مقدمه

فراوانی نسبی و دسترسی آسان به بافت چربی به‏عنوان منبعی از سلول­های بنیادی مزانشیمی در بین محققان برای درمان اسب­ها مورد توجه قرار می‏گیرد، بافت چربی در اسب­ها معمولا از ناحیه زیر­جلدی سوپراگتئال برداشته می­شوند (1). سلولهای بنیادی در اسب­های سوارکاری برای اهداف بازسازی­، نه‏تنها به‏دلیل پتانسیل تمایز آن‏ها، بلکه به‏دلیل توانایی ضدالتهابی و ایمنی سازی آن­ها، محبوبیت زیادی به‏دست آورده­اند (2). شایع­ترین کاربرد آن­ها برای درمان صدمات عضلات اسکلتی است؛ بیماری سیستم عضلانی اسکلتی مانند آتروز، آسیب­های تاندونی و شکستگی­های فاجعه بار دلایل اصلی بازنشستگی زود هنگام اسب­های مسابقه، بارکش و ... است (3، 4). به‏طورکلی، نتایج درمان تاندونوپاتی اسب­ها با سلول­های بنیادی بیشتر از آسیب شناسی مفصلی بوده است (5). پس از درمان تاندونوپاتی با سلول­های بنیادی، اولتراسونوگرافی یا هیستوپاتولوژیک پیشرفت‏هایی را در مدل­های آزمایشی برای درمان بیماری، با 77 تا 98 درصد بهبود در اسب­های مسابقه با نرخ 03 درصد بازگشت کمتر در بیماری گزارش کرده است (6، 7). در مطالعه­ای نشان داده شده است که 78 درصد از اسبهای بیمار پس از درمان با سلول‏های بنیادی بهبود کامل یافته‏اند (8). سلول­های بنیادی مزانشیمی را به‏طور مستقیم می‏توان از مغز استخوان، بافت چربی، بند ناف و بافت­های مختلف جنین جدا کرد و در شرایط مناسب کشت سلولی، آن­ها توانایی تمایز به چندین رده سلولی از جمله استخوان، غضروف، عضله، بافت چربی و تولید عوامل رشدی را دارند (9). بافت چربی به‏عنوان یکی از منابع مهم سلول بنیادی مزانشیمی، دارای سلول بنیادی بیشتری نسبت به مغز استخوان است و سلول­های بنیادی این بافت، با روش­های تهاجمی کمتری به‏دست می­آید (3). سلول­های بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت چربی با توجه به‏داشتن ویژگی­هایی نظیر توانایی تمایز به رده­های مختلف، در دسترس بودن نسبی و قابلیت تکثیر گسترده بدون از دست دادن قدرت تمایزی، منبع قابل توجهی برای سلول درمانی می­باشند (01، 11). جنستئین در گیاهان لوبیایی و محصولات سویا یافت میشود و یک ایزوفلاوون مشتق شده از گیاه است که به‏عنوان یک فیتواستروژن طبقه‏بندی شده است (21) .جنستئین به‏لحاظ ساختاری شبیه استرادیول17β_ است و به‏خاطر همین شباهت می­تواند به گیرنده­های استروژنی سلول­ها متصل شود و مسیر­های وابسته به استروژن را فعال کند (31). جنستئین باعث  افزایش تکثیر سلولی و تمایز استئوژنیک است که نشاندهنده رشد سلولی و فزونی فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز سلولی در کشت HBMSC است (41). جنستئین بسته به غلظت‌های مختلف می­تواند اثرات استروژنی و ضداستروژنی داشته باشد، که در غلظت­های پایین باعث فعالیت استروژنی و در غلظت­های بالاتر ممکن است به‏عنوان یک آنتی استروژن و مهارکننده اثرات تروموئید استروژن عمل کند (51). جنستئین ممکن است که غلظت‌‌های پایین­تر با گیرنده­های استروژن درون استئوبلاست­ها ارتباط برقرار کند و بنابراین به‏طور غیرمستقیم باعث جلوگیری یا مهار باز جذب استخوان از طریق اقدام مهار کننده بر روی استئوکلاست­ها ­شود (61). هدف از این تحقیق ارزیابی افزودن غلظت­های مختلف جنستئین به محیط کشت سلول­های بنیادی مزانشیمی اسب ترکمن و مطالعه اثر آن بر بازدهی تمایز این سلول‌ها به رده استخوانی می‌باشد.

