نوع مقاله : علمی - پژوهشی
چکیده
هدف: لوسمی حاد پرومیلوسیتی شایعترین لوسمی حاد درمیان بزرگسالان است. امروزه ازD -آلفا توکوفرولسوکسینات(ویتامینE) جهت مهار تکثیر و القا مرگ سلولیدر درمان لوسمی استفاده میشود. با توجه به اینکه غلظتهای بالای ویتامینجهت القا مرگ سلولی دارای اثرات جانبی بوده و استفاده از دوزهای بالای آن امکان پذیر نیست، لذا سعی میشود با بکار بردن همزمان دوزهای پایین این ویتامین و ترکیباتی که دارای اثر ضد تکثیری هستند، توانایی آن را در مهار تکثیر و القا مرگ سلولی افزایش داد.
مواد و روشها:در این مطالعه رده سلولی HL-60 در محیط RPMIکشت داده شد. سپس اثرات ضد تکثیری و کشندگی غلظتهای مختلف زهر زنبور عسل(BV) وD-آلفا توکوفرول سوکسینات (VES)با استفاده از روش شمارش سلولی تریپان بلو و سنجش MTT مورد بررسی قرار گرفت.در نهایت داده‌ها با استفاده از نرم افزار instat3 و برنامه آماری one-way ANOVA آنالیز شدند.
نتایج:نتایج نشان دادند که اثرات ضد تکثیری و کشندگی سلولی ویتامین(VES) Eدر حضورزهرزنبور بطور چشمگیری افزایش یافت. به طور کلی، یافته‌های تحقیق حاضر نشان داد که غلظتهای پایین زهر زنبور عسل میتواند اثرات ضد تکثیری و کشندگی سلولی ویتامین Eرا بر روی سلولهای سرطانیHL-60 افزایش دهد.
نتیجه گیری: نتایج ما نشان میدهند که زهر زنبور عسل اثرات ضد تکثیری و کشندگی ویتامینE را درسلولهای سرطانی HL-60افزایش میدهد و امید است در آینده بتوان از این ترکیب جهت افزایشاثرات ضد تکثیری ویتامینها در دوزهایی که غیر سمی هستندو فاقد اثرات جانبی میباشند، استفاده نمود.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
The Anti- Proliferative and Lethal Effects of D-alpha Tocopheryl Succinate (Vitamin E Succinate) and Honey Bee Venom(BV) on Human PromyelocyteLeukemia Cell Line (HL-60)
چکیده [English]
Aim: Acute promyelocytic leukemia is the most common leukemia among adults. Nowadays vitamin E has been used for cancer treatment in research and clinical approach. Application of high concentrations of vitamin E to induce apoptosis have side effects so in this study we examined the effect of bee venom or vitamin E or both together on the induction of apoptosis in HL-60 cell line in order to increase anti-proliferative ability and reduce side effect of vitamin E.
Material and Methods:HL-60 cell line were cultured in RPMI medium and then treated with different concentrations of vitamin E and bee venom. The effect of bee venom and vitamin E on cell viability and proliferation were measured by MTT assay and cell counting trypan blue staining. Data were analyzed using one-way ANOVA test and Instate 3 software.
Result: Our results show that inhibitory effect of vitamin E increased dramatically in the presence of bee venom. On this basis we suggest that non- toxic concentration of bee venom can increase anti –proliferative activity of vitamin E on HL-60 cancer cells.
Conclusion: Our result show that non-toxic concentration of BV can increase inhibitory effects of vitamin E and it make hope that BV can increases the anti-proliferative potential of vitamins in non-toxicconcentration and concentration withoutside effectsin the future.
