نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه اراک، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، گروه علوم دامی، اراک، ایران
2 دانشگاه تهران، پردیس ابوریحان، گروه علوم دام و طیور، تهران، ایران
3 دانشگاه تهران، پردیس علوم، گروه زیست فناوری، تهران، ایران
چکیده
هدف: هدف از مطالعهی حاضر بررسی اثر غلظتهای مختلف جنستئین بر تکثیر و تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی جدا شده از بافت چربی اسب ترکمن به سلولهای استخوانی بود.
مواد و روشها: در این مطالعه، سلولهای مزانشیمی با غلظتهای متفاوت 0، 8-10، 7-10، 6-10، 5-10 میکرومولار جنستئین و محیط تمایزی استخوان کشت داده شدند. در طول 21 روز، برای ارزیابی تکثیر و زندهمانی از آزمونMTT و نقش غلظتهای مختلف جنستئین در تمایز استخوانی از آزمایشهای آلیزارینرد، سنجش آنزیم آلکالین فسفاتاز و میزان رسوب کلسیم استفاده شد. دادههای حاصل در قالب آنالیز واریانس یکطرفه ANOVA تجزیه شدند.
نتایج: نتایج نشان داد که جنستئین اثر منفی بر روی زندهمانی سلولهای مورد آزمایش نداشت (05/0<p). تفاوت معنیداری در فعالیت آنزیم الکالین فسفاتاز در روز ۲۱ در غلظت ۵-۱۰ و سایر گروهها مشاهده شد (05/0>p). میزان رسوبات کلسیمی در روزهای 14 و 21، بین غلظت بیشینهی جنستئین (5-10) و دیگر غلظتها دارای تفاوت معنیداری بود (05/0>p). نتیجهگیری: نتایج نشان داد که افزودن جنستئین بر تمایز سلولهای بنیادی جدا شده از بافت چربی، باعث بهبود روند تمایز استخوانی بدون اثر سمیت میشود.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
The effect of Genestein on the proliferation and osteogenic differentiation of Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells from Turman hosres
نویسندگان [English]
- F Azadi 1
- M Khodaei Motlagh 1
- A Mohammadi Sangcheshmeh 2
- E Seyedjafari 3
1 Department of Animal Science, Faculty of Agriculture and Natural Resources Arak university, Arak, Iran
2 Department of Animal and Poultry Science, College of Aburaihan, University of Tehran, Tehran, Iran
3 Department of Biotechnology, College of Science, University of Tehran, Tehran, Iran
چکیده [English]
Aim: In current study was aimed to investigate effects of different concentrations Genestein on osteogenic differentiation and proliferation of adipose driven mesenchymal stem cells (ADMSCs) from Turkman horses.
Material and Methods: In this experimental study, ADMSCs were treated with 10-8,10-7,10-6,10-5 μM concentrations of Genestein with osteogenic medium. The proliferation and cell viability of Genestein was evaluated by MTT test for 7 days after cell culture, and the role of It on osteogenic differentiation was investigated by alizarin red staining, alkaline phosphatase assay and calcium content for 21 days. The data were analyzed with One-way ANOVA.
Results: The results of MTT test showed after treatment of cells by Genestein, it had no toxic effect (p < 0.05). The activity of alkaline phosphatase in 10-5 concentration treated cells was higher than the other which attributed to the end of differentiation process (21th day) (p < 0.05). The results of alizarin red staining and calcium content showed that the maximum level of Genestein has significantly increase of precipitation of mineral ions on extracellular matrix on 14th and 21st days compare other concertation.
Conclusion: According to the results of this study, Genestein promoted differentiation of these cells in to osteoblast cells without any toxicity effect.
