نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
دانشگاه ولیعصر (عج) رفسنجان، دانشکده کشاورزی، گروه ژنتیک و تولید گیاهی، رفسنجان، ایران
چکیده
هدف: هدف از این پژوهش بررسی تاثیر کیتوزان بر تولید ترکیبات فنلی، اسید رزمارینیک و بیان ژنهای کلیدی در بیوسنتز این ترکیبات در کشت تعلیقی بادرنجبویه بود.
مواد و روشها: جهت تهیه کالوس از ترکیب نفتالن استیک اسید (1 میلیگرم بر لیتر)، توفوردی (1 میلیگرم بر لیتر) و کینتین (5/0 میلیگرم بر لیتر) و ریزنمونه ساقه استفاده شد. پس از راه‌اندازی کشت تعلیقی، تیمار کیتوزان با سه سطح (0، 50 و 100 میلیگرم بر لیتر) به مدت یک، سه و پنج روز در قالب آزمایش فاکتوریل بر پایه طرح کاملا تصادفی با سه تکرار انجام شد. فعالیت آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز، میزان پروتئین محلول، میزان ترکیبات فنلی و میزان اسیدرزمارینیک اندازهگیری شد. همچنین بیان ژنهای فنیلآلانین آمونیالیاز و رزمارینیک اسید سینتاز با روش Real-time PCR بررسی شد.
نتایج: فعالیت آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز در غلظت 50 میلیگرم بر لیتر کیتوزان پس ازگذشت سه روز از شروع تیمار بیشترین افزایش را نشان داد که با افزایش میزان ترکیبات فنلی همراه بود. بیان نسبی ژن فنیلآلانین آمونیالیاز در غلظت 50 میلیگرم بر لیتر کیتوزان در زمان سه روز پس از اعمال تیمار نسبت به شاهد 5/2 برابر افزایش نشان داد. این افزایش بیان ژن، افزایش فعالیت آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز را بهدنبال داشت. بیشترین افزایش بیان ژن رزمارینیک‌اسید سینتاز در غلظت 100 میلیگرم بر لیتر کیتوزان پنج روز پس از اعمال تیمار مشاهده شد که به افزایش میزان اسیدرزمارینیک منجر شد.
نتیجهگیری: با توجه به نتایج بهدست آمده تیمار کیتوزان بهمدت پنج روز جهت افزایش میزان اسید رزمارینیک در کشت سلولی بادرنجبویه توصیه میشود.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
The effect of chitosan on phenolic compounds, rosmarinic acid and expression of key genes involved in rosmarinic acid biosynthesis in cell suspension culture of Melissa officinalis L.
نویسندگان [English]
- A Mahdavianfard
- M Dahajipour Heidarabadi
- KH Malekzadeh
- SR ahhafi
Department of Genetics and Plant Production, Faculty of Agriculture, Vali-e-Asr University of Rafsanjan, Rafsanjan, Iran
چکیده [English]
Aim: The aim of this study was the investigation of the effect of chitosan on phenolic compounds, rosmarinic acid content, and key genes expression involved in the biosynthesis of these compounds in Melissa officinalis L. cell suspension culture.
Material and Methods: A combination of NAA (1mg L-1), 2, 4-D (1mg L-1), and kinetin (0.5 mg L-1) and stem explants were used for callus induction. After initiation of cell suspension culture, chitosan treatment (0, 50, and100 mg L-1) was performed for one, three, and five days in a factorial experiment based on a completely randomized design with three replications. Phenylalanine ammonia-lyase (PAL) activity, soluble protein, phenolic compound, and rosmarinic acid content were measured. Also, the expressionof phenylalanine ammonia-lyase and rosmarinic acid synthase (RAS) genes was evaluated by real-time PCR.
Results: PAL activity at 50 mg L-1 chitosan showed the highest increase after three days of treatment, which was accompanied by an increase in phenolic compounds. The relative expression of the PAL gene at 50 mg L-1 chitosan increased 2.5 fold at three days after treatment compared to control. This increase in the expression of the PAL gene resulted in an increase in enzyme activity. However, the highest increase in expression of the RAS gene was observed at 100 mg L-1 chitosan in five days after treatment, which led to an increase in rosmarinic acid content.
Conclusion: According to the results, chitosan treatment is recommended to increase of rosmarinic acid content in lemon balm cell culture for five days.
کلیدواژه‌ها [English]
- Cell suspension culture
- Chitosan
- Lemon balm
- Phenylalanine ammonia-lyase
- Rosmarinic acid synthase
مقدمه
بادرنجبویه (Melissa officinalis L.) از خانواده نعناعیان، بهدلیل تولید متابولیتهای ثانویه مهم و کاربرد این ترکیبات در زمینههای پزشکی، صنایع آرایشی-بهداشتی و صنایع غذایی بسیار مورد توجه قرار گرفته است (1). اسیدرزمارینیک (استر اسیدکافئیک و 3، 4 دی هیدروکسی فنیل لاکتیکاسید) ترکیب فنلی فعال غالب (5/0 تا 8/6 درصد از وزن خشک گیاه) در گیاه بادرنجبویه علاوه بر فعالیت آنتیاکسیدانتی، دارای خواص ضدسرطانی، ضدافسردگی، ضدآرتروز، ضدآلرژی و ضدباکتریایی نیز میباشد (2). اسید رزمارینیک از طریق مسیر بیوسنتزی فنیلپروپانوئیدی با استفاده از پیشماده فنیلآلانین با دخالت آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز (PAL: EC 4.3.1.5) ساخته میشود. آنزیم رزمارینیک اسید سینتاز (RAS: EC 2.3.1.140)، در انتهای مسیر بیوسنتزی، تشکیل اسید رزمارینیک را کاتالیز میکند (شکل 1).
