نتایج فلوسیتومتری سه رنگ زیر دست های لنفوسیتی در بافت آپاندیس نرمال: نتایج نشان داد که درصد زیادی از سلولهای بافت آپاندیس (3/74%) از نوع لنفوسیت بوده(A)، همچنین درصد لنفوسیتهایB و T نزدیک بههم می باشند (B). مقایسه زیر دسته های لنفوسیت T نشان داد که حدود 65 درصد CD4+ و حدود 8 درصدCD8+ هستند(C). حدود 5 تا6 درصد از لنفوسیت های B مستقر در بافت آپاندیس از نوع(D) B1(CD5+ B cell) و غالب لنفوسیتهاBمولکولهایHLA-DR را در سطح خود بیان میکنند(E).
جدول3: مقایسه میانگین درصد زیر جمعیتهای لنفوسیتی در بیماران مبتلا به آپاندیسیت و افراد دارای آپاندیس نرمال. اعداد بصورتمیانگین±انحراف معیار ارائه شده است.
CD markers |
Appendix tissue |
||
Normal |
Suppurative |
Gangrene |
|
CD3 |
51.65±11.68 |
46.50±13.85 |
54.25±7.81 |
CD4 |
43.76±10.01 |
36.53±12.67 |
44.06±11.58 |
CD8 |
8.75±4.77 |
10.68±9.42 |
7.75±1.84 |
CD5 |
53.04±12.42 |
41.28±17.92 |
52.33±13.88 |
CD19 |
37.40±16.42 |
43.00±14.87* |
30.62±13.60 |
CD19/CD5 |
5.83±1.88 |
5.85±2.78 |
5.18±1.12 |
DR |
41.45±15.33 |
46.94±15.19 |
35.62±7.19 |
CD19/HLA-DR |
27.50±15.51 |
34.43±16.22** |
29.62±7.96 |
001/0,** p<01/0*p< در مقایسه با گروه کنترل
نمودار2: مقایسه پاسخ تکثیری سلولهای تک هسته ای جدا شده از بافت آپاندیس در حضور و عدم حضور فیتوهماگلوتنین-آ(PHA) و لیپوپلی ساکارید (LPS). نشان داد که میزان تکثیر سلولی در فرم ساپوراتیودر حضور فیتوهماگلوتنین(PHA) و لیپوپلی ساکارید (LPS)تفاوت معنیداریبا سایر گروههاداشت.
بحث
نتایج مطالعه حاضر نشان داد که درصد لنفوسیتهایB در بافت آپاندیس 40 تا 50 درصد لنفوسیتها را شامل میشود. somekh و همکاران (6) نیز نشان دادند که 48 درصد لنفوسیتهای موجود در آپاندیس دارای فنوتیپCD19میباشد. در حالی در خون محیطی درصد این سلولها بین 15 تا 20 درصد می باشد(7). لنفوسیتهایB با تولید آنتی بادی به عنوان اصلیترین سلول در پاسخهای ایمنی هومورال نقش دارند(8). درصد بالای لنفوسیتهایB در بافت آپاندیس حاکی از نقش حساس این بافت در دفاع بر علیه عفونت های رودهای است.
Soo و همکاران (9) نتایج مشابه ای را گزارش دادند. همچنین آنهاگزارش کردند که درصد لنفوسیتهایB در بافت آپاندیس نرمال با آپاندیس ملتهب تفاوتی ندارد. در حالی که در مطالعه حاضر نتایج نشان داد که درصد سلولهایB در آپاندیسیت ساپوراتیو در مقایسه با فرم گانگرنه و آپاندیس نرمال بیشتر بود. این افزایش در تعداد سلولهایB در آپاندیس ملتهب (حاد) ممکن است ناشی از فعال شدن و یا ارتشاح این سلولها از خون محیطی به این بافت باشد. در خصوص ارتشاحلنفوسیتهایB از خون محیطی به بافت آپاندیس شواهد یا عدله اثبات شدهای وجود ندارد. لازم است مطالعاتی در این زمینه صورت گیرد.
لنفوسیت های B به عنوان یک سلول عرضه کننده آنتی ژن نیز عمل می کند. این سلولهای در سطح خود مولکولهایHLA-DR را بیان میکنند. بدنبال فعال شدن لنفوسیتهایB بیان این مارکر نیز افزایش می یابد(10). نتایج مطالعه ما نشان داد درصد سلولهای واجد HLA-DR در بافت آپاندیس بیماران مبتلا به آپاندیسیت در مقایسه با آپاندیس نرمال بیشتر بود. نتایج حاصل، این تئوری را تقویت میکند که در آپاندیس ملتهب یک پاسخ ایمنی رخ داده که سبب افزایش بیان HLA-DR و افزایش تعداد لنفوسیتهایB می شود. نتایج فلوسیتومتری نشان از بیان بیشتر مولکولHLA-DR در سطح لنفوسیتهایB در افراد مبتلا به آپاندیسیت داشت. این سوال مطرح است که علت فعال شدن لنفوسیتی چیست؟ هر چند علت دقیق آپاندیسیت مشخص نیست ولی برخی مطالعات قبلی نشان میدهد که بعضی از عفونت ها در ایجاد آپاندیسیت دخالت دارند(11و 12). افزایش این سلولها ممکن است ناشی از ایجاد یک پاسخ ایمنی موضعی در بافت آپاندیس باشد و این تئوری را تقویت میکند که ورود برخی عفونت ها به بافت منجر به التهاب آپاندیس میشود. جهت توجیح این فرضیه، در این مطالعه میزان تکثیر لنفوسیتی به طور غیر اختصاصی به دو میتوژنفیتوهماگلوتنین آ (PHA) و لیپوپلی ساکارید (LPS) مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان داد که پاسخ تکثیری در لنفوسیت های جدا شده از بافت آپاندیس فرم ساپوراتیو در مقایسه با گروه نرمال به PHA و هم به LPS بیشتر بود. این افزایش تکثیر میتواند ناشی از یک واکنش ایمنی در بافت آپاندیس این دسته از بیماران باشد. در هر صورت با توجه به ماهیت میتوژنها می توان این نتیجه را گرفت که هم ایمنی سلولی در پاسخ به PHA و هم ایمنی هومورال در پاسخ به LPS در بافت آپاندیس ملتهب (ساپوراتیو) افزایش می یابد که تا حدودی میتواند تاییدی بر این نظریه باشد که برخی از باکتریهای گرم منفی موجود در دستگاه گوارش و روده ها در ایجاد آپاندیست دخالت دارند(13و 14). برای قطعیت این فرضیه پیشنهاد میشود که میزان پاسخ تکثیری به طور اختصاصی بر علیه آنتی ژهای خاص میکروبی مورد ارزیابی قرار گیرد.
نتیجه گیری
فنوتیپ و عملکرد لنفوسیتها در بافت آپاندیس متفاوت از خونمحیطی است. فنوتیپ و عملکرد لنفوسیتها در بافت آپاندیس نرمال با آپاندیس ملتهب متفاوت است. این نتایج نشان میدهد که بافت آپاندیس با پروفیل لنفوسیتی ویژه ممکن است در جلوگیری از برخی عفونتهایرودهای موثر باشد.
تشکر و قدردانی
بدینوسیله از معاونت محترم آموزش و تحقیقات و مدیریت محترم پژوهش و همکاران محترم حوزه پژوهش و شورای محترم پژوهشی و همه عزیزانی که به نحو مقتضی در پشتیبانی علمی و مالی و اجرایی ما را کمک نمودند صمیمانه تقدیر و تشکر به عمل میآید.