کلیدواژهها [English]
- Mesncymal stemcell
- Turkaman horse
- Osteogenic differentiation
- Genestein
مقدمه
فراوانی نسبی و دسترسی آسان به بافت چربی بهعنوان منبعی از سلولهای بنیادی مزانشیمی در بین محققان برای درمان اسبها مورد توجه قرار میگیرد، بافت چربی در اسبها معمولا از ناحیه زیرجلدی سوپراگتئال برداشته میشوند (1). سلولهای بنیادی در اسبهای سوارکاری برای اهداف بازسازی، نهتنها بهدلیل پتانسیل تمایز آنها، بلکه بهدلیل توانایی ضدالتهابی و ایمنی سازی آنها، محبوبیت زیادی بهدست آوردهاند (2). شایعترین کاربرد آنها برای درمان صدمات عضلات اسکلتی است؛ بیماری سیستم عضلانی اسکلتی مانند آتروز، آسیبهای تاندونی و شکستگیهای فاجعه بار دلایل اصلی بازنشستگی زود هنگام اسبهای مسابقه، بارکش و ... است (3، 4). بهطورکلی، نتایج درمان تاندونوپاتی اسبها با سلولهای بنیادی بیشتر از آسیب شناسی مفصلی بوده است (5). پس از درمان تاندونوپاتی با سلولهای بنیادی، اولتراسونوگرافی یا هیستوپاتولوژیک پیشرفتهایی را در مدلهای آزمایشی برای درمان بیماری، با 77 تا 98 درصد بهبود در اسبهای مسابقه با نرخ 03 درصد بازگشت کمتر در بیماری گزارش کرده است (6، 7). در مطالعهای نشان داده شده است که 78 درصد از اسبهای بیمار پس از درمان با سلولهای بنیادی بهبود کامل یافتهاند (8). سلولهای بنیادی مزانشیمی را بهطور مستقیم میتوان از مغز استخوان، بافت چربی، بند ناف و بافتهای مختلف جنین جدا کرد و در شرایط مناسب کشت سلولی، آنها توانایی تمایز به چندین رده سلولی از جمله استخوان، غضروف، عضله، بافت چربی و تولید عوامل رشدی را دارند (9). بافت چربی بهعنوان یکی از منابع مهم سلول بنیادی مزانشیمی، دارای سلول بنیادی بیشتری نسبت به مغز استخوان است و سلولهای بنیادی این بافت، با روشهای تهاجمی کمتری بهدست میآید (3). سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت چربی با توجه بهداشتن ویژگیهایی نظیر توانایی تمایز به ردههای مختلف، در دسترس بودن نسبی و قابلیت تکثیر گسترده بدون از دست دادن قدرت تمایزی، منبع قابل توجهی برای سلول درمانی میباشند (01، 11). جنستئین در گیاهان لوبیایی و محصولات سویا یافت میشود و یک ایزوفلاوون مشتق شده از گیاه است که بهعنوان یک فیتواستروژن طبقهبندی شده است (21) .جنستئین بهلحاظ ساختاری شبیه استرادیول17β_ است و بهخاطر همین شباهت میتواند به گیرندههای استروژنی سلولها متصل شود و مسیرهای وابسته به استروژن را فعال کند (31). جنستئین باعث افزایش تکثیر سلولی و تمایز استئوژنیک است که نشاندهنده رشد سلولی و فزونی فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز سلولی در کشت HBMSC است (41). جنستئین بسته به غلظتهای مختلف میتواند اثرات استروژنی و ضداستروژنی داشته باشد، که در غلظتهای پایین باعث فعالیت استروژنی و در غلظتهای بالاتر ممکن است بهعنوان یک آنتی استروژن و مهارکننده اثرات تروموئید استروژن عمل کند (51). جنستئین ممکن است که غلظتهای پایینتر با گیرندههای استروژن درون استئوبلاستها ارتباط برقرار کند و بنابراین بهطور غیرمستقیم باعث جلوگیری یا مهار باز جذب استخوان از طریق اقدام مهار کننده بر روی استئوکلاستها شود (61). هدف از این تحقیق ارزیابی افزودن غلظتهای مختلف جنستئین به محیط کشت سلولهای بنیادی مزانشیمی اسب ترکمن و مطالعه اثر آن بر بازدهی تمایز این سلولها به رده استخوانی میباشد.
