مقدمه

گیاهان دارویی از ارزش و اهمیت خاصی در تأمین بهداشت و سلامت جوامع هم به لحاظ درمان و هم پیشگیری از بیماری­ها برخوردار می­باشند. گرایش عمومی جامعه به استفاده از داروها و درمان­های گیاهی و به‏طور کلی فرآورده­های طبیعی به‏ویژه در طی سال‏های اخیر رو به افزایش بوده و مهم‏ترین علل آن، اثبات اثرات مخرب و جانبی داروهای شیمیایی از یک طرف و ایجاد آلودگی­های زیست محیطی تهدید کننده کره زمین از سوی دیگر بوده است (1).

گیاه دارویی شقایق (Papaver somniferum) یکی از مهم‏ترین گیاهان دارویی می‌باشد. خصوصیات دارویی شقایق از زمان‏های بسیار دور شناخته شده و ترکیبات گیاهی آن در ارتباط با زمینه­های اقتصادی، اجتماعی و سیاسی موجب شده تا به‏عنوان یکی از مهم‏ترین گیاهان دارویی دنیا مطرح شود. اهمیت دارویی این گونه مربوط به قابلیت تولید گروهی از آلکالوئیدهای بنزوفنانتریدین از زیر گروه آلکالوئیدهای بنزوایزوکوئینولی می­باشد. برخی از این مسکن­ها به‏عنوان آلکالوئیدهای 5حلقه­ای بنزیل ایزوکوئینولین شامل تبائین، کدئین، مورفین و مشتقات آن‏ها می­باشند. مورفین به­همراه مواد شیمی درمانی دیگر نظیر وین کریستین و وین‌بلاستین و کامپوتسین ازآلکالوئیدهای مهم تجاری شده هستند که از این گیاه دارویی استخراج می­شوند. همچنین می‌توان به آنتی­بیوتیک­هایی نظیر سانگونارین دارای خاصیت ضد میکروبی و ضد التهابی، نوسکاپین دارای خاصیت ضد سرفه و ضد توموری، پاپاورین به‏عنوان گشاد کننده رگ‏ها و توبوکورارین شل‌کننده عضلات اشاره نمود (2).

در طول مسیر ساخت داروهای نارکوتیک انتهایی، آنزیم مرحله نهایی در دو واکنش متناوب کدئینون رداکتاز می­باشد. اولین بار کدئینون رداکتاز (COR) توسط لنز و زنک (3) از کشت سلولی گونهP. somniferum استخراج شد. در سال 1999 نیز برای اولین بار جداسازی و شناسایی چهار cDNA مشابه کد کننده کدئینون رداکتاز انجام گرفت و در اشرشیاکلایی بیان شد (4). مسیر تولید آلکالوئیدهای مورفینان در شکل 1 آمده است (5).  

شکل 1: مسیر تولید آلکالوئیدهای مورفینان (5).

مهندسی متابولیک گیاهی رشته نسبتا جدیدی از تحقیقات است که فرصت­های تازه­ای را برای پیشرفت متابولیک­های گیاهی، سلولی و فرآیندهای فیزیولوژیکی ایجاد می­کند. امروزه مهندسی متابولیک به‏عنوان روشی خاص برای تنظیم ساخت آلکالوییدها و دست­کاری فرآورده­های متابولیکی است که می­تواند سطح مسیرهای با ارزش میانه یا فرآورده­های انتهایی را به­وسیله فوق بیان از یک آنزیم با سرعت محدود افزایش دهد و یا اینکه متابولیت­های نامطلوب را از طریق خاموشی ژن از بین برده و کاهش دهد (6). تاکنون آزمایش‏های زیادی جهت بررسی اثرات مهندسی متابولیکی مسیر آنزیمی ساخت مورفینان چه از طریق روش­های افزایش بیان ژن و چه از طریق روش­های خاموشی ژن انجام گرفته است. در گیاه شقایق  آزمایش‏هایی جهت افزایش بیان موقت ژن COR انجام گرفت که11 گیاه از 15 گیاه افزایش بیان را نشان دادند (7).

