نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه آزاد اسلامی، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی، زنجان، ایران
2 دانشگاه آزاد اسلامی، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی، رشت، ایران
3 دانشگاه اراک، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی، اراک، ایران
چکیده
هدف: هدف از این مطالعه مقایسه میزان بیان LncRNA CRNDE در نمونههای توموری و نرمال افراد مبتلا به سرطان روده بزرگ بهروش Real Time-PCR بود.
مواد و روشها: تعداد 20 نمونه از بافت توموری افراد مبتلا بهسرطان روده بزرگ و 20 نمونه بافت غیرتوموری همان افراد از بانک تومور مجتمع بیمارستانی امام خمینی دانشگاه علوم پزشکی تهران تهیه شد. پس از استخراج RNA کل از بافتهای سرطانی و نرمال، DNA مکمل سنتز و با استفاده از روش Real Time-PCR سطوح بیان LncRNA CRNDE در آنها مورد بررسی قرار گرفت. برای تجزیه و تحلیل آماری نتایج از روش ANOVA یکطرفه و تست Tukey استفاده شد.
نتایج: نتایج بهدست آمده نشاندهنده افزایش دو برابری بیان LncRNA CRNDE در هر 20 نمونه سرطان روده بزرگ در مقایسه با نمونههای نرمال بود.
نتیجهگیری: باتوجه بهافزایش قابل توجه بیان LncRNA CRNDE در سلولهای سرطانی نسبت به سلولهای نرمال، میتوان از حضور این LncRNA در خون بهعنوان یک نشانگر زیستی برای تشخیص زودرس و غیرتهاجمی، سرطان روده بزرگ استفاده کرد.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
Investigation of Long Non-coding RNA CRNDE Expression in Iranian Patients with Colorectal cancer
نویسندگان [English]
- S gholaminejad 1
- Z Deilami Khiabani 1
- A Salehzadeh 2
- A Jalali 3
1 Department of Biology, Faculty of Basic Science, Islamic Azad University, Zanjan, Iran
2 Department of Biology, Faculty of Basic Science, Islamic Azad University, Rasht, Iran
3 Department of Biology, Faculty of Basic Science, Arak University, Arak, Iran
چکیده [English]
Aim: This study aimed to compare the expression levels of LncRNA CRNDE in malignant colorectal tumorsand adjacent normal tissues of patients by Real Time-PCR.
Material and Methods: 20 pairs of colorectal tumors and adjacent normal tissue specimens were prepared from the tumor bank of Imam Khomeini Hospital in Tehran University of Medical Sciences. After total RNA extraction from cancerous and normal tissues, cDNA was synthesized, and the expression levels of LncRNA CRNDE were examined using the Real Time-PCR method. A one-way analysis of variance (ANOVA) and Tukey's HSD test used for statistical analysis of results.
Results: The results showed a two-fold increase in LncRNA CRNDE expression in all 20 colorectal cancer samples compared with the normal cells.
Conclusion: According to the significant increase of the LncRNA CRNDE expression in cancer cells relative to normal cells and its presence in the bloodstream, this LncRNA maybe used as a non-invasive diagnostic biomarker for early detection of colorectal cancer.
کلیدواژهها [English]
- Long noncoding RNA
- CRNDE
- Colorectal cancer
- Biomarker
مقدمه
سرطان شامل مجموعهای از بیماریهای ژنتیکی است که با رشد و تکثیر غیرقابل کنترل سلولها و انتشار آنها در بدن همراه است. براساس آخرین آمار جامع منتشر شده توسط سازمان بهداشت جهانی درباره میزان شیوع و مرگومیر ناشی از انواع سرطانها در سال 2018، سرطان روده بزرگ سومین سرطان شایع (1/6 درصد) و دومین عامل مرگ و میر ناشی از سرطان (2/9 درصد) در کل جهان بعد از سرطان ریه است. طبق برآوردهای انجام شده، در سال 2018 بیش از 8/1 میلیون نفر بهسرطان روده بزرگ مبتلا و 881 هزار نفر بر اثر آن بهمرگ دچار شدهاند (1). براساس این آمار میزان بروز سرطان روده بزرگ در کشورهای توسعه یافته در مقایسه با کشورهای درحال توسعه مانند ایران، حدود سهبرابر بیشتر است که بهنظر میرسد مهمترین دلیل آن استفاده بیشتر این جوامع از غذاهای فرآوری شده و آماده نسبت به غذاهای سنتی باشد.
