فصلنامه

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 گروه ژنتیک و بهنژادی، پژوهشکده گل و گیاهان زینتی، موسسه تحقیقات علوم باغبانی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، محلات، ایران.

2 دانشگاه ایلام، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت و اصلاح نباتات، ایلام، ایران

چکیده

هدف: هدف از این تحقیق، دسترسی به پروتکل تکثیر سریع و بهینه و زامی­فولیا با کشت بافت می­باشد.
مواد و روش‏ها: برای کالوس­زایی و باززایی، دو آزمایش به‏صورت فاکتوریل بر پایه طرح کاملا تصادفی با 3 تکرار در آزمایشگاه کشت بافت پژوهشکده ملی گل و گیاهان زینتی درسال 1397 انجام شد. در آزمایش اول جهت کالوس­زایی فاکتورهای 2, 4-D (0، 1 ، 2 و 4 میلی‌گرم بر لیتر) و BA (0، 1 و 2 میلی‌گرم­ بر ­لیتر) اعمال شد. در آزمایش دوم یا باززایی ریزنمونه‌ها، فاکتور NAA (0و 5/0 میلی‌گرم ­بر لیتر) و BA (0، 5/0 و 1 میلی‌گرم­ بر لیتر) اعمال شد.
نتایج: نتایج کالوس­زایی نشان داد که محیط MS تغییریافته با غلظت 2 میلی­گرم­ بر لیترBA  و یک میلی­گرم برلیتر  2, 4-Dبهترین کالوس را با 85 درصد باززایی تولید نمود. در مرحله باززایی نیز غلظت 5/0 میلی­گرم ­بر لیتر  BAهمراه با 5/0 میلی­گرم­ بر لیتر NAA بیش‏ترین تعداد گیاهچه و غده (90 درصد) را تولید نمود. سپس، تک گیاه‏چه­های غده­دار با موفقیت90-80 درصد در بستر کوکوپیت و پرلیت سازگار شدند.
نتیجه‏گیری: نتایج موفقیت­آمیز بوده و می‏توان با فرمول‏هایی حاصله، کار کالوس­زایی و باززایی زامی­فولیا را انجام و به‏عنوان پروتکلی کاربردی جهت تکثیر تجاری این گیاه زینتی ارزش‏مند، پیشنهاد نمود.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Impact of growth regulators on callus formation and regeneration of ornamental plant zamiifolia

نویسندگان [English]

  • E Beyramizadeh 1
  • A Arminian 2
  • A Fazeli 2

1 National Institute of Ornamental Plants (NIOP), Horticultural Science Research, Agricultural Research, Education and Development, Mahallat, Iran

2 Agronomy and Plant Breeding Department, Agricultural faculty, Ilam University, Ilam, Iran.

چکیده [English]

Aim: This study aimed to access the rapid and improved propagation protocol production of Zamifolia plant using tissue culture.
Material and Methods: For callus formation and regeneration, two independent factorial experiments were carried out in a completely randomized design with 3 replications in the tissue culture laboratory of the National Research Institute of Flowers and Ornamental Plants in 2018. In the first experiment, to induce callogenesis, 2,4-D (0, 1, 2, and 4 mg/l) and BA (0, 1 and 2 mg/l) were used. In the second experiment, or regeneration of explants, NAA (0 and 0.5 mg/l) and BA (0, 0.5, and 1 mg/l) were applied.
Results: The results of the callogenesis experiment showed that a modified basal MS medium with concentration of 2 mg/l BA and 1 mg /l 2,4-D produced the best callus with 85% regeneration. At the regeneration stage of the callus, 0.5 mg/l BA and 0.5 mg NAA produced the highest number of seedlings and regenerated tubers (90%). Subsequently, single tuber seedlings were successfully adapted to 80%-90% in the cocopeat and perlite substrates.
Conclusion: The results were successful and could be possible to achieve the callogenesis and regeneration of Zamifolia plant with the formula presented and recommend as practical a protocol for commercial micropropagation of this valuable ornamental plant.
 

کلیدواژه‌ها [English]

  • Auxin
  • cytokinin
  • proliferation
  • rooting
  • leaf piecess

مقدمه

در طی قرن گذشته به‏دلیل گسترش اطلاعات بشر از فرایندهای بیولوژیکی و به‏کارگیری این اطلاعات در برنامه‌های به‌نژادی، افزایش زیادی در تولید اکثر گیاهان حاصل شده است. گل‌های زیبا و جذاب امروزی حاصل تلاش و شکیبایی به­نژادگرانی است که از گذشته­های دور به گزینش و دورگ‌گیری در میان گل‌ها و گیاهان زینتی پرداخته‌اند. هم‏چنین در فعالیت‌های مذکور تولید گیاهان متحمل به آفات، بیماری‌ها و تنش‌های محیطی مورد نظر بوده است. به‏نحوی که ضرورت به‏کارگیری روش‌های نوین ازقبیل کشت بافت‌های گیاهی برای حل بعضی از این موانع مطرح شده است. با استفاده از این روش می‌توان اقدام به تولید انبوه ژنوتیپ‌های یکسان و یا معرفی ژنوتیپ‌های جدید از طریق تنوع سوماکلونال نمود (1).