شکل 1: مسیر بیوسنتزی اسیدرزمارینیک در بادرنجبویه (3)
استفاده از راهکارهای زیستفنآوری جهت بهبود کمیت و کیفیت مواد موثره گیاهان دارویی امری ضروری است. پیشرفت در روش‌های زیستشناسی بهویژه کشت بافت گیاهی، ابزار جدیدی را جهت فرآوری تجاری گیاهان دارویی و مواد موثره آنها فراهم کرده است. افزودن محرکها به کشت بافت گیاهی، موثرترین تکنیک برای بهبود تولید متابولیتهای ثانویه در این سیستمها میباشد، بهگونهای که طی پاسخ به محرکها، سیستم دفاعی گیاه فعال و در نتیجهی بیان ژنهای دفاعی و راه‌اندازی مسیرهای بیوسنتزی مربوط، متابولیتهای ثانویه تجمع مییابند (4). محرکهای زیستی به منظور افزایش تولید متابولیتهای ثانویه در شرایط کشت درون شیشه )ortiv ni( از اهمیت ویژهای برخوردار میباشند (5). مطالعات نشان داده است که محرکهای زیستی با القای تنش اکسیداتیو، ترکیبات فنلی را از طریق افزایش فعالیت آنزیمهای دخیل در بیوسنتز آنها افزایش میدهد (6). استفاده از کیتوزان بهعنوان محرک، چشمانداز امیدوارکنندهای در تولید فیتوالکسینها و متابولیتهای ثانویه در زیستفنآوری ایجاد کرده است (7). کیتوزان پلیساکاریدی پلیکاتیونی و مشتق از کیتین است. بهدلیل غیرسمیبودن، خاصیت جذب بالا، امکان تجزیه در طبیعت و سازگاری با محیط زیست بسیار مورد توجه قرار گرفته است.فعالیت زیستی کیتوزان از باندشدن به گیرندههای غشایی ناشی میشود که نقش آن در القای متابولیسم ثانویه در کشت سلول گیاهی، به وزن ملکولی و درجه استیلاسیون آن بستگی دارد (8).
تاثیر مثبت کیتوزان بر تولید متابولیتهای ثانویه در پژوهشهای زیادی به اثبات رسیده است. بهعنوان مثال، نتایج استفاده از کیتوزان در کشت سلولی گیاه ریحان، افزایش مقدار کل ترکیبات فنلی بهویژه اسیدرزمارینیک را نشان داده است (9). همچنین تیمار کیتوزان در کشت ریشههای مویین گیاهان مختلف افزایش قابل توجهی در میزان متابولیتهای ثانویه را موجب شده است (10- 14). نتایج کمالیپور آزاد و همکاران (15) نشان داد که کیتوزان با تاثیر بر بیان ژن آنزیمهای کلیدی مسیر بیوسنتزی ترکیبات فنیلپروپانوئیدی، سبب افزایش تولید متابولیتهای ثانویه شده است.
در گیاهان تولید کننده اسیدرزمارینیک، ارتباط سنتز اسیدرزمارینیک با بیان ژنهای دخیل در مسیر بیوسنتزی آن از جمله ژنهای فنیلآلانین آمونیالیاز و رزمارینیک اسید سینتاز تایید شده است. براساس بررسی DNA ژنومی و بررسیهای ساترن بلات مشخص شد که ژن فنیلآلانین آمونیالیاز جداسازی شده از گیاه بادرنجبویه، شامل یک اینترون میباشد و پروتئینی مشتمل بر 836 اسید آمینه را بهرمز درمیآورد. همچنین تنها یک نسخه از ژن رزمارینیک اسید سینتاز در بادرنجبویه حضور دارد که فاقد اینترون است و پروتئینی مشتمل بر 427 اسید آمینه را کد میکند (3).
براساس شواهد تولید اسیدرزمارینیک در کشت سلولی بسیار بیشتر از تولید آن در گیاهان طبیعی است (2). از آنجاییکه بادرنجبویه یک گیاه مدل دارویی مناسب جهت مطالعه در زمینه تنظیم بیوسنتز اسیدرزمارینیک است، در این پژوهش تاثیر کیتوزان بهعنوان یک محرک زیستی بر بیوسنتز ترکیبات فنلی، اسید رزمارینیک و فعالیت آنزیم کلیدی فنیلآلانین آمونیالیاز مرتبط با بیوسنتز آنها، در کشت تعلیقی آن مورد بررسی قرار گرفت. از آنجاییکه ژنهای فنیلآلانین آمونیالیاز و رزمارینیک اسید سینتاز بهعنوان ژنهای مهم در ارتباط با مسیر بیوسنتزی اسید رزمارینیک در گیاه بادرنجبویه شناسایی شدهاند، بررسی بیان این ژنها تحت تاثیر کیتوزان از اهداف دیگر این پژوهش بود.
مواد و روشها
تهیه ریزنمونه و القای کالوس از گیاهچههای استریل: بذرهای گیاه بادرنجبویه با درصد جوانهزنی 2/96 درصد از شرکت پاکان بذر اصفهان تهیه شد. بعد از ضدعفونی کردن سطحی بذرها، با محلول هیپوکلریت سدیم پنج درصد و سپس محلول اتانول 70 درصد سه بار آبکشی با آب مقطر استریل انجام شد. بذرهای ضدعفونیشده به شیشه‌های حاوی محیط کشت MS (50 درصد) بدون هورمون با اسیدیته 7/5، منتقل و جهت رشد به اتاق رشد با دوره نوری شانزده ساعت نور و هشت ساعت تاریکی، دمای 25 درجه سانتیگراد و شدت نور 3000 لوکس منتقل شدند. بعد از گذشت 30 روز از رشد گیاهچهها بهعنوان ریزنمونه مورد استفاده قرار گرفتند. برای القای کالوس، ریزنمونه ساقه و محیط MS شامل 8/0 درصد آگار و 3 درصد سوکروز همراه با ترکیبات هورمونی نفتالناستیک اسید (NAA)، توفوردی و کینتین بهترتیب با غلظت 1، 1 و 5/0 میلیگرم بر لیتر استفاده شد (16). سپس محیطهای کشت در اتاق رشد در دمای 25 درجه سانتیگراد در تاریکی نگهداری شد. بعد از گذشت 7 تا 01 روز القای کالوس در ریز نمونهها شروع شد. واکشت کالوسها هر دو هفته یکبار انجام شد.
راه‌اندازی کشت سلولی تعلیقی: بهمنظور راه‌اندازی کشت سلولی تعلیقی، مقدار دو گرم کالوس ترد و همسن درون ارلن 100 میلیلیتری، حاوی 25 میلیلیتر محیط کشت مایع MS با ترکیبات هورمونی ذکر شده منتقل و با سرعت 110 دور در دقیقه در دمای 25 درجه سانتیگراد در تاریکی روی لرزاننده (شیکر) نگهداری شدند. بهمنظور تکثیر، همگنسازی و سازگاری سلولها بهمحیط کشت تعلیقی واکشت سلولها هردو هفته یکبار انجام (5 مرحله) و در هر مرحله سلولها بر روی نایلون مش توسط قیف بوخنر با مکش جمعآوری و بهمحیط جدید منتقل شد.