یکی از راه‏های کاهش و متوقف سازی یک محصول در گیاه، خاموشی ژن می باشد که انواع مختلفی دارد (8). خاموشی پس از رونویسی (Post-transcriptional gene silencing) شامل آلودگی توالی نوکلئوتیدی خاصی است که با ویروس و mRNA سلول انجام می­گیرد (9). VIGSروشی است که در آن از دفاع ذاتی گیاه بر علیه آلودگی ویروسی استفاده شده و براساس پدیده RNA- interference  (RNAi) می­باشد که به تداخل بیان ژن به واسطه RNA های کوچک در توالی خاصی اشاره دارد. در گیاهانی که با ویروس آلوده می­شوند، چرخه­هایی ایجاد می­شود که RNA ویروسی، خاموشی ژن را در میزبان در برابر ویروس، تحریک می­کند (10). فن VIGS فنی قوی برای خاموشی ژن­های خاص و مطالعه سریع کاهش عملکرد و آنالیز بیان ژن است که نیازمند تراریزش در گیاه می­باشد و روشی ساده است که عملکرد را به‏سرعت نشان می­دهد (11). هدف از انجام این تحقیق ساخت سازه خاموشی موقت ژن کدئینون رداکتاز (COR) و تاثیر آن روی بیان ژن هدف آن در گیاه دارویی شقایق بود.

مواد و روش­ها

این آزمایش در آزمایشگاه بیوتکنولوژی دانشکده کشاورزی دانشگاه لرستان به اجرا در آمد. بذور گیاه شقایق (P. somniferum) از موسسه جنگل‏ها و مراتع تهیه شدند. پس از ضدعفونی بذور با الکل 70 درصد به‏مدت یک دقیقه، هیپوکلریت سدیم 5 درصد به‏مدت 10 دقیقه و پس از چند بار شستشو با آب مقطر استریل، در نهایت بذور استریل در محیط B5 (12) بدون هورمون حاوی 30 میلی­گرم بر لیتر ساکارز کشت شدند. بذ‏رهای کشت شده در شرایط مناسب جهت جوانه‌زنی در دمای 23 درجه سانتی­گراد با تناوب نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی نگه‏داری شدند. سپس برگ‏های جوان گیاه‏چه­های یک و نیم ماهه برداشت شد و با نیتروژن مایع پودر شد و بلافاصله در یخچال 80- درجه سانتی‏گراد نگه‏داری شد. به‏منظور ساخت سازه خاموشی موقت ژن COR، ابتدا از گیاه با استفاده از کیت RNA XPLUS (شرکت سیناژن) استخراج RNA انجام گرفت. سپس با آنزیم رونوشت بردار معکوس، cDNA ساخته شد. از cDNA تکثیر شده به‏عنوان الگو جهت ساخت DNA دو رشته­ای و تکثیر ژن توسط PCR با استفاده از آغاز گرهای اختصاصی ژن طبق برنامه استفاده شد. طراحی آغاز گر با استفاده از نرم افزار Vector NTI (version 9.0) روی توالی گرفته شده از پایگاه اطلاع داده­ها NCBI (شماره دسترسی (AF108435 طراحی شد. برنامه زمانی PCR به‏صورت دمای واسرشتگی 94 درجه سانتی­گراد به‏مدت 1 دقیقه، دمای اتصال 56 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 1 دقیقه و بسط در دمای 72 درجه سانتی­گراد به‏مدت 2 دقیقه طراحی شد. 35 چرخه برای واکنش PCR در نظر گرفته شد. الکتروفورز ژل آگارز برای محصول PCR بر روی ژل 5/1 درصد انجام گرفت. به‏منظور تکثیر و نگه‏داری ژن موردنظر و همسانه­سازی آن در ناقل pTRV ابتدا محصول PCR در ناقل T/A کلون شد. سپس قطعه تکثیر شده و الکتروفورز محصول PCR بر روی ژل آگارز 5/1 درصد انجام شد و پس از مشاهده باند مورد نظر و تطبیق اندازه باند با اندازه باند نشانگر، باند توسط دستورالعمل شرکت فرمنتاز از روی ژل استخراج شد و بعد الحاق محصول PCR در ناقل Vector ) Ptz57R/Tشرکت فرمنتاز) به‏کمک آنزیم لیگاز T4 طبق دستورالعمل شرکت انجام شد. تراریزش و عمل انتقال ناقل به باکتری E.coli سوش DH5α به روش ذوب و یخ با استفاده از شوک کلسیمی انجام گرفت. برای غربال باکتری‏هایی که پلاسمید به آن‏ها منتقل نشده است از آنتی بیوتیک آمپی سیلین و برای جداسازی باکتری‏هایی با پلاسمید ترا ریخت از روش رنگ کلونی استفاده شد. تعدادی از کلونی­های سفید به‏دست آمده (تراریزش شده) واکشت شد و کلونی PCR  با آغاز گرهای ژن انجام گرفت. بعد از تایید کلونی PCR بر روی کلونی‏ها، از کلونی‏ها استخراج پلاسمید با روش Miniperpration انجام شد و سپس مورد توالی یابی قرار گرفتند. نتیجه حاصل از توالی یابی با بانک‌های اطلاعاتی تطابق داده شد و آغاز گرهایی برای تکثیر این قطعه توسط نرم افزار (Vector NTI (version 9.0) طراحی شد. بعد از طراحی آغاز گرها و بازیابی قطعه نهایی، قطعه موردنظر به‏منظور مشابه نبودن توالی‌های برشی بر روی قطعه، با نرم افزار  NEBCutter مورد بررسی قرار گرفت. برنامه زمانی PCR برای آغاز گرهای طراحی شده به این صورت بود که دمای واسرشتگی 94 درجه سانتی­گراد به‏مدت 1 دقیقه، دمای اتصال 59 درجه سانتی­گراد به‏مدت 1 دقیقه و بسط در دمای 72 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 2 دقیقه طراحی شد. 35 چرخه برای واکنش PCR در نظر گرفته شد. الکتروفورز ژل آگارز برای محصول PCR بر روی ژل 5/1 درصد انجام گرفت.