مواد و روش‌ها

این تحقیق با همکاری دانشگاه اراک و دانشگاه تهران انجام شد. بافت چربی از قاعده دم سه راس اسب پس از ایجاد بی‏حسی با تزریق لیدوکائین دو درصد نمونه‌برداری شد و میزان 3-5 گرم چربی در یک فالکون 50 میلی‏لیتری استریل حاوی بافر نمکی فسفات  حاوی آنتی بیوتیک پنیسیلین-استرپتومایسین 1 درصد بلافاصله به آزمایشگاه کشت سلولی انتقال داده شد. نمونه بافت چربی در اتاق کشت سلولی و در زیر هود لامینار، برای حذف سلول­های خونی و دیگر موارد اضافی به خوبی و چندین مرتبه با بافر نمکی فسفات   شست و شو داده شد، و پس از آن نمونه بافت چربی با قیچی استریل و به‏کمک تیغ جراحی و در زیر هود  تا حد ممکن به قطعات ریز تبدیل شد؛ سپس بافت چربی ریز شده به فالکون منتقل شد و برای هضم و تخریب ماتریکس سلولی با کلاژناز تیپ I 1/0 درصد ترکیب، و در حمام آب گرم (بن‏ماری) قرار داده شد. در مدت 3-4 ساعت هر 30 دقیقه به‏منظور افزایش سطح تماس و هضم مکانیکی بهتر کلاژناز تیپ I با بافت چربی فالکون را از حمام آب گرم خارج و به‏خوبی تکان داده شد. پس از سپری شدن مدت زمان لازم، آن را با دور rpm 3000 و به‏مدت زمان 15 دقیقه سانتریفیوژ کرده؛ که در این مرحله سه فاز در فالکون تشکیل شد. فاز بالایی حاوی روغن وچربی هضم شده،  میانی حاوی بافر نمکی وخون و در ته فالکون سلول‌های استرومال مشتق از چربی اسب  مشاهده شد؛ در زیر هود محیط رویی را خارج کرده و به رسوب سلولی محیط تازه افزوده می­شود. سوسپانسیون را خوب پیپتاژ کرده و به‏درون فلاسک استریل ریخته شد. در نهایت فلاسک حاوی سلول داخل انکوباتور با دمای 37 درجه سانتیگراد و میزان ₂CO، 5 درصد قرار داده شد. پس از جداسازی سلولهای بنیادی می­بایست هر دو روز، یک‏بار محیط کشت سلول را تعویض نمود. بدین منظور فلاسک را به‏زیر هود انتقال داده، محیط رویی را دور ریخته و فلاسک را با بافر نمکی فسفات   شست و شو داده و سپس محیط کشت تازه که حاوی 01 درصد سرم جنین گاوی است، به فلاسک افزوده شد.