تعیین منحنی رشد سلولی: قبل از اعمال تیمار، بهمنظور تعیین منحنی رشد سلولها یک گرم کالوس همگن بهارلن 100 میلیلیتر حاوی 25 میلیلیتر محیط کشت مایع جدید MS با ترکیب هورمونی قبلی منتقل و از روز اول تا روز 20 پس از واکشت، بهفاصله زمانی دو روز یکبار نمونهبرداری انجام و براساس وزن تر توده سلولی منحنی رشد ترسیم شد.
تیمار سلولها با کیتوزان: بهمنظور اعمال تیمارها، کشت تعلیقی جدید تهیه شد. یک گرم سلول با استفاده از قیف بوخنر و در شرایط مکش برداشت و بهارلن حاوی 15 میلیلیتر محیط کشت مایع منتقل شد. محیطهای کشت در دمای 25 درجه سانتیگراد با سرعت 110 دور در دقیقه و در محیط تاریک روی لرزاننده (شیکر) نگهداری شدند. با توجه به منحنی رشد سلولها، که در آزمایشی جداگانه بررسی شد، در روز هفتم از دوره رشد سلولی محلول کیتوزان با غلظت های 0، 50 و 100 میلیگرم بر لیتر به محیط کشت سلولی اضافه شد. سپس سلولها در زمانهای 24 ساعت، سه روز و پنج روز بعد از اضافه نمودن کیتوزان به محیط کشت برای بررسیهای بیوشیمیایی و ملکولی برداشت، در نیتروژن مایع منجمد و بهفریزر 80- درجه سانتیگراد منتقل شد. جهت تهیه محلول کیتوزان از روش خان و همکاران (17) استفاده شد.
سنجش میزان پروتئین کل و فعالیت آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز: 2/0 گرم نمونه منجمد با استفاده از هاون در بافر Tris-HCl 50 میلیمولار با اسیدیته 8/8 حاوی مرکاپتواتانول دو میلیمولار ساییده و سپس با سرعت 9000 دور در دقیقه بهمدت 10 دقیقه در دمای چهار درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. فاز رویی برای سنجش پروتئین کل و فعالیت آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز مورد استفاده قرار گرفت. سنجش پروتئین تام بر اساس روش برادفورد (18) انجام گرفت. یک میلیلیتر معرف برادفورد به 1/0 میلیلیتر نمونه اضافه و بعد از مخلوط شدن، بهمدت 10 دقیقه در دمای اتاق نگهداری و سپس جذب نمونهها در طول موج 595 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر مدل Analytik Jena ساخت کشور آلمان قرائت شد. آلبومین سرم گاوی (Bovin Serum Albumin) با غلظتهای 0 تا 100 میکروگرم در میلیلیتر بهعنوان استاندارد مورد استفاده قرار گرفت. فعالیت آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز بهعنوان آنزیمی کلیدی در متابولیسم ترکیبات فنلی اندازهگیری شد. مخلوط واکنش شامل 5/0 میلیلیتر فنیلآلانین (10میلیمولار)، یک میلیلیتر بافر Tris-HCl 50 میلیمولار با اسیدیته 8/8، 4/0 میلیلیتر آب مقطر و 1/0 میلیلیتر عصاره استخراجی بود. نمونهها بهمدت یک ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد (ماکزیمم فعالیت آنزیم) نگهداری و واکنش آنزیمی با افزودن اسید کلریدریک شش مولار متوقف شد. اسید سینامیک (فرآورده آنزیم PAL) موجود، سه بار با اتیل استات استخراج و توسط جریانی از هوای تصفیه شده خشک شد. میزان اسید سینامیک پس از حل نمودن در NaOH 05/0 مولار، در طول موج 290 نانومتر سنجیده شد. فعالیت آنزیم برحسب میزان اسید سینامیک بهازای میلیگرم پروتئین در مدت یک ساعت بیان شد. محلول اسید سینامیک با غلظت 0 تا 35 میکرومولار برای رسم منحنی استاندارد مورد استفاده قرار گرفت (19).
استخراج و سنجش میزان فنل کل: ترکیبات فنلی کل براساس روش رنگ سنجی با استفاده از معرف فولین-سیوکالتیو اندازهگیری شد (20). ابتدا مقدار 2/0 گرم نمونه منجمد شده کالوس در سه میلیلیتر متانول 80 درصد همگن و بهمدت 3 ساعت در حمام آب گرم با دمای 70 درجه سانتیگراد قرار داده شد. سپس با سرعت 9000 دور در دقیقه بهمدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد و روشناور حاصل برای سنجش فنل کل مورد استفاده قرار گرفت. به 20 میکرولیتر عصاره متانولی، 100 میکرولیتر معرف فولین-سیوکالتیو اضافه شد. به مخلوط حاصل بعد از پنج دقیقه، 300 میکرولیتر محلول کربنات سدیم 5/7 درصد اضافه و بهمدت 5/1 ساعت در تاریکی و دمای اتاق قرار داده شد. در نهایت جذب هر نمونه در طول موج 765 نانومتر بهوسیله اسپکتروفتومتر مدل Analytik Jena ساخت کشور آلمان خوانده شد و مقدار فنل کل برحسب میلیگرم بر گرم وزن تر محاسبه شد. غلظتهای 0 تا 500 میلیگرم بر لیتر اسیدگالیک بهعنوان استاندارد مورد استفاده قرار گرفت (20).
استخراج و سنجش اسید رزمارینیک: عصارهگیری 1/0 گرم نمونههای خشک با استفاده از اتانول 30 درصد (v/v) و سونیکاسیون بهمدت 10 دقیقه در حمام فراصوت انجام شد. برای سنجش میزان اسیدرزمارینیک مخلوط آزمایش شامل 200 میکرولیتر از عصاره صاف شده، سه میلیلیتر اتانول و زیرکونیوم اکسی کلراید 2ZrOCl در غلظت نهایی 5/0 مولار بود. مخلوط حاصل بهمدت پنج دقیقه در تاریکی نگهداری و سپس جذب نمونهها در طول موج 362 نانومتر اندازهگیری و غلظت اسید رزمارینیک در هر نمونه، با استفاده از استاندارد اسید رزمارینیک برحسب میکروگرم بر گرم وزن خشک محاسبه شد (21).