درک اساس مولکولی سرطان نقش مهمی در شناسایی عوامل موثر در شکلگیری تومور و پیشرفت آن داشته و همچنین پاسخ یا مقاومت بافت توموری در برابر عوامل ضدتوموری را تعیین میکند. ابتلا بهسرطان روده بزرگ نتیجه وقوع برهمکنش بین مجموعهای از عوامل ارثی، محیطی و فردی است. آشنایی با سرطان روده بزرگ در سطح مولکولی، اطلاعات لازم برای غربالگری افراد مستعد ابتلا به اشکال خانوادگی سرطان، امکان شناسایی شناساگرهای پیشبینی کننده بهمنظور تشخیص استعداد افراد نسبت به روشهای درمانی مختلف و همچنین گسترش آزمایشهای تشخیص مولکولی غیرتهاجمی را فراهم کرده است. شناسایی عوامل مولکولی شرکت کننده در متاستاز سلولهای سرطانی روده بزرگ میتواند نقش مهمی در طراحی و تولید داروهای جدید برای جلوگیری از شکلگیری تومور و کنترل پیشرفت بیماری داشته باشد (2).
RNA ی غیرکدکننده طویل (lncRNAs) رونوشتهای با طول بیشتر از 200 نوکلئوتید با عدمقابلیت کدکردن پروتئینها هستند که در تنظیم بیان ژنها در سطوح رونویسی و ترجمه و همچنین تغییرات اپیژنتیک نقشهای مختلفی ایفا میکنند (3). اختلال در عملکرد یا بیان lncRNAها ارتباط نزدیکی با ابتلا بهانواع بیماریها از جمله سرطان دارد (4). مشخص شده است که این رونوشتهای بلند غیرکدکننده که در سرطانهای مختلف پروفایلهای منحصر بهفردی دارند، در مهار مرگ برنامهریزی شده، تکثیر، مهاجرت و تهاجم سلولهای سرطانی بهبافتهای دیگر شرکت دارند (5، 6). lncRNAها مانند سایر قطعات نوکلئیک اسید مرتبط با سرطان که از سلولها خارج شدهاند، بهداخل جریان خون بیماران مبتلا بهسرطان وارد شده و امکان ارزیابی غیرتهاجمی بیان ژنها را فراهم میکنند. بههمین علت از این رونوشتهای غیرکدکننده میتوان بهعنوان نشانگر زیستی برای پیش آگهی و تشخیص سرطان استفاده کرد. مطالعات اخیر نشان داده است که بیان lncRNAها در بعضی از تومورهای انسانی ازجمله سرطان روده بزرگ (CRC) بهمیزان زیادی افزایش یافته یا مهار میشد (7).