کلیدواژه‌ها [English]
- Anti- proliferative
- Bee venom
- HL-60 cell line
- Vitamin E
مقدمه
خون سازی نرمال یک فرایند دینامیک است که درآن سلولهای بنیادی خون ساز تمام سلولهای خونی از جمله گلبول قرمز،گلبول های سفید، پلاکتها و .... را تولید میکنند.این فرایندبه هماهنگی بین مسیرهای انتقال سیگنال تنظیمی فراوانی وابسته است که عملکرد منظم این مسیرها که درآنها پروتئینهای تنظیمی ایفای نقش میکنند، منجر به تولید سلولهای خونی باعملکرد مناسب میشوند (1) اختلال و ناهنجاری در هریک ازاین مسیرها منجربه ایجاد سلولهای نئوپلاستیک میشود که این اختلال به نوبهی خود منجر به اختلال در آپوپتوزیس،تمایز و تکثیرغیر قابل کنترل سلولهای خونی و پیشسازهای آنها میشود(2، 3، 4 و5).لوسمی حاد پرومیلوسیتی،سرطان خون غالب و بدخیم ترین نوع سرطان خود با خونریزی شدید در میان بزرگسالان استکه با تکثیر غیر قابل کنترل و عدم تمایز پیش سازهای نابالغ میلوئید (پرومیلوسیت) و تجمع این سلولها در مغزاستخوان مشخص میشود(6). سلولهای پرومیلوسیت ((HL-60در 95 درصد از بیماران مبتلا به سرطان حاد پرومیلوسیت دارای جابجایی کروموزمی مشخصی بین بازوهای بلند کروموزم 15 و 17 هستند که این جابجایی منجربه ایجاد پروتئین مرکب به نام PML-RARمیگردد. این پروتئین مرکب، سبب اختلال در مسیرهای انتقال سیگنال تنظیم کنندهی فرایند خونسازی و توقف پیشساز های نابالغ میلوئید (پرومیلوسیت) درمراحل اولیه تکوین (عدم تمایز به سمت سلولهای بالغ از جمله مونوسیت،نوتروفیل و ائوزینوفیل و ...) وتکثیر غیر قابل کنترل این پیش سازها میشود (7 و 8). درمان ایده آلی برای این سرطان تا بحال شناخته نشده است.هدف داروهای ضد سرطان بیشتر سنتز DNA و تقسیم سلولی است، درحالی که سلولهای سرطانی تنها سلولهایی نیستند که نیازبه تقسیم سلولی و سنتز DNA دارند(9). امروزه روشهای مختلفی در درمان سرطانخون بکار گرفته میشود. از جمله این روشها میتوان شیمی درمانی را نام برد.اما در این روش به دلیل غیر انتخابی بودن داروهای مورد استفاده، درصد زیادی از سلولهای سالم خون نیز به همراه سلولهای سرطانی از بین میروند (10 و 11). در سالهای اخیر تحقیقات قابل توجهی درمورداثر ضد تکثیری وکشندگی ویتامینها ازجمله ویتامین E برردههای مختلف سلول سرطانی دردرمان لوسمی حاد انجام شده است.- D آلفا توکوفرول سوکسیناتمشتق سنتزی ویتامینE میباشد که بیشترین میزان جذب را در بدن به خود اختصاص داده است.این ترکیب دارای توانایی مهار تکثیر والقا تمایزوالقامرگ سلولی درانواع ردههای سلول سرطانی است (12، 13، 14و 15). غلظتهای مورد استفاده این ترکیب جهت القا آپوپتوزیس درسلولهای سرطانی سمی میباشد(16).همچنیناین غلظتهامانع جذب ویتامین K (عدم انعقاد خون) وبه دنبال آن خونریزی و ایجاد زخم های گوارشی... در بیماران مبتلا به سرطان میشود. بنابراین این اثرات جانبی عامل محدود کننده در استفادهی بالینی ویتامین E در درمان سرطان میباشند (17 و 18).
