نوع مقاله : علمی - پژوهشی
چکیده
هدف:هدف از این پژوهش استخراج و همسانهسازی ژن تروپینون ردوکتاز 2 (tr-II) در جهت آنتیسنس در ناقل دوتایی pBI121 جهت تهیه گیاهان تراریخت با توانایی کاهش آنزیم TR-II و تولید بیشتر آلکالوئیدهای هیوسیامین و اسکوپولامین در پروژه‌های آینده بود.
مواد و روش‌ها: RNA کل از ریشههای کشت شده گیاه بنگدانه بومی ایران استخراج و ژن هدف پس از ساخت cDNAو همسانهسازی در جهت آنتیسنس در ناقل دوتایی pBI121، به اگروباکتریوم تومیفسینس سویه GV3101 منتقل شد. درستی همسانهسازی به سه روش هضم آنزیمی، PCR و توالییابی نوکلئوتیدی مطالعه گردید. سپس خصوصیات بیوانفورماتیکی ژن مورد بررسی قرار گرفت.
نتایج: واکنش PCR، هضم آنزیمی و توالییابی نوکلئوتیدی درستی همسانهسازی ژن هدف را با سودمندی بالا تایید کرد. توالی نوکلئوتیدی نشان داد که ژن هدف بطول bp 783 بوده و باستثنای یک نوکلئوتید، مشابه با نمونه ثبت شده در بانک جهانی NBCI است و یک پروتئین با 260 اسیدآمینه را رمز میکند. وزن مولکولی و نقطه ایزوالکتریک پیش بینی شده پروتئین به ترتیب برابر 4/28437 دالتون و 46/5 بود. بررسی ساختارهای دو بعدی و سه بعدی نشان داد که پروتئین کاملا مشابه با آنچه که قبلا در پایگاه PDB ثبت شده بود، نبود. همچنین، نتایج بررسی‌های فیلوژنتیکی نشان داد که این ژن به گروه I تروپینون ردوکتازها تعلق دارد.
نتیجه‌گیری: با توجه به همسانه سازی موفقیتآمیز و مشابهت بالای توالی نوکلئوتیدی و پپتیدی ژنtr-IIبا نمونه‌های ثبت شده جهانی، انتظار میرود مراحل بیان ژن در نیل به هدف اصلی نیز با موفقیت همراه باشد.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Cloning and Study the BioinfomaticTrait of TropinoneReductase-II (TR II) Gene fromHyoscyamusniger
چکیده [English]
Aim: The purpose of present research was extraction and cloning of tropinonereductase-II gene (tr-II) at antisense direction in pBI121 binary vector to provide transgenic plants with low rate of tropinonereductase-II enzyme and high production of scopolamine and hyoscyamine for future projects.
Material and methods: Total RNA was extracted from Iranian native Hyoscyamusnigerroots, and the interest gene after cDNA synthesis and cloning at antisense direction in pBI121 binary vector, was transfered to Agrobacterium tumefacience. Accurate cloning was studied through 3 methods; enzymatic digestion, PCR and DNA sequencing. The bioinformatic characters of the gene were then surveyed.
Results: Three used methods confirmed true cloning in high efficiency. Nucleotide sequence of the gene revealed the 783 bp in length, encoding a polypeptide of 260 amino acid residues, with high similarity to that one registered in NCBI. The predicted molecular mass and isoelectric point of deduced polypeptide were 28437.3 Da and 5.46, respectively. Protein structures were not completely similar to those previously reported at PDB data base. Also, phylogenic study demonstrated that this gene belongs to the group I of TRs.
Conclusion: Due to successful cloning and high similarity of nucleotide and polypeptide sequences of gene with those recorded in world data bases; it is expected to get success in access to main purpose.
کلیدواژه‌ها [English]
- Agrobacterium
- Antisense
- Bioinformatics
- Cloning
- Hyoscyamusniger
- TropinonereductaseII
- TR-II
مقدمه
تروپان آلکالوئیدهای هیوسیامین و اسکوپولامین، ترکیبات هتروسیکلیک آمینی هستند که به عنوان متابولیت‌های ثانویه در تعدادی از گیاهان تیره سولاناسه، از جمله جنسهای Hyosyamus, Atropa, Scopolia, Mandragora و Duboisia هستند (1و2). این آلکالوئیدهاروی سیستم پاراسمپاتیک عمل کرده و در داروسازی به عنوان رفعکننده اسپاسم، تسکین دهنده درد و برای اتساع زیاد مردمک چشم بکار برده میشود (1، 2، 3، 4، 5 و6). این ترکیبات و سایر تروپان آلکالوئیدها بهطور عمده در ریشههای گیاهان خانواده سولاناسه از جمله شابیزک، تاتوره، بنگدانه و اسکوپولیا سنتز و از طریق آوندهای چوبی به دیگر اندام‌های گیاهی انتقال یافته و در بافت‌های مخزن در سلول‌های اپیدرم ذخیره می‌شوند (7، 8 و 9). در مسیر بیوسنتز تروپان آلکالوئیدهای یاد شده، آنزیمهای بسیاری دخیل هستند (10 و 11)، ولی در پایین دست تروپینون که یک ترکیب حدواسط کلیدی این مسیر بیوسنتزی محسوب میشود، دو تروپینون ردوکتاز 1 و 2 (TR-I و TR-II) در قرار گرفتن آن در دو مسیر متفاوت نقش مهمی دارند. تفاوت فاحش این دو آنزیم در وابستگی آنها به سوبسترای تروپینون میباشد. هر دو آنزیم متعلق به گروه B اکسیدوردوکتازها میباشند که نقش آنها در انتقال pro-s هیدروژن NAD(P)H به سوبسترای آنهامیباشد (1) و میل ترکیبی متفاوتی نسبت به تروپینون از خود نشان میدهند (TR-II میل ترکیبی بیشتری نسبت به TR-I دارد). تروپینون ردوکتازهای 1 و 2 وابسته به NADPH تشکیل دهنده یک نقطه انشعاب در بیوسنتز تروپان آلکالوئیدها هستند: آنزیم TR-I تروپینون را از طریق NADPH، گروه3- کربونیل تروپینون را به یک گروه α– هیدروکسیل، به تروپین کاتالیز میکند که در پایان مسیر به آلکالوئیدهای تروپانی هیوسیامین و اسکوپولامین ختم میشود، در حالی که آنزیم TR-II آن را با استفاده از NADPH احیا و پزودوتروپین به همراه یک گروه β- هیدروکسیلی و در نهایت آلکالوئید غیر تروپانی کالستیژن را تولید میکند (12و 13).