پاساژ سلولی:چنانچه سلول­ها عاری از هر گونه آلودگی بودند و میزان تراکم سلول­های چسبنده به کف فلاسک به میزان 80 درصد رسیده بود، فلاسک را به ‏زیر هود انتقال داده و محیط کشت رویی را خارج کرده و برای هر فلاسک 25 به‏میزان، 500 میکرو‏لیتر و هر فلاسک 75 به‏میزان، 1 میلی‏لیتر تریپسین افزوده می­شود و به‏مدت 2-3 دقیقه در انکوباتور قرار داده می­شود تا سلول­ها از کف فلاسک کنده شوند. بعد از گذر مدت زمان بیان شده فلاسک را از انکوباتور خارج و در زیر میکروسکوپ نوری مشاهده شد که تمام یا بیشتر سلول­ها از کف فلاسک جدا شده باشند، در این مرحله فلاسک را به‏ زیر هود انتقال داده و محیط تازه کامل به همراه سرم به‏ آن افزوده می­شود. سوسپانسیون محیط به‏همراه سلول­های کنده شده را درون فالکون ریخته و با دور 1200 و به‏مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد تا سلول­ها رسوب کنند. سپس در زیر هود محیط رویی را خارج کرده و محیط جدید افزوده می­شود و سوسپانسیون را خوب پیپتاژ کرده و با توجه به‏میزان سلول­ها به‏درون 2-3 فلاسک جدید انتقال داده می­شود. به‏میزان 100 میکرولیتر از محلول را درون یک میکرو تیوب ریخته؛ سپس به‏میزان 100 میکرولیتر تریپان بلو به میکروتیوب افزوده شده و بر روی لام نئوبار و در زیر میکروسکوپ تعداد سلول­ها شمارش می­شود (17).

آزمایش درصد زنده­مانی سلول­ها (MTT): برای همه آزمایش­های این مطالعه از پاساژ سه سلول­های بنیادی مزانشیمی برگرفته از بافت چربی اسب استفاده شد. به‏منظور ارزیابی میزان رشد و چسبندگی سلول‏ها، تعداد 10 هزار سلول در هر چاهک پلیت 24 خانه کشت داده شد و در روزهای یک، چهار و هفت به چاهک­های مربوطه مقدار 200 میکرولیتر محلول نمک تترازولیوم (MTT) اضافه شد و پلیت به‏مدت سه ساعت در انکوباتور قرار گرفت. در این آزمون نمک زرد تترازولیوم به‏وسیله سلول­های زنده جذب شد و کریستال­های بنفش رنگ نامحلول فرمازان تشکیل شد که با افزودن یک شوینده حل شد. این رنگ با روش اسپکتروفتومتری در طول موج 570 نانومتر سنجش و اندازه­گیری شد. برای هر نوع سلول یک رابطه خطی میان تعداد سلول­ها و میزان جذب اندازه­گیری شده وجود دارد که این رابطه امکان تعیین دقیق هرگونه تغییرات در میزان تکثیر سلول­ها را فراهم می­سازد. روش آنالیز نتایج تستهای سنجش زندهمانی مانند yassA TTM بدین شکل است که پس از خوانش پلیت با دستگاه الایزا ریدر، از جذب خانه­های تکرار شده برای هر دز میانگین گرفته می­شود. باید توجه داشت که میزان جذب هر چاهک از میزان جذب چاهک بلانک کم شود (عموماً این کار توسط خود دستگاه الایزا ریدر انجام میشود). در نهایت میانگین جذب هر دز به میزان جذب کنترل تقسیم شده و در 100 ضرب میشود. اعداد بهدست آمده نشان­دهنده درصد نرخ زنده مانی (Viability)می باشد. سپس نرخ زنده مانی هر یک از غلظت­ها به شکل نمودار ترسیم شده و بر طبق نمودار تفسیر و آنالیز نتایج انجام می­پذیرد (18).

آزمایش آلیزارین رد: آلیزارین قرمز که از آنتراکینون مشتق شده است، عموما برای شناسایی میزان کلسیم در مقاطع بافت‌ها به‏کار می‌رود اما اثر آن اختصاصا برای بررسی کیفی کلسیم نیست. این رنگ‌آمیزی به‌منظور تشخیص ذخایر کلسیمی ایجاد شده در سلول‌ها در حین تمایز صورت می­گیرد. برای انجام این آزمون در سه روز (هفت، 14 و 21) سلول‌ها در پلیت 48 خانه کشت شدند. در هر یک از روزهای مشخص شده، ابتدا محیط رویی سلول‌ها تخلیه و سلول‌ها با محلول PBS شست و شو شدند‌. سپس PBS خارج شد و به‏هر چاهک گلوتارآلدئید 5/2 درصد اضافه شده و پس از گذشت ده دقیقه با الکل ۷۰ درصد فیکس شدند. بعد از آن 200 میکرولیتر رنگ آلیزارین رد اضافه شد تا کاملا روی سلول‌ها را بپوشاند. بعد از 15 دقیقه، سلول‌ها آن را به‏خود جذب کرده، سپس آلیزارین را خارج کرده و سلول‌ها با PBS شست و شو داده شدند. عمل شست و شو تا مشاهده یک هاله ارغوانی رنگ‌ بر روی سلول‌ها ادامه داشت (18).                        