خانواده Araceae یکی از خانواده‌های بزرگ و قدیمی گیاهان تک­لپه است که به‏دلیل دارا بودن ویژگی‏های مورفولوژیکی جالب مثل کوچک‌ترین آنژیوسپرم به‏عنوان یکی از بزرگ‌ترین ساختارهای گیاهی و تولید­مثلی جهان مورد توجه قرار گرفته است. این خانواده شامل 3800 جنس در 118 گونه هستند که در نواحی گرمسیری پراکنده هستند ولی در سایر مناطق با گستره دمایی مختلف نیز دیده می‌شوند. این گیاهان در شرایط اکولوژیکی مختلف از ارتفاع 3000 متری سطح دریا تا حالت شناور در آب یا غیرشناور و شرایط هوازی، به‏صورت بالارونده و یا زمینی رشد می‌نمایند. ساقه‌های این گیاهان می‌توانند به‏شکل ریزوم، غده و غیره دیده شوند. گیاهان این خانواده به‏دلیل داشتن کریستال‌های متنوع اگزالات کلسیم، دارا بودن اسپادیکس کوچک، گل‌های تک­جنسی ودوجنسی، محافظت توسط اسپات و سلول‌های فاقد روغن‌های اتری از سایر خانواده‌ها متمایز هستند (2). گیاه زامی­فولیا با نام علمی Zamioculcos zamiifoliaگیاهی چندساله، بومی آفریقای شرقی از خانواده آراسه می­باشد که در مناطق جنگلی حاره‌ای و مرطوب با زمین‌های سخت رشد می‌کند. این گیاه دارای برگ‌های بزرگ و ساده و ریزوم‌های ضخیم افقی (با تشکیل غده) بوده و برگ‌های داخلی آن توانایی رشد در شرایط نور پایین را دارند. این گیاه به‏شدت تحمل بالایی به استرس خشکی و بیماری‌ها و آفات دارد. گیاهی است همیشه سبز، کندرشد با برگ‌های نسبتا باریک سبز براق و تیره به‏طول 7 تا 15سانتی‏متر گل‌های کوچک زردروشن متمایل به قهوه‌ای یا برنزی به‏طول 5 تا 7 سانتی‏متر، ارتفاع 45 تا 60 سانتی‏متر، ساقه زیرزمینی ضخیم و آب‏دار که معمولا در فصل تابستان تا اوایل پاییز رشد می­کنند. متداول­ترین راه تکثیر این گیاه از طریق تکثیر ریزوم و قلمه برگ می­باشد که این روش­ها بسیار زمان­بر و طولانی بوده، لذا تهیه پروتکل تکثیر از طریق کشت بافت می­تواند افزایش عمل‏کرد و کاهش هزینه تولید را به‏دنبال داشته باشد.

جهت ریزازدیادی گیاه زامی‌فولیا از نمونه اولیه برگ در محیط کشت MS (3) حاوی 20 میلی­گرم بر لیتر بنزیل آدنین (6-BA) و 02/0 میلی­گرم ­بر لیتر آلفا نفتالین استیک اسید ((NAA جهت ساقه‌زایی استفاده شده که نتایج مفید و قابل توجهی به‏همراه داشته است. هم‏چنین بنا به گزارشات، ریشه‌زایی ساقه‌ها نیز در محیط حاوی 5/0 میلی­گرم بر لیتر اندول 3 بوتریک اسید (IBA) انجام شده است (4). جهت کالوس‌زایی گیاه زامی‌فولیا از بافت کاس‏برگ و برگ‏چه در محیط  MS2/1 به‏همراه 100 میلی­گرم بر لیتر میواینوزیتول، 2/0 میلی­گرم ­بر لیتر بنزیل آدنین BA، 4 میلی­گرم­ بر لیتر 2,4-D (2و4-دی‏کلروفنوکسی­استیک اسید)، 20 گرم­برلیتر ساکارز و 3 گرم­برلیتر آگار استفاده گزدیده است. کشت‌ها پس از 5/4 هفته به محیط ساقه‌زایی شامل محیط  MS2/1 به‏همراه 100 میلی­گرم­ بر لیتر میواینوزیتول، 1 میلی­گرم ­بر لیتر BA، 40 گرم­ بر لیتر ساکارز و 3 گرم­ بر لیتر آگار منتقل شده است (5). در آزمایش دیگری اثر نوع و جهت ریزنمونه‌ها در واکنش به هورمون‌های رشد گیاهی در ریزازدیادی گیاه زامی‌فولیا صورت گرفته و نتایج نشان داده که بهترین پاسخ به هورمون و تولید گیاهچه‌ در کالوس‏های دارای جنین در محیط حاوی هورمون 2, 4-D صورت گرفته است (6).

هم‏چنین باکتی و همکاران (7) در کشت درون­ شیشه‌ای گیاه آگلونما، از جوانه‌های جانبی اولیه و برگ‌های جوان در محیط کشت MS با مقدار مختلف تنظیم­کننده‌های ­رشد (BA و 2, 4-D) در غلظت‌های ppm 5، 10، 15، 20 استفاده کردند. اگرچه کشت درون­شیشه‌ای آگلونما می‌تواند نتایج خوبی داشته باشد ولی در چنین آزمایشاتی ساقه یا کالوس تشکیل نشده است (7). بنا به‏گزارشی، در کشت درون شیشه‌ای قطعات ساقه با جوانه‌های جانبی آگلونما درغلظت‌های مختلف 6-BA برای تولید ساقه نیز استفاده شده و نتایج آن نشان داده که غلظت‌های پایینBA  (5/1 میلی­گرم ­بر لیتر) مناسب بوده و تیمار محیط MS همراه 1/0- 05/0 میلی­گرم­ بر لیتر NAA و 5/2 میلی­گرم­ بر لیتر BA برای تکثیر جوانه‌ها با ضریب تکثیر 1/4 در هر ماه مناسب بوده است. ریشه‌زایی گیاه‏چه‌ها در محیط MS 2/1 با 5/0-2/0 میلی­گرم ­بر لیتر NAA به‏صورت نرمال انجام شده است (8).