هاشیموتو و همکاران (14) دو آنزیم تروپینون ردوکتاز1 و 2 را از گیاه بنگدانه (Hyoscyamus niger) جدا سازی، خالصسازی و شناسایی کردند. آنها نشان دادند که این دو آنزیم مشخصات کینتیکی مشابه و بیوشیمیایی متفاوتی دارند. برای درک بهتر ساختار و تکامل روابط این ردوکتازها، ناکاجیما و همکاران (15) cDNA ژن عامل آنزیم تروپینون ردوکتاز2 مربوط به گیاه بنگدانه را سنتز و توالی یابی کردند و اعلام نمودند که اینژنbp1029 طول داشته و ازbp783 آن نسخه برداریمیشود و پپتیدی بهطول 260 اسید آمینه را رمز میکند.توالی آمینواسیدی آنزیم TR-II نشان داده است که این آنزیم متعلق به خانواده دهیدروژناز/ ردوکتاز رشته کوتاه(Short –chain Dehydrogenases/Reductases, SDR) میباشد. آنزیمهای خانواده SDR، برای واکنشهای آنزیمی خود نیاز به فلزات و یا پیوندهای سیستئینی ندارند. همچنین این آنزیمها د یک رشته Try-x-x-x-Lys دارند. عملکرد باقیماندههای حفاظت شده (تیرویزین، لیزین و همچنین سرین) از ساختار سه بعدی آنزیمهای SDR برای اولین بار در دهه 90 پیشنهاد شده است. تیروزین به عنوان یک کاتالیست اسید و باز عمومی عمل میکند که در آن لیزین و سرین این عمل را به ترتیب از طریق اثرات الکترواستاتیکی و پیوند هیدروژنی با تیروزین تسهیل میکنند (1).
هر چند در پایین دست آنزیم تروپینون ردوکتاز1 در مسیر تبدیل تروپین به اسکوپولامین آنزیمهای مهم دیگری از جمله هیوسیامین 6β- هیدروکسیلاز (Hyoscyamine 6β- hydroxylase, H6H) وجود دارند که تولید اسکوپولامین را کاتالیز مینمایند (16 و 17)، ولی آنزیم تروپینون ردوکتاز2 رقیب اصلی آنزیم تروپینون ردوکتاز 1 در انشعاب مسیر به سمت آلکالوئیدهای تروپانی هیوسیامین و اسکوپولامین و یا آلکالوئید غیرتروپانی کالیستژین میباشد.تحقیقات نشان داده است که کالیستژین نسبت به آتروپین و اسکوپولامین در سولاناسه به میزان بیشتری وجود دارد (18) و در زمان کوتاهی پس از تیمار پیشماده تروپینون در بافت‌های مختلف سولاناسه، پزودوتروپین سریعتر از تروپین تجمع می‌یابد (19).کای و همکاران (20) نشان دادند که در گیاه Anisodus acutangulus میزان بیان آنزیم TR-II به مراتب بیشتر از TR-I و بیان هر دو در تیمار با اسید جاسمونیک و همچنین در ریشههای مویین افزایش می‌یابد ولی با افزایش TR-II بیش از TR-I میباشد. بنابراین تصور میشود کاهش آنزیم تروپینون ردوکتاز2 میتواند در افزایش بیان ژن تروپینون ردوکتاز1 و در نتیجه افزایش میزان تروپان آلکالوئیدهای هیوسیامین واسکوپولامین نقش قابل توجهی داشته باشد (21). بدلیل اهمیت ذکر شده، در این مطالعه ژن تروپینون ردوکتاز2 (tr-II) از یک گونه گیاه بنگدانه بومی ایران جداسازی و به منظور کاهش بیان آن در جهت آنتی سنس همسانهسازی شد. همچنین برای آگاهی از ساختار شیمیایی و بیوشیمیایی ژن و پروتئین گیاه بومی و مقایسه آن با چند گیاه هم نام و مشابه خصوصیات شیمیایی، ساختار دوم و سوم و همچنین تکامل ژنتیکی آن مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روش‌ها
مواد گیاهی و جداسازی RNAکل: بذرهای گیاه بنگدانه (Hyoscyamus niger)، جمعآوری شده از اطراف شاهی جان پیرکوه، شهرستان سیاهکل استان گیلان، با کدگیاهی21161 از سازمان تحقیقات جنگل‌ها و مراتع تهیه و جهت تسریع در جوانه‌زنی با اسید جیبرلیک ppm 200 به مدت 48 ساعت تیمار (22) و پس از ضدعفونی بر روی محیط کشت جامد B5 بدون هورمون به مدت 4 روز کشت شدند. ریشههای به طول تقریبی 2 سانتی متر از بذر جدا و برای رشد و افزایش بیشتر به مدت 4 هفته در محیط کشت مایع B5 به همراه 1 میکرومولار هورمون IBA واکشت و بر روی شیکر با سرعت 100 دور در دقیقه و در تاریکی نگه‌داری شدند (23 و 24). RNA کل از بافت ریشه به روش لیتیوم کلراید (25 و 26) با کمی تغییرات استخراج شد. کیفیت و کمیت RNA استخراجی به ترتیب با استفاده از الکتروفورز روی ژل آگارز 2/1 درصد حاوی فرم آلدئید و اسپکتروفتومتر (labomed-UVD3200انگلستان) مورد بررسی قرار گرفت.