آزمایش کلسیم: برای اندازه‏گیری رسوبات کلسیمی، ابتدا تعداد cell/cm25000 سلول در هر چاهک از پلیت 24 خانه کشت داده شد و پس از مشاهده کانفلوئنسی مناسب محیط کشت تمایزی به چاهک­ها افزوده شد. پس از آن هر سه روز محیط رویی را خارج کرده و با PBS شست و شو شدند؛ به‏هر چاهک حاوی نمونه به‏میزان 200 میکرولیتر اسید کلریدریک 6/0نرمال افزوده شد، محتویات هر چاهک جداگانه با دور 1200 و به‏مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد تا لاشه­های سلول­ها در ته میکروتیوپ ته‏نشین شود. در این آزمایش از کیت  سنجش کلیسم پارس آزمون استفاده شد، و به‏ازای هر نمونه یک میلی‏لیتر معرف در تیوپ­های جداگانه ریخته شد. آن‏گاه برای هر تیمار به‏میزان 20 میکرولیتر از محلول سانتریفیوژ شده را به‏معرف­ها افزوده شد و سپس به‏خوبی پیپتاژ انجام شد. 100 میکرولیتر از هر تیوپ به‏چاهک­های پلیت 96 خانه انتقال داده و به‏وسیله دستگاه الایزا و در طول موج 570 نانومتر خوانده شد (18). برای تحلیل میزان کلسیم با توجه به دستورالعمل کیت میزان کلسیم با استفاده از استاندارد ان نرمال شده و سپس در فرمول خطی بدست امده، هر یک از جذبهای خوانش شده قرار گرفتند.

Ca concentration (μg /well)=((OD+.0234)/7.555)*V(μl)

آزمایش آلکالین فسفاتاز: برای انجام تست آلکالین فسفاتاز سلول­ها در پلیت 24 خانه کشت داده، ابتدا محیط رویی سلول‌ها خارج ‌شده و با مقداری PBS به‌آرامی شست و شو داده شدند. سپس به‏هر چاهک میزان معینی بافر لیز کننده ریپا (200 میکرولیتر) جهت استخراج کل پروتئین موجود در سلول اضافه شد. پس از پیپتاژ هر یک جداگانه در میکروتیوپ ریخته شد و با دور RPM 1200 به‏مدت پنج دقیقه سانتریفیوژ انجام شد تا لاشه‌های سلول‌ها ته میکروتیوپ ته‌نشین شوند. سپس از کیت شرکت پارس آزمون که حاوی سوبسترای این آنزیم، پارانیتروفنیل فسفات، برای اندازه‌گیری میزان ALP استفاده شد. به این صورت که همانند آزمون کلسیم به‏ازای هر نمونه این‏بار یک میلی‏لیتر معرف برداشته و در میکروتیوپ ریخته شد. سپس برای هر تیمار با سر سمپلر جداگانه میزان 20 میکرولیتر از محلول سانتریفیوژ شده را به‏معرف­ها اضافه کرده و پیپتاژ شد. سپس 100 میکرولیتر از محلول درون پلیت ریخته شد و جذب نوری توسط دستگاه الایزا در طول‌ موج 405 نانومتر خوانده شد.  برای بهدست اوردن فعالیت آنزیم الکالین فسفاتاز از دستوراالعمل کیت مورد استفاده بهره برده شد. فرمول مورد استفاده یه شرح زیر است:

ALP activity=

OD جذب نمونه=

t= زمان خوانش بعد از اضافه کردن نمونه به کیت

1000 تبدیل میلی مول درلیتر به میکرومول در لیتر=

ε محاسبه شده= p.nitrophenol برابر با 75/18

l=1

گروه­های آزمایشی برای تمایز استخوانی شامل موارد زیر بود:

گروه شاهد: سلول­های بنیادی تمایز نیافته در محیط کامل به‏همراه فاکتور­های تمایز استخوانی بدون جنستئین، تیمار یک، دو، سه و چهار به‏ترتیب به‏گروه شاهد غلظت ^8-10، ^7-10، ^6-10، ^5-10 میکرومولار جنستئین اضافه شد.