رونوشتهای غیرکدکننده CRNDE (colorectal neoplasia differentially expressed) ازجمله lncRNAهای سلولهای انسان است که ژن کدکننده آن برروی بازوی بزرگ کروموزوم 16 انسان (16q12.2) قرار گرفته است. نتایج حاصل از تحقیقات گذشته، نشان داده است که CRNDE نقش قابل توجهی در تکثیر، مهاجرت و تهاجم انواع سلولهای توموری دارد. Wang و همکاران در سال 2015 بیان بیش از اندازه CRNDE در سلولهای گلیوما را گزارش کردند که نتیجه آن ممکن است تسهیل رشد و مهاجرت این سلولها درشرایط in vivo و in vitro باشد (8). همچنین Chen و همکاران (9) مشاهده کردند که افزایش CRNDE از راه تاثیر منفی برروی تنظیم mirRNA-384 باعث بیان بیشتر فاکتور هستهای κB و p پروتئین کیناز B (AKT) و در نتیجه تحریک تکثیر، مهاجرت و تهاجم کارسینوم کبدی میشود. Zhu و همکاران (10) به بررسی نقش LncRNA CRNDE برروی تکثیر و تهاجم سلولهای کارسینوم سلولهای کبدی در شرایط in vivo و in vitro پرداختند. آنها در بررسیهای خود نشان دادند که کاهش بیان CRNDE باعث افزایش بیان پروتئینهای کادهرین E و ZO-1 و کاهش بیان کادهرین N، slug، twist و vimentin میشود که نتیجه آن مهار انتقال اپیتلیال-مزانشیمی است. نقش CRNDE در شروع و پیشرفت سرطان روده بزرگ نیز توسط محققین مختلف اثبات شده است. در سال 2016، Liu و همکاران (11) گزارش کردند که یک ارتباط معنیدار بین افزایش بیان LncRNA CRNDE-h که یکی از اشکال CRNDE است با شکلگیری و پیشرفت سرطان روده بزرگ وجود دارد. براساس گزارش Ding و همکاران (12)، غیرفعال کردن این رونوشت غیرکدکننده منجر بهمهار تکثیر سلولهای سرطانی روده بزرگ و القای مرگ برنامهریزی شده در آنها در هردو حالت in vivo و in vitro میشد که نتیجه آن کاهش اندازه تومور است.
باوجود پیشرفت در روشهای تشخیص، بیش از نیمی از بیماران مبتلا بهسرطان روده بزرگ تسلیم بیماری میشوند که دلیل آن تشخیص بیماری در مراحل پیشرفته است. بههمین دلیل با توجه بهکمبود روشهای پیش آگهی و تشخیصی غیرتهاجمی و کم هزینه برای CRC، شناسایی نشانگرهای زیستی جدید و بالقوه موثر در تحقیقات اخیر سرطان توجه بیشتری را بهخود جلب کرده است. با توجه بهآمار بالای ابتلا و مرگومیر ناشی از سرطان روده بزرگ و نقش مهم CRNDE در شکلگیری و پیشرفت این سرطان و از آنجا که تاکنون تحقیقی برروی ارتباط سطوح بیان CRNDE و استعداد ابتلا بهسرطان روده بزرگ در جمعیتهای ایرانی صورت نگرفته، در این تحقیق بهمطالعه سطح بیان LncRNA CRNDE در یک جمعیت از افراد مبتلا بهسرطان روده بزرگ پرداخته شد.
مواد و روشها
جمعآوری نمونه: در این تحقیق بهمنظور بررسی تغییرات بیانی ژن کدکننده LncRNA CRNDE، تعداد 20 نمونه بافت توموری تازه جدا شده از افراد مبتلا بهمراحل مختلف سرطان روده بزرگ از بانک تومور مجتمع بیمارستانی امام خمینی دانشگاه علوم پزشکی تهران تهیه شد. از بین بیماران انتخاب شده که هیچکدام پیش از آن تحت درمانهای مختلف مانند شیمی یا پرتو درمانی قرار نگرفته بودند، 10 مورد بهدرجات 1 و 2 بیماری و 10 مورد دیگر بهدرجات 3 و 4 مبتلا بودند. درکنار هر نمونه توموری، یک نمونه از بافت سالم مجاور فرد بیمار نیز بهعنوان نمونه کنترل جمعآوری شد. تمام افرادی که از نمونههای بافت ایشان در این پژوهش استفاده شده، طبق فرم اجازهنامه کتبی بیمارستان امام خمینی، رضایت خود را جهت انجام پژوهش اعلام کردند.