سنتز رشته اول cDNA: برای سنتز cDNA ژن عامل آنزیم تروپینون ردوکتاز 2، از آغازگر عمومی Oligo (dT)18 و آنزیم نسخه بردار معکوس RevertAidTM M-MuiV (شرکت فرمنتاز) استفاده و طبق دستورالعمل شرکت سازنده انجام گرفت.
طراحی آغازگرها و واکنش RT-PCR: با استفاده از توالی قطعه ژن مورد نظر از گیاه بنگدانه (Hyoscyamus niger) با توالی ژن HYSTR2A با شماره دسترسی L20485 که توسط ناکاجیما و همکاران (15) در بانک اطلاعاتی NCBI ثبت شده است، یک جفت آغازگر اختصاصی ژن عامل آنزیم تروپینون ردوکتاز2 حامل 11 جفت باز اختصاصی به همراه ترادف نوکلئوتیدی آنزیم برشی Xba I (با ترادف بازی آغازگر رفت5'-ATATCTAGAACCATGGCTGGCAG-3'و آغازگر برگشت3(5'-GGCGTCTAGATTAAAAACCACCAT- در پایانه 5' طراحی گردید. آغازگرها توسط شرکت metabion آلمان سنتز شدند. برای انجام واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR) از 5/2 میکرولیتر بافر10x PCR ، 1 میکروگرم cDNA، 75/1 میکرولیتر MgCl2 50 میلی مولار، 5/0میکرولیترdNTP 10میلی مولار، 1 میکرولیتر آغازگر رفت (pmol20)،1 میکرولیتر آغازگر برگشت ( pmol20)، 1 واحد آنزیمDNATaq پلیمراز در حجم کلی واکنش (25 میکرولیتری) استفاده گردید. برنامه چرخه‌ای PCR با آغازگرهای رفت و برگشت در 35 دور انجام گرفت. درستی بیان ژن تروپینون ردوکتاز II (tr-II ) توسط الکتروفورز ژل آگارز 2/1 درصد صورت گرفت. محصول PCR با استفاده از کیت استخراج DNA (شرکت سیناژن، تهران- ایران) خالص سازی شد.
همسانه سازی و توالی یابی DNA: محصول PCR و فاژمید (SK-) pBluescript II با استفاده از آنزیم Xba I هضم و قطعه مورد نظر با استفاده از آنزیمDNA لیگازT4 و مطابق روش توصیه شده توسط شرکت سازنده به فاژمید متصل گردید. پس از تهیه سلول‌های مستعد باکتری E. coli سویه DH5α در OD600=0.4 به روش قلیایی کلرید کلسیم (17)،فاژمید نوترکیب با استفاده از شوک حرارتی (27) به باکتری انتقال داده شد. سلول‌های باکتری تراریخت با استفاده از آزمون پلاک‌های سفید و آبی انتخاب (27) پس از کشت باکتری تراریخت، فاژمیدهای نوترکیب به روش قلیایی با SDS (28) با کمی تغییرات استخراج شدند. از تکنیک هضم آنزیمی و PCR با آغازگرهای اختصاصی برای بررسی کلونی‌های نوترکیب استفاده شد. جهت انجام هضم آنزیمی، 1 میکروگرم از محلول DNA پلاسمیدی به طور جداگانه با استفاده از 3 آنزیم محدود کننده Xba I، Hind III و Sac Iهضم (29) و محصول واکنش بوسیله الکتروفورز در یک ژل آگارز 5/1 درصد مورد بررسی قرار گرفت. پس از اینکه کلونی‌های نوترکیب با استفاده از PCR و هضم آنزیمی مورد تائید قرار گرفتند، صحت توالی همسانهسازی شده از طریق توالییابی DNA با استفاده از آغازگرهای راه انداز باکتریوفاژ T7 در دو جهت رفت و برگشت توسط شرکت Seqlab آلمان انجام شد.