تمام آزمایش­ها با حداقل سه بار تکرار انجام پذیرفت و داده­های شاهد وتیمارهای آزمایشی به‏صورت میانگین و انحراف از خطای میانگین محاسبه شدند و برای بررسی معنی­دار بودن اختلاف بین گروه­ها از آزمون تحلیل یک‏طرفه (ANOVA) استفاده و 05/0>p معنی­دار در نظر گرفته شد. برای تحلیل آماری نتایج از نرم­افزار ۸.۰.۲ Graphpad prism استفاده شد.

نتایج

سلول­های بنیادی استخراج شده در فلاسک­های 25 سانتی‌متر مربع کشت داده شدند و پس از یک شبانه روز از زمان کشت به‏کف فلاسک چسبیدند؛ بعد از حدود یک هفته، سلول­های چسبیده رشد کرده و با تکثیر خود 70 تا 80 درصد فضای فلاسک را پر کردند (شکل 1).

شکل 1: مورفولوژی سلول­های بنیادی مزانشیمی اسب ترکمن(A): روز یک از رشد سلول (B): روز سه از رشد سلول (C): تراکم سلولی 80  درصددر فلاسک سلولی (D): نمایی از کلنی­های سلولی )بزرگنمایی x۴۰ (

آزمایش MTT

میزان زنده‏مانی و تکثیر سلول­های بنیادی در ظروف کشت به‏وسیله آزمون MTT در روزهای یک، چهار و هفت مورد بررسی قرارگرفت. نتایج این مطالعه تفاوت معنی‏داری بین سلول­های شاهد و سلول­های با غلظتهای مختلف جنستئین نشان نداد (شکل 2).

شکل 2: بررسی  زنده مانی سلول­های بنیادی مزانشیمی اسب ترکمن با غلظت های مختلف جنستیین

براساس اطلاعات به‏دست آمده از شکل 2 جنستئین باعث مرگ سلول­های بنیادی مزانشیمی اسب ترکمن نشد.

آزمایش آلکالین فسفاتاز

فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز در تمام گروه‏ها از روز 7 تا 14 رو به ‏افزایش بوده اما پس از آن و تا روز 21 رو به‏ کاهش می­رود. در تمام گروه‏ها فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز در روز 7 به نسبت زیاد است، در روز 14 به بیشینه خود می­رسد و سپس در روز بیست و یکم کاهش می­یابد که نشان­دهنده­ی الگو فعالیت این آنزیم در حین تمایز استخوانی در تمام گروه­ها است. در تمامی روزها گروه کنترل کم‏ترین میزان فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز را دارد که نشان­دهنده­ی اثر مثبت جنستئین در افزایش فعالیت این آنزیم می­باشد (شکل 3).

شکل 3: اثر جنستئین بر میزان فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز سلول‏های بنیادی مشتق از بافت چربی اسب در طی روند 21 روزه تمایز استخوانی

در روز هفت بین گروه کنترل و غلظت ^5-10 تفاوت معنی‏داری میزان فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز وجود دارد؛ در حالی‏که در روز چهارده بین گروه­های کنترل، ^8-10 و ^7-10 با غلظت ^6-10 تفاوت معنی‏دار وجود دارد؛ هم‏چنین تمامی گروه­ها با بیشینه غلظت جنستئین (^5-10) هم تفاوت معنی‏دار وجود دارد. در نهایت اطلاعات مربوط به روز بیست و یک نشان می­دهد که بین تمامی گروه­ها با غلظت ^5-10 تفاوت معنی‏داری مشاهده شد (05/0>p). میزان رسوبات کلسیمی در روز 21 نسبت به روز 14 و در روز 14 نسبت به روز 7، در گروه­های شاهد و در غلظت­های مختلف جنستئین بیشتر شده است. در تمام این روز­ها مقدار رسوبات کلسیمی در گروه حاوی بیش‏ترین میزان از جنستئین (^5-10) نسبت به گروه شاهد و دیگر گروه­ها بیش‏تر است.