بررسی بیان ژنهای فنیلآلانین آمونیالیاز و رزمارینیک اسید سینتاز:استخراج RNA نمونهها با استفاده از کیت Column RNA isolation kit براساس دستورالعمل شرکت سازنده (دنا زیست آسیا) انجام و پس از حذف DNA ژنومی با استفاده از آنزیم DNase1، محصول شرکت Thremo Scientific، کمیت و کیفیت RNA استخراجی با استفاده از دستگاه نانودراپ و الکتروفورز در ژل آگارز تایید شد. ساخت رشته اول cDNA از 5/0 میکروگرم RNA کل با استفاده از کیتRevertAid First Strand cDNA Synthesis kit شرکت Thermo Scientific انجام و بعد از رقیقسازی بهعنوان الگو در واکنشهای RCP emit-laeR مورد استفاده قرار گرفت.
برای بررسی کمی بیان ژنهای فنیلآلانین آمونیالیاز و رزمارینیک اسید سینتاز، از آغازگرهای اختصاصی با طول قطعه تکثیر شونده 132 جفت باز برای هر ژن استفاده شد (جدول 1). ساخت آغازگرها توسط شرکت ماکروژن کره جنوبی بهسفارش شرکت دنا زیست آسیا صورت گرفت.
جدول 1: فهرست آغازگرهای اختصاصی برای واکنشهای RT-PCR (22)
|
ژن |
|
توالی آغازگرها |
|
MoPAL |
رفت: برگشت: |
5 GCCGAAGTCATGAACGGAAAGC 3 5 CGCAGCCTTAACATAACCGCTC 3 |
|
MoRAS |
رفت: برگشت: |
5 ACGCCCCGACCTCAACCTTATC 3 5 AAGTGGTGCTCGTTTGCCACG 3 |
|
MoEF1α |
رفت: برگشت: |
5 TTGCTGCTGCAACAAGATGGAC 3 5 GGGACGAATGCGATTTTGTCGG 3 |
مخلوط واکنش شامل 4 میکرولیتر cDNA رقیق شده، 25/0 میکرولیتر آغازگرهای رفت و برگشت و 10 میکرولیتر مسترمیکس سایبرگرین (RealQ Plus Master Mix Green) با حجم نهایی 20 میکرولیتر بود. دستگاه Real-time مدل 9600 plus شرکت Bioer، برای بررسی بیان ژنها بهروش Relative Quantitative PCR مورد استفاده قرار گرفت. مراحل واکنش شامل سه مرحله بهترتیب مرحله اول، 95 درجه سانتیگراد بهمدت 15 دقیقه، مرحله دوم،40 چرخه 95 درجه سانتیگراد بهمدت 15 ثانیه، 60 درجه سانتیگراد بهمدت 30 ثانیه و 72 درجه سانتیگراد بهمدت 25 ثانیه و مرحله سوم، منحنی ذوب از 55 تا 95 درجه سانتیگراد با فاصلههای افزایشی 5/0 درجه سانتیگراد در مدت 15 ثانیه بود. در بررسی کمی بیان ژنهای مورد نظر از αEF1 بهعنوان شاهد داخلی استفاده شد. با استفاده از روش ΔΔCT- 2 تعداد نسخههای تکثیرشده برای هر ژن محاسبه شد. مقدار نسخههای هر ژن در هر نمونه نسبت به مقدار نسخههای تکثیرشده ژن کنترل داخلی در همان نمونه نرمالیزه و سپس داده‌ها در نمونههای تیمار نسبت به شاهد کالیبره شد.
طرح آزمایش و بررسیهای آماری: طرح آزمایش بهصورت فاکتوریل بر پایه طرح کاملا تصادفی با سه تکرار اجرا شد. کلیه بررسیهای بیوشیمیایی و ملکولی نیز در سه تکرار مستقل، هریک با سه تکرار تکنیکی انجام شد. از نرم افزار SAS نسخه 9 برای تجزیه آماری داده‌ها استفاده شد. با مشاهده تفاوت معنیدار در تجزیه واریانس (ANOVA)، مقایسه میانگینها در سطح احتمال پنج درصد با آزمون دانکن صورت گرفت. برای تعیین میانگین، انحراف معیار و رسم نمودارها از بسته نرمافزاری Excel استفاده شد.
نتایج
بررسیهای اولیه نشان داد که در گیاه بادرنجبویه ریزنمونه ساقه نسبت به ریزنمونه برگ، میزان کالوس بیشتری تولید کرده است (شکل 2). کالوسهای حاصل از ریزنمونه ساقه ترد و شیری رنگ بوده لذا از آنها جهت بررسیهای بعدی استفاده شد.
|
(الف) |
(ب) |
|
(ج) |
(د) |
شکل 2: الف) گیاهچههای استریل بادرنجبویه پس از گذشت 30 روز از زمان کاشت بذر ب) تشکیل کالوس اولیه از ریزنمونه ساقه بعد از گذشت 7 روز ج) تشکیل کالوسهای ترد پس از واکشت چهارم از ریزنمونه ساقه د) کشت تعلیقی کالوسهای حاصل از ریزنمونه ساقه بعد از واکشت پنجم
تعیین منحنی رشد سلول
پیش از اعمال تیمار، میزان رشد سلولها در بازه زمانی 20 روزه در کشت تعلیقی بررسی شد. نتایج نشان داد که در دو روز اول پس از کشت، میزان رشد سلولها کم بود بهعبارتی سلولها در مرحله تاخیری رشد بودند. سپس رشد سلولها از روز چهارم افزایش یافته و این روند افزایشی تا روز دهم ادامه (مرحله لگاریتمی) داشت و پس از این زمان تغییری در وزن سلولها مشاهده نشد. بهعبارتی از روز یازدهم بهمدت پنج روز میزان رشد ثابت ماند. پس از مرحله سکون از میزان رشد سلولها بهتدریج کاسته شد. با توجه به منحنی رشد در روز هفتم سلولها در مرحله لگاریتمی رشد بوده و بهشدت در حال تقسیم بودند (شکل 3). بنابراین روز هفتم بعد از واکشت بهعنوان زمان مناسب برای افزودن کیتوزان انتخاب شد.
شکل3: منحنی رشد سلولی در کشت تعلیقی بادرنجبویه در طی 20 روز کشت در محیط کشت MS
فعالیت آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز، میزان ترکیبات فنلی، پروتئین کل و اسید رزمارینیک
نتایج تجزیه واریانس نشان داد که فعالیت آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز، میزان ترکیبات فنلی کل و میزان اسید رزمارینیک تحت تاثیر اثرات اصلی کیتوزان، زمان پس از اعمال تیمار و اثر متقابل کیتوزان و زمان پس از اعمال تیمارها قرار گرفت (جدول 2)، در حالیکه میزان پروتئین کل تحت تاثیر اثرات اصلی کیتوزان و زمان پس از اعمال تیمارها قرار گرفت (جدول 2).
