نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه علومپ زشکی اردبیل، دانشکده علوم پزشکی، گروه علوم تشریحی، آزمایشگاه تحقیقاتی جنینشناسی و سلولهای بنیادی، اردبیل، ایران
2 دانشگاه علوم پزشکی اردبیل، دانشکده علوم پزشکی، گروه علوم تشریحی، آزمایشگاه تحقیقاتی جنینشناسی و سلولهای بنیادی، اردبیل، ایران
چکیده
هدف: هدف از این مطالعه ارائه یک روش ساده و کارآمد جهت جداسازی و تعیین خصوصیت سلولهای ستیغ عصبی از بافت لوله عصبی میباشد.
مواد و روش‌ها: تخم مرغهای نطفهدار حدود 35 ساعت در دمای 38 درجه سانتیگراد و رطوبت نسبی 55 تا 60 درصد در داخل انکوباتور قرار داده شدند تا جنینها بهمراحل 10-12 طبق جدول تکاملی هامبورگر-هامیلتون رسیدند. سپس جنینها از روی سطح زرده تخم مرغ جداسازی شده و لوله عصبی از جنین جوجه جدا و بهمدت 24 ساعت در ظروف کشت سلولی، کشت داده شد تا سلولهای ستیغ عصبی از آن جدا شوند. آنگاه لوله عصبی از کف ظروف کشت جدا و خارج شد و به سلولها بهمدت 5 روز اجازه تکثیر و ازدیاد داده شد. در نهایت این سلولها جمعآوری شدند و جهت ارزیابی پروفایل بیان ژن، PCR صورت گرفت.
نتایج: سلولهای ستیغ عصبی از لوله عصبی جدا شده و در شرایط کشت گسترش یافتند. این سلولها همچنین نشانگرهای Slug، Sox9 و Sox10 را بهروش RT-PCR بیان کردند.
نتیجهگیری: سلولهای ستیغ عصبی میتوانند در محیط آزمایشگاهی از لوله عصبی رها شده و در شرایط کشت مناسب و ساده تکثیر و گسترش یابند.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Isolation and primary culture of chick embryonic neural crest cells
نویسندگان [English]
- M Matin 1
- MGH Golmohammadi 2
- M Sagha 2
1 - Research Laboratory for Embryology and Stem Cells, Department of Anatomical Sciences, School of Medicine, Ardabil University of Medical Sciences, Ardabil, Iran
2 - Research Laboratory for Embryology and Stem Cells, Department of Anatomical Sciences, School of Medicine, Ardabil University of Medical Sciences, Ardabil, Iran
چکیده [English]
Aim: we aimed at presenting a simple and efficient method for isolating and characterizing the neural crest cells.
Material and Methods: The hen’s fertilized eggs were incubated for about 35h at 38°c and 55-60% humidity until the embryos reached to stages 10-12 according to Hamburger-Hamilton developmental stage table. Then the embryos were removed from the egg’s yolk and the neural tube was isolated and cultured for 24 h in a tissue culture dish to release neural crest cell. Then after, the neural tube was removed and allowed to NCC to expand for further 5 days. Finally, the cells were collected and subjected to PCR to study their gene expression profile.
Results: The neural tube released NCC and these cells proliferated in culture condition. They also expressed markers including Slug, Sox9 ,and Sox10 by the RT-PCR method.
Conclusion: The neural tube can release NCC in culture condition and these cells can proliferate in the presence of an appropriate medium.
کلیدواژه‌ها [English]
- Chick embryo
- Neural crest cell
- Neural tube
مقدمه
سلولهای ستیغ عصبی سلولهای مشتق از نورواکتودرم هستند که در مرز بین صفحه عصبی و اپیدرم در حال تکوین جنین شکل میگیرند و با مهاجرت و جابهجایی فعال از این ناحیه و نفوذ به مزودرم زیرین از حالت اپیتلیالی بهحالت مزانشیمی تغییر حالت میدهند (1). این سلولها بهعنوان سلولهای پیش ساز چند توان نامیده میشوند، چون قابلیت تمایز بهردههای مختلف سلولی را دارند (2). از مشتقات مختلف سلولهای ستیغ عصبی میتوان به بافت همبند و استخوانهای صورت و جمجمه، گانگلیونهای اعصاب نخاعی و جمجمهای، سپتوم مخروطی-تنهای در قلب، اودونتوبلاستها، بخش مرکزی غدد فوق کلیه، سلولهای شوان اشاره نمود (3).
