نوع مقاله : علمی - پژوهشی
چکیده
هدف: هدف از این مطالعه بررسی تفاوت هفت رقم بذر سویاتحت کشت در ایران بر اساس الگوی پروتئین‌های ذخیره‌ای بذر با استفاده از روشSDS-PAGE می‌باشد.
مواد و روش‌ها: پروتئینمحلولکلدانه از هفت رقم سویا تحت کشت در ایران شامل: GK،L17 ،ساری،033،032،تلار و سحر استخراج و اندازه‌گیری شد.سپسالگویالکتروفورزیپروتئین‌هایذخیره‌ای دانه‌های هفت رقم سویا با روش SDS-PAGE بررسی گردید. تراکمنسبیباندهایپروتئینیبهوسیلهنرمافزار آنالیز شد. همچنینبرپایهحضوروغیابباندهاوباتحلیلخوشه‌ای،روابط خویشاوندیارقام سویا ارزیابیگردید.
نتایج: نتایج حاصل از آنالیز محتوای پروتئین کل دربذرهای هفت رقم سویا نشان داد که تنها در یک رقم محتوای پروتئین کل به صورت معنی‌داری نسبت به سایر واریته‌ها کمتر بود. در این مطالعهبر روی ژل 11 باند اصلی و پلی مورفیک برای بررسی تنوع ژنتیکی تشخیص داده شد و آنالیز گردید. در این باندها تفاوت در شدت بیان پروتئین‌ها در میان ژنوتیپ‌های مختلف مشاهده شد.روابطخویشاوندیمیان هفترقمسویابرپایهالگویپروتئینیدانه‌های سویابررسیگردید و رقم‌هایی که دارای بیشترین و کمترین شباهت بودند مشخص شدند.
نتیجه گیری: الگوی پروتئینی بذرهای سویا بر پایه حضور و عدم حضور باندهای پروتئینی می‌تواند تنوع ژنتیکی را مشخص سازد و همچنین شناساگرهای پروتئینی خاصی معرفی کند که در شناسایی ارقام مختلف استفاده گردد.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Application of Seed Storage Protein Marker for Identification of Seven Soybean (Glycine max) Cultivars
چکیده [English]
Aim: The purpose of this study is evaluation of seven different varieties of soybean seeds cultivated in Iran based on seed storage protein patterns using SDS-PAGE method.
Material and methods: First, total soluble protein extracted from seeds of seven different varieties of soybean cultivated in Iran including: GK, L17, Sari, 033, 032, Talar and Sahar were measured. The electrophoretic pattern of storage proteins of soybean seeds was evaluated by SDS_PAGE method. Relative density of protein bands was analyzed. Relationships among the seven varieties of soybeans were evaluated based on the presence or absence of protein bands and cluster analysis.
Results: Protein content of soybean seeds showed that total protein in only one variety decreased compared to other varieties. In this study, 11 polymorphic bands on a gel for evaluation of genetic variation were detected and analyzed. Differences in intensities of protein expression were observed among different genotypes. Relationships among the seven varieties of soybeans were studied based on protein patterns and the highest and lowest similarities among varieties were identified.
Conclusion: The protein pattern of soybean seeds based on the presence or absence of protein bands can identify genetic variation and will also introduce specific protein markers that might be used to identify different varieties.