ساخت سازواره نوترکیب pBI121 و انتقال به آگروباکتری تراریخت GV3101: با توجه به هدف پژوهش، ژن عامل آنزیم تروپینون ردوکتاز II با حذف ژن بتاگلوکورونیداز (GUS) در جهت آنتی سنس در درون پلاسمید بیان دو تاییpBI121 همسانهسازی گردید. بدین منظور فاژمید نوترکیب (pBluescript sk-) حاوی ژن هدف و پلاسمید pBI121وحشی با دو آنزیم برشی BamH I و Sac I هضم دوتایی شدند. برای انجام واکنش اتصال از کیتRapid DNA ligation kit (با شماره کاتالوگ K1421، محصول شرکت فرمنتاز) استفاده و مطابق توصیه شرکت سازنده آزمایش انجام گردید. از سازواره نوترکیب ساخته شده برای ساخت آگروباکتری تراریخت استفاده شد. بدین منظور ابتدا سلول‌های مستعد آگروباکتریومبهروش وایز، لیو و بینز (30) تهیه و سپس پلاسمید نوترکیب حاوی ژن مورد نظر به روش شوک حرارتی (30) به درون سلول‌های مستعد آگروباکتریوم منتقل گردید. پلاسمید نوترکیب با استفاده از محلول قلیایی و با استفاده از SDS استخراج و مورد مطالعه قرار گرفت (31).
برای مطالعه درستی همسانه سازی پلاسمید نوترکیب علاوه بر روش PCR، از هضم آنزیمی استفاده شد. برای انجام هضم آنزیمی از روش هضم دوتایی استفاده شد. بدین منظور 1 میکروگرم از محلول DNA پلاسمید نوترکیب با آنزیم BamH Iو Sac I عمل هضم دوتایی انجام و سپس محصولات واکنش به‌وسیله الکتروفورز در یک ژل آگارز 5/1 درصد مورد بررسی قرار گرفتند.
بررسی توالی و پیش بینی ساختارهای دوم و سوم پروتئین: توالی نوکلئوتیدی حاصل از فرآیند توالی یابی با استفاده از برنامه Translate(http://www.expasy.ch/tools/dna.html) ترجمه شده و خصوصیات بیوشیمیایی پروتئین بدست آمده با استفاده از برنامههای protparam (32) (http://www.expasy.org/tools/protpar-ref.html)،protscale(http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl) و TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services)مورد بررسی قرار گرفت. ساختار دوم توالی پروتئین با استفاده از برنامه SOPMA(http:/npsa-pbil.ibcp) و ساختار سوم آن با استفاده از برنامه I-TASSER ، SPDV Viwer و PYMOL تعیین گردید (33، 34 و 35).
بررسی فیلوژنتیکی: برای کسب اطلاع از توالی پروتئین های مشابه، توالی نوکلئوتیدی به دست آمده در بانک اطلاعاتی با استفاده از برنامه BLASTp در سایت (www.uniprot.org/blastp) مورد جستجو قرار گرفت. توالیهای پروتئینی که بیشترین تشابه را با توالی مورد نظر داشتند (جدول 1)، در ترسیم درخت فیلوژنتیکی با استفاده از نرم افزار MEGA 4 مورد استفاده قرار گرفتند (36 و 37).
جدول1: مشخصات توالیهای پروتئینی مورد استفاده در ساخت درخت فیلوژنتیکی به همراه شماره دستیابی موجود در پایگاه اطلاعات توالی NCBI GenBank.
|
شماره دستیابی |
نام ژن |
نام علمی |
ردیف |
|
P50164 |
tropinone reductase-II |
Hyoscyamus niger |
1 |
|
GenBank: AAA33281.1 |
tropinone reductase-I |
Datura stramonium |
2 |
|
GenBank: AAA33282.1 |
tropinone reductase-II |
Datura stramonium |
3 |
|
UniProtKB/Swiss-Prot: P50165.1 |
Tropinone reductase homolog; AltName: Full=P29X |
Datura stramonium |
4 |
|
GenBank: CAC19810.1 |
Tropinone reductase II |
Solanum tuberosum |
5 |
|
GenBank: CAC34420.1 |
tropinone reductase I |
Solanum tuberosum |
6 |
|
GenBank: AAN15454.1 |
putative tropinone reductase |
Arabidopsis thaliana |
7 |
|
GenBank: AAM10204.1 |
putative tropinone reductase |
Arabidopsis thalian |
8 |
|
GenBank: AAO42159.1 |
putative tropinone reductase |
Arabidopsis thaliana |
9 |
|
GenBank: ABG22470.1 |
Tropinone reductase, putative, expressed |
Oryza sativa Japonica Group |
10 |
|
GenBank: ABW74581.1 |
putative tropinone reductase |
Boechera divaricarpa |
11 |
|
XP_002280517.2 |
PREDICTED: tropinone reductase homolog |
Vitis vinifera NCBI Reference Sequence: |
12 |
|
NCBI Reference Sequence: XP_002277835.1 |
PREDICTED: tropinone reductase homolog At1g07440 |
Vitis vinifera |
13 |
|
GenBank: ACG34080.1 |
tropinone reductase |
Zea mays |
14 |
|
GenBank: ACG28624.1 |
tropinone reductase 2 |
Zea mays |
15 |
نتایج
پس از گذشت 4 هفته، توده‌ای از ریشه‌ها به وزن تقریبی 15 گرم در محیط کشت مایع B5 حاوی 1 میکرومولار هورمون IBA به‌دست آمد (شکل 1). نتایج حاصل از اسپکتروفتومتری و الکتروفورز ژل آگارز 2/1 درصد و فرمالدئید (شکل A2) نشان داد که استخراج RNA با این روش از کمیت (36/3 نانوگرم RNA به ازای 5/2 گرم بافت ریشه) و کیفیت قابل قبولی برخوردار است. در RT-PCR با استفاده از cDNA ساخته شده تنها یک باند قوی و تقریبا به طول bp783 در دمای اتصال 58 درجه سانتی‌گراد تشکیل شد (شکل B2). بازده تراریختی سلول‌های مستعد باکتری E. coli با استفاده از کلریدکلسیم 100 میلی مولار در OD600 به میزان 4/0 بوده و استخراج فاژمید نوترکیب با استفاده از روش SDS نیز با موفقیت انجام شد.