ردهی سلولی HL-60 یک ردهیسلول سرطانی خون انسانی استکه از بیماران مبتلا به سرطان حاد پرومیلوسیت گرفته شده است.این سلولها درمرحلهی پرومیلوسیت تکوین سلولهای خونی متوقف شده و به صورت غیر قابل کنترل به تکثیر ادامه می دهند (19).مطالعات قبلی نشان میدهد که–Dآلفا توکوفرول سوکسینات(ویتامینE) دارای اثر مهار تکثیر و کشندگی بر ردهی سلولیHL-60 دارد. اما از آنجایی که غلظتهای مورد استفاده ویتامین E در القا مرگ سلولی والقا تمایز دارای اثرات جانبی است، برای مقابله با این محدودیت و حذف اثرات جانبی ویتامین راهکارهای دیگری ارائه شده از جمله اینکه موادی همراه با غلظتهایپائین ویتامین(غلطتهایی که غیر سمی و فاقد اثرات جانبی میباشند) به کار برده شوند،تااثر ضدتکثیری وکشندگی ویتامین را در سلولهای سرطانی بدون ظهور اثرات جانبی آن افزایش دهند.از جمله این مواد میتوان به زهر زنبور عسل اشاره نمود که اثرات ضد تکثیری و آپوپتوزی این ترکیب بر رده های مختلف سلول سرطانی اثبات شده است (20). زهر زنبور دارای بیش از 18 ترکیب فعال فیزیولوژیکی با خواص دارویی فراوان می باشد (21). برای اولین بارHavasدر سال 1950 اثر القایی آپوپتوزیس زهر زنبور را بر سلولهای سرطانی گزارش کرد (21).اصلیترین ترکیبات سمی زهر ملیتین و آنزیم فسفولیپاز A2 میباشند. ملیتین سبب فعال شدن آنزیم فسفولیپاز A2موجود در زهر میشودکه این آنزیم به نوبهی خود دارای اثرات سیتوتوکسیک بر روی سلولهای سرطانی میباشد (21). Moon وهمکارانش در سال 2006 نشان دادند که زهر میتواند آپوپتوزیس را در سلولهای لوسمی القا کند، در حالی که هیچ اثر سایتوتوکسیکی بر سلولهای نرمان خون موش ندارد.پیشنهاد شده که احتمالا زهراز طریق مکانیسمهایی چون آپوپتوزیس، نکروز و لیز سلولی سبب مهار رشد تومور میشود (22).با توجه به اثرات ضدسرطانی زهر زنبورعسل، این مطالعه باهدف بررسی بکارگیری توام غلظتهای مهارکنندهیتکثیرزهرزنبورعسل و ویتامینE به منظورافزایش توان ضد تکثیری ویتامین در غلظتهای فاقد عوارض جانبی انجام گرفت.
مواد و روشها
در این پژوهش تجربی ردهی سلولی HL-60) (NCBI Code: C217 از انستیتو پاستور ایران تهیه شد و در محیط کشت (RPMI1640 (Gibco, USA حاوی 20 درصد FBS ((Gibco,USA و U/ml 100 پنی سیلین و 100 میکروگرم در میلی لیتر استرپتومایسین در فشار5 درصدCO2 و دمای 37 درجه سانتیگراد در فلاسک 25 سانتی متر مکعب کشت داده شدند. زهر زنبور عسل ( (Sigma, UKبا غلظت اولیه 1میلی گرم تهیه و در 1 میلیلیتر PBS حل گردید و در دمای 40- درجه سانتیگراد نگه داری شد. - Dآلفا توکوفرول سوکسینات (ویتامین E) (Sigma, USA) با غلظتهای اولیه4 میلیگرم تهیه و در20 میلیلیتر اتانول مطلق حل گردید و در شرایط بدون نور در 4 درجه سانتیگراد به مدت یک ماه نگه داری شد. به منظور بررسی اثر زهر زنبور عسل،104×5 HL-60سلولبه ازای هر میلیلیتر محیط کشت شمارشو در پلیت 24 خانه با غلظتهای مختلف زهر زنبور عسل (1، 5/2، 5، 5/7، 10 و 20 میکروگرو در میلیلیتر) تیمار شد و بعد از طی بازههای زمانی مشخص (24، 48 و 72 ساعت) جهت تعیین اثر زهر بر زیستپذیریسلولها و همچنین جهت تعین غلظتهای مناسب زهر از روش های رنگ آمیزی تریپان بلوو سنجشMTT استفاده شد. همچنین جهت بررسی اثر ویتامین بر زیست پذیری سلول و تعیین غلظت مناسب ویتامینE، میزان104×5 سلول به ازای هر میلی لیتر محیط کشت شمارش و در پلیت 24 خانه با غلظتهای مختلف ویتامینE (1، 4، 6، 9، 12، 15، 18، 20، 25 و 30 میکروگرم در میلیلیتر) تیمارشد و درمدت 24، 48 و 72 ساعت با روشهای ذکر شده بررسی شد. برای رنگ آمیزی تریپان بلو، 10 میکرولیتر محلول سلول با 10میکرولیتر رنگ تریپانبلو مخلوط گردید. سپس با استفاده از شمارش سلولی با لام هموسیتومتر درصد سلولهای زنده محاسبه شد. برای انجام روش سنجش MTT، بعد از گذشت بازه زمانی معین به هر خانه از پلیت های 24 خانه 100 میکرولیتر از محلول MTT (Sigma, UK) با غلظت 5 میلیگرم در میلیلیتر(حل شده درPBS) در شرایط تاریکی افزوده شد و پلیت 4 ساعت دور از نور در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه گردید. سپس به هر خانه از پلیت،1میلیلیتر ایزوپروپانول اسیدی (Merck, Germany) افزوده شد. اسید موجود در ایزوپروپانول موجب لیز غشا سلول گردیده و بلورهای نامحلول (که در اثر احیا MTTتوسط سلول زنده ایجاد شدهاند) به محیط بیرون از سلول ریخته شده وایزوپروپانول بلورهای نامحلول فورمازان را به حالت محلول در آورد. پس از گذشت 7 تا 8 ساعت محتوی خانهها پیپتاژ شد و میزان جذب نوری در طول موج 570 نانومتر توسطدستگاه اسپکتروفتومتر((Milton Roy- Spectronic 21D- USAاندازهگیری گرفته شد. مطابق معادله زیر درصد بقا سلولها (Cell Viability) محاسبه گردید.