جدول 2: تجزیه واریانس اثرات کیتوزان و زمان بر فعالیت آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز، ترکیبات فنلی، پروتئین کل و اسیدرزمارینیک در کشت تعلیقی بادرنجبویه
|
|
|
میانگین مربعات |
|||
|
منابع تغییر |
درجه آزادی |
فعالیت آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز |
ترکیبات فنلی |
پروتئین کل |
اسیدرزمارینیک |
|
کیتوزان |
2 |
** 83/3676 |
** 0566/0 |
** 43/681329 |
** 89/60902 |
|
زمان |
2 |
** 24/6664 |
** 1645/0 |
** 72/431354 |
** 48/32732 |
|
کیتوزان×زمان |
4 |
** 62/1361 |
** 0468/0 |
65/9452 ns |
** 07/9244 |
|
اشتباه |
18 |
36/43 |
0024/0 |
73/38335 |
07/168 |
|
درصد ضریب تغییرات |
|
41/8 |
02/9 |
03/9 |
13/11 |
** در سطح 1 درصد معنیدار، * در سطح 5 درصد معنیدار،ns عدم تفاوت معنیدار
فعالیت آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز
چنانچه در شکل 4 نشان داده شده است استفاده از کیتوزان با غلظت 50 میلیگرم بر لیتر در زمان یک، سه و پنج روز پس از اعمال تیمارها، فعالیت آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز را نسبت به شاهد بهطور معنیداری افزایش داد. اما با افزایش غلظت کیتوزان به 100 میلیگرم بر لیتر تنها در زمان سه روز پس از اعمال تیمار افزایش معنیدار فعالیت آنزیم فنیل‌آلانین‌آمونیالیاز نسبت به شاهد مشاهده شد (شکل 3). بیشترین افزایش فعالیت آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز در زمان سه روز پس از اعمال تیمار کیتوزان بود، بهگونهای که کیتوزان با غلظت 50 و 100 میلیگرم بر لیتر فعالیت آنزیم را نسبت به شاهد بهترتیب بهمیزان 4/2 و 9/1 برابر افزایش داد. تیمار 100 میلیگرم بر لیتر کیتوزان اگرچه فعالیت آنزیم را در زمان پنج روز پس از اعمال تیمار نسبت به شاهد افزایش داد اما این افزایش از لحاظ آماری تفاوت معنیداری نشان نداد (شکل 4).
شکل 4: اثر کیتوزان و زمان پس از اعمال تیمار بر فعالیت آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز در کشت تعلیقی بادرنجبویه. میانگینهایی که دارای حداقل یک حرف مشترک هستند بر اساس آزمون دانکن در سطح احتمال 05/0p≤ اختلاف معنیداری ندارند.
میزان ترکیبات فنلی
میزان ترکیبات فنلی کل با استفاده از کیتوزان در کشت تعلیقی بادرنجبویه افزایش نشان داد (شکل 5). تیمار کیتوزان با غلظتهای 50 و 100 میلیگرم بر لیتر در زمانهای یک و سه روز پس از اعمال تیمار افزایش میزان فنل کل را بههمراه داشت. در زمان یک روز پس از اعمال تیمار، غلظتهای 50 و 100 میلیگرم بر لیتر کیتوزان بهترتیب 4/1 و 3/1 برابر نسبت به شاهد، ترکیبات فنلی را در کشت سلولی بادرنجبویه افزایش داد. تفاوت معنیداری بین افزایش میزان ترکیبات فنلی در غلظتهای 50 و 100 میلیگرم کیتوزان، در زمان یک روز پس از اعمال تیمار در کشت تعلیقی بادرنجبویه مشاهده نشد (شکل 5)، ولی با گذشت سه روز از اعمال تیمار، کیتوزان با غلظت 50 و 100 میلیگرم بر لیتر بهطور معنیداری میزان ترکیبات فنلی را بهترتیب بهمیزان 8/1 و 4/1 برابر نسبت به شاهد افزایش داد. با گذشت زمان بهمدت پنج روز پس از اعمال تیمارها تفاوت معنیداری در میزان ترکیبات فنلی کل مشاهده نشد (شکل 5).
شکل 5: اثر کیتوزان و زمان بر میزان ترکیبات فنلی در کشت تعلیقی بادرنجبویه. میانگینهایی که دارای حداقل یک حرف مشترک هستند بر اساس آزمون دانکن در سطح احتمال 05/0 p ≤ اختلاف معنیداری ندارند.
میزان پروتئین کل
میزان پروتئین کل تحت تاثیر اثرات اصلی کیتوزان و زمان پس از اعمال تیمارها در سطح احتمال یک درصد (01/0p≤) قرار گرفت (جدول 2). غلظتهای 50 و 100 میلیگرم کیتوزان بهطور معنیداری (در سطح احتمال 5 درصد) میزان پروتئین کل را نسبت به شاهد در کشت تعلیقی بادرنجبویه افزایش داد (شکل 6). با افزایش غلظت کیتوزان به 100 میلیگرم بر لیتر افزایش کمتری در میزان پروتئین کل نسبت به غلظت 50 میلیگرم بر لیتر آن مشاهده شد (شکل 6).
شکل 6: اثر غلظت کیتوزان بر میزان پروتئین کل در کشت تعلیقی بادرنجبویه. میانگینهایی که دارای حداقل یک حرف مشترک هستند بر اساس آزمون دانکن در سطح احتمال 05/0p≤ اختلاف معنیداری ندارند.
همانطور که در شکل 7 مشاهده میشود میزان پروتئین کل در طی یک و سه روز پس از اعمال تیمارها تفاوت معنیداری را از لحاظ آماری نشان نداد. در حالیکه با افزایش زمان اعمال تیمار کیتوزان به پنج روز میزان پروتئین کل کاهش یافت (شکل 7).
شکل 7: اثر زمان پس از اعمال تیمار کیتوزان بر میزان پروتئین کل در کشت تعلیقی بادرنجبویه. میانگینهایی که دارای حداقل یک حرف مشترک هستند بر اساس آزمون دانکن در سطح احتمال 05/0p≤ اختلاف معنیداری ندارند.