کلیدواژه‌ها [English]
- electrophoresis
- Protein marker
- Soybean
مقدمه
سویا از محصولات مهم دانه‌های روغنی می‌باشد و در کشورهایی مثل ایران هم در فصل بهار و هم در فصل پاییز به خوبی رشد می‌کند. سویا از خانواده Fabaceae و تیره بقولات، گیاهی است یکساله به طول 50 تا 60 سانتی‌متر با برگ‌های سه قسمتی و دارای گل‌های کوچک سفید یا بنفش می‌باشد. این گیاه بهخاطر دانه‌های سرشار از پروتئین آن کشت داده می‌شود. محصولات سویا حاوی هر سه ماده غذایی اصلی یعنی پروتئین‌ها، کربوهیدرات‌ها و چربی بوده و همچنین حاوی سایر عناصر غذایی از جمله ویتامین‌ها، کلسیم، آهن، املاح معدنی و اسیدفولیک می‌باشد. این گیاه از نظر پروتئین بسیار غنی بوده و یک منبع خوبی از ایزوفلاون‌ها می‌باشد که دارای فواید زیادی در تامین سلامتی است. دانه سویا شامل آمینو اسیدهای سیستئین و متیونین است که بدن به هیچ وجه نمی‌تواند آنها را بسازد. سویا حاوی 40 تا 42 درصد پروتئین با کیفیت خوب و 18 تا 22 درصد روغن (شامل 85 درصد اسیدهای چرب اشباع نشده و فاقد کلسترول)می‌باشد و از لحاظ تغذیه‌ای در رژیم غذائی انسان مطلوب و حائز اهمیت است(1). سویا در میان لگوم‌های غذایی از محصولات مهم در سراسر جهان شناخته شده است. رقم‌های سویای کشت شده از نظر نوع و محتوای پروتئینی به میزان زیادی از یکدیگر متفاوتند. بنابراین درک تنوع ژنتیکی ارقام زراعی و ارتباط بین آنها ارزشمند است و سبب سهولت در انتخاب نوع رقم و انتقال ژن‌های مفید در میان ارقام کشت شده می‌گردد. همچنین حداکثر استفاده از منابع ژرم پلاسم در دسترس و موجود فراهم می‌شود. وسعت و محدوده تنوع ژنتیکی در ژرم پلاسم می‌تواند از طریق خصوصیات مورفولوژیکی ونشانگرهای ژنتیکی بررسی گردد. سپس نشانگر مشخص شده به اصلاح کنندگان گیاهان کمک خواهد کرد تا رقم‌های مناسبی برای برنامه‌های هیبریداسیون و دورگه گیری انتخاب کنند(2). به هر حال علی رغم اهمیت وجود تنوع ژنتیکی در میان گونه‌ها و کاربرد آن، هنوز ساختار ژنتیکی جمعیت سویا در آسیا نامشخص است(3).
تکنیک‌های مولکولی امکان بررسی ژنتیکی دقیق‌تر و بررسی عوامل محیطی تنوع را امکان پذیر می‌سازد و سبب دقت بیشتر در اندازه‌گیری و ارزیابی تنوع ژنتیکی می‌گردد.از میان تکنیک‌های بیوشیمیایی،انواع نشانگرهای DNA شامل RFLP، PBR، SSCP، DGGE، ARMS، AFLP، STSوALP، RAPD، DAF، و SCAR و میکرو ستلایت‌ها می‌باشند. البته استفاده از روش‌های نیازمند به این نشانگر‌ها اغلب پیچیده بوده ودر مقایسه با مارکرهای پروتئینی مستلزم صرف وقت و هزینه‌های بسیار زیاد می‌باشد (4). تکنیک الکتروفورز SDS-PAGE به طور وسیع برای بررسی تنوع پروتئینی دانه در محصولات زراعی استفاده شده است(4). این روش همچنین می‌تواند به عنوان یک ابزار مفید و مورد اطمینان برای تشخیص رقم‌های زراعی خاص استفاده گردد(5 و 6). پروتئین‌های ذخیره‌ای دانه به دلیل اینکه به میزان زیادی مستقل از نوسانات محیطی هستند برایمطالعهتنوعاتژنتیکیارزشمندترازپروتئین‌هایرویشی (vegetative proteins) می‌باشند(7).بررسی تنوع ژنتیکی و الگوی تنوع در جمعیت‌های سویا در آسیا تاکنون از طریق پروتئین‌های دانه انجام گردیده است (8 و 9). Dabhal (10) تنوع معنی‌داری در میان برخی رقم‌های سویا شناسایی کرد که سبب گروه بندی در 17 خوشه گردید. Bushehriو همکاران (11) پیشنهاد کردند که SDS-PAGE یک ابزار قوی برای شناسایی رقم‌های سویا در مقایسه با الگوی ایزوزیمی آنها می‌باشد. پروتئین‌های ذخیره‌ای دانه همچنین برای بررسی و مطالعه ارتباط تکاملی و فیلوژنی چندین محصول زراعی دیگر نیز به کار گرفته شده اند. برای مثالAhmad و همکاران (12) روابطفیلوژنتیکی را درمیانگونه‌هایCicerبراساسدادههایحاصل از SDS-PAGE گزارشوپیشنهادنمودند کهCicer reiculatumنیایوحشیارقامنخود(chickpea) است.