Viability=mean absorbance of sample/ mean absorbance of control ×100
LD50(دوز کشندگی) زهر زنبور و آلفا توکوفرول سوکسینات از طریق شمارش سلولی با تریپان بلو و سنجش MTTمحاسبه گردید. از محیط کشت خالی برای صفر کردن دستگاه و محیط کشت دارای سلول (نمونه کنترل) بدون حضور مواد مورد نظر بعنوان کنترل استفاده شد .تمامی تجربیات حداقل سه بار تکرار شدند.
آنالیز داده ها:
جهت تجزیه و تحلیل آماری داده‌ها و مقایسه میانگین‌ها از نرم افزار Instat3 و آزمون آماری پارامتریک One-way ANOVA استفاده شد. نمودارها از طریق نرم افزار EXCEL رسم شدند.
نتایج
اثر زهر زنبور عسل بر تکثیر ردهی سلولی HL-60
نتایج حاصلهازشمارش سلولهای رنگ آمیزی شده با تریپان بلو و سنجش MTT نشان دادند که زهر زنبور در غلطت های مختلف در بازهی زمانی مختلف دارای اثرات متفاوتی بر روی میزان تکثیر سلولهای HL-60 می باشد، به طوریکه زهر در غلظتهای بالای 15 میکروگرم در میلیلیتر دارای اثر کشندگی بسیار شدیدی بود و به محض اضافه نمودن زهر در این غلظتها لیز شدید سلولی مشاهده شد. غلظت 5/2 میکروگرم در میلیلیتر زهر زنبور پس از گذشت 72 ساعت تفاوتی در تعداد سلولهای مرده نسبت به نمونه کنترل ایجاد نکرد و مهار تکثیر نسبت به نمونه کنترل در سطح 001/0P<معنی دار بود (نمودار 1 و 2).
نمودار1: اثرغلظتهای مختلف زهر زنبورعسل (BV) بر تکثیرسلولهای HL-60 پس از طی ٢٤ٌ، ٤٨ و ٧٢ ساعت با استفاده از سنجشMTT.
001/0 ,***p <01/0**p <0در مقایسه با گروه کنترل، Mean ± SEM
نمودار 2: اثرغلظتهای مختلف زهر زنبور عسل (BV) بر تکثیرسلولهای HL-60( تعداد سلولها ×١٠٤) پس از طی ٢٤ٌ، ٤٨ و ٧٢ ساعت با استفاده از سنجشMTT..001/0 ,***p <01/0**p <0در مقایسه با گروه کنترل، Mean ± SEM
نمودار 3: اثرغلظتهای مختلف D-آلفا توکوفرول سوکسینات (VES) بر تکثیرسلولهای HL-60پس از طی ٢٤ٌ، ٤٨ و ٧٢ ساعت با استفاده از سنجشMTT.001/0 ,***p <01/0**p <0در مقایسه با گروه کنترل، Mean ± SEM
اثر D-آلفا توکوفرول سوکسینات (ویتامین (Eبر تکثیر رده ی سلولی HL-60
جهت بررسی اثرD -آلفا توکوفرول سوکسینات بر تکثیر سلولها و بدست آوردن غلظتهای سمی و غیر سمی، غلظتهای 4، 6، 9، 12، 15، 18، 20و30 میکروگرم در میلیلیتر بر سلولها اثر داده شد.نتایج بدست آمده از سنجش MTT ورنگ آمیری تریپان بلو نشان دادند که ویتامین در الگویی وابسته به زمان و دوزسبب القاء مرگ سلولی و یا مهار تکثیر میگردد. بدین صورت که غلظت 30 وغلظتهای بالاترازآن بیشترین میزان القا مرگ سلولی را به خود اختصاص دادند (نمودار4).