شکل 1:تشکیل کلون ریشه در محیط کشت مایع B5 همراه با1 میکرومولار IBA.
هضم آنزیمی فاژمید نوترکیب با استفاده از 3 آنزیم برشی Hind III، Xba I و Sac I، درستی ساخت فاژمید نوترکیب را تائید کرد. نتایج حاصل از PCR فاژمید نوترکیب، قطعه‌ای بهطول bp783 را ایجاد کرد که مطابق با طول قطعه مورد انتظار بود (شکلC2).
درستی همسانه سازی ژن هدف در جهت آنتی سنس در ناقل دوتایی pBI121 (شکل D2) و انتقال آن به درون اگروباکتریوم GV3101، با استخراج پلاسمید دو تایی نوترکیب و هضم آن با آنزیمهای برشی BamH I و Sac I ، با ایجاد دو قطعه با اندازه های تقریبی11200 و 840 جفت بازی به اثبات رسید (شکلC2).
نتایج توالییابی DNA، صحت قطعه همسانهسازی شده را تائید نمود. توالی قطعه ژن مورد نظر از گیاه بومی بنگدانه با توالی ژن HYSTR2A با شماره دسترسی L20485 که توسط ناکاجیما و همکاران (15) در بانک اطلاعاتی NCBI ثبت شده است، مورد مقایسه قرار گرفت. همردیف سازی توالی‌ها با استفاده از برنامه BLAST در بانک اطلاعاتی NCBI نشان داد که این دو توالی 99 درصد با یکدیگر مشابهت دارند. قطعه مورد نظر مشابه نتایج ناکاجیما و همکاران (15) یک پروتئین با 260 اسیدآمینه را کد مینماید. بررسی توالی اسیدآمینه ای نشان داد که در آن یک جایگاه فعال آنزیم به عنوان گیرنده پروتون و همچنین یک جایگاه اتصال سوبسترا وجود دارد (شکل 3).
شکل2: الکتروفورز محصولات RNA و DNA. A) 1 و 2 دو نمونه RNA استخراج شده از ریشه های گیاه بنگدانه. B) تکثیرcDNA ژنtr-II با استفاده از آغازگرهای اختصاصی و تکنیک PCR با دمای اتصال 58 درجه سانتی‌گراد: ستون1 باند قطعه هدف در تیمار هورمونی IBA. C)PCR اختصاصی فاژمید نوترکیب: ستون 1 فاژمید نوترکیب حلقوی (شاهد)، ستون 2 محصول PCR فاژمید نوترکیب با آغازگرهای اختصاصی ژن tr-II. D) محصول هضم آنزیمی پلاسمید نوترکیب pBI121 با آنزیمهای برشی BamH Iو Sac I: ستون 1 باندهای حاصل پس از هضم پلاسمید دوتایی pBI121 نوترکیب (حاوی ژن TR-II) و ستون2: باندهای حاصل پس از هضم پلاسمید دوتایی pBI121 غیر نوترکیب.
1 atggctggcaggtggaatcttgaaggctgcactgcccttgttactggtggctcgcgaggc
1 M A G R W N L E G C T A L V T G G S R G
61 atagggtatgggatcgtagaggaattagcaaatcttggagcatcagtttatacatgttca
21 I G Y G I V E E L A N L G A S V Y T C S
121 cgtaatcaaaaggagcttgatgagtgtttaactcaatggagaagtaaaggttttaatgtt
41 R N Q K E L D E C L T Q W R S K G F N V
181 gaagcttctgtttgtgatttatcatcaagatctgaacgagaagagtttatgaagactgta
61 E A S V C D L S S R S E R E E F M K T V
241 tctaatcatttccatggaaaactcaatattttggtaaataatgctggtattgtcatatac
81 S N H F H G K L N I L V N N A G I V I Y
301 aaggaagctaaagattacactatggaagattactctcatattatgagcataaactttgag
101 K E A K D Y T M E D Y S H I M S I N F E
361 gctgcttatcacttatctgtacttgcacatccctttttgaaggcatcagaaaggggaaat
121 A A Y H L S V L A H P F L K A S E R G N
421 gttgtatttatttcctccatttctggggcttctgcactaccatatgaggctgtttatgga
141 V V F I S S I S G A S A L P Y E A V Y G
481 gcaaccaaaggagcaatggaccaactgacaagatgcttggcgtttgagtgggcaaaggac
161 A T K G A M D Q L T R C L A F E W A K D
541 aatattcgtgtcaatggtgttggacctggggttattgcaacttctatggtcgaaatgact
181 N I R V N G V G P G V I A T S M V E M T
601 attcaagatccagaacaaaaagaaaacttggataagctgattgatagatgtgctctccgg
201 I Q D P E Q K E N L D K L I D R C A L R
661 cgaatgggagagcccaaagaacttgcagcagtggttgcattcctctgtttccctgctgct
221 R M G E P K E L A A V V A F L C F P A A
721 tcatatgtcactggccaaattatctatgttgatggtggatttatggctaatggtggtttt
241 S Y V T G Q I I Y V D G G F M A N G G F
781 taa(Stop codon)
شکل 3: توالی نوکلئوتیدی و پروتئینی ژن TR-II. توالیهای آبی رنگ: بخش ژنی توالیهای آغازگرهای رفت و برگشت؛ توالی پپتید راهنما بصورت زیرخط، آمینواسیدهای تیروزین و لیزین به عنوان باقیماندههای حفاظت شده در آنزیمهای متعلق به خانواده SDR به ترتیب با علامت مربع و دایره و اسید آمینههای موجود در جایگاههای اتصال و فعال به ترتیب با مثلثها سیاه و زرد رنگ نشان داده شدهاند.