به‏علت اینکه در فن خاموشی به‏روش VIGS اساس کار بر پایه همولوژی است، قطعه مورد نظر با استفاده از سایت RNASCAN مورد بررسی قرار گرفت. بعد از تایید توالی یابی، کشت مایع از یکی از کلونی‏های سفید تایید شده انجام شد و به‏مدت یک شب در دمای 37 درجه سانتی‏گراد در انکوباتور انکوبه شد. روز بعد استخراج پلاسمید انجام گرفت.

همسانه سازی ژن  COR در ناقل خاموشی pTRV2

یکی از ناقل­های مورد استفاده در VIGS ناقل pTRV یا ویروس جغجغه ای توتون می­باشد که متعلق به جنس Tobravirus بوده و ژنوم آن از نوع مولکول RNA تک رشته ای می­باشد. ناقل pTRV در دو ناقلpTRV1 و pTRV2 توزیع شده است. ناقلpTRV1 حاوی ژن­های کد کننده برای حرکت پروتئین و تکثیر پروتئین می­باشد. ناقلpTRV2 شامل ژن­های کد کننده پروتئین پوششی (coat protein) و دو پروتئین غیرساختاری است. هر دو بخش ژنوم ویروسی به‏وسیله آغاز گر CaMV 35S  آغاز و با ساخت نوپالین به اتمام می­رسند. هر دو ناقل مقاومت به آنتی بیوتیک کانامایسین را دارند. در شکل 2 ساختارهای ناقل pTRV1 و pTRV2 آمده است (13).

شکل 2: ساختار ناقل­های pTRV1 و pTRV2 (13).

برروی پلاسمید استخراج شده از ناقل T/A به‏منظور ساخت سازه خاموشی، هضم آنزیمی با آنزیم‌های XbaI وSma1 گذاشته شد. هم‏زمان با آن هضم آنزیمی بر روی ناقل pTRV2 با همان آنزیم‏های برشی انجام گرفت. در روی ژل محصول حاصل از هضم آنزیمی در ناقل T/A دو باند به‏دست آمد، یک باند 214 جفت نوکلئوتیدی و یک باندی در حدود سه کیلو بازی، که باند 214 جفت نوکلئوتیدی از ژل آگارز جدا شد. هم‏زمان با آن محصول هضم ناقل خاموشی pTRV2 نیز بر روی ژل آگارز برده شد و باند بریده شده آن از روی ژل با استفاده از کیت استخراج ژن از ژل انجام شد. سپس الحاق باند بریده شده از روی ژل در ناقل pTRV2 توسط آنزیم لیگاز T4 طبق دستورالعمل شرکت انجام شد.

انتقال سازه خاموشی موقت ژن COR به آگروباکتری: پس از ساخت سازه خاموشی موقت ژن COR، از آگروباکتری تومیفشنس (A. tumefaciens) سویه GV3101 برای انتقال ژن به گیاه استفاده شد. پلاسمید از باکتری E.coli استخراج شده و به باکتری آگروباکتری تومیفشینس سویه GV3101 به‏روش ذوب انجماد شوک کلسیمی انتقال داده شد.