با توجه به نقایص شدید ناشی از عدم تشکیل سلولهای ستیغ عصبی، توجه محققان به بیماریهای مرتبط با این سلولها معطوف شده است؛ چراکه، اختلال در تکوین، تکثیر و مهاجرت این سلولها میتواند با ناهنجاریهای شدیدی در بخش جمجمه و صورت، قلب و عروق و بیماریهای عصبی همراه باشد (3، 4).
امروزه روشهای آزمایشگاهی متداول و متنوعی برای دستیابی به سلولهای ستیغ عصبی وجود دارد. میتوان با جداسازی مستقیم این سلولها از لوله عصبی جنین در حال تکوین جانوران (5، 6) یا تمایز سلولهای بنیادی مختلف به سلولهای پیشساز ستیغ عصبی و در نهایت سلولهای ستیغ عصبی، به چگونگی تکوین و تمایز این سلولها پی برد و به بررسی روند تکثیر و مهاجرت این سلولها در شرایط آزمایشگاهی پرداخت (7، 8). همچنین میتوان با استفاده از (FACS) fluorescence activated cell sorting بهتمایز و جداسازی جمعیت سلولهای ستیغ عصبی از پیش سازهای سلولهای بنیادی با منشا مختلف نظیر پالپ دندان، فولیکول مو و سلولهای شوآن اقدام نمود. تلاشهای فراوانی صورت میگیرد تا شرایط کشت این دسته از سلولها بهگونهای بهبود یابد که بتوان با استفاده از آنها به ارزیابی دقیقتر فرآیند تکوین و تمایز و رفتار مهاجرتی این سلولها پرداخت (9). بسیاری از این روش‌ها بسیار پرهزینه و مستلزم صرف زمان زیاد میباشند و برخی از آنها نیاز به یک لایه سلولی تغذیه کننده (Feeder layer) جهت کشت و تکثیر این سلولها دارند. برخی از سلولهای بنیادی که بهعنوان منبع تمایز به سلولهای ستیغ عصبی بهکار میروند از پتانسیل تمایزی متفاوتی برخوردارند و نمیتوانند سلولهای ستیغ عصبی در مرحله پیش مهاجرتی (Premigratory) جهت ارزیابی دینامیک مهاجرت سلولی این سلولها تولید کنند (5، 9). لذا هدف از این مطالعه ارایه یک راهکار ساده، سریع و تا حدی کم هزینه جهت جداسازی و کشت اولیه سلولهای ستیغ عصبی در مرحله پیش مهاجرتی از بافت لوله عصبی جنین جوجه در محیط آزمایشگاهی است.
مواد و روش‌ها
جداسازی و کشت اولیه لوله عصبی: در این مطالعه تجربی، تخم مرغهای نطفهدار حدود 28 تا 33 ساعت در دمای 38 درجه سانتیگراد و رطوبت نسبی 55 تا60 درصد در داخل انکوباتور قرار داده شدند تا جنینها بهمراحل 7 تا 10 برطبق جدول تکاملی هامبورگر-هامیلتون برسند. در این مطالعه کلیه موازین اخلاقی جهت کار بر روی جنینهای حاصل از تخممرغهای نطفهدار مطابق با تاییدیه کمیته اخلاق دانشگاه علوم پزشکی اردبیل رعایت شده بود. سپس جنینها از روی سطح زرده تخممرغ جداسازی شده و در محیط (L15) Leibovitz's جمعآوری شدند. برای جداسازی راحتتر بافتها از همدیگر، جنینها در 5 میلیلیتر آنزیم Dispase با غلظتmg/ml 1 بهمدت 10 دقیقه قرار داده شدند. سپس برای خنثی شدن اثر آنزیم جنینها بهمدت 15 دقیقه در محیط L15 حاوی سرم جنینی گوساله قرار داده شدند. سپس در زیر استریومیکروسکوپ بهکمک سوزنهای انسولین لوله عصبی از جنین جوجه جدا شد و بهمحیط L15تازه منتقل شد. لولههای عصبی سپس بهظروف کشت 6 خانهای که حاویDMEM/F12 + 15% FBS + 10-7µM RA + 20ng/mL bFGF + 10ng/ml EGF + 0.1% β-ME + 1% Pen/Sterp بودند، انتقال داده شدند و پس از گذشت 24 ساعت، سلولهای ستیغ عصبی شروع بهجداشدن از لوله عصبی کردند. آنگاه لوله عصبی از کف ظروف کشت جدا و خارج شد. سپس بهسلولها در محیط کشت DMEM/F12 + 15% FBS + µM RA 7-10 بهمدت 5 روز اجازه تکثیر و ازدیاد داده شد.