بررسی خصوصیات بیوشیمیایی پروتئین بدست آمده با استفاده از برنامه ProtParam نشان داد که وزن مولکولی محاسبه شده و نقطه ایزوالکتریک پیش بینی شده توالی پروتئینی ژن هدف با فرمول مولکولی C1255H1963N341O381S16به ترتیب برابر 4/28437 دالتون و 46/5 میباشد. شاخص ناپایداری پروتئینها بیانگر میزان پایداری آنها در لوله آزمایش میباشد و پروتئینهایی با شاخص کمتر از 40 جز پروتئینهای پایدار تقسیم بندی می‌شوند. شاخص ناپایداری پروتئین مورد نظر در حدود 93/32 محاسبه گردید، با توجه به وجود یک اسیدآمینه حفظ شده متیونین در انتهای آمینوی پروتئین، نیمه عمر آن در محیط درون شیشه در حدود 30 ساعت محاسبه میگردد. عامل مهم در برآورد مقاومت پروتئینها در برابر حرارت، شاخص آلیفاتیک است. این شاخص در پروتئین تروپینون ردوکتاز II، 81/84 می باشد. الگوی آبگریزی که توسط ProtScale با استفاده از Kyte & Doolittle Hydrophobicity Scale محاسبه گردید، نشان داد که این پروتئین آبگریز بوده و از مجموع کل اسیدهی آمینه، 24 اسید آمینه بار الکتریکی مثبت (Arg+Lys) و 30 اسید آمینه دیگر بار منفی (Asp+Lys) دارند. همچنین با استفاده از برنامه TMHMM مشخص گردید که با توجه به داشتن دومین غشایی، آنزیم TR II مورد مطالعه یک پروتئین خارج سلولی است.
بررسی ساختار دوم پروتئین با استفاده از برنامه SOPMA نشان داد که این پروتئین دارای 5/55 درصد اسیدآمینه آبگریز و 5/44 درصد اسیدآمینه آب دوست است. پروتئین TR II حاوی 117 مارپیچ α (38/34 درصد)، 45 صفحه β (31/17 درصد)، 29 پیچ β (15/11 درصد) و 69 مارپیچ تصادفی (54/26 درصد) میباشد. این نتایج با ساختار دوم توالی پروتئینی ژن تروپینون ردوکتاز II در سه گیاه Hyoscyamus niger] با 117 مارپیچ α (38/34 درصد)، 45 صفحه β (31/17 درصد)، 29 پیچ β (15/11 درصد) و 69 مارپیچ تصادفی (54/26 درصد)[ ، گیاهDartura Strumonium] با 121 مارپیچ α (54/46 درصد)، 42صفحه β (15/16 درصد)، 22 پیچ β (46/8 درصد) و 75 مارپیچ تصادفی (85/28 درصد)[ و گیاه Solanum tuberosum] با 113مارپیچ α (30/43 درصد)، 44 صفحه β (86/16 درصد)، 25 پیچ β (58/9 درصد) و 79 مارپیچ تصادفی (27/30 درصد)[ بالاترین تشابه را نشان داد (شکل 4).
|
A |
|
|
B |
|
|
C |
|
|
D |
شکل 4: ساختار دوم پروتئین TR-II گیاه هدف با استفاده از برنامه SOPMA و مقایسه آن با توالی پروتئینی در سه گیاه دیگر: (A) Hyoscyamus niger (گیاه بنگدانه هدف)، (B) Hyoscyamus niger (گیاه بنگدانه موجود در NBCI)، (C) Datura strumonium و (D) Solanum tuberosum. مارپیچ α (خطوط آبی)، صفحه β (خطوط قرمز)، پیچ β (خطوط سبز) و مارپیچ تصادفی (خطوط بنفش).
پیشبینی ساختار سهبعدی توالی پروتئینی ژن تروپینون ردوکتاز II بوسیله برنامه I-TASSER نشان داد که این آنزیم حاوی 8 صفحه β و 12 مارپیچ α میباشد. نحوه آرایش مارپیچهای α و صفحات β در ساختار سهبعدی پروتئین این آنزیم به گونهای است که مارپیچهای α در سطح خارجی پروتئین و صفحات β در داخل پروتئین قرار گرفتهاند. صفحات β بطور موازی و هم جهت با هم قرار گرفته اند (شکل 5).