انتقال سازه خاموشی موقت به گیاه: برای انتقال سازه به گیاه، بذور گیاه شقایق در گل‏خانه در گلدان­های حاوی خاک سیلتی لومی کشت شدند و در دمای 23 درجه سانتی‏گراد و تناوب نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی قرار گرفتند. به‏منظور انتقال سازه خاموشی به گیاه ابتدا یک تک کلونی از آگروباکتری حاوی سازه خاموشی در LB مایع حاوی آنتی‏بیوتیک‌های کانامایسین (50 میلی­گرم بر لیتر) و ریفامپسین (20 میلی­گرم بر لیتر) و 20 میکرولیتر استوسرینگون و 10 میلی‏مولار بافر MES اضافه شد و کشت شبانه داده شد. باکتری رشد یافته در سانتریفیوژ با 3000 دور در دقیقه با دمای 4 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 20 دقیقه قرار گرفت. به رسوب باکتری، محیط القایی رشد که شامل 10 میلی مولار Mgcl₂ و 20 میکرولیتر استوسرینگون و 10 میلی مولار بافر MES است اضافه شد، به‏طوری‌که به OD600=0.25 رسید. اگروباکتری دارای COR-pTRV2 با pTRV1 خالی با نسبت 1:1 ترکیب و برای شاهد نیزpTRV2 خالی با pTRV1 خالی با نسبت 1:1 ترکیب شدند. بعد از دو ساعت که باکتری در دمای اتاق قرار گرفت و رشد کرد، مقدار 1 میلی‏لیتر از محیط را با سرنگ کشیده و به سطح پشتی برگ تزریق شد.

به‏منظور بررسی گیاهان ترا ریخت، حدود 8 تا 10 هفته پس از اگرواینفیلتراسیون گیاه، هم‏زمان با ظهور جوانه­های گل، سه قطعه یک سانتیمتری از بافت ساقه در زیر جوانه گل برش خورده و به‏صورت تازه در نیتروژن مایع پودر شد، سپس از آن‏ها استخراج RNA و ساخت cDNA انجام گرفت. از ساخت پروتئین پوششی ویروس برای جداسازی اولیه ترا ریخت­ها از غیر ترا ریخت­ها استفاده شد که به‏کمک PCR غربال شدند. سپس گیاهانی که وجود پروتئین پوششی در آن‏ها تایید شد PCR نیمه کمی با آغاز گرهای کدئینون رداکتاز (COR) و فاکتورهای طویل شدن نسخه برداری ((Elongation factor انجام گرفت. آغاز گرهای طراحی شده برای پروتئین پوششی و ژن کدئینون رداکتاز در جدول 1 آمده است. پس از انتخاب گیاهان بر اساس PCR نیمه‌کمی، واکنش PCR در زمان واقعی انجام گرفت. این واکنش براساس نورسنجی رنگ فلورسنس سایبرگرین انجام گرفت و از ژن دائم‌البیان فاکتور طویل شدن نسخه برداری (EF) به‏عنوان ژن کنترل داخلی استفاده شد. جهت آنالیز نتایج PCR در زمان واقعی، از فرمول ^{ΔΔct -}2  استفاده شد (14). مواد واکنش PCR در زمان واقعی شامل 10 میکرولیتر محلول حاوی سایبرگرین، 1 میکرولیترآغاز گر رفت (باغلظت pmol/µL 10)، 1 میکرولیترآغاز گر برگشت (باغلظت pmol/µL 10)، 2 میکرولیتر از نمونه موردنظر و 6 میکرولیتر آب مقطر استریل بود که حجم نهایی واکنش به 20 میکرولیتر رسید. واکنش PCR در زمان واقعی به این صورت انجام شد که واسرشتگی مقدماتی به‏مدت 3 دقیقه در دمای 95 درجه سانتی‏گراد، واسرشتگی به‏مدت 10 ثانیه در دمای 95 درجه سانتی­گراد و برای اتصال  آغاز‏گر‏ها به‏مدت 25 ثانیه در دمای 60 درجه سانتی­گراد قرار گرفتند. تعداد چرخه­ها 35 سیکل بود.