دیر و همکاران (9) نیز اثر ترکیب و غلظت‌های مختلف تنظیم‌کننده‌های رشد بر روی شاخه‌زایی ریزنمونه‌های نوک شاخه S. cannifoliumدر محیط کشت MS را بررسی نموده و مشخص نمودند که شاخه‌زایی به‏شدت تحت تاثیر نوع و غلظت سیتوکینین قرار داشته و محیط کشت حاوی 3-1 میلی‌گرم برلیتر BA باعث بیش‏‏ترین شاخه‌زایی می­شود. در همین گزارش، وقتی اکسین همراه با سیتوکنین به محیط کشت اضافه شد، تعداد شاخه‌های تولید شده در هر ریزنمونه افزایش یافت. بیش‏ترین تعداد شاخه نیز در محیط کشت حاوی 3 میلی‌گرم بر لیتر BA و 1 میلی‌گرم بر لیتر IBA به‏دست آمد. بنا به‏همین گزارش، از غلظت‌های مختلف MS و ساکارز برای تحریک شاخه‌زایی استفاده شده و مشاهده شد که غلظت کامل MS و 30 گرم بر لیتر ساکارز برای کشت نوک شاخه S. cannifolium مناسب بوده است (9).

چان و همکاران (10) نیز در یک تحقیق برروی گونه­های گیاهی زینتی از خانواده Araceae (خانواده زامی­فولیا)، به‏نامهای Alocasia sanderina, Colocasia antiquorum, Gonatanthus   pumilusSyngonium podophylum. در محیط کشت MS، تاثیر تنظیم­کننده­های رشدی BA (غلظت 2 میلی­گرم ­بر لیتر) و IBA (5/0 میلی­گرم­ بر لیتر) را در القای شاخساره و ریشه­زایی این گونه­ها بررسی نموده و به‏خوبی تا مرحله بلوغ و سازگاری با محیط ادامه داده و به نتایج مثبتی درخصوص تکثیر برخی از گونه­های این خانواده دست یافتند.

 

مواد و روش‌ها

تهیه مواد گیاهی:در این تحقیق، برای انجام آزمایشات کشت بافت، قطعات برگی گیاه زینتی زامی‌فولیا مورد استفاده قرار گرفته و کلیه مراحل آزمایش در آزمایشگاه کشت بافت پژوهشکده ملی گل و گیاهان زینتی محلات در سال 1397 انجام گرفت (شکل 1).

 

 

شکل 1: نمونه گیاهی زامی­فولیا

ضدعفونی مواد گیاهی:ابتدا برگ‌های سالم از بوته بالغ برداشت شده و به آزمایشگاه منتقل شدند. سپس برای نفوذ بیش‏تر مواد ضدعفونی­کننده برگ‌ها به قطعات حدود 2×2 سانتی‏متری تقسیم شده و در محلول آب و مایع ظرفشویی به‏مدت 30 دقیقه غوطه‏ور شد. سپس نمونه­های برگی به‏مدت 30 ثانیه در الکل 70 درصد قرار گرفته و بعد از شست‏وشو با آب مقطر به‏ظرف حاوی هیپوکلریت 1 درصد (w/v) به‏همراهTween 20  به‏مدت 20 دقیقه منتقل شدند. در ادامه­، شست‏وشو در سه مرحله (5، 10، 15 دقیقه) در زیر دستگاه لامینار انجام شد. قطعات برگی استریل شده در زیر لامینار به قطعات 1×1 سانتی‏متری حاوی رگ‏برگ اصلی تقسیم و پس از حذف حاشیه­ها در ظروف حاوی محیط کشت، کشت شدند.

طراحی آزمایش و محیط کشت بافت:این تحقیق در قالب دو آزمایش مستقل به‏صورت فاکتوریل بر پایه طرح کاملا تصادفی با 3 تکرار در آزمایشگاه کشت بافت انجام گرفت. در آزمایش اول به‏منظور القای کالوس­زایی فاکتورهای آزمایشی شامل تنظیم‌کننده رشد ‌2, 4-D با 4 سطح (0، 1 ، 2 و 4 میلی‌گرم بر لیتر)  و BA در سه سطح (0، 1 و 2 میلی‌گرم بر لیتر) مورد بررسی قرار گرفتند. در آزمایش دوم، به‏منظور باززایی ریزنمونه‌ها، فاکتورهای آزمایشی NAA با دو سطح (0و 5/0 میلی‌گرم بر لیتر) و BA با سه سطح (0، 5/0 و 1 میلی‌گرم بر لیتر) مورد بررسی قرار گرفتند. در هر شیشه­ تعداد 4 ریزنمونه کشت شد. محیط کشت پایه مورد استفاده در این آزمایش  MSتغییر یافته (ماکرو) بود. مقدار 30 گرم بر لیتر ساکارز به‏همراه 7 گرم بر لیتر آگار نیز به محیط کشت اضافه شد. هم‏چنین pH محیط کشت با استفاده از NaOH یک نرمال برروی عدد 7/5 تنظیم شد. به‏منظور توزیع یکنواخت محیط کشت، ظروف شیشه‌ای قبل از توزیع به‏مدت یک دقیقه داخل اتوکلاو و در دمای حدود 115 درجه سانتی­گراد قرار داده شد تا آگار آن­ها به‏خوبی حل شود. پس از خروج از اتوکلاو، ارلن حاوی محیط کشت برروی هات‌پلیت هم‏زده شد تا یکنواخت شد. سپس به‏میزان 30 تا 40 میلی‏لیتر محیط کشت در هر ظرف شیشه­ای توزیع شد. ظروف شیشه­ای پس از بستن درب به‏مدت 20 دقیقه در اتوکلاو (دمای 121 درجه سانتی‏گراد و فشار 2/1 اتمسفر) استریل شد. جهت جلوگیری از خطای احتمالی در طی مراحل اتوکلاو محیط‌های کشت به‏مدت 10-7 روز در اتاق تاریک با شرایط دمایی معمولی نگه‏داری شدند تا در صورت بروز آلودگی حذف شدند.