مواد و روشها
این تحقیق با همکاری دانشگاه اراک و دانشگاه تهران انجام شد. بافت چربی از قاعده دم سه راس اسب پس از ایجاد بیحسی با تزریق لیدوکائین دو درصد نمونهبرداری شد و میزان 3-5 گرم چربی در یک فالکون 50 میلیلیتری استریل حاوی بافر نمکی فسفات حاوی آنتی بیوتیک پنیسیلین-استرپتومایسین 1 درصد بلافاصله به آزمایشگاه کشت سلولی انتقال داده شد. نمونه بافت چربی در اتاق کشت سلولی و در زیر هود لامینار، برای حذف سلولهای خونی و دیگر موارد اضافی به خوبی و چندین مرتبه با بافر نمکی فسفات شست و شو داده شد، و پس از آن نمونه بافت چربی با قیچی استریل و بهکمک تیغ جراحی و در زیر هود تا حد ممکن به قطعات ریز تبدیل شد؛ سپس بافت چربی ریز شده به فالکون منتقل شد و برای هضم و تخریب ماتریکس سلولی با کلاژناز تیپ I 1/0 درصد ترکیب، و در حمام آب گرم (بنماری) قرار داده شد. در مدت 3-4 ساعت هر 30 دقیقه بهمنظور افزایش سطح تماس و هضم مکانیکی بهتر کلاژناز تیپ I با بافت چربی فالکون را از حمام آب گرم خارج و بهخوبی تکان داده شد. پس از سپری شدن مدت زمان لازم، آن را با دور rpm 3000 و بهمدت زمان 15 دقیقه سانتریفیوژ کرده؛ که در این مرحله سه فاز در فالکون تشکیل شد. فاز بالایی حاوی روغن وچربی هضم شده، میانی حاوی بافر نمکی وخون و در ته فالکون سلولهای استرومال مشتق از چربی اسب مشاهده شد؛ در زیر هود محیط رویی را خارج کرده و به رسوب سلولی محیط تازه افزوده میشود. سوسپانسیون را خوب پیپتاژ کرده و بهدرون فلاسک استریل ریخته شد. در نهایت فلاسک حاوی سلول داخل انکوباتور با دمای 37 درجه سانتیگراد و میزان 2CO، 5 درصد قرار داده شد. پس از جداسازی سلولهای بنیادی میبایست هر دو روز، یکبار محیط کشت سلول را تعویض نمود. بدین منظور فلاسک را بهزیر هود انتقال داده، محیط رویی را دور ریخته و فلاسک را با بافر نمکی فسفات شست و شو داده و سپس محیط کشت تازه که حاوی 01 درصد سرم جنین گاوی است، به فلاسک افزوده شد.
پاساژ سلولی:چنانچه سلولها عاری از هر گونه آلودگی بودند و میزان تراکم سلولهای چسبنده به کف فلاسک به میزان 80 درصد رسیده بود، فلاسک را به زیر هود انتقال داده و محیط کشت رویی را خارج کرده و برای هر فلاسک 25 بهمیزان، 500 میکرولیتر و هر فلاسک 75 بهمیزان، 1 میلیلیتر تریپسین افزوده میشود و بهمدت 2-3 دقیقه در انکوباتور قرار داده میشود تا سلولها از کف فلاسک کنده شوند. بعد از گذر مدت زمان بیان شده فلاسک را از انکوباتور خارج و در زیر میکروسکوپ نوری مشاهده شد که تمام یا بیشتر سلولها از کف فلاسک جدا شده باشند، در این مرحله فلاسک را به زیر هود انتقال داده و محیط تازه کامل به همراه سرم به آن افزوده میشود. سوسپانسیون محیط بههمراه سلولهای کنده شده را درون فالکون ریخته و با دور 1200 و بهمدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد تا سلولها رسوب کنند. سپس در زیر هود محیط رویی را خارج کرده و محیط جدید افزوده میشود و سوسپانسیون را خوب پیپتاژ کرده و با توجه بهمیزان سلولها بهدرون 2-3 فلاسک جدید انتقال داده میشود. بهمیزان 100 میکرولیتر از محلول را درون یک میکرو تیوب ریخته؛ سپس بهمیزان 100 میکرولیتر تریپان بلو به میکروتیوب افزوده شده و بر روی لام نئوبار و در زیر میکروسکوپ تعداد سلولها شمارش میشود (17).
آزمایش درصد زندهمانی سلولها (MTT): برای همه آزمایشهای این مطالعه از پاساژ سه سلولهای بنیادی مزانشیمی برگرفته از بافت چربی اسب استفاده شد. بهمنظور ارزیابی میزان رشد و چسبندگی سلولها، تعداد 10 هزار سلول در هر چاهک پلیت 24 خانه کشت داده شد و در روزهای یک، چهار و هفت به چاهکهای مربوطه مقدار 200 میکرولیتر محلول نمک تترازولیوم (MTT) اضافه شد و پلیت بهمدت سه ساعت در انکوباتور قرار گرفت. در این آزمون نمک زرد تترازولیوم بهوسیله سلولهای زنده جذب شد و کریستالهای بنفش رنگ نامحلول فرمازان تشکیل شد که با افزودن یک شوینده حل شد. این رنگ با روش اسپکتروفتومتری در طول موج 570 نانومتر سنجش و اندازهگیری شد. برای هر نوع سلول یک رابطه خطی میان تعداد سلولها و میزان جذب اندازهگیری شده وجود دارد که این رابطه امکان تعیین دقیق هرگونه تغییرات در میزان تکثیر سلولها را فراهم میسازد. روش آنالیز نتایج تستهای سنجش زندهمانی مانند yassA TTM بدین شکل است که پس از خوانش پلیت با دستگاه الایزا ریدر، از جذب خانههای تکرار شده برای هر دز میانگین گرفته میشود. باید توجه داشت که میزان جذب هر چاهک از میزان جذب چاهک بلانک کم شود (عموماً این کار توسط خود دستگاه الایزا ریدر انجام میشود). در نهایت میانگین جذب هر دز به میزان جذب کنترل تقسیم شده و در 100 ضرب میشود. اعداد بهدست آمده نشاندهنده درصد نرخ زنده مانی (Viability)می باشد. سپس نرخ زنده مانی هر یک از غلظتها به شکل نمودار ترسیم شده و بر طبق نمودار تفسیر و آنالیز نتایج انجام میپذیرد (18).