تحقیقاتی که روی ژرم پلاسم گیاهان زراعی صورت می‌گیرد می‌تواند تولید روغن خوراکی و ارزش تغذیه‌ای این محصولات را از نظر کیفیت روغن و پروتئین آنها افزایش دهد. در کشورهای در حال توسعه که تقاضای بالایی برای سویا وجود دارد چنین اطلاعاتی کمتر در دسترس می‌باشد. بر اساس مطالعات ما بررسی‌های دقیق در مورد تنوع ژرم پلاسم سویا بر اساس الکتروفورز پروتئین‌های بذر در ایران صورت نگرفته است. بنابراین هدف از مطالعه حاضر بررسی تنوع ژنتیکی و پروتئینی بذر هفت واریته مختلف سویا تحت کشت در ایران و گروه بندی آنها با استفاده از نشانگرهای پروتئینی، از نوع پروتئین‌های ذخیره‌ای بذر می‌باشد. اطلاعات حاصل می‌تواند در انتخاب ارقام سویا با اندوخته پروتئینی غنی‌تر برای کشت کمک نماید.
مواد و روش‌ها
ابتدا دانه‌های هفت رقم سویا به نام‌های GK،L17، ساری،033، 032، تلار و سحر از مرکز تولید دانه‌های روغنی وزارت جهاد کشاورزی استان اصفهان تهیه گردید. پس از جداسازی پوسته دانه‌های سویا، لپه‌ها و جنین موجود در آنها توسط نیتروژن مایع تبدیل بهپودر گردیدند. سپس جهت چربی زدایی پودرهایحاصله از هر رقم، به آنها استون سرد اضافه شد(13). پودرهای فاقد چربی دانه برای هر رقم سویا در دمای اتاق و به مدت 8 ساعت در جریانهوا خشک گردیدند. سپس به پودر های خشک شده هررقم، محلول 50 میلیمولار بافر تریس محتوی 1میلی مولار DTT، 2 میلی مولارEDTAو 2 میلی مولار مرکاپتواتانول 5/7 pH=به نسبت 1 به 20 وزنی/حجمی اضافه و به مدت 2 تا 3 ساعت بر رویشیکر مدلPOLE IPI PARS، با سرعت 50 دور در دقیقه(rpm) در دمای 4 درجهسانتیگراد تکان داده شدند(13). پسازاینمدتسوسپانسیون‌هایحاصلهبهمدت25دقیقهدر rpm10000 در4درجهسانتیگرادتوسط سانتریفوژ ساخت شرکت SIGMA مدل 3K20سانتریفوژ گردیدند. پسازاینمرحله،محلولروییازرسوبجداو پروتئین‌ها توسطاضافه نمودن استونبه نسبت 1 به 4 وزنی/حجمی رسوب داده شدند. رسوب‌های پروتئینی برای هر رقم سویا به مدت 25 تا 30 دقیقه در دمای 20- درجهسانتیگراد نگه‌داری شده و سپس بهمدت25دقیقهدرrpm10000 در4درجهسانتیگرادسانتریفوژگردیدند. در این مرحله پس از جداسازی محلولروییازرسوب،رسوب پروتئین‌ها در دمای اتاق و بهمدت1ساعتخشک شدند. رسوب پروتئینی هر رقم سویا در نهایت در 400 میکرولیتر از محلول استخراج ذکر شده، حل شده و سپس بهمدت15دقیقهدرrpm10000 در4درجهسانتیگرادسانتریفوژگردیدند. پسازاینمرحله،محلولرویی هر رقم سویا برایارزیابیپروتئیناستفادهشد. اندازهگیریپروتئین کل(میلیگرمدرگرمپودرفاقدچربی)براساسروش تغییریافته Bradfordبا استفاده ازآلبومین سرم گاوی (Bovine Serum Albomin)بهعنواناستانداردانجامگرفت(14).
آنالیز SDS-PAGE با استفاده از ژل متمرکزکننده(Stacking) با غلظت 5 درصد و ژل جداکننده(Separating) با غلظت 12درصد به وسیله تانک الکتروفورز ساخت شرکت PEQLAB مدل 1614-45 و با استفاده از مارکر پروتئینیPreotein ladder PLUS PS11 انجام گرفت(15). پس از الکتروفورزدر130ولت،باندهایپروتئینیبااستفادهاز نیتراتنقرهرنگآمیزیشده وتراکمنسبیباندهایپروتئینیبهوسیلهنرمافزار Image J آنالیز گردید.