 

استقرار مواد گیاهی:ریز‌نمونه‌های ضدعفونی شده برگ در زیر لامینار به‏چندین قطعه 1×1 سانتی‏متری تقسیم و هر قطعه حاوی رگ‏برگ‌ اصلی برروی محیط کشت قرار گرفت. سپس ظروف حاوی ریز نمونه به اتاق رشد منتقل و در شرایط تاریکی نگه‏داری شدند. هر هفته به‏طور مستمر کشت‌ها کنترل شده و در صورت مشاهده آلودگی روی محیط کشت حذف شدند. دو ماه بعد از کشت با ظهور کالوس­های مناسب، واکشت مجدد نمونه­ها به قفسه‌های نوری منتقل شدند تا در صورت مناسب بودن باززایی انجام شود.

 

شرایط اتاق رشد:پس از آماده‌سازی و کشت ریزنمونه­ها،‌ کلیه ظروف حاوی قطعات برگی به اتاق رشد با دمای 24 درجه سانتی‏گراد در شرایط تاریکی نگه‏داری شدند. ظروف حاوی کالوس در همان اتاق رشد با شدت نور حدود 2500 لوکس که توسط لامپ‌های فلورسنت تامین می‌شد نگه‏داری شد.

 

شاخص­های مورد ارزیابی:بعد از گذشت یک ماه و به‏دنبال ظهور کالوس‌ها، صفاتی ازجمله درصد کالوس‌زایی و حجم کالوس با استفاده از روش استاندارد هوکر و نی­برز (11) ارزیابی شده و 2 ماه بعد از انتقال به شرایط نوری و ظهور گیاه‏چه، صفات درصد تولید گیاه‏چه، تعداد گیاه‏چه و برگ، تعداد غده کامل و رشد ریشه (برای باززایی از کالوس) یادداشت­برداری شد (شکل 2).

 

آزمایش باززایی کالوس‌ها:کالوس­ها پس از ظهور و رسیدن به‏حجم یک سانتی­متری از نظر اندازه و کیفیت، جهت باززایی و تولید گیاه (اندام زایی) به محیط کشت جدید یا MS تغییر یافته همراه با NAA (0، 5/0 و 1 میلی‏گرم بر لیتر) و BA (0، 5/0 و 1 میلی­گرم­ بر لیتر) منتقل شد. ساکارز مورد استفاده 30 گرم بر لیتر و  pHمحیط برروی 7/5 تنظیم شد. کلیه محیط‌های این مرحله نیز در ظروف شیشه­ای250 سی‌سی تهیه شد و مقدار 7 گرم بر لیتر آگار مورد استفاده قرار گرفت. صفاتی که در این مرحله یادداشت‌برداری شدند شامل درصد تولید گیاه‏چه، تعداد برگ، تعداد غده کامل و رشد ریشه بود.

 

آنالیز آماری

محاسبات آماری داده­های حاصل از آزمـایش بـا اسـتفاده از نـرم افزارهای SPSS v.25 و  Rانجام شد و برای رسم نمودارها و گراف­ها از برنامه Excel استفاده شد. مقایسات میانگین­ تیمارها نیز با آزمون چند دامنـه­ای دانکـن در سطح 1درصد انجام شد.

 

نتایج

آزمایش کالوس‌زایی

نتایج تجزیه واریانس نشان داد که اثرات اصلی غلظت­های مختلف هورمون 2, 4-D و BA و هم‏چنین اثرات متقابل آن‏ها بر درصد، و حجم کالوس(زایی) اثر معنی­داری (05/0p≤) داشت (جدول 1).

 

جدول 1: تجزیه واریانس غلظت­های مختلف تنظیم­کننده­های رشد 2, 4-D و BA بر کالوس‌زایی زامی‌فولیا

منابع تغییر

درجه آزادی

میانگین مربعات

درصد کالوس

 

حجم کالوس

2,4-D

3

**01/18

 

**36/0

BA

2

**82/12

 

*12/0

2,4-D×BA

6

**70/5

 

**36/0

خطا

24

82/0

 

036/0

ضریب تغییرات(%)

 

56/19

 

81/13

 

 

 

 

 

 

 

 

 

* و ** بهترتیب معنیدار در سطوح 5 و 1 درصد

 

مقایسه میانگین اثر اصلی 2, 4-D به‏روش آزمون چند دامنه­ای دانکن برای درصد کالوس­زایی نشان داد که بیش‏ترین درصد کالوس در غلظت 1 میلی­گرم ­بر لیتر و کم‏ترین درصد کالوس در غلظت 4 میلی­گرم ­بر لیتر2, 4-D  به‏دست آمد (شکل 2). نتایج مقایسه میانگین اثرات اصلی هورمون2, 4-D  بر حجم کالوس نیز نشان داد که بیش‏ترین میزان این صفت در غلظت 1 میلی‏گرم بر لیتر2, 4-D  به‏دست آمد (شکل 3). نتایج سایر تحقیقات انجام­ گرفته نیز نقش موثر 2, 4-D بر کالوس­زایی را تائید نموده و با نتایج به‏دست آمده در این تحقیق هم‏خوانی دارد (شکل 2، 3). مقایسه میانگین اثرات اصلی  BAبر درصد کالوس­زایی نشان داد که بیش‏ترین درصد کالوس­زایی در غلظت 2 میلی­گرم ­بر لیتر هورمون BA و کم‏ترین درصد آن در غلظت صفر (شاهد) 2, 4-D به‏دست آمده است (شکل 3).