میزان اسید رزمارینیک
غلظتهای 50 و 100 میلیگرم بر لیتر کیتوزان در کشت تعلیقی بادرنجبویه میزان اسیدرزمارینیک را در زمان سه و پنج روز پس از اعمال تیمار بهمیزان 5/1 تا 3 برابر نسبت به شاهد افزایش داد (شکل 8). بیشترین میزان اسید رزمارینیک در تیمار کیتوزان با غلظت 100 میلیگرم بر لیتر در زمان پنج روز مشاهده شد (شکل 8). اگرچه افزایش اسید رزمارینیک یک روز پس از اعمال تیمار کیتوزان نیز مشاهده شد ولی این افزایش از لحاظ آماری (05/0p≤)معنیدار نبود (شکل 8).
شکل 8: اثر کیتوزان و زمان بر میزان اسید رزمارینیک در کشت تعلیقی بادرنجبویه. میانگینهایی که دارای حداقل یک حرف مشترک هستند براساس آزمون دانکن در سطح احتمال 05/0p≤ اختلاف معنیداری ندارند.
بررسی بیان نسبی ژن ژنهای فنیلآلانین آمونیالیاز و رزمارینیک اسید سینتاز
نتایج تجزیه واریانس نشان داد که بیان نسبی ژنهای فنیلآلانین آمونیالیاز (PAL) و رزمارینیک اسید سینتاز (RAS) تحت تاثیر اثرات اصلی کیتوزان و زمان پس از اعمال تیمار و اثرات متقابل کیتوزان و زمان پس از اعمال تیمار قرار گرفت (جدول 3).
جدول 3: تجزیه واریانس اثرات کیتوزان و زمان پس از تیمار بر بیان نسبی ژن فنیلآلانین آمونیالیاز(PAL) و رزمارینیک اسید سینتاز (RAS) در کشت تعلیقی بادرنجبویه
|
|
|
میانگین مربعات |
|
|
منابع تغییر |
درجه آزادی |
بیان نسبی ژن فنیل‌آلانین‌آمونیالیاز |
بیان نسبی ژن رزمارینیک اسید سینتاز |
|
کیتوزان |
2 |
** 411/1 |
** 952/0 |
|
زمان |
2 |
** 152/0 |
** 105/1 |
|
کیتوزان×زمان |
4 |
** 125/1 |
** 297/0 |
|
اشتباه |
18 |
060/0 |
023/0 |
|
درصد ضریب تغییرات |
|
186/27 |
595/11 |
** در سطح 1 درصد معنیدار، * در سطح 5 درصد معنیدار،ns عدم تفاوت معنیدار
بیان نسبی ژن فنیلآلانین آمونیالیاز
بهطور کلی تیمار با کیتوزان باعث افزایش بیان ژن فنیلآلانین آمونیالیاز در کشت سلولی بادرنجبویه شد (شکل 9). با اعمال تیمار کیتوزان با غلظت 50 میلیگرم بر لیتر بهمدت یک و سه روز، بیان ژن فنیلآلانین آمونیالیاز افزایش معنیداری را در مقایسه با شاهد نشان داد. اما با افزایش زمان اعمال تیمار، افزایش بیان ژن نسبت به شاهد مشاهده نشد (شکل 9). غلظت 100 میلیگرم بر لیتر کیتوزان بیان ژن فنیلآلانین آمونیالیاز را پنج روز پس از اعمال تیمار بهطور معنیداری نسبت به شاهد افزایش داد (شکل 9).
شکل 9: اثر کیتوزان و زمان بر میزان بیان نسبی ژن فنیلآلانین آمونیالیاز. میانگینهایی که دارای حداقل یک حرف مشترک هستند بر اساس آزمون دانکن در سطح احتمال 05/0p≤ اختلاف معنیداری ندارند.
بیان نسبی ژن رزمارینیک اسید سینتاز
با گذشت یک روز از اعمال تیمار کیتوزان، تغییرات مشاهده شده در بیان ژن رزمارینیک اسید سینتاز نسبت به شاهد از لحاظ آماری معنیدار نبود (شکل 10). بیان ژن رزمارینیک اسید سینتاز با افزایش زمان اعمال تیمار کیتوزان در مقایسه با شاهد بهطور معنیدار (05/0p≤)افزایش یافت. همچنین با افزایش غلظت کیتوزان، افزایش بیان ژن رزمارینیک اسید سینتاز نسبت به شاهد مشاهده شد. بهگونهای که کیتوزان با غلظت 100 میلیگرم بر لیتر در زمان پنج روز پس از اعمال تیمار، بیشترین افزایش بیان ژن رزمارینیک اسید سینتاز را موجب شد (شکل 10).
شکل 10: اثر کیتوزان و زمان بر میزان بیان نسبی ژن رزمارینیک اسید سینتاز. میانگینهایی که دارای حداقل یک حرف مشترک هستند براساس آزمون دانکن در سطح احتمال 05/ p≤ اختلاف معنیداری ندارند.
بحث
روش‌های زیستفنآوری با ارایه شواهد در رابطه با چگونگی مسیر بیوسنتزی و تنظیم متابولیتهای ثانویه، برای محققان امکان دستوری هدفمند ژنهای دخیل در بیوسنتز این ترکیبات را جهت افزایش تولید متابولیتهای ثانویه با سرعت و هزینه کمتر فراهم نموده است. در سالهای اخیر، افزایش تولید متابولیتهای ثانویه در کشت سلولی گیاهان دارویی بهوسیله محرکها مورد توجه قرار گرفته است. براساس شواهد تولید اسید رزمارینیک در کشت سلولی بسیار بیشتر از تولید آن در گیاهان طبیعی میباشد(2). بادرنجبویه یک گیاه مدل دارویی مناسب، جهت مطالعه در زمینه تنظیم بیوسنتز اسید رزمارینیک است. لذا، در این پژوهش تاثیر کیتوزان بهعنوان یک محرک زیستی بر مسیر بیوسنتزی اسید رزمارینیک در کشت تعلیقی آن مورد بررسی قرار گرفت.