همه آزمایش‌هادر3تکرارانجاموداده‌هاباکمکنرمافزارSASو آنالیز ANOWA و آزمون دانکن در سطح 05/0p<مقایسهگردیدند. همچنینبرپایهحضوروغیابباندهاوباتحلیلخوشه‌ایUGMA و استفاده از ضریب Jacardروابطخویشاوندیارقام سویا با کمک نرم افزار NTSYSpc2 ارزیابیگردید.
نتایج
نتایج حاصل از آنالیز محتوای پروتئین کل در بذرهای هفت رقم سویا به نام‌های GK(A)، L17(B)، ساری (C)، 033 (D)،032(E) ، تلار (F) و سحر (G)نشان داد که تنها در واریته C محتوای پروتئین کل به طور معنی داری کمتر از سایر واریته‌ها می‌باشد. در حالی‌که در بین سایر ارقام تفاوت معنی داری از لحاظ میزان پروتئین محلول مشاهده نشد(شکل 1).
آنالیز الگوی پروتئینی بذرهای هفت رقم سویا در شکل 2 الف و ب نشان داده شده است. بر اساس میزان حرکت نسبی پروتئین‌های دانه بر روی ژل، در این مطالعه 11 باند اصلی و پلی مورفیک برای بررسی تنوع ژنتیکی تشخیص داده شد و آنالیز گردید. پلی مورفیسم مشاهده شده در این باندها بر اساس تفاوت در تعداد و شدت بیان پروتئین‌های ذخیره‌ای بذر در میان ژنوتیپ‌های مختلف می‌باشد. الگوی پروتئینی دانه‌های هفت رقم سویا مشخص کرد که باند 2(با وزن تقریبی 130 کیلو دالتون) و باند 10(با وزن تقریبی 35 کیلودالتون) تنها در رقم B حضور داشته و بیان آنها در سایر رقم‌های سویا مشاهده نشد.
پس از بررسی میزان بیان باندهای پروتئینی مشخص گردید که باند 1(با وزن تقریبی 175 کیلو دالتون) در رقم‌های E و G و باند 3(با وزن تقریبی 62 کیلو دالتون)در رقم A قابل تشخیص نبوده در حالی‌که بیان این باندهای پروتئینی در سایر ارقام سویا مشاهده شد. سطح بیان باند 1 در رقم C در مقایسه با سایر ارقام به طور معنی داری بیشتر بود. باند 3 بیشترین بیان را در ارقام B وC و کمترین سطح بیان را در ارقام F و G نشان داد.
در مورد باندهای 4(با وزن تقریبی 60 کیلو دالتون) و 5( با وزن تقریبی 55 کیلو دالتون) و 6(با وزن تقریبی 51 کیلو دالتون) و 11 (با وزن تقریبی 25 کیلو دالتون) نیز بیشترین سطح بیان در واریته B مشاهده شد در حالی که باند 9(با وزن تقریبی 35 کیلو دالتون) کمترین سطح بیان را در واریتهB داشت.
در مورد باندهای 7(با وزن تقریبی 44 کیلو دالتون) و 8(با وزن تقریبی 40 کیلو دالتون) و 9 حداکثر میزان بیان پروتئین‌ها در رقمC مشاهده شد. کمترین سطح بیان باندهای 7و 8 و 11 مربوط به واریتهF بود.
دراینمطالعه،روابطخویشاوندیمیان هفترقمسویابرپایهالگویپروتئینیدانه‌های سویابررسی گردید. دندروگرامحاصلنشاندادکهرقم‌های E و G و رقم‌های C و D(با85 درصد شباهت) دارایبیشترینشباهتبایکدیگر هستند و پس از آن رقم‌های A و F(با بیش از 70 درصد شباهت) بیشترین شباهت را نشان دادند.درحالی‌کهرقم B کمترینشباهت(حدود 33 درصد)رابا سایرارقامداشت (شکل 3).
شکل 1: محتوای پروتئین محلول ذخیره‌ای دانه‌های هفت رقم سویا به ترتیب GK(A)، L17(B)، ساری (C)، 033 (D)، 032(E )، تلار (F) و سحر (G)، dp: پودر فاقد چربی(defatted powder).داده‌ها میانگین 3 تکرار SD±و حروف نامشابه نشان دهنده اختلاف معنی‌دار (05/0P≤) بر اساس آزمون دانکن می‌باشد.