آزمایش آلیزارین رد: آلیزارین قرمز که از آنتراکینون مشتق شده است، عموما برای شناسایی میزان کلسیم در مقاطع بافتها بهکار میرود اما اثر آن اختصاصا برای بررسی کیفی کلسیم نیست. این رنگآمیزی بهمنظور تشخیص ذخایر کلسیمی ایجاد شده در سلولها در حین تمایز صورت میگیرد. برای انجام این آزمون در سه روز (هفت، 14 و 21) سلولها در پلیت 48 خانه کشت شدند. در هر یک از روزهای مشخص شده، ابتدا محیط رویی سلولها تخلیه و سلولها با محلول PBS شست و شو شدند. سپس PBS خارج شد و بههر چاهک گلوتارآلدئید 5/2 درصد اضافه شده و پس از گذشت ده دقیقه با الکل ۷۰ درصد فیکس شدند. بعد از آن 200 میکرولیتر رنگ آلیزارین رد اضافه شد تا کاملا روی سلولها را بپوشاند. بعد از 15 دقیقه، سلولها آن را بهخود جذب کرده، سپس آلیزارین را خارج کرده و سلولها با PBS شست و شو داده شدند. عمل شست و شو تا مشاهده یک هاله ارغوانی رنگ بر روی سلولها ادامه داشت (18).
آزمایش کلسیم: برای اندازهگیری رسوبات کلسیمی، ابتدا تعداد cell/cm25000 سلول در هر چاهک از پلیت 24 خانه کشت داده شد و پس از مشاهده کانفلوئنسی مناسب محیط کشت تمایزی به چاهکها افزوده شد. پس از آن هر سه روز محیط رویی را خارج کرده و با PBS شست و شو شدند؛ بههر چاهک حاوی نمونه بهمیزان 200 میکرولیتر اسید کلریدریک 6/0نرمال افزوده شد، محتویات هر چاهک جداگانه با دور 1200 و بهمدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد تا لاشههای سلولها در ته میکروتیوپ تهنشین شود. در این آزمایش از کیت سنجش کلیسم پارس آزمون استفاده شد، و بهازای هر نمونه یک میلیلیتر معرف در تیوپهای جداگانه ریخته شد. آنگاه برای هر تیمار بهمیزان 20 میکرولیتر از محلول سانتریفیوژ شده را بهمعرفها افزوده شد و سپس بهخوبی پیپتاژ انجام شد. 100 میکرولیتر از هر تیوپ بهچاهکهای پلیت 96 خانه انتقال داده و بهوسیله دستگاه الایزا و در طول موج 570 نانومتر خوانده شد (18). برای تحلیل میزان کلسیم با توجه به دستورالعمل کیت میزان کلسیم با استفاده از استاندارد ان نرمال شده و سپس در فرمول خطی بدست امده، هر یک از جذبهای خوانش شده قرار گرفتند.