شکل 4: اثر جنستئین بر محتوای کلسیم سلول‌های بنیادی مشتق از بافت چربی اسب در طی روند 21 روزه تمایز استخوانی

رسوبات کلسیمی در روز هفت اختلاف معنی‏داری بین گروه کنترل و غلظت­های مختلف جنستئین در سطح 05/0>p وجود ندارد ولی در روز­های 14 و 21، بین غلظت بیشینه­ی جنستئین (^5-10) و دیگر غلظت­ها به همراه گروه­های شاهد تفاوت معنی‏داری در سطح 05/0>p وجود دارد (شکل 4).

آزمایش آلیزارین رد

کنترل                                         10 ^{8-                         7-}  10  

B

^6-10                                    10  ^5-

شکل 5: رنگ‏آمیزی سلول­های بنیادی مزانشیمی اسب ترکمن در روز 7 تمایز استخوانی با الیزارین رد. بزرگنماییx۴۰

کنترل                              10 ^8-                                 10 ^7-

^6-10                                               ^5-10

شکل 6: رنگ‏آمیزی سلول­های بنیادی مزانشیمی اسب ترکمن در روز 14 تمایز استخوانی  با الیزارینرد. با بزرگنمایی X۴۰

    کنترل                               10 ^8-                           10 ^7-

^6-10                       10  ^5-

شکل 7: رنگ‏آمیزی سلول­های بنیادی مزانشیمی اسب ترکمن در روز 21 تمایز استخوانی  با الیزارین رد. بزرگنمایی X۴۰

رنگ آمیزی آلیزارین رد از پرکاربردترین روش­ها برای تشخیص میزان رسوبات کلسیمی در محیط کشت استخوانی است سلول­های کشت شده  که به مدت سه هفته در معرض محیط القا تمایز به استخوان قرار گرفته بودند با رنگ­آمیزی اختصاصی آلیزارین قرمز مورد ارزیابی قرار گرفتند. اولین نشانه­های تغییرات موفولوژیکی و تمایز به استخوان، هفت روز پس از القای تمایز مشاهده شد. در پایان دوره تمایز (21روز) توده های سلولی مقدار فراوانی ماتریکس معدنی ترشح کرده بودند. بررسی ‌نتایج ‌نشان ‌داد ‌که ‌الگوی ‌رنگ‌پذیری‌ ‌ سلول­های ‌تیمار ‌شده ‌با ‌افزایش غلظت  جنستیین  نسبت مستقیم دارد. با افزایش غلظت رسوب کلسیمی افزایش یافته و حتی در روزهای ۱۴ و ۲۱ در غلظت­های^{۶ -}۱۰ و ^۵-۱۰ ندول های کلسیمی به وضوح قابل مشاهده هستند (شکل 5، 6 و 7).

بحث

سلول­های بنیادی از پتانسیل بالایی برای عمل به‏عنوان گزینه درمانی در شرایط مختلف بالینی برخوردار هستند. در اسب­ها، سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان، بافت­های چربی یا جنین عمدتا برای درمان­ها استفاده می­شوند. تعدادی از درمان‌های بالینی سلول­های بنیادی اسب در سراسر جهان انجام می­شود، که بدون هیچ نتیجه­گیری­های قطعی می­باشد (19). سلول­های بنیادی مزانشیمی پتانسیل بهبود بیماری­های اسب­ها را دارند. اگرچه درک ما از بسیاری از جنبه­های این روش درمانی محدود است، اما برخی از تحقیقات منتشر شده در مورد شرایط خاص موثر بر استفاده از سلول­های بنیادی مزانشیمی وجود دارد (20). مطالعات انجام شده در خرگوش­ها، بهبودی زودرس مشابه در بهبود غضروف، 2 هفته پس از کاشت سلول­های بنیادی مزانشیمی را نشان داده است (21).

