باززایی

باززایی غیرمستقیم (ازکالوس) با کاربرد تنظیم­کننده‌ رشد BA (1میلی‌گرم در لیتر) همراه با NAA (2/0 و 5/0 میلی‌گرم در لیتر) نتیجه مطلوبی را داشت. به‌طوری‌که در این غلظت تنظیم­کننده‌های رشد، مقدار کالوس‌های باززایی شده 2/83 و 6/81 درصد بود. همچنین کاربرد تنهای BA موفقیت‌آمیز نبود به‌طوری‌که کمترین مقدار باززایی در غلظت 1 و 5/1 میلی‌گرم در لیتر BA مشاهده شد(شکل 1).

بحث

یکی از پارامترهایی که در تکنیک کشت بافت اهمیت دارد مسئله تولید شاخه جانبی می­باشد، زیرا در مرحله واکشت نمونه­ها، شاخه­های جانبی تولید شده را می­توان جدا کرد و هر یک را به‏عنوان یک نمونه در محیطی جداگانه کشت نمود. حتی در برخی موارد که رشد شاخساره­ها قوی باشد از هر شاخساره می­توان چندین ریزنمونه تهیه کرد و با این کار سرعت تکثیر بسیار افزایش می­یابد. نتایج به‏دست آمده از تحقیق حاضر نشان داد که در غلظت­های پایین نتایج بهتری را می­توان در رابطه با شاخه­زایی به‏دست آورد. AL- Sulaiman و همکاران (20) گزارش کردند که مقادیر کم سیتوکنین­ها برای شاخه­زایی عناب مناسب می­باشد.

Muna و همکاران (21) گزارش کردند در محیط حاوی مقادیر کم NAA و IBA به‏ویژه زمانی که در ترکیب با غلظت­های بالای BA همراه هستند، تشکیل کالوس اتفاق افتاده و شاخه­های نابجا تمایز می­یابند. Eliasson و Nordstrom (22) نیز گزارش کردند که در محیط حاوی BA شاخه­زایی زیادی اتفاق می­افتد. نقش BA در محیط کشت، شکستن غالبیت انتهایی و تحریک رشد شاخه­های جدید است. اثر آشکار دیگر حضور BA در محیط کشت، اثر بازداندگی آن در تشکیل ریشه می­باشد. این نتایج با یافته­های ما در این مطالعه هم­خوانی دارد.