بررسی‌های فیلوژنتیکی توالی پلی پپتیدی تروپینون ردوکتاز II با توالیهای پروتئینی آنزیم تروپینون ردوکتاز در گیاهان دیگر با استفاده از نرم افزار Mega 4 و با روش Neighbor Joiningنشان داد که توالی پروتئینی تروپینون ردوکتاز II از سه گیاه Hyoscyamus niger, Dartura Strumonium و Solanum tuberosum در یک گروه (I) و توالی پروتئینی تروپینون ردوکتاز I از دو گیاه Dartura Strumonium و Solanum tuberosum در گروه مجزای دیگر(II) قرار دارند. بررسی فیلوژنتیکی توالی پروتیئنی تروپینون ردوکتاز I و II گیاهان خانواده سولاناسه نشان داد که از لحاظ تکاملی از یک جد مشترک میباشند (شکل 6) که باتوجه به اینکه تروپینون‌ردوکتازها در 64 درصدبنیان‌های آمینواسیدی مشترک بوده و متعلق به خانواده‌ی دهیدروژناز/ ردوکتاز زنجیره کوتاه(SDR) هستند، موید نتایج دیگران میباشد (13). هر چند تصور برخی این است که TRII آنزیمی است که از نظر تکاملی قدیمی‌تر بوده و TRI از آن انشعاب یافته است (38). همانطور که در درخت فیلوژنتیکی مشاهده میشود، آنزیم تروپینون ردوکتاز II استخراج شده از گیاه Hyoscyamus niger(Sample) در گروه I قرار دارد (شکل 6).
|
A |
|
B |
|
C |
|
D |
|
Tyr 159 |
|
Lys163 |
|
Asn 118 |
|
Ser146 |
|
E |
شکل5: مدلهای سهبعدی توالی پروتئینی ژن TR-II. A) مدل سهبعدی روبان (Cartoon) توالی پروتئینی با مارپیچهای α (قرمز)، صفحات β (زرد) و نواحی مارپیچ پیچیده (آبی)؛ B) آمینواسیدهای موجود در جایگاه اتصال به شکل گوی- میله (Ball-stick)؛ C) مدل سهبعدی توالی پروتئینی ژن TR-II با سطح جامد؛ (D اسیدهای آمینهLys ، Tyr ، Ser و Asn موجود در جایگاه فعال به شکل کروی (Sphere)؛ E)مدل سهبعدی توالی پروتئینی ژن TR-IIبه همراه سطح واندروالسی.
|
I |
|
II |
شکل 6: درخت فیلوژنتیکی ژن تروپینون ردوکتاز 1 و2 با توالیهای پروتئینی تروپینون ردوکتاز از گیاهان دیگر. شماره دستیابی ژن ها در جدول 1 آورده شده است.
بحث
اکثر محققان وجود میزان متعادل از اکسین و سیتوکنین را برای ریشه زایی و شاخه زایی لازم میدانند (39). اکسینها در تحریک تقسیم سلولی، افزایش طول سلولها، تحریک آغاز ریشه، تمایز یابی بافت‌های آوندی و افزایش حرکت مواد در آوندها نقش دارند (40). در تمامی مطالعات صورت گرفته توسط سایر محققین (24، 25، 41، 42 و 43) از محیط کشت B5 حاوی 1 میکرومولار هورمون IBA برای رشد ریشههای موئین استفاده گردید اما در این آزمایش از ریشههای گیاه غیرتراریخت استفاده شد. نتایج این تحقیق با مطالعات انجام گرفته توسط این محققین از نظر امکان تکثیر ریشه همسانی نشان داد، ولی با نتایج هیگا و همکاران (41) مشابهت بیشتری داشت.هر چند به نظر میرسد علاوه بر نوع گیاه (44)، نوع ریشه، سن ریشه (45)، ترکیب محیط کشت (46) نیز میتواند موثر باشد. ولی به هرحال نتیجه این تحقیق نشان داد که به منظور هدف مشابه میتوان از ریشههای تراریخت جهت تکثیر استفاده نمود.
کریستوسک و همکاران (46) بیان نمودند که روش استخراج با فنل- کلروفرم موجب تجمع RNA، حذف نواحی پلی (A) از انتهای mRNA میشود که با نتایج این آزمایش مطابقت دارد. ابراهیم‌زاده و همکاران (25) از دو روش استخراج با گوانیدین ایزوسیانات و شیب سزیم کلراید و فنل- کلروفرم برای استخراج RNA استفاده نموده و به این نتیجه دست یافتند که روش استخراج با شیب سزیم کلراید بهتر از روش فنل- کلروفرم است که مغایر با نتایج این آزمایش میباشد. این نتایج بیانگر این نکته میتواند باشد که احتمالا شرایط و شیوه انجام آزمایش نیز میتواند بر نتیجه آزمایش موثر باشد.
نتیجه RT-PCR حاصل از cDNA به‌دست آمده با طول bp783 با اندازه توالی ژن ثبت شده در بانک اطلاعاتی NCBI، 99 درصد مطابقت دارد.
انتقال پلاسمید به درون سلول های مستعد باکتری تکنیک کلیدی و مهمی در همسانه سازی مولکولی محسوب میشود. میزان بازده تراریختی بدست آمده در این تحقیق (4/0) با مقدار بدست آمده توسط کوهن و همکاران (45/0) (27) قابل توجه میباشد. همچنین این نتیجه با نتایج زیمینگ و همکاران (47) در روش مشابه و با استفاده از 75 میلی مولار کلرید کلسیم مطابقت داشت.