نمودار 4: اثرغلظتهای مختلف آلفا توکوفرول سوکسینات((VES برتکثیرسلولهای HL-60(تعداد سلولها ×١٠٤) پس از طی ٢٤ٌ، ٤٨ و ٧٢ ساعت با استفاده از روشتریپان بلو. 001/0 ,***p <05/0*p <، Mean ± SEM
اثر هم افزایی زهر زنبور وD-آلفا توکوفرول سوکسینات(ویتامینE) بر تکثیر و بقا سلولهای HL-60 :
جهت بررسی اثر هم افزایی زهر زنبوروD-آلفا توکوفرول سوکسینات بر میزان بقا و تکثیر سلولهایHL-60 ، غلظتهای 5/2 میکروگرم بر میلیلیتر از زهرو 4و6 میکروگرم بر میلیلیتر از ویتامین انتخاب شدند (این غلظتها موجب مهار تکثیر سلولها شده ودرعین حال اثرات سمی کمتری نسبت به غلظتهای بالاتر داشتند). بررسیاثر همزمان این دوماده نشان داد که میزان مهار تکثیر سلولی در زمان هم افزایی بطور معنی داری نسبت به زمان استفاده از هریک از این مواد به تنهایی افزایش یافت (نمودار5 و 6).
نمودار 5: اثرغلظت 5/2 میکروگرم در میلیلیتر زهر زنبور (BV) و غلظت های6و4میکروگرم در میلیلیتر آلفا توکوفرول سوکسینات (VES) بهصورت توام بر تکثیرسلولهای HL-60پس از طی ٢٤ٌ، ٤٨ و ٧٢ ساعت با استفاده از سنجش MTT.تعداد اولیه سلول ها 104×5 در هر میلی لیتر محیط کشت. 001/0 ,***p <01/0 , **p <05/0*p <، Mean ± SEM
نمودار6 :اثر غلظت 5/2 میکروگرم در میلیلیتر زهر زنبور (BV)و غلظت های6و4میکروگرم در میلیلیتر آلفا توکوفرول سوکسینات (VES) به صورت توام بر تکثیر سلولهایHL-60 پس از طی ٢٤ٌ، ٤٨ و ٧٢ ساعت با استفاده از شمارش سلولهای رنگ آمیزی شده توسط تریپان بلو. تعداد اولیه سلولها 104×5 در هر میلی لیتر محیط کشت. 001/0 ,***p <01/0**p <0در مقایسه با گروه کنترل، Mean ± SEM
بحث
نتایج حاصله از این پژوهش نشان داد که زهر زنبور عسل و آلفا توکوفرول سوکسینات در الگویی وابسته به دوز و زمان در غلظت های بالا سبب القا مرگ سلولی ودر دوزهای پائین سبب مهارتکثیر می شود. به این صورت که زهر زنبور در غلظتهای بالای10 میکروگرم در میلیلیتر دارای اثر کشندگی شدیدی بر روی سلولهایHL-60 است. زهر زنبور در دوزهای 5، 5/7 و 10 میکروگرم در میلیلیتر بصورت وابسته به زمان و غلظت باعث کاهش بقا سلولی گردید. زهر زنبور در غلظت5/2 میکروگرم در میلیلیتر در طی 72 ساعت بدون القا مرگ سلولی باعث کاهش معنی داری در میزان سلولهای زنده نسبت به نمونه کنترل گردید و بقایای سلولهای مرده در محیط تفاوتی با نمونه کنترل نداشت و به نظر میرسد این کاهش بیشتر مرتبط با مهار تکثیر بوده باشد نه مرگ سلولی. در بررسی اثر -Dآلفا توکوفرول سوکسینات بر روی سلولهای HL-60 مشاهده شد که آلفا توکوفرول سوکسینات در غلظتهای بالاتر از 30 دارای اثرات سیتوتوکسیک بر روی سلولهای HL-60 میباشد به طوری که بعد از 24 ساعت سلول زندهای در محیط مشاهده نشد. .غلظتهای4، 6، 9، 12، 15، 18، 20، 25و 30 میکروگرم در میلیلیتر -Dآلفا توکوفرول به صورت وابسته به زمان و دوز دارای اثر بر روی تکثیر ردهی سلولی میباشندبطوری که در غلطت20 بعد از گذشت 24 ساعت از تیمار و در غلظت 15 بعد از گذشت 48 ساعت و در غلظت12 پس از گذشت 72 ساعت از تیمار بقای سلولی به 50 درصد کاهش یافت.