استخراج RNA و انجام RT-PCR: در این بررسی از روش RT-PCR برای ارزیابی بیان ژنهای Slug، Sox9 وSox10بهعنوان ژنهایی که در سلولهای ستیغ عصبی بیان میشوند، استفاده شد. همچنین بیان ژنهای BrachyuryوMyoD که در سلولهای مزودرمی و پیشسازهای عضلانی تجلی مییابند در این سلولها مورد بررسی قرار گرفتند. سلولهای ستیغ عصبی پس از جداسازی از ظروف کشت، در محلول ترایزول قرار داده شده ودر دمای 80- درجه سانتیگراد نگهداری شدند. پس از استخراج RNA Total از نمونههای جدا شده، با استفاده از کیت سنتز cDNA از روی یک میکروگرم Total RNA، cDNA سنتز شد. سپس واکنش PCR برای پرایمرهای اختصاصی مختلف در حجم کلی 25 میکرولیتر با استفاده از دستگاه مَسترسایکلر گرادیان اپندورف مدل 5331 صورت گرفت. لیست پرایمرها و توالی آنها در جدول 1 آورده شده است. در نهایت محصول PCR حاصل از تکثیر بیان ژنهای اختصاصی Sox9، Sox10،Slug، MyoD و Brachyury و ژن GAPDH بهعنوان ژن خانگی روی ژل آگارز 1 درصد الکتروفورز شد و باندهای ایجاد شده بهکمک نور UV دستگاه doc Gel مشاهده و تصاویر آن ثبت شد.
جدول 1: فهرست پرایمرهای مورد استفاده همراه با تعداد جفت بازها (Base pair: bp)، دمای اتصال پرایمر بهالگو (AT) و تعداد سیکل
|
Cycle |
Length(bp) |
AT(°C) |
Primer Sequence (5'→3' Gene ) |
Gene |
|
28 |
330 |
50 |
F: AGTCATCCCTGAGCTGAATG R: AGGATCAAGTCCACAACACG |
GAPDH |
|
35 |
448 |
60 |
F: CAGCCCCACCATGTCGGAT R: GGTGGTCCTTCTTGTGCTGC |
Sox9 |
|
33 |
447 |
60 |
F: CAAGAGCAAACCCCACGTCA R: CTCGGTCTTAGGGGTGGTGG |
Sox10 |
|
33 |
509 |
53 |
F:CCAAGAAGCCAAACTACAGCG R: GTAGCGTGTGGGTCCTGATGT |
Slug |
|
35 |
200 |
55 |
F:ACTACACGGAATCACCAAATGACC R: AAGGAATCTGGGCTCCACTGTC |
MyoD |
|
35 |
388 |
49 |
F: CCTCAAGTTTGGCATCTGG R: GCTGACAGGGGTCTGAATGT |
Brachyury |
نتایج
کشت اولیه لوله عصبی جداشده از جنین جوجه
پس از جداسازی لولههای عصبی از جنین جوجه و کشت آنها در ظروف کشت (شکل A1)، لولههای عصبی بهکف این ظروف چسبیدند و طی مدت 24 ساعت، سلولهای ستیغ عصبی از اطراف آنها شروع بهجدا شدن نمودند (شکل B1). بعد از این زمان، توده های باقیمانده از بافت لوله عصبی از ظروف کشت جدا شدند و جای آنها بهصورت یک حفره در وسط سلولهای جدا شده از آن مشاهده شد (شکل C1).
شکل 1: کشت اولیه لوله عصبی. A) استقرار لوله عصبی در ظرف کشت، (B جدا شدن سلولهای ستیغ عصبی از اطراف لوله عصبی کشت داده شده و (C حذف بافت کشت داده شده لوله عصبی از ظرف کشت پس از 24 ساعت (بزرگنمایی 20×).