Ca concentration (μg /well)=((OD+.0234)/7.555)*V(μl)
آزمایش آلکالین فسفاتاز: برای انجام تست آلکالین فسفاتاز سلولها در پلیت 24 خانه کشت داده، ابتدا محیط رویی سلولها خارج شده و با مقداری PBS بهآرامی شست و شو داده شدند. سپس بههر چاهک میزان معینی بافر لیز کننده ریپا (200 میکرولیتر) جهت استخراج کل پروتئین موجود در سلول اضافه شد. پس از پیپتاژ هر یک جداگانه در میکروتیوپ ریخته شد و با دور RPM 1200 بهمدت پنج دقیقه سانتریفیوژ انجام شد تا لاشههای سلولها ته میکروتیوپ تهنشین شوند. سپس از کیت شرکت پارس آزمون که حاوی سوبسترای این آنزیم، پارانیتروفنیل فسفات، برای اندازهگیری میزان ALP استفاده شد. به این صورت که همانند آزمون کلسیم بهازای هر نمونه اینبار یک میلیلیتر معرف برداشته و در میکروتیوپ ریخته شد. سپس برای هر تیمار با سر سمپلر جداگانه میزان 20 میکرولیتر از محلول سانتریفیوژ شده را بهمعرفها اضافه کرده و پیپتاژ شد. سپس 100 میکرولیتر از محلول درون پلیت ریخته شد و جذب نوری توسط دستگاه الایزا در طول موج 405 نانومتر خوانده شد. برای بهدست اوردن فعالیت آنزیم الکالین فسفاتاز از دستوراالعمل کیت مورد استفاده بهره برده شد. فرمول مورد استفاده یه شرح زیر است:
ALP activity=
OD جذب نمونه=
t= زمان خوانش بعد از اضافه کردن نمونه به کیت
1000 تبدیل میلی مول درلیتر به میکرومول در لیتر=
ε محاسبه شده= p.nitrophenol برابر با 75/18
l=1
گروههای آزمایشی برای تمایز استخوانی شامل موارد زیر بود:
گروه شاهد: سلولهای بنیادی تمایز نیافته در محیط کامل بههمراه فاکتورهای تمایز استخوانی بدون جنستئین، تیمار یک، دو، سه و چهار بهترتیب بهگروه شاهد غلظت 8-10، 7-10، 6-10، 5-10 میکرومولار جنستئین اضافه شد.
تمام آزمایشها با حداقل سه بار تکرار انجام پذیرفت و دادههای شاهد وتیمارهای آزمایشی بهصورت میانگین و انحراف از خطای میانگین محاسبه شدند و برای بررسی معنیدار بودن اختلاف بین گروهها از آزمون تحلیل یکطرفه (ANOVA) استفاده و 05/0>p معنیدار در نظر گرفته شد. برای تحلیل آماری نتایج از نرمافزار ۸.۰.۲ Graphpad prism استفاده شد.
نتایج
سلولهای بنیادی استخراج شده در فلاسکهای 25 سانتیمتر مربع کشت داده شدند و پس از یک شبانه روز از زمان کشت بهکف فلاسک چسبیدند؛ بعد از حدود یک هفته، سلولهای چسبیده رشد کرده و با تکثیر خود 70 تا 80 درصد فضای فلاسک را پر کردند (شکل 1).
D |
C |
A |
B |
شکل 1: مورفولوژی سلولهای بنیادی مزانشیمی اسب ترکمن(A): روز یک از رشد سلول (B): روز سه از رشد سلول (C): تراکم سلولی 80 درصددر فلاسک سلولی (D): نمایی از کلنیهای سلولی )بزرگنمایی x۴۰ (
آزمایش MTT
میزان زندهمانی و تکثیر سلولهای بنیادی در ظروف کشت بهوسیله آزمون MTT در روزهای یک، چهار و هفت مورد بررسی قرارگرفت. نتایج این مطالعه تفاوت معنیداری بین سلولهای شاهد و سلولهای با غلظتهای مختلف جنستئین نشان نداد (شکل 2).
شکل 2: بررسی زنده مانی سلولهای بنیادی مزانشیمی اسب ترکمن با غلظت های مختلف جنستیین
براساس اطلاعات بهدست آمده از شکل 2 جنستئین باعث مرگ سلولهای بنیادی مزانشیمی اسب ترکمن نشد.
آزمایش آلکالین فسفاتاز
فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز در تمام گروهها از روز 7 تا 14 رو به افزایش بوده اما پس از آن و تا روز 21 رو به کاهش میرود. در تمام گروهها فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز در روز 7 به نسبت زیاد است، در روز 14 به بیشینه خود میرسد و سپس در روز بیست و یکم کاهش مییابد که نشاندهندهی الگو فعالیت این آنزیم در حین تمایز استخوانی در تمام گروهها است. در تمامی روزها گروه کنترل کمترین میزان فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز را دارد که نشاندهندهی اثر مثبت جنستئین در افزایش فعالیت این آنزیم میباشد (شکل 3).