در غلظت بالای 30 ویتامین، لیز شدید سلولی مشاهده شد،بطوریکه پس از گذشت 24 ساعت تقریبا هیچ سلول زنده ای در محیط مشاهده نشد. با توجه به خاصیت ضد تکثیری زهر زنبور، در اینتحقیق زهر به عنوان یک گزینه مناسب جهت کاهش اثر سیتوتوکسیک غلظتهای بالایآلفا توکوفرول سوکسینات مورد توجه قرار گرفت. بدین منظور زهر زنبور بصورت توام با غلظت غیر سمیآلفا توکوفرول سوکسینات،جهت افزایش مهار تکثیر سلولهای HL-60 و کاهش اثرات جانبی غلظت بالای آلفا توکوفرولسوکسینات به کار گرفته شد. نتایج این هم افزایی نشان داد که استفاده از زهر زنبور با غلظت 5/2 میکروگرم در میلیلیتر وآلفا توکوفرول سوکسینات با غلظتهای 4 و 6 میکروگرم در میلیلیتر بصورت همزمان بدون داشتن اثر سیتوتوکسیک باعث افزایش مهار تکثیر سلولهای HL-60 شدندکه بیشترین اثر مهار تکثیر در غلظت 6 ویتامین و 5/2 زهر زنبور مشاهده شد. برای اولین بار نقش ضد سرطانی ویتامینE در سال 1960 نشان داده شد و مطالعات قبلی نشان دادند که مشتقات استری ویتامین E(آلفا توکوفرول سوکسینات) مهمترین ترکیب موثر در مهار تکثیر سلولهای سرطانی میباشند.Jenifer و همکارانش نشان دادند که آلفا توکوفرول سوکسینات در غلطت 15 پس از طی 48 ساعت بقاء سلولی را به60 درصد میرساند که این نیز با یافته‌های این پژوهش همخوانی داشت (23 و 24). این غلظت از آلفا توکوفرول سوکسینات سبب توقف سلولها در فازG2/M چرخهی سلولی می شود.هم چنین مطالعات قبلی نشان دادهاند که مشتق آلفا توکوفرول سوکسینات نسبت به سایرمشتقات دارای بیشترین اثر بر تکثیر ردهی سلولی HL-60 می باشد (25).به هرحال مکانیسمهای مولکولی سیگنالینگ سلولی که طی آنها آلفا توکوفرول سوکسینات سبب مهار تکثیر و القامرگ سلولی در ردههای مختلف سلولی می شود، به طور واضح مشخص نیست. مطالعات قبلی نشان دادهاند که سلول سرطانی به دلیل دارابودن pH اسیدی تری نسبت به سلول سالم میزان بیشتری از ویتامین را جذب می کند. Kozin و همکارانشنشان دادند که توکوفرول سوکسینات میتواند بطور قوی به صورت وابسته به pH مرگ سلولی را در سلولهای سرطانی پستان و خون القا کند (26). هم چنین نشان دادند که فعالیت پروآپپتوتیک این ترکیب با کاهش pH افزایش می یابد.در سال2007، Crispenو همکارانش پیشنهاد نمودند که آلفا توکوفرول سوکسینات از طریق مهار فعالیت فاکتور هسته ایkappa-β (NF-kβ) و مهار رونویسیAP-1 سبب مهار تکثیر سلولهای سرطانی میشود(27). فاکتور هستهای kappa-β بعنوان تنظیم کننده بیان بسیاری از ژنها از جمله آنزیم سیکلواکسیژناز-2 (هدف بسیاری از داروهای ضد سرطان) شناخته می شود و در تکثیر سلولی، پاسخ های التهابی وآپوپتوزیس دخیل است (28). بیان بالای این فاکتور در ردههای مختلف سلول سرطانی دیده شده است.