ظهور و تکثیر سلولهای ستیغ عصبی
بررسی مورفولوژی سلولها با استفاده میکروسکوپ اینورت نشان داد که 24 ساعت بعد از جداسازی تودههای باقیمانده لوله عصبی از ظروف کشت، سلولهایی با زواید متعدد که از نظر مورفولوژیکی با سلولهای ستیغ عصبی مطابقت داشتند، ظاهر شدند (شکل A2). تعداد این سلولها پس از تعویض محیط کشت روبه افزایش نهاد؛ طوریکه بعد از 5 روز، تعداد فراوانی از آنها با مورفولوژی سلولهای ستیغ عصبی در کف ظروف کشت مشاهده شدند (شکل B2). حدودا 5-6 روز بعد از تکثیر این سلولها در محیط کشت، برخی از آنها بهسمت تولید سلولهای ملانوسیت پیش رفتند. این سلولها از لحاظ مورفولوژیکی، سلولهایی با دانههای سیتوپلاسمی سیاه رنگ بودند (شکل C2).
شکل2: (A) مورفولوژی سلولهای ستیغ عصبی با زوائد متعدد. تکثیر فوق العاده آنها بعد 5 روز، (B) سلولهای ستیغ عصبی با بزرگنمایی بیشتر (C) سلولهای شبیه ملانوسیت 5 روز بعد از کشت.
نتایج RT-PCR
با استفاده از روش RT-PCR، بیان ژنهای Sox9،Sox10، Slug در سلولهای ستیغ عصبی بهدست آمده از کشت اولیه لوله عصبی جنین بررسی شد. بیان ژن GAPDH نیز بهعنوان ژن خانگیدر همه سلولها ارزیابی شد. نتایج بهدست آمده نشان دادند که ژنهای Sox9،Sox10، Slug. که نشاندهنده هویت سلولهای ستیغ عصبی بودند در سلولهای ستیغ عصبی جدا شده از لوله عصبی بیان شدند. همچنین جهت ارزیابی بهتر این سلولها، بیان ژن MyoD بهعنوان ژنی که درمایوتومهای حاصل از سومایتهای جنینی بیان میشود و نیز بیان ژنBrachyury که خاص سلولهایی با منشا مزانشیمی است، مورد ارزیابی قرار گرفت. همانطورکه در شکل3 مشخص شده است، بیان این ژن در سلولهای ستیغ عصبی در مقایسه با کل جنین و حتی ژنهای اختصاصی سلولهای ستیغ عصبی بهمراتب کمتر بود.
شکل3: نتایج RT-PCR بیان ژنهای مختلف در سلولهای ستیغ عصبی (NCC) و کل جنین (WE).
بحث
با توجه به اهمیت و گستردگی تمایز سلولهای ستیغ عصبی در موجودات زنده و بیماریهای مختلف مرتبط با نواقص و جهشهای این سلولها، امروزه مطالعات مختلفی برروی نمونههای آزمایشگاهی این سلولها معطوف شده است. از بین حیوانات آزمایشگاهی بیشتر مطالعات برروی جنینهای موش و جوجه صورت گرفته است (10). در مطالعه حاضر از لوله عصبی جنین جوجه برای دستیابی به سلولهای ستیغ عصبی درمحیط آزمایشگاهی استفاده شده است.