همانطور که در نتایج ذکر شد حضور قطعه ژن مورد نظر در فاژمید نوترکیب تهیه شده با استفاده از سه روش هضم آنزیمی، PCR و توالی یابی نوکلئوتیدی تائید شد. مقایسه توالی یابی قطعه ژن هدف مستخرج از بنگدانه بومی ایران و قطعه ژن ثبت شده در بانک اطلاعاتی NCBI نشان میدهد که احتمالا خاستگاه آنها یکسان باشد.
با استفاده از برش‌های آنزیمی، نقشه سازواره‌های ناقل دوتایی حاوی ژن هدف ترسیم گردید (شکل 7). همانطور که در شکل یادشده مشاهده میشود، ژن تروپینون ردوکتاز II در جهت آنتی سنس به جای ژن بتاگلوکورونیداز (GUS) قرار گرفته است. بههرحال تهیه موفقیت آمیز سازواره نوترکیب با جهت آنتیسنس ژن هدف امکان انتقال آن به گیاه بنگدانه و یا گیاهان مشابه تولیدکننده آلکالوئیدهای تروپانی هیوسیامین و اسکوپولامین و غیر تروپانی کالستیژن را فراهم نموده تا پس از بیان ژن هدف در سطح نسخهبرداری در گیاه بتوان میزان متابولیت‌های ثانویه هیوسیامین و اسکوپولامین و همچنین فعالیت آنزیم تروپینون ردوکتاز- II و دیگر آنزیم‌هایی موثر در مسیر بیوسنتزی تولید این متابولیت‌های ثانویه را دقیقتر بررسی نمود.
بررسی‌های حاصل از ساختار سه بعدی و نتایج حاصل از جایگاه اتصال و جایگاه فعال آنزیم با دادههای حاصل از یاماشیتا (1) مطابقت کامل ندارد که با توجه به شیوه مطالعه و تخمین ساختار نیاز به مطالعه دقیقتر میباشد.
|
BamH I |
|
tr-II |
|
Sac I |
شکل7: نمودار ترسیمی سازواره نوترکیب بیان: همسانه سازی ژن tr-II در ناقل دوتایی pBI121 در جهت آنتی سنس. سازواره شامل ژن گزارشگر نئومایسین فسفوترانسفراز 2 (NPT-II) برای مقاومت در باکتری و گیاه تحت کنترل پروموتر بیان NOS و ژن تروپینون ردوکتاز 2 (tr-II) (قطعه سنگین) تحت کنترل پروموتر بیان CaMV 35S، که در ناقل دو تایی pBI121 پس از حذف ژن β-GUS در جهت معکوس (آنتی سنس) بجای آن قرار گرفته است.
همانطور که پیشتر اشاره شد، تروپینون ردوکتاز II در گیاهH. niger در سطح آمینو اسیدی، شباهت بالایی به آنزیمTR-II در دیگر گیاهان خانواده سولاناسه داشته و در یک گروه قرار میگیرند، در حالیکه مجموعه آنزیمهای TR I در گروه مجزای دیگری جای گرفته اند و تنها حدود 66 درصد تشابه آمینواسیدی بین این دو آنزیم وجود دارد . این تفاوت میتواند بدلیل ساختار فضایی متفاوت در دو تروپینون ردوکتاز باشد که باعث قرار گرفتن آنها در دو گروه مجزا میشود. الگوی تکامل ژنتیکی بدست آمده در این مطالعه نشان داد که با نتایج کای و همکاران (48) مطابقت دارد.
نتیجه گیری
cDNA ژن عامل آنزیم تروپینون ردوکتاز 2 با توجه به RNA کل مستخرج از ریشههای گیاه بنگدانه بومی ایران، کشت شده در شرایط درون شیشه جداسازی و با در ناقل دوتایی pBI121 در جهت آنتیسنس همسانه سازی و سپس ناقل نوترکیب به اگروباکتریوم تومیفسینس سویه GV3101 منتقل شد. در نهایت خصوصیات بیوشیمیایی ژن مورد بررسی قرار گرفت.
همسانهسازی با موفقیت مورد تایید قرار گرفت و توالییابی نوکلئوتیدی نشان داد که توالی ژن هدف بطول bp 783 بوده و باستثنای یک نوکلئوتید، مشابه با نمونه ثبت شده در بانک جهانی NBCI است و یک پروتئین با 260 اسیدآمینه را رمز مینماید. علیرغم تشابه بالای توالی نوکلئوتیدی و پپتیدی، بررسی ساختارهای پروتئینی کاملا مشابه با آنچه که قبلا در پایگاه اطلاعاتیپروتئین PDB ثبت شده نبود. نتایج حاصل از بررسی‌های فیلوژنتیکی نشان داد که این ژن به گروه I تروپینون ردوکتازها تعلق دارد. با توجه به همسانه سازی موفقیتآمیز و مشابهت بالای توالی نوکلئوتیدی و پپتیدی ژنهدف با نمونه‌های ثبت شده جهانی، انتظار میرود مراحل بیان ژن در نیل به هدف اصلی نیز با موفقیت همراه باشد.
تشکر و قدردانی
بدینوسیله از جناب آقای دکتر حسن مداح عارفی (سازمان جنگل‌ها و مراتع) جهت اهدای بذرها گیاه بنگدانه و همچنین سرکارخانم دکتر قنادنیا و جناب آقای مهندس سلیمانی (کارشناسان محترم آزمایشگاه‌های کشت بافت و بیولوژی مولکولی) جهت همکاری در انجام این پژوهش، تشکر و قدردانی میشود.
)