نتایج مقایسه اثرات متقابل2, 4-D  و BA بر درصد کالوس، حجم کالوس به‏روش آزمون چنددامنه­ای دانکن نشان داد که مصرف هم‏زمان یک میلی‌گرم ­بر لیتر 2, 4-D و 2 میلی‌گرم­ بر لیتر BA بهترین نتیجه و بیش‏ترین درصد کالوس را تولید نموده و مصرف هم‏زمان یک میلی‌گرم ­بر لیتر از هرکدام از این دو هورمون، کم‏ترین درصد تولید کالوس را درپی داشت (شکل 2). هم‏چنین عدم مصرف 2, 4-D و مصرف یک میلی‌گرم­ بر لیتر BA و هم‏چنین یک میلی‌گرم ­بر لیتر 2, 4-D و 2 میلی‌گرم ­بر لیترBA  اثرات یکسان و مطلوبی را بر درصد حجم کالوس تولیدی نشان داده (شکل 3) که با نتایج حاصله از تحقیقات صورت گرفته دیگر (5) مطابقت داشت.

 

 

شکل2: اثر سطوح مختلف 2, 4-D و BA بر درصد کالوس­­زایی در زامی‌فولیا

 

 

شکل 3: اثر سطوح  مختلف 2, 4-D و BA بر حجم کالوس در زامی‌فولیا

 

آزمایش باززایی نتایج نشان داد که غلظت­های مختلف NAA و BA بر درصد تولید و تعداد صفات گیاه‏چه و برگ، تعداد غده کامل و رشد ریشه اثر معنی­داری در سطح 5 و 1 درصد داشته است (جدول 2).

 

جدول 2: تجزیه وایانس غلظت های مختلفNAA و BA در باززایی زامی‌فولیا

 

 

منابع تغییر

 

 

درجه آزادی

میانگین مربعات

درصد تولید گیاهچه

تعداد برگ

تعداد غده کامل

رشد ریشه

NAA

1

**03/23

**87/0

**46/0

**65/0

BA

2

**85/21

**26/0

**38/0

**21/0

NAA*BA

2

**46/4

**28/0

**46/0

*11/0

Error

13

86/0

04/0

02/0

02/0

CV (%)

 

48/17

62/13

09/10

62/10

* و ** به  ترتیب معنی دار در سطوح 5 و 1 درصد

 

نتایج نشان داد که بیش‏ترین درصد تولید و تعداد گیاه‏چه و برگ، تعداد غده کامل و میزان رشد ریشه با کاربرد 5/0 میلی­گرم ­بر لیتر NAA و کم‏ترین درصد این صفات در غلظت صفر میلی­گرم ­بر لیتر NAA (شاهد) به‏دست آمد (جدول 3). هم‏چنین نتایج مقایسه میانگین اثرات اصلی BA به‏روش آزمون دانکن نشان داد که بیش‏ترین درصد تولید گیاه‏چه، تعداد گیاه‏چه و برگ، تعداد غده کامل و رشد ریشه در غلظت 5/0 میلی­گرم­ بر لیتر BA و کم‏ترین مقدار این صفات در غلظت صفر میلی­گرم­ بر لیتر BA (شاهد) به‏دست آمد (جدول 3).

 

جدول 3: مقایسه میانگین غلظت­های مختلف NAA و BA در باززایی زامی‌فولیا

فاکتور/تنظیم­کننده رشد

سطوح فاکتورها (mg/L)

درصد

 تولید گیاهچه

تعداد برگ

تعداد

غده کامل

رشد

 ریشه

NAA

صفر

32/4b

36/1b

25/1b

25/1b

5/0

28/6a

74/1a

52/1a

58/1a

BA

0/0

40/3b

13/1b

22/1b

26/1b

5/0

37/6a

63/2a

63/1a

59/1a

0/1

10/6a

88/1b

31/1b

39/1b

میانگین­های دارای حروف مشابه از نظر آماری، تفاوت غیرمعنی­دار دارند.

 

مقایسه میانگین اثرات متقابلNAA و BA بر درصد تولید گیاه‏چه، تعدادگیاه‏چه و برگ، تعداد غده کامل و رشد ریشه به‏روش دانکن انجام شد و نشان داد که مصرف هم‏زمان 5/0 میلی‌گرم­ بر لیتر NAA و 5/0 میلی‌گرم­ بر لیتر BA بهترین نتیجه و بیش‏ترین درصد تولید گیاه‏چه، تعدادگیاه‏چه و برگ، تعداد غده کامل و رشد ریشه را درپی داشت (شکل­های 4، 5، 6 و 7). نتایج این تحقیق با نتایج به‏دست آمده توسط هپینگ و پنگ (4) مطابقت داشت. هم‏چنین غده­ها در محیط باززایی، ریشه­زایی نموده و لذا نیازی به تیمار ریشه­زایی نبود و گیاه‏چه­ها به‏راحتی مراحل سازگاری را طی نمودند (شکل 8).

 

 

شکل 4: مقایسه درصد تولید گیاه‏چه در زامی‌فولیا تحت اثرات سطوح مختلف BA و NAA

 

 

شکل 5: مقایسه تعداد گیاه‏چه و برگ در زامی‌فولیا تحت اثرات مختلف سطوح BA و NAA

 

 

شکل 6: مقایسه تعداد غده در زامی‌فولیا تحت اثرات مختلف سطوح BA و NAA

 

 

شکل 7: مقایسه رشد ریشه در زامی‌فولیا تحت اثرات مختلف سطوح BA و NAA

 

 

شکل 8: مراحل کالوس زایی و باززایی و سازگاری گیاه زامی فولیا

 