بررسیهای صورت گرفته نشان میدهد که نوع محیط کشت تاثیر مهمی در تکثیر و تمایز سلولها دارد. بهعنوان مثال؛ بدون وجود FBS درمحیط کشت، لوله عصبی توانایی اتصال بهظروف کشت را ندارد. در غلظتهای 5، 15 و 20 درصد FBS توانایی اتصال لوله عصبی وجود دارد، اما درصورتیکه غلظت FBS از 15 تا 20 درصد بالاتر رود توانایی تمایز این سلولها بهسمت سلولهای ملانوسیت افزایش مییابد. بههمین دلیل بهترین غلظت حدود FBS 15 درصد است تا علاوه بر اتصال لوله عصبی و آزادسازی سلولهای ستیغ عصبی، از تمایز سریع آنها بهسمت سلولهای ملانوسیت جلوگیری شود. در صورت حضور لوله عصبی، ظرف مدت 1 تا 4 روز جمعیت زیادی از سلولهای ستیغ عصبی در محیط کشت ایجاد میشود. اما در صورت جدا کردن لوله عصبی از محیط، بیشتر سلول ها لیز میشوند (11). این امر احتمالا نشاندهنده وجود فاکتورهای حفظ کننده بقا سلولهای ستیغ عصبی است که از لوله عصبی ترشح میشود (12). مطالعات مختلف افزودن اسید رتینوییک و بتامرکاپتواتانول را نیز در حفظ بقای سلولهای ستیغ عصبی موثر دانستهاند (13). لذا در این مطالعه از bFGF و EGF و نیز اسید رتینوئیک و بتا مرکاپتواتانول برای حفظ بقا سلولهای ستیغ عصبی در محیط کشت استفاده شد و نتایج بیانگر تکثیر و تزاید این سلولها در محیط کشت بود.
24 تا 48 ساعت بعد از کشت لوله عصبی درمحیط کشت، 2 دسته سلول در اطراف آن از نظر مورفولوژیکی ایجاد میشود که یک دسته از سلولها از لحاظ مورفولوژی ستارهای شکل با فضای بین آنها هستند که شبیه سلولهای ستیغ عصبی میباشند و دسته دیگر سلولهای پهنی هستند که از قسمت شکمی لوله عصبی منشا میگیرند. حدود 5-4 روز بعد از کشت، شبکه پیچیدهای از آکسون و ساختارهای شبیه نورون در محیط شکل میگیرد. همچنین ملانوسیتها نیز در این مرحله تشکیل میشوند که این نوع تمایز، ارتباط مستقیمی با غلظتهای بالای FBS دارد (11). در این مطالعه نیز 1 روز بعد از کشت لوله عصبی، سلولهایی که از لحاظ مورفولوژی شبیه سلولهای ستیغ عصبی بودند، تکثیر یافتند و بعد از جداسازی از لوله عصبی و اضافه کردن ترکیبات مکمل بهمحیط کشت، تکثیر قابل توجهی از سلولهای ستیغ عصبی اتفاق افتاد. با گذشت زمان، از تکثیر سلولهای ستیغ عصبی در محیط کشت کاسته شده و بهسمت تمایز پیش رفتند. لذا در این مطالعه حدود 5 روز بعد از تکثیر، سلولهای ستیغ عصبی از محیط کشت جمعآوری شدند.
بعد از جداسازی و جمعآوری سلولهای ستیغ عصبی، ماهیت این سلولها باید از طریق بیان نشانگرهای اختصاصی بهاثبات برسد. ژنهای مختلفی برای تعیین ماهیت این سلولها استفاده میشود (14، 15 و 16). در مطالعه حاضر بیان ژنهای Sox9،Sox10 و Slug با استفاده از روش RT-PCR بررسی شدند.
مطالعات نشان میدهند که در تشکیل سلولهای ستیغ عصبی فاکتورهای مختلفی از جمله اعضا خانواده SoxوSnail درتنظیم تغییر حالت اپیتلیال بهمزانشیم (EMT) و نیز مهاجرت سلولهای ستیغ عصبی نقش دارند (17، 18 و 19). Sox9 هم بهطورمستقیم و هم از طریق فعالسازی Snail2 سبب این تغییر حالت میشود (17، 18). در تشکیل سلولهای ستیغ عصبی، علاوهبر فاکتورهای ذکر شده، مولکولهای پیامرسانی مانند BMP وWNT نیز نقش دارند. در واقع، BMP سبب فعال شدن Snail2 وSox9 میشود (20، 21 و 22).
Snail1/2 در مراحل اولیه تشکیل سلولهای ستیغ عصبی بیان میشود که نقش مهمی در تخصص یافتگی این سلولها دارد. اختلال در بیان این ژن سبب بروز مشکلات جمجمهای–چهرهای مانند کام شکافدار در موش میشود (10). Sox10 نقشهای مختلفی در سلولهای ستیغ عصبی و مشتقات آنها بازی میکند از جمله حفظ ظرفیت تمایز بهسمت سلولهای نورون و گلیال، جلوگیری از تمایز آشکار بهسمت سلولهای ماهیچهای صاف و نورون و حفظ تکثیر سلولهای ستیغ عصبی (18). در انسان، موش و ماهی گورخری، جهشهایSox10، مشتقات سلولهای ستیغ عصبی واگال و ترانکال را تحت تاثیر قرار میدهد که این نشان میدهد سلولهای ستیغ عصبی این دو منطقه به Sox10 وابسته هستند (23، 24 و 25).