شکل2 :الف-الگویالکترفورزی (SDS-PAGE)پروتئین‌هایذخیره‌ای دانهدررقم‌های سویابه ترتیب GK(A)، L17(B)، ساری (C)،033 (D)، 032(E) ، تلار (F) و سحر (G) و M: مارکرپروتئینی
شکل2:ب- آنالیزمیزاننسبیبیانپروتئین‌هایذخیره‌ای دانه دررقم‌هایسویابه ترتیب GK(A)، L17(B)، ساری (C)، 033 (D)، 032(E) ، تلار (F) و سحر (G). داده‌ها میانگین 3 تکرار SD±و حروف نامشابه نشان دهنده اختلاف معنی‌دار (05/0P≤) بر اساس آزمون دانکن می‌باشد.
شکل 3: دندروگرام بررسی روابط خویشاوندی بر اساس باندهای پروتئینی دانه در رقم‌های سویا به ترتیب:GK (A) ، L17(B)، ساری (C)، 033 (D)، 032(E) ،تلار (F) و سحر (G)
بحث
داشتن اطلاعات کافی در مورد درجه تشابه ژنتیکی در میان ژنوتیپ‌های مختلف گیاهان اهمیت خاصی در برنامه اصلاح گیاهان دارد. چنین اطلاعاتی برای شناسایی گروه‌های ناهمگون و انتخاب والدها در دورگه گیری و ایجاد هیبریدها مفید و با ارزش است(16). الکتروفورز پروتئین‌ها یک ابزار قوی برای تشخیص تنوع ژنتیکی است و مخصوصا SDS-PAGE پروتئین‌های دانه به عنوان یک تکنولوژی قابل اطمینان در نظر گرفته می‌شود. به دلیل اینکه اکثر روش‌های الکتروفورزی تولید تعداد زیادی باند بر روی ژل‌ها می‌نمایند که معمولا بیشتر از آن چیزی است که از طریق یک الگوی ایزوزیم به دست می‌آید(17). شناساگرهای مولکولی نظیر نشانگر DNA و نشانگر پروتئینی می‌توانند به عنوان ابزار مفید و قابل اعتماد در شناسایی و تعیین تنوع ژنتیکی و بررسی روابط خویشاوندی رقم‌ها و گونه‌های گیاهی استفاده شوند(18و 19). الگوی الکتروفورزی پروتئین‌ها می‌تواند باندهایی رابه عنوان نشانگر مولکولی معرفی نماید و در این خصوص بررسی الگوی الکتروفورزی پروتئین‌های ذخیره‌ای بذر به دلیل عدم تاثیر پذیری آنها از محیط اهمیت خاصی دارند(20، 21،22 و 23). از طرف دیگر پروتئین‌ها در بذرهای بالغ ثابت‌تر از بافت‌های رویشی گیاهی می‌باشند(24). بنابراین الگوی پروتئینی بذرهای سویا بر پایه حضور و عدم حضور باندهای پروتئینی به عنوان نشانگرهای پروتئینی می‌تواند تنوع ژنتیکی را در میان ارقام مشخص سازد. در این مطالعه حضور باند 2(با وزن تقریبی130 کیلو دالتون) و باند 10(با وزن تقریبی 35 کیلو دالتون) در پروتئین‌های دانه سویا رقم B می‌تواند به عنوان شناساگر پروتئینی برای این رقم سویا معرفی گردد. همچنین عدم حضور باند 1( با وزن تقریبی 175کیلو دالتون) در الگوی پروتئینی دانهدر رقم‌های E و G و عدم حضور باند 3(با وزن تقریبی 62 کیلو دالتون) در رقم A می‌تواند به عنوان نشانگر برای این ارقام پیشنهاد گردد.
مشابهبامطالعهحاضر،الگوهای SDS-PAGEپروتئین‌هایبذر بهعنوانشناساگرهایپروتئینیبرایشناساییومقایسهرقم‌های Poa pratensis (19)،جو دو سر (oat) (21)، گونه‌هایوحشیآلو (pronus) (25)،گونه‌هایTriticum aestivum (26 و 27)، رقم‌های Timothy(Phleum pratense)(28)، رقم‌هایبراسیکا (29) و گونه‌های پسته (30) استفادهشده‌اند.