Afzalifar و همکاران (15) طی آزمایشی BA را به‌منزله­ی موثرترین تنظیم­کننده رشد در پرآوری دو گونه مرزه معرفی کردند. در آزمایش آن‏ها، بیشترین تأثیر را غلظت 2 میلی‌گرم در لیتر BA از خود نشان داد. این بدان معناست که مرزه به غلظت‌های متوسط به بالای سیتوکنین از نوع BA جواب­دهی بهتری از خود نشان می‌دهند. در صورتی‌که در پژوهش حاضر در پونه­سای بی­کرک BA به‌تنهایی نتیجه مطلوبی را به‏همراه نداشت. همچنین آن‏ها بیان کردند که در بین سیتوکنین‌های آزمون شده، کینتین در پرآوری کمترین اثر را داشته است که با نتیجه پژوهش ما در پونه­سای بی­کرک کاملا مطابقت دارد (جدول 3). آن‏ها گزارش کردند که طویل‌ترین شاخه در ریزازدیادی مرزه در تیمار 2 میلی‌گرم در لیتر BA مشاهده گردید که مطابق با نتایج به‌دست‌آمده در پژوهش حاضر در پونه­سای بی­کرک است. مطالعات انجام ‌شده درباره اثرات تنظیم­کننده­های رشد سیتوکینینی بر ریزازدیادی گیاهان مختلف حاکی از تأثیر بیشتر و بهتر تنظیم­کننده رشد BAP در مقایسه با سایر تنظیم­کننده‌های رشد مورد مطالعه است که موید نتایج به‌دست‌آمده است (23). در مطالعه Shafie Haji Abad و همکاران (24) بر پرآوری ریز نمونه‌های سرخس بوستونی، بیشترین تعداد شاخساره را در محیط کشت حاوی غلظت‌های 1 و 2 میلی‌گرم در لیتر BAP به‏دست آوردند که نشان از اهمیت این تنظیم­کننده‌ رشد با غلظت به‌کاربرده شده دارد. در آزمایش حاضر تنظیم­کننده‌ رشد BA همراه با IBA دارای نتیجه‌ای مطلوبی بود. البته لازم به ذکر است که غلظت تنظیم­کننده رشد BA توصیه ‌شده در هر دو آزمایش مشابه هم می‌باشد. در بررسی تأثیر غلظت‌های مختلف تنظیم­کننده‌های رشد سیتوکینینی بر ریزازدیادی گل آهار ظریف توسطMahmoodzadeh و همکاران (25)، مشخص شد کینتین با غلظت 5/0 میلی‌گرم در لیتر تأثیر مثبتی بر جوانه‌زنی و افزایش ارتفاع گیاه داشت که با نتایج این تحقیق مشابهت دارد و نشان می‌دهد با افزایش غلظت کینتین، ارتفاع گیاه نیز افزایش‌ می­یابد و این تنظیم­کننده‌ رشد نیز به‌نوبه‌ی خود توانسته در افزایش ارتفاع گیاه موثر واقع شود. در بررسی‌های Karuppusamy و همکاران (26) با استفاده از تنظیم­کننده‌های رشدKin ،2iP و BAP موفق به ساقه­زایی در گیاه Vanasushava pedata شده و BAP را از کینتین و 2iP موثرتر دانست. همچنین فراوانی تولید شاخه در تنظیم­کننده‌ BAP نسبت به دو تنظیم­کننده‌ دیگر بیشتر بود، که با نتایج این تحقیق نیز مطابقت دارد.

ریشه­زایی که نقش مهمی در آماده­سازی ریزشاخساره­ها برای مرحله سازگاری دارد، در برگیرنده ریشه­زایی تک­ریز شاخساره­ها در محیط کشتی است که در آن میزان اکسین افزایش و میزان سایتوکینین­ها کاهش یافته و یا به­طورکلی حذف شده است. هورمون اکسین در گیاهان معمولا باعث تحریک ریشه­زایی و جلوگیری از ایجاد شاخه­های جانبی می­شود. یکی از متداول­ترین اکسین­ها در کشت بافت گیاهی تنظیم­کننده‌ رشد IBA می­باشد. در رابطه با ریشه‌زایی، IBA به‌منظور ریشه‌زایی برخی گیاهان خانواده چتریان نظیر V. pedata توسط Karuppusamyو همکاران (26)، Anethum graveolens توسط Sharma و همکاران (27) گزارش ‌شده که با نتایج این تحقیق مشابهت دارد. برخی پژوهش‌ها آثار مثبت کاهش غلظت نمک‌ها را در افزایش و بهبود ریشه‌زایی، در گونه‌های دارویی از قبیل Salix humboldtiana (28) و Hancorina speciosa(29) نشان داده‌اند. در این پژوهش نیز کاهش غلظت نمک به نصف به‏همراه کاربرد غلظت متوسط IBA موجب تولید بیشترین درصد و طول ریشه در ریز نمونه­های پونه­سای بی­کرک شد. در تحقیقی بر روی گونه Origanum sipyleum L. برای آزمون ریشه‌زایی از دو اکسین NAA و IBA استفاده کردند. در اینجا نیز مانند آزمون شاخه‌زایی مقدار کمتر تنظیم­کننده‌ رشد تأثیر بهتری بر صفات مربوط به ریشه­زایی داشت. 96% از شاخه‌ها پس از قرارگیری در محیط کشت با 5/0 میلی‌گرم بر لیتر IBA پس از سه هفته ریشه‌دار شدند که کاملا با نتایج این پژوهش مطابقت دارد (30). همچنین نتایج تحقیق Junaid و همکاران (31) نیز نشان داد که با افزایش غلظت تنظیم­کننده‌ رشد IBA تعداد ریشه­ها کاهش پیدا می­کند. Dhandapani و همکاران (32) نیز از غلظت 44/0 میلی­گرم در لیتر IBA بهترین نتیجه ریشه­زایی را به‏دست آوردند و بیان داشتند که این تنظیم­کننده‌ رشد در غلظت­های پایین تأثیر به­مراتب بهتری در ریشه­زایی دارد.