جدول1 : لیست آغاز گرهای به‏کاربرده شده در واکنش PCR در زمان واقعی.

نتایج

به‏منظور تایید ساخت سازه خاموشی ژن کدئینون رداکتاز در ناقل pTRV2، از روش کلونی PCR روی کلونی­های E.coli استفاده شد. نتایج این واکنش نشان داد که تعداد قابل توجهی از کلونی‌ها باند مورد نظر (قطعه 224 جفت باز) را تولید کردند (شکل 3). در مرحله بعد، از کلونی‌هایی که وجود سازه مورد نظر در آن‏ها تایید شد،‌ استخراج ناقل صورت گرفت و ناقل مربوطه به آگروباکتری ترانسفورم شد. سپس وجود ناقل حاوی سازه خاموشی ژن کدئینون رداکتاز در آگروباکتری با روش PCR مورد بررسی قرار گرفت. برای این منظور از آگروباکتری استخراج پلاسمید صورت گرفت و با استفاده از واکنش PCR قطعه مورد نظر (قطعه 224 جفت باز) تکثیر شد (شکل 4) که تایید کافی بر وجود ناقل حاوی قطعه خاموشی ژن هدف در آگروباکتری بود.

شکل 3: نتیجه کلونی PCR روی کلونی­های E.coli حاوی خاموشی  CORدر ناقل خاموشی موقت pTRV2. چاهک شماره 1و20 نشانگر bp100، چاهک شماره 2، 3، 4، 5، 6، 11، 15و 19 کلونی­هایی که قطعه خاموشی در آن‏ها تراریزش شده است.

شکل 4: نتیجه استخراج پلاسمید از آگروباکتری و PCR خاموشی  COR، چاهک 1 مارکر bp 100، چاهک 2 و3 محصول PCR قطعه خاموشی COR ، چاهک 4 کنترل منفی.

با توجه به اینکه از روش تلقیح با آگروباکتری حاوی ناقل ویروسی در بردارنده قطعه خاموشی جهت ترا ریخت نمودن موقت گیاهان استفاده شد؛ از این‏رو جهت غربال و تفکیک گیاهان ترا ریخت از غیرترا ریخت از روش PCR استفاده شد. برای این منظور، پس از  استخراج RNA و ساخت cDNA، از آغاز گرهای ژن پروتئین پوششی ویروس (CP) جهت واکنش استفاده شد. نتایج نشان داد که تعداد قابل توجهی از گیاهان ترانسفورم شده، حاوی سازه ژنتیکی مورد نظر بودند و باندی با اندازه 370 جفت باز در این گیاهان مشاهده شد (شکل 5). 

شکل 5: تعیین نمونه­های دارای پروتئین پوششی، چاهک 1 نشانگرbp100، چاهک 2، 3، 5، 7، 8، 10، 11 نمونه­های دارای پروتئین پوششی.

جهت بررسی میزان خاموشی ژن مورد نظر در گیاهان ترا ریخت تایید شده از این آزمایش، ابتدا از واکنش PCR نیمه کمی استفاده شد. نتایج نشان داد که در تعدادی از نمونه‌ها بر اساس مقایسه شدت باندهای تولید شده (شکل 6)، گیاهان یا نمونه‌های شماره نمونه­های شماره 2، 7، 8 و 10 دارای کاهش بیان بیشتری نسبت به گیاه شاهد (غیرترا ریخت) بودند. بنابراین این گیاهان جهت آنالیز بیان ژن با روش PCR در زمان واقعی انتخاب شدند.

نتایج آنالیز بیان ژن در گیاهان ترا ریخت حاوی قطعه خاموشی ژن کدئینون رداکتاز با روش PCR در زمان واقعی در حداقل سه تکرار فنی و زیست شناختی روی سه قسمت ساقه انجام شد. نتایج نشان داد که سطح نسخه­برداری ژن  CORدر گیاهان ترا ریخت انتخاب شده نهایی به‏طور میانگین حدود 89 درصد نسبت به گیاهان غیر ترا ریخت (شاهد) کاهش بین نشان داد ( شکل7).

شکل 6: مقایسه نمونه­های خاموشی ژن COR با فاکتورهای طویل شدن نسخه برداری.

شکل 7: مقایسه سطح نسبی نسخه­برداری ژن  CORدرگیاهان ترا ریخت (TRV2-COR) با گیاهان غیر ترا ریخت (TRV2-EMPTY).