نتایجبررسیروابطخویشاوندیبراساسالگویپروتئینیدانه‌هایارقام سویا نشاندادکهرقم‌های E و G و رقم‌های C و Dبیشترینشباهتورقم B کمترینشباهتراباسایرارقامدارد. مشابهبایافته‌هایماحضورویاعدم حضوربانددرالگویپروتئینیبهمنظورآشکارسازیپلی مورفیسمرقم‌های Brassica استفاده شده است(31). در مطالعه‌ای که بر روی ارقام مختلف سویا در کشور پاکستان و سایر ارقام از کشورهای دیگر صورت گرفت مشخص شد که تنوع ژنتیکی بین واریته‌های پاکستان و آمریکا خیلی بیشتراز تنوع ژنتیکی بین ارقام پاکستان و کره جنوبی و یا ژاپن بود (32). همچنین در تحقیقی دیگر بررسی تنوع ژنتیکی در میان ژنوتیپ‌های سویا با استفاده از تکنیک AFLP بر روی ارقام برزیل صورت گرفته است(16).
در کل نتایج به دست آمده از تحقیق حاضرنشان داد که تنوع کافی در مورد پروتئین‌های ذخیره‌ای دانه در میان ارقام سویا مورد مطالعه وجود دارد و می‌توان رقم‌های زراعی سویا را با این روش از یکدیگر جدا نمود. همچنین پیشنهاد می‌شود بر روی ژنوتیپ‌هاییکه الگوهای باندهای پروتئینی مشابهی دارند سایر آنالیزهای بیوشیمیایی و الکتروفورز 2Dصورت گیرد تا اختلاف احتمالی آنها نیز مشخص شود و مدیریت بهتر در مورد ژن بانک گونه‌های گیاهی صورت گیرد.
نتیجه گیری
با توجه به توضیحات ذکر شده می‌توان نتیجه گیری نمودکه الگوی باندهای پروتئینی و سطحبیان پروتئین‌های ذخیره‌ای بذر در ارقام مختلف سویا می‌تواند نشانگرهای پروتئینیخاصی معرفی نماید که در شناسایی ژنوتیپ‌ها استفاده گردد.
تشکروقدردانی
نویسندگان این مقالهلازممی‌داننداز خانم مهندس فاطمه رستمی بهخاطرهمکاری بااینپژوهشصمیمانهقدردانی نمایند.
- Aslam M, Mirza MS, Shah SM, Shafeeq S, et al. Crop Production Bulletin. Pak.Agric. Res. Council: Islamabad, Pakistan. 1995; 6: pg. 1.
- Ghafoor A, Zahoor A, Qureshi AS, Bashir M. Genetic relationship in Vigna mungo (L.) Hepper and V. radiata (L.) R. Wilczek based on morphological traits and SDS-PAGE. Euphytica. 2002; 123: 367-377.
- Abe J, Xu DH, Suzuki Y, Kanazawa A, et al. Soybean germplasm pools in Asia revealed by nuclear SSRs. Theor. Appl. Genet. 2003; 106: 445–453.
- Das S, Mukarjee KK. Comparative study on seed proteins of Ipomea. Seed Sci. Technol. 1995; 23: 501-509.
- Camps G, Vernetti Fde-J, Augustin E, Irigon D. Morphological and electrophoretical characterization of twenty soybean cultivars. Pesqui. Agropecu. Bras. 1994; 29(11): 1779-1787.
- Jha SS, Ohri D. Phylogenetic relationships ofCajanus cajan (L.) Millsp. (pigeonpea) and its wild relatives based on seed protein profiles. Genet.Resour. Crop Evol. 1996; 43: 275–281.
- Gepts P. Genetic diversity of seed storageproteins in plants. In: A.H.D. Brown, M.T. Clegg, A.L. Kahler & B.S. Weir (Eds.), Plant PopulationGenetics, Breeding and Genetic Resources. Sinauer Associates Inc., Sunderland,Massachusetts. 1989; 64-82.
- Han O, Abe J, Shimamoto Y. Genetic diversityof soybean landraces in Korea. Korean J. Crop Sci. 1996; 44: 256–262.
- Hirata T, Abe J, Shimamoto Y. Geneticstructure of the Japanese soybean population.Genet. Resour. Crop Evol.1999; 46: 441–453.
10. Dobhal VK. Genetic divergence in soybean.Legume Res. 1995; 18 (1): 29-34.
11. Bushehri SAA, Abd-Mishani C, Yazdi-Samadi B,Sayed-Tabatabaei BE. Variety specificelectrophoretic profiles of soybean cultivars.Iranian J. Agric. Sci. 2000; 31(1): 55-61.