شکل 3: اثر جنستئین بر میزان فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز سلولهای بنیادی مشتق از بافت چربی اسب در طی روند 21 روزه تمایز استخوانی
در روز هفت بین گروه کنترل و غلظت 5-10 تفاوت معنیداری میزان فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز وجود دارد؛ در حالیکه در روز چهارده بین گروههای کنترل، 8-10 و 7-10 با غلظت 6-10 تفاوت معنیدار وجود دارد؛ همچنین تمامی گروهها با بیشینه غلظت جنستئین (5-10) هم تفاوت معنیدار وجود دارد. در نهایت اطلاعات مربوط به روز بیست و یک نشان میدهد که بین تمامی گروهها با غلظت 5-10 تفاوت معنیداری مشاهده شد (05/0>p). میزان رسوبات کلسیمی در روز 21 نسبت به روز 14 و در روز 14 نسبت به روز 7، در گروههای شاهد و در غلظتهای مختلف جنستئین بیشتر شده است. در تمام این روزها مقدار رسوبات کلسیمی در گروه حاوی بیشترین میزان از جنستئین (5-10) نسبت به گروه شاهد و دیگر گروهها بیشتر است.
شکل 4: اثر جنستئین بر محتوای کلسیم سلولهای بنیادی مشتق از بافت چربی اسب در طی روند 21 روزه تمایز استخوانی
رسوبات کلسیمی در روز هفت اختلاف معنیداری بین گروه کنترل و غلظتهای مختلف جنستئین در سطح 05/0>p وجود ندارد ولی در روزهای 14 و 21، بین غلظت بیشینهی جنستئین (5-10) و دیگر غلظتها به همراه گروههای شاهد تفاوت معنیداری در سطح 05/0>p وجود دارد (شکل 4).
آزمایش آلیزارین رد
کنترل 10 8- 7- 10
B
6-10 10 5-
شکل 5: رنگآمیزی سلولهای بنیادی مزانشیمی اسب ترکمن در روز 7 تمایز استخوانی با الیزارین رد. بزرگنماییx۴۰
کنترل 10 8- 10 7-
6-10 5-10
شکل 6: رنگآمیزی سلولهای بنیادی مزانشیمی اسب ترکمن در روز 14 تمایز استخوانی با الیزارینرد. با بزرگنمایی X۴۰
کنترل 10 8- 10 7-
6-10 10 5-
شکل 7: رنگآمیزی سلولهای بنیادی مزانشیمی اسب ترکمن در روز 21 تمایز استخوانی با الیزارین رد. بزرگنمایی X۴۰
رنگ آمیزی آلیزارین رد از پرکاربردترین روشها برای تشخیص میزان رسوبات کلسیمی در محیط کشت استخوانی است سلولهای کشت شده که به مدت سه هفته در معرض محیط القا تمایز به استخوان قرار گرفته بودند با رنگآمیزی اختصاصی آلیزارین قرمز مورد ارزیابی قرار گرفتند. اولین نشانههای تغییرات موفولوژیکی و تمایز به استخوان، هفت روز پس از القای تمایز مشاهده شد. در پایان دوره تمایز (21روز) توده های سلولی مقدار فراوانی ماتریکس معدنی ترشح کرده بودند. بررسی نتایج نشان داد که الگوی رنگپذیری سلولهای تیمار شده با افزایش غلظت جنستیین نسبت مستقیم دارد. با افزایش غلظت رسوب کلسیمی افزایش یافته و حتی در روزهای ۱۴ و ۲۱ در غلظتهای۶ -۱۰ و ۵-۱۰ ندول های کلسیمی به وضوح قابل مشاهده هستند (شکل 5، 6 و 7).
بحث
سلولهای بنیادی از پتانسیل بالایی برای عمل بهعنوان گزینه درمانی در شرایط مختلف بالینی برخوردار هستند. در اسبها، سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان، بافتهای چربی یا جنین عمدتا برای درمانها استفاده میشوند. تعدادی از درمانهای بالینی سلولهای بنیادی اسب در سراسر جهان انجام میشود، که بدون هیچ نتیجهگیریهای قطعی میباشد (19). سلولهای بنیادی مزانشیمی پتانسیل بهبود بیماریهای اسبها را دارند. اگرچه درک ما از بسیاری از جنبههای این روش درمانی محدود است، اما برخی از تحقیقات منتشر شده در مورد شرایط خاص موثر بر استفاده از سلولهای بنیادی مزانشیمی وجود دارد (20). مطالعات انجام شده در خرگوشها، بهبودی زودرس مشابه در بهبود غضروف، 2 هفته پس از کاشت سلولهای بنیادی مزانشیمی را نشان داده است (21).