بررسیهای اولیه نشان داد که در گیاه بادرنجبویه ریزنمونه ساقه نسبت به ریزنمونه برگ، میزان کالوس بیشتری تولید کرد (شکل 2). بنابراین، در بررسیهای بعدی از کالوسهای بهدست آمده از ریزنمونه ساقه استفاده شد. این نتیجه توسط نتایج پژوهشهای دیگر مورد تایید قرار گرفت (23). با توجه به نتایج بهدست آمده فعالیت آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز تحت تاثیر کیتوزان با غلظت 50 میلیگرم بر لیتر در کشت تعلیقی بادرنجبویه، افزایش فعالیت این آنزیم را موجب شده است. درحالیکه غلظت 100 میلیگرم بر لیتر در زمان سه روز بعد از اعمال تیمار افزایش نشان داده است (شکل 4). در اکثر موارد به منظور درک تاثیر محرکها بر دفاع گیاهی و متابولیسم ثانویه در کشت سلولی، فعالیت آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز اندازهگیری شده است (24). آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز، یکی از آنزیمهای کلیدی در شروع مسیر فنیل پروپانوئیدی است که جریان متابولیتهای اولیه را به کانال متابولیسم ثانویه هدایت و کنترل میکند. بهعبارتی این مرحله، نقطه تنظیمی مهمی بین متابولیسم اولیه و ثانویه است (25). این آنزیم با دآمیناسیون فنیلآلانین و سنتز اسید سینامیک، پیش ماده مشترک برای بیوسنتز ترکیبات پلیفنلی مانند لیگنین، فلاونوئید، آنتوسیانینها، سینامات و فیتوالکسینها را فراهم میکند (26). نتایج تحقیقات متعددی افزایش فعالیت آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز را تحت تیمار با محرکها نشان داده است (15، 27 و 28). استفاده از کیتوزان در کشت سلولی گیاه نارگیل فعالیت آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز را در شروع تیمار بهطورمعنیداری افزایش داد. اگرچه این افزایش فعالیت تا روز سوم پس از افزودن کیتوزان ادامه داشت ولی فعالیت آن پس از گذشت پنج روز از آغاز تیمار کاهش نشان داد (29). همچنین افزایش فعالیت فنیلآلانین آمونیالیاز، چهار روز پس از اعمال تیمار کیتوزان در کشت سلولی انگور مشاهده شد (30). نتایج تاثیر کیتوزان بر فعالیت آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز نشان داد که فعالیت این آنزیم در شروع تیمار کیتوزان بهعنوان یک سیستم محافظتی در مقابل محرک افزایش و با گذشت زمان بهصورت خودتنظیمی از فعالیت آن کاسته شده است.
فعالیت آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز، بهعنوان آنزیمی کلیدی در شروع مسیر فنیل پروپانوئیدی، نقش مهمی در سنتز ترکیبات فنلی بهعهده دارد (25). نتایج تحقیقات مختلف یک ارتباط مثبت بین فعالیت آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز و تجمع ترکیبات فنلی کل را نشان داده است. بهعبارتی قرار گرفتن در معرض محرک به افزایش تجمع ترکیبات فنلی از طریق تحریک فعالیت این آنزیم منجر میشود (27). براساس نتایج این پژوهش افزایش در میزان ترکیبات فنلی در گیاه بادرنجبویه هماهنگ با افزایش فعالیت آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز بود. بهگونهای که در زمان سه روز پس از اعمال تیمار کیتوزان با افزایش فعالیت آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز بیشترین افزایش در میزان ترکیبات فنلی مشاهده شد (شکل 5). استفاده از کیتوزان در کشت تعلیقی سیب طی سه روز پس از تیمار تولید ترکیبات فنلی را 5/1 تا 2 برابر در مقایسه با شاهد افزایش داد (31). تحریک تجمع ترکیبات فنلی بهوسیله محرکها در کشت درون شیشه گونههای دیگر گیاهی مانند نارگیل با استفاده از کیتوزان (29)، مریمگلی با استفاده از عصاره مخمر (32) نیز گزارش شده است. نتایج پژوهش اسماعیل زاده و همکاران (33) در کشت تعلیقی کتان سفید افزایش ترکیبات فنلی را با تیمار کیتوزان نشان داد. استفاده از تیمار کیتوزان در گیاه گل میمونی سازویی نیز افزایش ترکیبات فنلی را موجب شد (15).
کیتوزان بهعنوان محرک زیستی خارج سلولی آنزیمهای مسیر فنیلپروپانوئیدی و تولید متابولیتهای ثانویه را تحت تاثیر قرار میدهد (29 و 34). تحقیقات بسیاری نشان داده است که کاربرد کیتوزان بهعنوان محرک سلولی بیوسنتز متابولیتهای ثانویه را در گیاهان گوناگون افزایش داده است (9، 35- 38). بررسیها نشان داده است که غلظت محرک، برحسب گونه گیاهی نقش مهمی در تحریک و شدت پاسخ گیاه به محرک دارد (39). چنانچه در نتایج این پژوهش نشان داده شده است استفاده از کیتوزان بهمدت سه و پنج روز در کشت تعلیقی بادرنجبویه میزان اسید رزمارینیک را نسبت به شاهد افزایش داده است. در این راستا نتایج اسماعیلزاده بهابادی و همکاران (33) نشان داد که بیشترین میزان تجمع متابولیتهای ثانویه پودوفیلوتوکسین و لاریسیرزینول در کشت سلولی کتان سفید، تحت تاثیر تیمار کیتوزان با غلظت 100 میلیگرم بر لیتر، در روز پنجم پس از اعمال تیمار بهدست آمد. استفاده از کیتوزان میزان تولید گلیکوزید فنیل اتانویید در کشت سلولی گیاه سیستانچه (40)، سورولین در کشت سلولی باکوچی (41)، تاننها در کشت سلولی فیلانتوس (42) و آرتمیزین را در کشت ریشه مویین آرتمزیا (12) افزایش داد.
نتایج این پژوهش نشان داد که تیمار کیتوزان افزایش میزان پروتئین کل را نسبت به شاهد موجب شده است. افزایش میزان پروتئین در حضور محرکها، با افزایش سنتز پروتئینهایی مانند دهیدرینها، پروتئینهای شوک حرارتی و آنزیمهای آنتیاکسیدانت نسبت داده شده است (43). همچنین کاهش میزان پروتئین کل در زمان پنج روز پس از اعمال تیمار کیتوزان با تخریب اکسیداتیو پروتئینها و کاهش میزان آنها با افزایش تولید گونههای فعال اکسیژن و افزایش حساسیت آنها را در مقابل پروتئولیزکننده داخل سلولی مانند پروتئازها و پپتیدازها مرتبط است. بهعبارتی افزایش مدت زمان تیمار میتواند با مرگ سلولی و تخریب پروتئینها کاهش میزان پروتئینها را موجب شود (44).