این فاکتور منجر به تکثیر غیر قابل کنترل و مقاوم شدن سلولهای سرطانی در برابرعوامل القا کنندهیآپوپتوزیس میشود .Ni وهمکارانش(نشان دادند که آلفا توکوفرول سوکسینات از طریق مهار بیان پروتِئین های تنظیمی چرخه ی سلولی از جمله Cyclin D, E CDK 2,4و کاهش فسفوریلاسیون Rb سبب توقف سلولها در فاز S/G1 می شود(25). همچنین مطالعات قبلی نشان دادهاند که توکوفرول سوکسینات سبب تولید رادیکالهای آزاد در انواع سلولهای سرطانی میشود که به دنبال آن القا مرگ سلولهای سرطانی را منجر میگردد، این در حالی است که این ترکیب در سلولهای طبیعی نقش آنتی اکسیدانت را ایفا میکند.Gu و همکارانش(29) نشان دادند توکوفرول سوکسینات سبب افزایش فعالیت اسفنگومیلیناز در غشای سلولی میشود که در اثر فعال شدن این آنزیم، اسفنگومیلین غشای سلولی به اسپونژیومین هیدرولیز شده و به دنبال آن مرگ سلولی وابسته به اسپونژیومین آغاز میگردد.به این صورتکه اسپونژیومین سبب راه اندازی آبشاری از کاسپازهاو کاهش پایداری غشا میتوکندری،لیزورم وسپس مرگ سلولی می شود.هم چنین Neuzil و همکارانش نشان دادند که توکوفرول سوکسینات سبب فعال سازی PP2A (پروتئین فسفاتاز (2Aمیشود که این ترکیب منجر به دفسفوریلاسیون و غیر فعال شدن αPKC میشود که به نوبه خود سبب دفسفوریلاسیون و غیر فعال شدن پروتئینBcl-2 میگردد(30). در نهایت فعال شدن PP2A و غیر فعال شدن PKC سبب آزاد سازی سیتوکروم c از میتوکندری شده که سیتوکروم c به نوبه ی خود باApaf-1 و کاسپاز 9 جسم آپپتوتیک را تشکیل میدهند که این کمپلکس منجر به فعال شدن سایر کاسپازها از جمله کاسپاز 3 میگردد (30).بررسیهای متعددی خاصیت ضد تکثیری زهر را در ردههای مختلف سلول سرطانی نشان داده اند. زهر زنبور دارای توانایی القا آپوپتوزیس، نکروز و لیز سلولی در سلولهای سرطانی می باشد (31و32 و 33).kim پیشنهاد میکند که ملیتین موجوددرزهر زنبورازطریقفعال کردن فسفولیپاز A2 سبب القا مرگ در سلولهای سرطانیمی شود(32). بررسی دیگرینشان داد که ملیتین بعنوان یک مهار کننده کالمودولین، تکثیر را در سلولهای لوسمی انسان و موش مهار میکند(30).همچنینOrsolic و Liu نتایج جالبی را در مورد ارتباط بین مهارکننده های کالمودولین و مهار رشد سلول سرطانی گزارش کردند(20و31). هم چنین نشان داده شده که ملیتین و فسفولیپاز- A2 موجود در زهر در غلظت های غیر سمی، باعث مهار فعالیت فاکتور هستهای kappa-β و مهار m-RNA سیکلواکسیژناز-2 میشود (33). Park وهمکارانش نشان دادند که زهر زنبور با مهار فاکتور هستهایkappa-β باعث کاهش بیان آنزیم COX-2و سبب مهار تکثیر در سلولهای Raw 264.7 میشود(33). در سال 2006،Son و همکارانش نشان دادند که ملیتین موجود در زهر زنبور در الگویی وابسته به غلظت از طریق مهار فعالیت سیگنالهای Akt و فاکتور هستهای β -kappa و همچنین بالا بردن بیان پروتئینهای دخیل در آپوپتوزیس باعث مهار تکثیر سلولهای عضله صاف جداره عروق میگردد. نتایج حاصل از این پژوهش نیز نشان داد که زهر زنبور عسل تکثیر را در ردهی سلولی HL-60 مهار میکند که با تحقیقات انجام گرفته در رابطه با توانایی مهار تکثیر زهر زنبور مطابقت دارد (34).Zhu و همکارانشگزارش کردند که ملیتین در غلظتی که تکثیر را در سلولهای سرطانی مهار میکند بر روی مهار رشد سلولهای نرمال موثر نیست(36). SONو همکاران گزارش کردند که Dunn و Killionنشان دادند که حساسیت سلولهای لوسمی سرطانی L1210نسبت به سلولهای سالم DBA/2 طحال موش به اثرات سمی ملیتین 2تا 4 بار بیشتر است(34).