روشهای درمانی مبتنی بر سلول با استفاده از سلولهای بنیادی مزانشیمی بهطور مکرر در درمان اسب و گاو با تلاش برای ترمیم غضروف، تاندون و استخوان پس از آسیب گزارش شده است (22). پیوند سلول بنیادی مزانشیمی در ناهنجاری نقص مفصلی در اسب منجر بهبهبود زودرس میشود (23).
توافق کلی در مورد تاثیر هورمونهای جنسی بر متابولیسم استخوانها براین است که هورمونهای جنسی تنظیم کننده متابولیسم استخوان هستند. هورمونهای جنسی میتوانند بیشترین اثر را بر رشد استخوانها و عضلات داشته باشند (24). بررسی 105 مطالعه بالینی هیچ اثبات روشنی را در مورد اینکه استروژنهای گیاهی که تحت عنوان فیتواستروژنها شناخته میشوند خطر ابتلا به سرطان پستان و بیماریهای قلبی عروقی را کاهش میدهند، بههمراه نیاورد، اما بهنظر میرسد بدیهی است که آنها خطر ابتلا به پوکی استخوان را کاهش میدهند (25).
دادههای بیشماری وجود دارد که اثرات محافظتی محصولات سویا را در مدلهای حیوانات و در مطالعات اپیدمیولوژیک نشان میدهد (26) شواهدی وجود دارد که نشان میدهد مصرف سویا طیف وسیعی از تاثیرات سلامتی مانند پیشگیری از سرطان، کاهش خطر ابتلا به پوکی استخوان، نقش ارزشمند در بیماری مزمن کلیوی و محافظت در برابر برخی از اختلالات قلبی عروقی را دارد (27).
بسیاری از ترکیبات محافظ در گیاهان کشف شده است. فیتواستروژنها یا استروژنهای گیاهی، ترکیباتی هستند کـه بـا تغییراتی که از سوی فلـور طبیعـی بـدن بـر روی آنهـا اعمـال میشود، عملکردی شبیه استروژن از خود نشان مـیدهنـد (28). جنستئین یک فیتواستروژن غالب در سویاست که بهعنوان ایزوفلاوین شناخته میشود و غیراستروئیدی است (29).
الگوی تاثیر جنستئین بر روند تکثیر و تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمال را میتوان بهخاصیت فیتواستروژنی جنستئین نسبت داد. در مطالعه محمودی و همکاران (30) نشان دادند که وجود خاصیت فیتواستروژنی گیاه باریجه سبب تکثیر و تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمال شد که با نتایج تحقیق حاضرمنطبق است.
گیرندههای استروژن هر دو روی استئوبلاستها و استئوکلاستها قرار دارند. بنابراین اعتقاد بر این است که جنستئین بهدلیل شباهت ساختاری با استرادیول میتواند برای تنظیم فعالیت پوکی استخوان بهگیرندههای استروژن موجود در استئوکلاستها متصل شود، و میتواند بهگیرندههای موجود در استئوبلاستها متصل شود، آنها را تحریک کند و سپس تشکیل استخوان را تسریع کند. از نظر عملکرد استئوکلاستها، جنستئین در مهار جذب استئوکلاست در شرایط آزمایشگاهی موثر است (31).
جنستئین شباهت ساختاری با 17β استرادیول دارد بهطوریکه میتواند بهگیرندههای استروژن متصل شود و اعتقاد براین است که با تقلید پاسخهای بیولوژیکی استروژنها، اثر مفیدی برروی بافت استخوان میگذارد. این فیتواستروژن همچنین میتواند با تقویت تشکیل استخوان و جلوگیری از جذب استخوان، متابولیسم استخوان را بهبود بخشد. جنستئین همچنین یک روش قابل دوام بیشتر برای درمانهای بیماریهای جذب استخوان، بهعنوان مثال پوکی استخوان فراهم میکند (31). که این موید اثرات مثبت جنستئین در افزایش رسوب کلسیم میباشد که در این آزمایش نیز مشاهده شد با افزایش غلظت جنستئین و گذشت 14 و 21 روز، میزان رسوبات کلسیمی زیاد شد و تشکیل استخوان را تشدید کرد که با نتایج آزمایشات ذکر شده همخوانی دارد.