بافت کالوس گیاهی علاوه بر ازدیاد گیاهان، قابلیت­های متنوع دیگری نیز دارد که از جمله می­توان به استفاده از آن­ها در انتقال ژن به گیاه و یا کاربرد آن در تهیه کشت­های سوسپانسیون سلولی به‏منظور تولید متابولیت­های ثانویه و یا ترکیبات مفید دیگر حاصل از آن‏ها اشاره نمود (16). اثر تنظیم­کننده‌های رشد را روی کالوس­زایی ریز نمونه­های مختلف (برگ، ساقه، ریشه و هیپوکوتیل) گیاه Saussurea obvallata بررسی نموده و دریافتند که ریز نمونه برگی و غلظت 5/2 میلی­گرم BA و 10 میلی‏گرم NAA بیشترین میزان کالوس­زایی را داشتند (33). تنوع در فراوانی تولید کالوس در گیاهان مختلف و در پاسخ به سطوح مختلف تنظیم­کننده‌های رشد، می­تواند به‏دلیل تمایز در بیان ژن­های کنترل کننده تولید کالوس باشد. همچنین ممکن است که در بعضی از سطوح تنظیم­کننده‌های رشد مورد استفاده، برخی از ژن­های مسئول در سنتز کالوس، به‏طور کامل بیان نشوند (34). در بسیاری از مطالعات اثر القایی تاریکی بر تولید کالوس گزارش‌شده است (35 و 36). در این مطالعه نیز کالوس‌زایی اختلاف چشمگیری را در نور و تاریکی نشان داد. به‌طوری‌که در شرایط وجود نور کالوس‌ها بعد از مدتی به رنگ سیاه درآمدند. اغلب مطالعات نشان می‌دهد که تنظیم­کننده­های رشد گروه اکسین به‌ویژه 2,4-D و NAA در تمایززدایی و تولید کالوس نقش مهمی دارند. همچنین این تنظیم­کننده­های رشد همراه با سیتوکینین‌هایی ازجمله BA در تولید و رشد کالوس موثرند (37).

نقش سیتوکینین‌ها به‌عنوان مهم‌ترین فاکتور موثر در باززایی ساقه به اثبات رسیده‌ است و اثرات چشمگیر آن‌ها شاید با تغییرات بافت‌شناسی در بافت‌های القاشده مرتبط باشد (38). در گیاه Taxus wallichiana گزارش‌ شده است که با افزایش سیتوکینین و کاهش اکسین، باززایی افزایش می‌یابد که منطبق با نتیجه این آزمایش می‌باشد. همان‌طور که در شکل 1 مشاهده می‌شود کمترین غلظتBA (1 میلی‌گرم در لیتر) دارای بیشترین باززایی می‌باشد (39).

نتیجه‌گیری

در پژوهش حاضر به ریزازدیادی پونه‌سای بی‌کرک پرداخته شد. نتایج به‌دست ‌آمده بیانگر این بود که تیمار 1میلی‌گرم در لیتر BA با 5/0 میلی‌گرم در لیتر IBA و NAA از مهم‌ترین و مفیدترین ترکیبات تنظیم­کننده‌ رشد برای ریزازدیادی این گیاه می‏‌باشند.