اثر محرکها بر ژنهای درگیر در مسیر بیوسنتزی اسید رزمارینیک بهویژه فنیلآلانین آمونیالیاز و رزمارینیک اسید سینتاز در گیاهان مختلف نشان داده شده است (45). بررسیهای بیان ژن فنیلآلانین آمونیالیاز نشان داد که ژن فنیلآلانین آمونیالیاز در زمانهای اولیه بعد از تیمار با کیتوزان افزایش بیان داشته است. بهعبارتی افزایش بیان ژن و فعالیت این آنزیم بهعنوان اولین واکنش گیاه در برابر محرکها عمل میکند. فعالیت آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز تاحدی از طریق تغییرات پسترجمهای تنظیم میشود؛ بهگونهای که فسفریلاسیون، موجب غیرفعالشدن آن میشود (46). با افزایش زمان قرار گرفتن سلولها در معرض محرک کیتوزان، بهدلیل افزایش فرآورده آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز (اسید سینامیک)، کاهش فعالیت آنزیم از طریق افزایش فسفریلاسیون مشاهده شد. کاهش فعالیت آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز در زمان پنج روز پس از اعمال تیمار کیتوزان، القای سریع بیان نسبی ژن فنیلآلانین آمونیالیاز را موجب شده است. مطالعات فری و همکاران (2009) تغییر بیان ژن تعدادی از آنزیمهای اساسی درگیر در مسیر فنیلپروپانوئیدی و پروفایل بیان پروتئین کل را بعد از تیمار با کیتوزان نشان داد. افزایش بیان ژن و پروتئین فنیلآلانین آمونیالیاز (PAL)، افزایش تجمع متابولیتهای ثانویه در تیمار با کیتوزان را نشان داد (27). با توجه به مسیر بیوسنتزی اسید رزمارینیک در گیاه بادرنجبویه، آنزیم رزمارینیک اسید سینتاز آخرین مراحل را در این مسیر متابولیسمی کاتالیز میکند. پژوهشهای اولیه تجمع اسید رزمارینیک را با بیان ژن رزمارینیک اسید سینتاز در کشت سلولی بادرنجبویه مرتبط نشان دادند (3). براساس بررسی DNA ژنومی و بررسیهای ساترن بلات مشخص شد که تنها یک نسخه از ژن رزمارینیک اسید سینتاز که فاقد اینترون است در بادرنجبویه حضور دارد. بنابراین بادرنجبویه یک گیاه مدل دارویی مناسب جهت تحقیقات در زمینه تنظیم بیوسنتز اسیدرزمارینیک است (3). نتایج بررسی بیان ژن آنزیم رزمارینیک اسید سینتاز نشان داد بیان آن در زمان پنج روز پس از تیمار کیتوزان نسبت به شاهد حدود سه برابر افزایش یافته است. بهعبارتی براساس ارتباط بین بیان ژن آنزیم رزمارینیک اسید سینتاز و تجمع اسید رزمارینیک، با افزایش زمان تیمار کیتوزان، میزان تولید اسیدرزمارینیک نیز افزایش نشان داده است. بهعبارتی دیگر سنتز متابولیت ثانویه اسیدرزمارینیک پس از سنتز پیشمادههای لازم برای این ترکیب توسط آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز صورت میگیرد. در این راستا افزایش بیان ژن رزمارینیک اسید سینتاز به تجمع اسید رزمارینیک در گیاه آویشن منجر شد (47). همچنین استفاده از اسیدآبسیزیک بهعنوان یک محرک در کشت شاخه بادرنجبویه، با افزایش بیان ژن فنیلآلانین آمونیالیاز و رزمارینیک اسید سینتاز افزایش اسید رزمارینیک را موجب شده است (48).
نتیجهگیری
اهمیت اقتصادی متابولیتهای ثانویه بهدست آمده از گیاهان، تحقیقات را به استفاده از روش‌های زیستفنآوری جهت افزایش تولید این ترکیبات سوق داده است. کشت بافت و سلول گیاهی یکی از روش‌هایی است که امروزه در زمینه بررسی متابولیتهای گیاهی مورد توجه خاصی قرار گرفته است. علاوه بر آن استفاده از محرکها یکی از موثرترین روشها برای بهبود سنتز متابولیتهای ثانویه در کشت سلولی گیاهان دارویی است. کیتوزان بهعنوان یک محرک زیستی از طریق تحریک سیستم دفاعی گیاه و بیان برخی ژنها، تولید متابولیتهای ثانویه را در گیاهان دارویی موجب شده است. کیتوزان با افزایش فعالیت آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز آنزیم کلیدی دخیل در بیوسنتز ترکیبات فنلی، افزایش ترکیبات فنلی را در زمان سه روز پس از اعمال تیمار موجب شد. در زمان پنج روز پس از اعمال تیمار کاهش فعالیت آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز به کاهش میزان ترکیبات فنلی منجر شد. بررسیهای بیان نسبی ژن فنیلآلانین آمونیالیاز در زمانهای یک و سه روز بعد از تیمار با کیتوزان با فعالیت آنزیم مربوطه هماهنگ بود. کاهش فعالیت آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز در زمان پنج روز پس از اعمال تیمار کیتوزان افزایش بیان نسبی ژن فنیلآلانین آمونیالیاز را موجب شد. افزایش بیان ژن آنزیم رزمارینیک اسید سینتاز، تجمع اسید رزمارینیک را با افزایش زمان تیمار کیتوزان نشان داد. با توجه به مسیر بیوسنتزی اسید رزمارینیک این نتیجه بهدست میآید که سنتز اسیدرزمارینیک پس از آمادهسازی پیشمادههای لازم برای این متابولیت ثانویه توسط آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز صورت میگیرد. در نهایت، با توجه به نتایج این پژوهش، تیمار کیتوزان با غلظت 100 میلیگرم بر لیتر بهمدت پنج روز با افزایش فعالیت و بیان ژنهای مرتبط با مسیر بیوسنتزی اسیدرزمارینیک میتواند افزایش این ماده دارویی ارزشمند را موجب شود. بنابراین، استفاده از کیتوزان جهت افزایش متابولیتهای ثانویه بهعنوان چشماندازی امیدوارکننده، در مطالعات زیستفناوری تایید میشود.
تشکر و قدردانی
نویسندگان مراتب قدردانی خود را از معاونت محترم پژوهش و فناوری دانشگاه ولیعصر (عج) برای حمایتهای مالی و در اختیار قرار دادن امکانات لازم جهت انجام این تحقیق اعلام میدارند.
)