بررسی بیان ژن
استخراج RNA: برای استخراج RNA کل سلول از کیت RiboEX (GeneAll Biotechnology RNA extraction kit, South Korea) و طبق دستورالعمل شرکت سازنده استفاده شد. برای اطمینان از استخراج صحیح RNA، نمونهها روی ژل آگارز 2 درصد بررسی و بهمنظور حذف آلودگیهای DNA، بهمدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد با 2 میکرولیتر آنزیم DNaseI (TaKaRa bio, Japan) تیمار شدند. در پایان برای غیرفعال کردن آنزیم DNaseI، نمونههای RNA بهمدت 60 دقیقه با 2 میکرولیتر EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) تیمار و کمیت و کیفیت آنها، باروش تعیین دانسیته نوری بهوسیله دستگاه نانودراپ (Thermo scientific-Nanodrop 2000) تعیین شد.
طراحی آغازگر و سنتز cDNA: میزان بیان ژن کدکننده LncRNA CRNDE باروش Real Time-PCR مورد بررسی قرارگرفت. برای طراحی آغازگرهای اختصاصی مورد نیاز جهت سنتز توالی cDNA از نرمافزار generunner و برای بررسی اختصاصیت آنها از نرم افزار primerblast در پایگاه داده NCBI استفاده شد (جدول 1). سنتز cDNA با کیت BioFact (South Korea) انجام شد. برای این منظور بهوسیله دستگاه نانودراپ غلظت 1000 نانوگرم در میلیلیتر از هر نمونه تهیه و cDNA طبق دستورالعمل شرکت سازنده سنتز شد. مخلوط واکنش Real Time-PCR با حجم کلی 20 میکرولیتر شامل 6 میکرولیتر مخلوط سایبرگرین (TaKaRa bio, Japan)، 2 میکرولیتر cDNA (با غلظت 100 نانوگرم در میکرولیتر)، 10 پیکومول مخلوط آغازگرهای رفت و برگشت و 12 میکرولیتر آب عاری از نوکلئاز، تهیه و واکنش زنجیرهای پلیمراز در 40 چرخه، مطابق برنامه زمانی-دمایی جدول 2 بهوسیله دستگاه ترمال سایکلر (Eppendorf Master Cycler Gradient, Germany) انجام شد. بهمنظور مقایسه و بررسی درستی بیان ژن هدف، از GAPDH (Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase) بهعنوان ژن مرجع استفاده شد (13). پس از پایان مراحل واکنش زنجیرهای پلیمراز، منحنیهای ذوب بین دماهای 60 تا 64 درجهسانتیگراد بهمنظور بررسی اختصاصیت واکنش و عدم تشکیل دایمرهای آغازگر رسم شد.
جدول 1: توالی آغازگرهای مورد استفاده
آغازگر |
توالی |
طول محصول (bp) |
CRNDE-F |
5'-ACACGGCTTTCCGGAGTAGA-3' |
bp 118 |
CRNDE-R |
5'-GCCAACATTTGGAGGAACCC-3' |
|
GAPDH-F |
5'-ATGTTGCAACCGGGAAGGAA-3' |
bp 159 |
GAPDH-R |
5'-AGGAAAAGCATCACCCGGAG-3' |
|
جدول 2: برنامه زمانی و دمایی واکنش Real Time-PCR
مرحله |
زمان |
دما (درجه سانتیگراد) |
تعداد چرخه |
واسرشت اولیه |
10 دقیقه |
95 |
1 |
واسرشت |
30 ثانیه |
94 |
40 |
اتصال مجدد |
30 ثانیه |
60 |
|
طویل شدن |
20 ثانیه |
72 |
آنالیز آماری
تجزیه و تحلیل آماری دادههای بهدست آمده از واکنش Real Time-PCR با استفاده از نرم افزار SPSS نسخه 23 انجام شد. بیان ژن LncRNA CRNDE در نمونهها باروش Tukey's HSD post-hoc محاسبه و برای بررسی توزیع نرمال بودن دادهها از آزمون ANOVA یکطرفه استفاده و متوسط متغیرها با استفاده از میانگین±انحراف معیار بیان شد. رسم نمودارها در Excel 2016 انجام شد. هر آزمایش حداقل سهبار تکرار و 05/0p< برای سطح اختلاف معنیداری بین گروهها درنظر گرفته شد.