Slug و Snail از اولین عوامل رونویسی بودند که در سلولهای ستیغ عصبی شناسایی شدند. این ژنها جزو خانواده Zn-finger هستند و بهوفور بهعنوان نشانگر سلولهای ستیغ عصبی استفاده میشوند. در جنین جوجه Slug بیان میشود ولی snailبیان ندارد؛ اما در موش و ماهی گورخری سلولهای ستیغ عصبیSnail را بهجای Slug بیان میکنند (16، 19). کاهش عملکردSlug در جنین جوجه و Xenopus سبب نقص مهاجرت سلولهای ستیغ عصبی درمحیط آزمایشگاهی میشود. بنابراین Slugاز مهمترین عوامل لایهزایی سلولهای ستیغ عصبی بهشمار میرود (16، 17).
در مطالعه حاضر بیان ژنهای Sox9،Sox10 وSlugروی سلولهای ستیغ عصبی با استفاده از روش RT-PCR بررسی شد که نتایج نشاندهنده بیان بالای ژنهای ذکر شده روی سلولهای ستیغ عصبی بود. از آنجاییکه صرف بیان ژنها در سلولهای کشت داده شده نمیتواند تعیینکننده هویت سلولها باشد بلکه ژنهایی که در آن سلولها بیان نمیشوند نیز باید مورد بررسی قرار گیرند )26)، در این مطالعه بیان دو ژن MyoDوBrachyury نیز در این سلولها بررسی شدند که نتایج بهدست آمده نشان دهنده عدم بیان MyoDو بیان بسیار ضعیفBrachyury در سلولهای ذکر شده بود. MyoD از ژنهایی میباشد که در سومایتها با غلظت بالا تحت تاثیر SHH بیان میشود و در واقع نشاندهنده هویت میوژنیک در سلولهای سومایتی میباشد و عدم بیان ژن ذکرشده در سلولهای ستیغ عصبی نیز بهنوعی ماهیت غیرمزودرمی این سلولها را نشان میدهد (27).
ژن Brachyury که در گره اولیه، سلولهای پیشساز نوتوکورد و نوتوکورد تجلی مییابد، تنظیم تشکیل مزودرم پشتی را در نواحی میانی و دمی رویان کنترل میکند. این ژن برای مهاجرت سلولها از طریق شیار اولیه ضرورت دارد. Brachyury نوعی پروتئین متصل شونده به توالیهای اختصاصی DNA را که بهعنوان عامل نسخهبرداری عمل میکند، رمزگذاری مینماید (1). این ژن نیز در سلولهای ستیغ عصبی بیان بسیار ضعیفی را در مقایسه با ژنهای اختصاصی سلولهای ستیغ عصبی نشان داد که این امر بیانگر ماهیت غیرمزودرمی این سلولها بود.
نتیجهگیری
نتایج حاصل از این مطالعه نشان میدهد که لوله عصبی جنین جوجه در محیط آزمایشگاهی قادر بهرهاسازی سلول ستیغ عصبی میباشد و میتوان هویت آنها را از طریق بیان ژنهایی که در شکلگیری و مهاجرت این سلولها نقش دارد مانند Slug، Sox9 وSox10 و عدم بیان ژنهایی که نقشی در تشکیل آنها ندارند مثل MyoD و Brachyury تعیین نمود. همچنین با استفاده از یک محیط کشت غنی حاوی فاکتورهای رشد میتوان به تکثیر و ازدیاد این سلولها مبادرت نموده و از آنها در مطالعات آتی بهره جست.
تشکر و قدردانی
این مقاله برگرفته از پایان نامه دانشجویی با کد 0539 در دانشگاه علوم پزشکی اردبیل میباشد و بدینوسیله نویسندگان مقاله مراتب تقدیر و تشکر خود را از معاونت تحقیقات و فناوری دانشگاه علوم پزشکی اردبیل جهت تامین اعتبار این پایان نامه بهعمل میآورند.
)