Jangو همکارانش اثر زهر را در مهار COX2 و القا آپوپتوزیس در ردهی سلولیNCI-H1299 مربوط به سرطان ریه گزارش کردند(37).هم چنین Moon و همکارانش با بررسی اثر زهر زنبور بر رده ی سلولی میلوئیدی U937 به این نتیجه رسیدند که زهر زنبور سبب کاهش بیان پروتئین های ضدآپوپتوزیس از جملهBcl-2 , Bcl-x1 , و سبب فعال شدن کاسپازهای 3 و 9 در این رده سلول سرطانی می شود(22).مطالعات اخیر فعالیت ضد توموری زهر زنبور را در محیطinvivo و in vitro نشان دادهاند و بیان میکنند که زهر زنبور میتواند بعنوان یک عامل در درمان سرطان استفاده شود (37). با توجه به مسیرهایمولکولی دخیل در مهار تکثیر سلولی و القا آپوپتوز توسط زهر زنبور و آلفا توکوفرول سوکسینات میتوان گفت که عملکرد زهر زنبور و آلفا توکوفرول سوکسینات در چندین مسیر در طول مهار تکثیر و القا آپوپتوزیس مشابه می باشد. بنابراین می توان بیان نمود که زهر زنبور در غلظتهای غیر سمی و مهاری میتواند از طریق مهار فعالیت فاکتور هستهایkappa-β و کاهش بیان COX-2، کاهش بیان پروتئینهای ضد آپوپتوزیس از جمله Bcl-2 , Bcl-x1 موجب افزایش اثر مهار تکثیری آلفا توکوفرول سوکسینات بر روی سلولهای سرطانی HL-60 شود (38).
با توجه به اینکه نتایج این پژوهش همسو با نتایج سایر تحقیقات انجام شده در این زمینه میباشد، به منظور تکمیل نتایج و جامع تر شدن ابعاد این بررسی، پیگیری موضوعات زیر پیشنهاد میشود:
1- بررسی فعالیت فاکتور هستهایkappa-β و بیان آنزیم COX-2 در هم افزایی دو ترکیب ذکر شده.
2- با توجه به موفق بودن درمان ترکیبی در درمان لوسمیحاد بررسی اثر همافزایی زهر زنبور ویتامین E در سطح in-vivo.
3- بررسی بیان فاکتورهایی چون Bcl-2 , Bcl-x1 در هم افزایی دو ترکیب ذکر شده.
نتیجه گیری
نتایج حاصل از این پژوهش تائید کننده اثر مهاری زهر زنبور عسل وآلفا توکوفرول سوکسینات بر تکثیر رده سلولی HL-60 میباشد.مقایسه اثرهمافزایی زهر زنبور و-D آلفا توکوفرول سوکسینات با اثر منفرد هر یک از این مواد نشانمیدهد که زهر زنبور موجب افزایش اثر مهار تکثیری آلفا توکوفرولسوکسینات میشود. افزایش اثر مهارتکثیری ویتامینE بر ردهی سلول سرطانی HL-60 توسط زهر زنبور تاکنون درهیچ مطالعهای بررسی نشده و برای اولین باردراین پژوهش مورد بررسی قرار گرفته است. لازم به ذکر است که نتایج این مطالعه حاصل کار در محیط آزمایشگاهی است و لزوم انجام تحقیقات بیشتر مورد تاکید میباشد.
تشکر و قدردانی
این تحقیق در آزمایشگاه زیست شناسی سلولی تکوینی دانشکده علوم زیستی دانشگاه خوارزمی انجام شد. مولفین بر خود لازم میدانند از پرسنل آزمایشگاه و ریاست دانشکده علوم زیستی، سپاسگزاری نمایند.
)