نتایج
در این مطالعه بهبررسی میزان بیان ژن کدکننده LncRNA CRNDE در 20 نمونه از بافت توموری و 20 نمونه از بافت سالم افراد مبتلا بهسرطان روده بزرگ، بهروش Real Time-PCR پرداخته شد. منحنی ذوب رسم شده برای ژن هدف دارای یک قله بود که نشان دهنده تکثیر تنها یک محصول خاص در واکنش PCR است (نمودار 1).
نمودار1: نمودار منحنی ذوب LncRNA CRNDE با نقطه ذوب 9/82 درجهسانتیگراد
در زمان انجام واکنش، دستگاه Real Time-PCR میزان تغییرات نور فلورسنت در هر چرخه را بهصورت یک منحنی تکثیر نشان داد (نمودار 2)، بهاین ترتیب که با افزایش میزان محصول تولید شده، میزان رنگ متصل شده بین دو رشته DNA بیشتر و در نتیجه میزان نور فلورسنت ساطع شده نیز بیشتر خواهد شد. برای منحنی تکثیر همه نمونهها یک حد آستانه در فاز نمایی تعریف شد و یک Ct بهدست آمد که نشان دهنده چرخهای است که در آن شدت نور فلورسانت ساطع شده از تکثیر محصول بهحد آستانه رسیده است.
نمودار2: منحنی تکثیر LncRNA CRNDE
بررسی بیان LncRNA CRNDE در نمونههای توموری در مقایسه با نمونههای نرمال، نشان دهنده افزایش بیان در سلولهای هر 20 فرد مبتلا بهسرطان روده بزرگ بود. این افزایش بهطور میانگین حدود دو برابر و در سطح 1000/0 معنیدار بود (شکل 1).
شکل1: مقایسه میانگین بیان ژن LncRNA CRNDE در 20 نمونه توموری و بافت نرمال مجاور آن (0001/0p<، 3=n)
بحث
RNAهای غیرکدکننده طویل (LncRNAs) گروهی از miRNAها هستند که با هدف قرار دادن توالیهای غیرکدکننده سمت ʹ3 ژنهای هدف خود، بیان آنها را تنظیم میکنند (14، 15). مطالعات گذشته نشان داده است که فعالیت حدود 18 درصد از ژنهای غیرکدکننده lncRNAها با انواع سرطانها مرتبط است، درحالیکه تنها 9 درصد از ژنهای کدکننده پروتئینهای انسانی در ارتباط با سرطانهای مختلف هستند (16). شواهد نشان میدهد که تغییر بیان lncRNAها با شکلگیری تومور همراه است (71).