بحث

کالوس­زایی

همان‏طور که ذکر شد گیاه زامی­فولیا از گیاهان زینتی نسبتا جدید و ارزش‏مند است که به‏دلیل کند رشدی و محدود بودن زمان تکثیر گل‏خانه­ای، ازدیاد این گیاه از طریق روش‏های مرسوم با مشکلات زیادی همراه است. طولانی شدن فرآیند تکثیر، سبب افزایش چشم‏گیر قیمت این گیاه شده است. قسمت‏های تکثیری همانند برگ‏چه­ها و قطعات برگی و یا محور برگ آن فقط یک شاخ‏ساره در هر واحد تکثیری (propagule) را در روش‏های مرسوم ازدیاد این گیاه، تولید می­کنند. پرآوری این گیاه با استفاده از تکنیک کشت بافت، یک روش سریع جهت دست‏یابی به تعداد انبوه گیاه با ساختار ژنتیکی یکسان است. تکثیر با استفاده از کشت بافت منجر به کاهش هزینه تولید و حذف بیماری‏ها در زمان کوتاه می­شد. تولید کالوس در روش کشت بافت اهمیت زیادی دارد و در تکثیر گیاه زامی­فولیا  یکی از مهم‏ترین مراحل ریز ازدیادی محسوب می­شد. ریز نمونه‏های برگ و دم‏برگ گیاه زامی­فولیا در محیط MS 2/1 کشت شده و مشخص شد که تنظیم­کننده­های رشد BA  (2/0 میلی‏گرم بر لیتر) و 2, 4-D (میلی‏گرم بر لیتر) مناسب­ترین سطوح هورمونی برای مرحله کالوس‏زایی بود (5). در این رابطه، پاپافاتیون و مارتینی (6) در مطالعه ریز ازدیادی زامی­فولیا از محیط کشت MS و تنظیم­کننده­های BA و 2, 4-D برای کالوس­زایی استفاده کردند که باعث تولید سلول­های شبیه­جنین رویشی شد که سپس منتج به باززایی شد. آن‏ها هم‏چنین از ترکیبBA  وNAA برای باززایی استفاده نمودند که باعث تولید ریشه­های غده­ای شده است و کلیه نتایج حاصل از کالوس­زایی و باززایی این آزمایش در نتایج حاصل از تحقیق این مقاله نیز تایید شد. هم‏چنین در این رابطه در تحقیقی دیگر به نقش و تاثیر هورمون‏هایی همانند 2, 4-D، BAA و NAA اشاره شده، بطوریکه وانیزه­کانتون و لئون­هارت (5) با اعمال هورمون‏های 2, 4-D و BA در باززایی زامی­فولیا نتیجه گرفتند که پروتوکل آن‏ها جهت باززایی این گیاه زینتی مفید بوده و می‏توان گیاهان زامی­فولیای تتراپلوئید را در شرایط درون­ شیشه به‏دست آورد. البته موضوع دیگری که بایستی به‏آن توجه نمود این‏که تاکنون تحقیقی در رابطه با جهت و موقعیت ریزنمونه‏های برگچه زامی‏فولیا در تکثیر درون‏ شیشه این گیاه مشاهده نشد. هم‏چنین نکته مهمی که بایستی خاطر نشان ساخت توجه به نسبت هورمون‏های ریشه­زایی یعنی اکسین به ساقه­زایی یعنی سیتوکینین در آزمایشات کالوس­زایی و باززایی مهم است. در تحقیق حاضر نسبت بالای سیتوکینین به اکسین منجر به تولید نوساقه (شاخساره) شده و هم‏چنین نسبت بالای اکسین به سیتوکینین، منجر به تولید ریشه­چه شد (87/1 به 31/1 در شکل 7). البته سطوح یکسان این دو هورمون، باعث افزایش تشکیل کالوس می­شد. به‏طوری‏که در شکل 4 افزایش مقدار اکسین (NAA) از صفر به 5/0 میلی­گرم، منجر به افزایش مقدار تولید گیاهچه از 35/2 به 45/4 درصد شد. هم‏چنین در همین جدول افزایش میزان اکسین از صفر به 5/0 به‏همراه افزایش سیتوکینین از صفر به 5/0 منجر به بیش‏ترین درصد تولید گیاه‏چه (06/8) شد. لذا نتیجه گرفته میشود که نه‏تنها افزایش فیتوهورمون اکسین بلکه افزایش سیتوکینین نیز برای تولید گیاه‏چه ضرورت دارد. در این رابطه اذعان شده که آزمایش­های کلاسیک کشت بافت گیاهی نشان داده است که در معرض قرار گرفتن کشت سلول به نسبت بالای اکسین به سیتوکینین، باعث تشکیل ریشه می­شود و نسبت اکسین به سیتوکینین پایین نیز منجر به بازسازی شاخه‏ها می­شود. در تحقیقی که توسط صیادی­نژادی و صادقی (21) برروی زامی­فولیا صورت گرفت مشاهده شد که بیش‏تری میزان یا درصد کالوس­زایی، کوتاه­ترین زمان به کالوس رفتن و بیش‏ترین وزن کالوس در محیط کشتی به‏دست آمد که شامل 2 میلی­گرم بر لیتر BA و یک میلی­گرم بر لیتر NAA نمونه­های برگی به‏دست آمد که تا حدودی نتایج حاضر را تایید می­کند. هرچند در آن آزمایش غلظت‏های هورمونی بیش‏تری اعمال شده است.