بافت استخوانی از ماتریکسی معدنی شده بههمراه سلولهای استخوانی تشکیل شده است. استئوبلاستها سلولهای بالغ و فعال بافت استخوانی محسوب میشوند که سبب ساختن این ماتریکس آلی و همچنین مسئول معدنی کردن آن میباشند. آنزیم آلکالین فسفاتاز نقش کلیدی در پروسه تمایز سلولهای استخوانی ایفا کرده و اندازهگیری میزان فعالیت این آنزیم بهعنوان یکی از مارکرهای اصلی تمایز به استخوان محسوب میشود (32). ژنهای فاکتور رونویسی مربوط به runt 2 (Runx2) و استریکس (Osx) دو فاکتور اثرگذار در تمایز استئوبلاست میباشند (33) نقش اصلی Runx2 در تنظیم استئوژنیک با تشکیل عامل اصلی فاکتور بتا (Cbf ß) و اتصال با DNA میباشد علاوه براین تمایز سلولهای مزانشیمال به سلول استخوانی با افزایش بیان ژن مارکر اولیه آنزیم آلکالین فسفاتاز همراه است (34). که این تمایز با روشهای مختلفی مانند تشخیص بیان ژن Runx2یا تست آلیزارینرد قابل تشخیص است (33) مکانیسم عمل رنگ آلیزارینرد بدین صورت است که با کلسیم تشکیل کیلات میدهد و بهرنگ قرمز دیده میشود. البته تشکیل کیلات تنها منحصر به کلسیم نمیباشد بلکه با عناصر فلزی دیگری مثل منیزیم، منگنز و آهن نیز کلات تشکیل میشود اما در اغلب موارد میزان این عناصر بهحدی نیست که سبب واکنش موثر شود. در نتیجه رنگآمیزی آلیزارین رد روش مناسبی برای سنجش کیفی میزان کلسیم میباشد (53) از آنجاییکه نتیجهی تست آلیزارین رد با میزان رسوبات کلسیمی سلول ارتباط مستقیم دارد پس تصور بر این بود که با توجه بهشکل 4 با گذشت زمان و نزدیک شدن بهروز 21 سلولها بهدلیل افزایش میزان رسوبات کلسیمی رنگ قرمز بیشتری را از خود بروز دهند. با توجه به این مطالب و آنچه بهعنوان نتیجه از تست آلیزارین رد بهدست آمد سلولهای بنیادی با محیط تمایزی همراه با جنستئین، بهتر و بیشتر از سلولهای کنترل بهسمت سلولهای استخوانی تمایز پیدا کردند. هرچه میزان غلظت جنستیین افزایش پیدا کرده میزان رسوب معدنی در سلول نمایان تر است. نتایج نشان داد که قدرت جنستئین در افزایش میزان آنزیم آلکالین فسفاتاز معنیدار بود که بهطور غیرمستقیم موید افزایش بیان ژن Runx2 است که با تمایز به استئوبلاست رابطه مستقیم دارد (33). افزایش غلظت آنزیم آلکالین فسفاتاز در این تحقیق با نتایج سایر محققین شباهت داشت.
نتیجه گیری
در مجموع یافتهها تاییدی بر این اسـت کـه سلولهای بنیادی مزانشیمی جـدا شـده از چربی اسب ، توانـایی تمـایز بـه سـلولهـای استئوبلاسـت را دارنـد و فاکتورهای تمـایز دهنـدههایی چـون دگزامتـازون، بتـا- گلیسروفســفات و اســید اســکوربیک، قــادر هســتند ایــن سلولها را به سمت سلولهای استئوبلاسـتی تمـایز دهنـد. براساس نتایج بهدست آمده از انجام این پژوهش میتوان گفت که جنستئین اثر مثبتی بر روند تمایزی سلولهای بنیادی مزانشیمی به سلولهای استخوانی در اسب ترکمن داشته است که شاخص ان فعالیت آنزیم الکالین فسفاتاز است. بررسی نتایج فعالیت آنزیم آلکالین فسـفاتاز، بیـانگر تمـایز بهتر سلولهای MSC در حضور جنستیین با غلظتهای مختلف نسبت به محیط فاقد آن بود.
تشکر و قدردانی
نویسندگان از آقای دکتر احسان سید جعفری استاد دانشکده زیست فناوری دانشگاه تهران که با در اختیار قرار دادن ازمایشگاه و تجهیزات، زمینه انجام این پژوهش را فراهم و خانم فاطمه سادات مهدوی برای همه راهنماییهایشان تشکر و قدر دانی مینمایند.