منابع

1. Arikat NA, Jawad FM, Karam NS, Shibli RA. Micropropagation and accumulation of essential oils in wild sage (Salvia fruticosa Mill.). Sci. Hort. 2004; 100(1):193-202.
2. Lambert J, Srivastava J, Vietmeyer N. Medicinal plants: rescuing a global heritage. 1^th Ed. The World Bank Washington, D. C; 1997.
3. Pushpangadan P. On Conservation Biology, Domestication and Commercial Cultivation of Wild Medicinal and Aromatic Plants. Recent Advances in Medicinal Aromatic, Spices and Crop. 1992; 2: 431-436.
4. Uniyal RC, Uniyal MR, Jain P. Cultivation of Medicinal Plants in India: A reference book– New Delhi, India, TRAFFIC India & WWF India; 2000.
5. Fotovati H, Noorbakhsh, S. Biotechnology, the new aspect for agricultural progress. The 6^th National Biotechnology Congress of Iran, 13-15 Aug, Tehran; 2009.
6. Seitz HV, Hinderer W. Anthocyanins in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. San Diego Academic Press: Constabel, F & Vasil, I., 1988; 49-76
7. Amin G. Traditional Medical Plants of Iran, 2^th Ed, Tehran: Ministry of Health publisher; 1990; 55p.
8. Jamzad Z, Chase MW, Ingrouille M, Simmonds MS, et al. Phylogenetic relationships in Nepeta L. (Lamiaceae) and related genera based on ITS sequence data. J. Taxon. 2003; 52(1): 21-32.
9. Zargari A, Medical Plants, 4^th ET, Tehran University Publisher, 1993; Page 450.
10. Rechinger KH. Nepeta. Flora Iranica. 1982; 150: 108-216.
11. Kökdil G, Kurucu S, Topçu G. Chemical constituents of the essential oils of Nepeta italica L. and Nepeta sulfuriflora PH Davis. Flavour Frag. J. 1997; 12(1): 33-5.
12. Skaltsa HD, Lazari DM, Loukis AE, Constantinidis T. Essential oil analysis of Nepeta argolica Bory & Chaub. Subsp. argolica (Lamiaceae) growing wild in Greece. Flavour Frag. J. 2000; 15(2): 96-9.
13. Bagheri A, Moshiri F, Khosravinia S. Investigation on reaction of explants and plant growth regulators on callus induction, rooting and in vitro regeneration of Bunium persicum (Boiss.) B. Fedtsch. Crop Biotech. 2013; 5: 53-61.
14. Echeverrigaray S, Basso R, Andrade LB. Micropropagation of Lavandula dentata from axillary buds of field-grown adult plants. Biol. Plantarum. 2005; 49(3): 439-42.
15. Afzalifar M. Evaluation of different propagation and androgenesis in Satureja khuzistanica and S. rechingeri. M.Sc. thesis. Medicinal Plants and Drug Research Institute. Shahid Beheshti University, Iran. 2012; 46-73.
16. Kayser O, Quax W. Medicinal Plant Biotechnology. 7^th ET. Federal Republic of Germany: Wiley-VCH; 2006.
17. Tripathi L, Tripathi JN. Role of biotechnology in medicinal plants. Trop. J. Pharm. Res. 2003; 2(2): 243-53.
18. Murashige T, Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 1962; 15(3): 473-97.
19. Zahedi B, Sahraro A. Evaluation of the micropropagation of Satureja khuzistanica. Iranian Hort. Sci. 2015; 7(2): 291-296.
20. Al-Sulaiman MA. Clonal propagation of Ziziphus spina-christi by shoot tip culture: I. improved inorganic and organic media constituents for in vitro shoot multiplication. J. King Abdulaziz Uni. 2010; 21(2): 3.
21. Muna AS, Ahmad AK, Mahmoud K, Abdul-Rahman K. In vitro propagation of a semi-dwarfing cherry rootstock. PCTOC. 1999; 59(3): 203-8.