12. Ahmad F, Slinkard AE. Genetic relationships in the genus Cicer L., as revealedby polyacrylamide gel electrophoresis of seed storage proteins. Theor Appl Genet. 1992; 84: 688-692.
13. Rostami F, Ehsanpour, A A. Application of silver thiosulfate (STS) on silver accumulation and protein pattern of potato (Solanum tuberosum L.) under in vitro cultivar. Malays Appl Biol. 2009; 38(2): 49-54.
14. Bradford M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976; 72: 248-254.
15. Hames, B.D. One-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, In: Gel electrophoresis of proteins. 2th Ed. Oxford University Press, New York.1990.
16. BonatoAV, CalvoII ES, Geraldi IO, Arias AA. Genetic similarityamongsoybean(Glycine max (L) Merrill) cultivars released in Brazil usingAFLP markers. Genet. Mol. Biol. 2006; 29(3): 692-704.
17. Nielsen G, Johansen HB. Proposal for the identification of barley varieties based on the genotypes for 2 hordein and 39 isoenzyme loci of 47 reference varieties. Euphytica. 1986; 35(3):717-728.
18. Criley RA, Roh, MS, Kikuchi M, Manshardt RM. A Comparison of Gardenia augusta cultivars using isozymes and RAPD markers. Acta Hortic. 2008; 766: 461-468.
19. Tamkoc A, Arslan E. Comparison of agronomic characters, total seed storage proteins and their use for genotypes discrimination in the kentucky bluegrass (Poa pratensis L.). Biotechnol Biotec Eq. 2010; 24(1): 1573-1576.
20. Jha SS, Ohri D. Phylogenetic relationships of Cajanus cajan (L.) Millsp. (pigeonpea) and its wild relatives based on seed protein profiles. Genet Resour Crop Ev. 1996; 43(3): 275-281.
21. Dvoracek V, Curn V, Moudry J. Suitability of oat-seed storage-protein markers for identification of cultivars in grain and flour samples. Plant, Soil Environ. 2003; 49 (11): 486-491.
22. Javid A, Ghafoor A, Anwar R. Seed storage protein electrophoresis in groundnut for evaluating genetic diversity. Pakistan J Bot. 2004; 36(1): 25-29.
23. Iqbal SH, Ghafoor A, Ayub N. Relationship between SDS-PAGE markers and Ascochyta blight in chickpea. Pakistan J Bot. 2005; 37(1): 87-96.
- 24. Magni C, Scarafoni A, Herndl A, Sessa F, et al. Combined 2D electrophoretic approaches for the study of white lupin mature seed storage proteome. Phytochem. 2007; 68: 997-1007.
25. Zeinalabedini M, Majourhat K, Khayam-Nekoui M, Grigorian V, et al. Comparison of the use of morphological, protein and DNA markers in the genetic characterization of Iranian wild Prunus species. Sci Hortic. 2008; 116: 80-88.
26. Fufa H, Baenziger PS, Beecher BS, Dweikat I, et al. Comparison of phenotypic and molecular marker-based classifications of hard red winter wheat cultivars. Euphytica. 2005; 145: 133-146.
27. Zeb A, Zahir A, Ahmad T, Abdumanon A. Physiochemical characteristics of wheat varieties growing in the same and different ecological regions of Pakistan. Pakistan J Biol Sci. 2006; 9: 1823-1828.
28. CaiQ, Bullen MR. Identification of timothy cultivars by. SDS-PAGE analysis of seed storage proteins. Can. J. Plant Sci.1992; 72: 1215-1222.
- 29. Rahman MD. Mukhlesur and Yutaka Hirata. Genetic Diversity inBrassica Species Using SDS-PAGE Analysis. J Biol Sci. 2004; 4: 234-238.
30. Ehsanpour AA, Shojaie B, Rostami F. Characterization of seed storage protein patterns of four Iranian Pistachios using SDS-PAGE. 2010; 2 (7): 737-740.
31. Sadia M, Salman AM, Rabbani MA, Pearce S R. Electrophoretic characterization and the relationship between some Brassica species. Electron J Bio. 2009; 5(1): 1-4.
32. Faisal MAM, Afsari SQ, Muhammad A, Muhammad R K, et al. Evaluation of genetic diversity in soybean (Glycine max) lines using seed protein Electrophoresis. Aust J Crop Sci. 2009; 3(2): 107-112.
)