البته میزان بالای اکسین نیز سمیت را به‏همراه دارد. همان‏طور که به‏میان آمد، با افزایش میزان اکسین در برخی موارد، همانند افزایش از یک به 2 میلی­گرم در لیتر برای 2, 4-D، درصد و حجم کالوس­زایی نیز کاهش معنی­داری پیدا نمود. شاید این نتیجه را به سمیت یا اثرات منفی کالوس به مقادیر زیادتر اکسین نسبت داد. هم‏چنین میزان بالاتر اکسین از نوع 2, 4-D منجر به موتاسیون یا جهش می‏شد. دراین خصوص گزارش شده است که کاربرد مقادیر بالای اکسین، مستقیما باعث ممانعت از رشد ساقه­چه­­ها شده به‏طوری­که چنین غلظت‏هایی جریانات سیتوپلاسمی را مختل نموده و در حدی هست که چنین موادی سمیت داشته باشند (13). ازآن‏جا که سطح اکسین در بافت‏های مریستم شاخ‏ساره بسیار بالا است، مشخص نیست که چگونه نسبت اکسین کم به سیتوکینین باعث تولید مجدد شاخساره­ها می­شود (14). همین گزارش می­افزاید که افزایش و توزیع اکسین به‏جای کم، توسط سایتوکینین تحریک می‏شود و اکسین یا اکسین برون­زا که مستقیما استفاده می­شود، برای بازسازی شاخه­ها ضروری است. البته بنا به‏همین گزارش، گزارش شده که سیتوکینین­ها تمایز سلولی را در منطقه انتقال مریستم ریشه القا می­کنند.

 

باززایی

همان‏طور که اشاره شد، در این تحقیق در محیط باززایی از کالوس، ریشه و گیاه‏چه تولید شد که این موضوع در مقایسه با نتایج محققین دیگر که یک مرحله برای تولید شاخساره و یک مرحله مجزا برای تولید ریشه استفاده می­کردند، باعث کاهش زمان و افزایش کیفیت و کمیت گیاه تولیدی شده و هزینه تولید را کاهش می­دهد. در کل در این تحقیق، در سطح صفر از سیتوکینین BA، افزودن اکسین NAA از صفر به 5/0 میلی­گرم­درلیتر، منجر به افزایش تولید گیاهچه شد ولی بیش از آن تاثیر چندانی را بر افزایش گیاه‏چه نداشت. هم‏چنین افزایش BA از 5/0 به یک میلی­گرم­ در لیتر باعث کاهش درصد گیاه‏چه و تعداد برگ و تعداد غده و رشد ریشه شد. در این خصوص، گزارش شده که با به‏کار بردن یک گرم­ در لیتر کینتین و 1/0 گرم­ در لیتر NAA باعث افزایش تولید ریشه در کشت بافت زامی­فولیا شد هرچند در بعضی موارد، اضافه نمودن اکسین، سبب تسریع رشد گیاه‏چه می­شد. به‏علاوه ­این‏که اکسین­ها مسئول القای غده و ریشه هستند (15). براساس همین گزارش، NAA اثر محرک بر تشکیل ریشه داشته و به‏نظر می‏رسد که به‏تنهایی باعث ممانعت از تشکیل شاخساره شود. البته دلیل افزایش طول ریشه­چه نسبت به افزایش سیتوکینین از نوع کینتین هنوز ناشناخته باقی مانده است.

همان‏طور که گفته شد، در آزمایش باززایی، به‏استثنای اعمال NAA و BA در افزایش رشد ریشه که در سطح شاهد BA، تفاوتی بین به‏کار بردن سطوح صفر و 5/0 از NAA نبود، افزایش BA از 5/0 به یک میلی­گرم، منجر به افزایش رشد ریشه شد. لذا به‏نظر می‏رسد که افزایش دوز هر کدام از این هورمون‏ها همانند محرکی عمل نموده ولی این افزایش رشد ریشه در سطح 5/0 از هورمون BA بیش‏تر بوده و احتمالا افزایش بیش‏تر سیتوکینین BA از 5/0 به یک اثر ممانعت کنندگی بر تاثیر NAA داشته و رشد کم‏تری را درپی داشته است. لذا بای در به‏کار بردن این فیتوهورمون‏ها، به نسبت دقیق آن‏ها جهت نتیجه بهتر، دست یافت. در مورد میانگین تولید گیاه‏چه و برگ و غده نیز اعمال بیش از 5/0 میلی­گرم بر لیتر از سیتوکینی BA باعث افزایش این صفات نبود که احتمالا به برهمکنش این دو هورمون برمی‏شد. البته همانند بحث کالوس­زایی، در این‏جا یعنی در بحث باززایی نیز چنین اثرات متقابلی مشاهده شد که مشابه با این، گزارش شده است که اصطلاح "ممانعت­کننده رقابتی" در مورد ترکیبات کشت بافت وجود داشته و به‏عنوان نمونه برخی از اسیدهای آمینه در غلظت‏های نسبتا کم ممانعت­کننده رشدی بوده و این پدیده به­ویژه زمانی مشاهده می­شود که ترکیبی از دو یا چند اسیدآمینه به محیط کشت افزوده شوند که در این‏جا اثر ممانعت­کنندگی، به‏دلیل اثرات رقابتی یک ترکیب با دیگری رخ می­دهد. حتی اثر متقابل بور با اکسین نیز در ریشه­زایی قلمه­ها مشاهده شده است (16). همچنین لتهام (17) مشاهده نمود که میواینوزیتول با سیتوکینین در جهت القای تقسیم سلولی ریزنمونه­های آوندی هویج برهمکنش داشتند.