22. Nordstrom A, Eliasson L. Uptake and translocation of C14-labled benzylaminopurine in apple shoots grown in vitro in relation to shoot development. Physiol. Plant. 1986; 68(3): 431-435.
23. Nowruzian A, Masoumian M, Ebrahimi MA, Bakhshi Khaniki GR. Optimization of cytokinin concentration on Ferula assa-foetida height. 1^th International & 13^th Iranian Crop & Plant Breeding Sciences Congress and 3^rd Seed Science and Technology Conference. Karaj, Iran. Agust 2014; 26-28.
24. Shafie Haji Abad M, Hamid Oghli Y. Fatahi Moghadam, J. The effects of different nutrient media on shoot proliferation of Boston Fern (Nephrolepis exaltata Schott cv. ‘Bostoniensis’). J. Horti. Sci. Technol. 2008; 9: 139-144.
25. Mahmoodzadeh H, Abbasi F, Rohani Sh. The effect of different concentrations of cytokinins on micropropagation of Zinnia elegans Thumbelina. J. Biol. Sci., Islamic Azad Uni. Zanjan. 2010; 2: 61-65.
26. Karuppusamy S, Kiranmai C, Aruna V, Pullaiah T. Micropropagation of Vanasushava pedata-An endangered medicinal plant of South India. BAPTC&B. 2006; 16(2): 85-94.
27. Sharma RK, Wakhlu AK, Boleria M. Micropropagation of Anethum graveolens L. through axillary shoot proliferation. J. Plant Biochem. Biot. 2004; 13(2): 157-9.
28. Pereira AMS, Bertoni BW, Moraes RM, Franca SC. Micropropagation of Salix humboldtiana Hild. Rev. Bras. Plantas Med. 2000; 2: 17-21.
29. Pereira-Netto AB. In vitro propagation of Hancornia speciosa, a tropical fruit tree. In Vitro Cell Dev. Biol. Plant. 1996; 32(4): 253-6.
30. Ccedil AK, Oluk a E, Ihsan YA. Comparison of the antimicrobial activity and essential oil content of wild and micropropagated Origanum sipyleum L.: A medicinal herb native to Turkey. J. Med. Plants Res. 2013; 7(6): 230-3.
31. Junaid A, Mujib A, Bhat MA, Sharma MP, et al. Somatic embryogenesis and plant regeneration in Catharanthus roseus. Biol. Plantarum. 2007; 51(4): 641-6.
32. Dhandapani M, Kim DH, Hong SB. Efficient plant regeneration via somatic embryogenesis and organogenesis from the explants of Catharanthus roseus. In Vitro Cell Dev. Biol. Plant. 2008; 44(1):18-25.
33. Dhar U, Joshi M. Efficient plant regeneration protocol through callus for Saussurea obvallata (DC.) Edgew. (Asteraceae): effect of explant type, age and plant growth regulators. Plant Cell Rep. 2005; 24(4): 195-200.
34. Mahmood I, Razzaq A, Khan ZD, Hafiz IA, et al. Evaluation of tissue culture responses of promising wheat (Triticum aestivum L.) cultivars and development of efficient regeneration system. Pak. J. Bot. 2012; 44(1): 277-84.
35. Li X, Krasnyanski SF, Korban SS. Somatic embryogenesis, secondary somatic embryogenesis, and shoot organogenesis in Rosa. J. Plant Physiol. 2002; 159(3): 313-9.
36. Nakamura M, Takeuchi Y, Miyanaga K, Seki M, et al. High anthocyanin accumulation in the dark by strawberry (Fragaria ananassa) callus. Biotechnol. Lett. 1999; 21(8): 695-9.
37. Dixon, RA, Gonzales, RA. A Practical Approach Plant Cell Culture. 2^nd Ed. IRL Press; 1996; 230 p.
38. Neibaur I, Gallo M, Altpeter F. The effect of auxin type and cytokinin concentration on callus induction and plant regeneration frequency from immature inflorescence segments of seashore paspalum (Paspalum vaginatum Swartz). In Vitro Cell Dev. Biol. Plant. 2008; 44(6): 480-486.
39. Datta MM, Jha S. Embryo culture of Taxus wallichiana (Zucc.). J. Plant Biotech. 2004; 6(4): 213-219.