در سال های اخیر مشخص شده است که بیان بیقاعده بعضی از lncRNA ها نقش مهمی در شکلگیری و پیشرفت سرطان روده بزرگ ایفا میکند. بهعنوان مثال مشخص شده است که افزایش بیان lncRNAهای CCAT1، MALAT1، PVT-1 و HOTAIR در سلولهای سرطان روده بزرگ میتواند نقش مهمی در شکلگیری تومور و متاستاز آن بهبافتهای دیگر داشته باشد (81-12). Cui و همکاران (22) نشان دادند که lncRNA HEIH با تغییر عملکرد miR-939/Bcl-xL باعث افزایش تکثیر سلولهای تومور روده بزرگ میشود. Iguchi و همکاران (23) ثابت کردند که lncRNA ATB بهطور مشخصی با رشد سلولهای تومور روده بزرگ و رگزایی در بافت سرطانی ارتباط دارد. Xu و همکاران(24) تایید کردند که کاهش سطوح lncRNA SNHG1 در سلولهای سرطان روده بزرگ، از راه تنظیم miR-154-5p باعث مهار رشد سلولهای سرطانی میشد. با اینحال بیان lncRNAها در سلولهای سرطان روده بزرگ همواره با افزایش همراه نیست، مطالعات نشان داده است که کاهش بیان lncRNAهای Evf-2 و GAS5 در این سلولها میتواند عامل جلوگیری از پیشرفت چرخه سلولی و آغاز مرگ برنامهریزی شده در سلولهای سرطان روده بزرگ باشد (25 و 26).
در این مطالعه میزان بیان ژن LncRNA CRNDE در سلولهای بافت سرطانی و بافت نرمال مجاور آن در 20 فرد مبتلا بهسرطان روده بزرگ مورد ارزیابی و مقایسه قرار گرفت. نتایج بهدست آمده نشان دهنده افزایش معنیدار و قابل توجه LncRNA CRNDE در هر 20 فرد مورد مطالعه در بافت توموری نسبت به بافت نرمال بود. این نتایج، تحقیقات Ding و همکاران (12) که نشان دادند LncRNA CRNDE از طریق مهار بیان DUSP5/CDKN1A باعث تکثیر سلولهای توموری روده بزرگ میشود، را تایید میکند. افزایش بیان LncRNA CRNDE و ارتباط آن با تکثیر و متاستاز سلولهای سرطانی و مهار مرگ برنامهریزی شده در مطالعات دیگر نیز گزارش شده است. بهعنوان مثال، Tang و همکاران نشان دادند که این LncRNA از راه افزایش بیان SIX1 در پیشرفت کارسینوم سلولهای کبدی نقش دارد (27). Zhu و همکاران (10) نشان دادند LncRNA CRNDE با افزایش مسیر سیگنالینگ Wnt/beta-catenin در شکلگیری کارسینوم سلولهای کبدی شرکت میکند. آنها همچنین تایید کردند که این LncRNA بهواسطه miR-136-5P باعث افزایش بیان IRX5 و تحریک تشکیل سلولهای سرطانی میشود (28). علاوه براین، غیرفعال شدن ژن کدکننده LncRNA CRNDE ممکن است با افزایش مرگ برنامهریزی شده سلولهای سرطانی روده بزرگ در شرایط in vitroو in vivoهمراه باشد (12). Han و همکاران (29) مشاهده کردند که غیرفعال شدن این LncRNA و miR-181a-5p microRNA باعث مهار مسیر سیگنالینگ Wnt/β-catenin و در نتیجه مهار تکثیر سلولهای سرطانی و کاهش مقاومت آنها در برابر داروهای شیمی درمانی میشد. بنابراین شاید بتوان از آن بهعنوان یک مارکر پیش آگهیدهنده در این سرطان استفاده کرد.
نتیجهگیری
بررسی سطوح بیان LncRNA CRNDE در نمونههای توموری و نرمال افراد مبتلا بهسرطان روده بزرگ با استفاده از روش Real Time-PCR نشان داد که تفاوت قابل ملاحظهای بین میزان بیان این LncRNA در دو گروه سلولی وجود دارد. بنابراین شاید بتوان از اندازهگیری مقادیر این LncRNA در خون محیطی افراد مستعد یا مشکوک به ابتلا بهسرطان روده بزرگ بهعنوان یک روش غیرتهاجمی برای تشخیص زود هنگام بیماری استفاده کرد.
تشکر و قدردانی
از مدیریت مرکز تومور بیمارستان امام خمینی تهران بهدلیل در اختیار گذاشتن نمونههای توموری تشکر و قدرانی میشود.