 

نتیجه­گیری/

از آن‏جایی‏‏که اساس همه آزمایش‏های انتقال ژن (18) و اصلاح درون شیشه­ای و اصلاح به‏روش جهش، و حتی تولید بذور مصنوعی (19) تحقیقات بر روی کشت بافت گیاهان می­باشد، هم‏چنین با توجه به این‏که تکثیر گیاه زامی­فولیا به‏صورت قلمه­ای و تقسیم ریزوم زمان­بر بوده و صرفه اقتصادی ندارد، لذا تکنیک کشت بافت در تکثیر این گیاه مهم زینتی، اهمیت زیادی داشته و نه‏تنها به‏منظور تکثیر تجاری، بلکه به‏منظور تهیه مواد اولیه برای آزمایش‏های انتقال ژن و اصلاح درون شیشه­ای و اصلاح به‏روش پرتوتابی نیز به‏کار گرفته می­شود. لذا در تحقیق حاضر کالوس­زایی و باززایی این گیاه زینتی مورد بررسی قرار گرفت. هم‏چنین از آن‏جایی‏که  فیتوهورمون­هایی ازجمله اکسین و سیتوکینین در کنترل فرایندهای مختلف و اساسی گیاه همانند رشد، نمو و تنظیم پاسخ به محرک­های محیطی نقش کاربردی دارند، روشن شده است که هر کدام از این هورمون­ها قادرند با تنظیم سطوح دیگر بر فرآیندهایی همانند اندام­زایی تاثیرگذار باشند، لذا این تحقیق با هدف بررسی تاثیر این فیتوهورمون‏ها، انجام گرفت. نتایج آزمایش کالوس­زایی نشان داد که محیط پایهMS  تغییر یافته همراه با غلظت 2 میلی­گرم­ بر لیترBA  به‏همراه یک میلی­گرم­ بر لیتر  2, 4-Dقادر است بهترین کالوس با خاصیت باززایی بالا را در برداشته باشد. در مرحله باززایی از کالوس نیز، غلظت 5/0 میلی­گرم­ بر لیتر NAA بیش‏ترین تعداد گیاهچه و غده باززایی شده را تولید نمود.

 

 تشکر و قدردانی

نویسندگان برخود لازم می‏دانند که از پژوهشکده ملی گل و گیاهان زینتی محلات بابت اجرای این پروژه قدردانی نمایند.

 

 

 

1. Krishna H, Alizadeh M, Sigh D, Singh U, et al.  Somaclonal variations and their applications in horticultural crops improvement. Biotech.2016; 6(54): 1-18.
2. Henriquez CL, Arias T, Pires JC, Croat TB, et al. Phylogenomics of the plant family Araceae.  Mol Phyl Evol. 2014; 75(1): 91-102.
3. Murashinge T, Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiolia Plantarum. 1962; 15(3): 473-497.
4. Heping S, Peng L. Plantlet regeneration from leaf explants of Zamioculcas zamiifolia. Acta Hort Sinica. 2003; 30(5): 621-622.
5- Vanzie-Canton SD, Leonhardt KW. In vitro callus induction and plantlet regeneration protocol developed for the oryzalin treatment of Zamioculcas zamiifolia (Lodd.) Engl. (Araceae). Proceedings of the VI International Symposium on New Floricultural Crops. 2007; 813: 201-208.‏
6. Papafation M, Martini AN. Effect of position and orientation of leaflet explants with respect to plant growthregulators on micropropagation of Zamioculcaszamiifolia Engl. (ZZ). Scientia Horticulturae. 2009; 120: 115-120.
7. Bakti C, Murgayanti A, Mubarok S. Aglaonema micropropagation by in vitro culture. Micropropagasi Aglaonema secara in vitro. Indonesian Agr Res. 2011; 28(2): 121.
8. Shijun, Z, Rulan, J, Hougao, Z. Stufy on rapid propagation of Aglaonema commutatum cv. Golden Jewelry. Chinese Agricultural Sciences Bulletin.2004; 20(4): 39.
9. Deeir YH, Hahn EJ, Peak KY. In vitro flowering of Spathiphyllum cannifolium: influence of gibberllic acid, culture type and sucrose concentration. ISHS Acta Horticulture725: V International Symposium on in vitro Culture and Horticultural Breeding. 2006.
10. Chan L-K, Tan CM, Chew GS. Micropropagation of the Araceae ornamental plants. ISHS Acta Horticulturae 616: I International Symposium on Acclimatization and Establishment of Micropropagated Plants. 2003; 616; 383-390.
11. Hooker MP, Nabors MW. Callus initiation, growth and organogenesis in sugar beet (Beta vulgaris), PFL Physiol. 1977; 54: 237-246.
12. Sayadi Nejad M, Sadeghi SM. Optimization of callus production and regeneration of Zamiifolia (Zamioculcas zamiifolia). J. Hort. Sci. (Agricultural Sciences and Technology).2019; 33(3): 405-415.
13. Thimann KV. Auxins and the inhibition of plant growth. Biol. Rev. 1938;14(3): 314-337.
14. Kakani A. Molecular and biochemical role of auxin and cytokinin in dedifferentiation and organogenesis of Arabidopsis. 2009. Ph.D. Thesis, Mississippi State University, Mississippi, USA.
15. Prathibha BR, Nirmala KS, Satyanarayana BN, Anithe P, et al. Induction of multiple shoots in Zamioculcas zamiifolia Engl. under in vivo condition. Int. J. Chem. Stud. 2018; 6(6): 667-671. 
16. George EF, Hall MA, De Klerk G. Plant propagation by tissue culture- 3rd Ed. The Background. 2008; 504 p.  
17. Letham DS. Regulation of cell division in plant tissues. XII. A cytokinin in plant extracts: isolation and interaction with other growth regulators. Phytochem. 1966; 5: 269-286.
18. Dini Torkamani MR, Abaspour N, Jafari M, Samadi A. Induction and optimization of hairy root growth condition for Valeriana officinalis L. through inoculation by Agrobacterium rhizogenes. J Cell Tissue (JCT). 2014; 5(1): 23-30.                                                                                               
19. Majd A, Zandi N, Arbabian S, Sharifnia F. The comparative study of synthetic seed production of two Crataegus species by meristem culture and somatic embryos methods. J. Cell Tissue (JCT). 2016; 7(2): 121-129.