روش­های درمانی مبتنی بر سلول با استفاده از سلول­های بنیادی مزانشیمی به‏طور مکرر در درمان اسب و گاو با تلاش برای ترمیم غضروف، تاندون و استخوان پس از آسیب گزارش شده است (22). پیوند سلول بنیادی مزانشیمی در ناهنجاری نقص مفصلی در اسب منجر به‏بهبود زودرس می­شود (23).

توافق کلی در مورد تاثیر هورمون­های جنسی بر متابولیسم استخوان­ها براین است که هورمون­های جنسی تنظیم کننده متابولیسم استخوان هستند. هورمون­های جنسی می­توانند بیش‏ترین اثر را بر رشد استخوان­ها و عضلات داشته باشند (24). بررسی 105 مطالعه بالینی هیچ اثبات روشنی را در مورد این‏که استروژن­های گیاهی که تحت عنوان فیتواستروژن­ها شناخته می­شوند خطر ابتلا به سرطان پستان و بیماری­های قلبی عروقی را کاهش می­دهند، به‏همراه نیاورد، اما به‏نظر می‏رسد بدیهی است که آن‏ها خطر ابتلا به پوکی استخوان را کاهش می­دهند (25).

داده­های بی‏شماری وجود دارد که اثرات محافظتی محصولات سویا را در مدل­های حیوانات و در مطالعات اپیدمیولوژیک نشان می­دهد (26) شواهدی وجود دارد که نشان می­دهد مصرف سویا طیف وسیعی از تاثیرات سلامتی مانند پیش‏گیری از سرطان، کاهش خطر ابتلا به پوکی استخوان، نقش ارزشمند در بیماری مزمن کلیوی و محافظت در برابر برخی از اختلالات قلبی عروقی را دارد (27).

 بسیاری از ترکیبات محافظ در گیاهان کشف شده است. فیتواستروژن­ها یا استروژن­های گیاهی، ترکیباتی هستند کـه بـا تغییراتی که از سوی فلـور طبیعـی بـدن بـر روی آن‏هـا اعمـال می­شود، عمل‏کردی شبیه استروژن از خود نشان مـی­دهنـد (28). جنستئین یک فیتواستروژن غالب در سویاست که به‏عنوان ایزوفلاوین شناخته می‌شود و غیراستروئیدی است (29).

الگوی تاثیر جنستئین بر روند تکثیر و تمایز سلول‏های بنیادی مزانشیمال را می‏توان به‏خاصیت فیتواستروژنی جنستئین نسبت داد. در مطالعه محمودی و همکاران (30) نشان دادند که وجود خاصیت فیتواستروژنی گیاه باریجه سبب تکثیر و تمایز سلول­های بنیادی مزانشیمال شد که با نتایج تحقیق حاضرمنطبق است.

گیرنده­های استروژن هر دو روی استئوبلاست­ها و استئوکلاست­ها قرار دارند. بنابراین اعتقاد بر این است که جنستئین به‏دلیل شباهت ساختاری با استرادیول می­تواند برای تنظیم فعالیت پوکی استخوان به‏گیرنده­های استروژن موجود در استئوکلاست­ها متصل شود، و می­تواند به‏گیرنده­های موجود در استئوبلاست­ها متصل شود، آن‏ها را تحریک کند و سپس تشکیل استخوان را تسریع کند. از نظر عمل‏کرد استئوکلاست­ها، جنستئین در مهار جذب استئوکلاست در شرایط آزمایشگاهی موثر است (31).

جنستئین شباهت ساختاری با 17β  استرادیول دارد به‏طوری‏که می­تواند به‏گیرنده­های استروژن متصل شود و اعتقاد براین است که با تقلید پاسخ­های بیولوژیکی استروژن­ها، اثر مفیدی برروی بافت استخوان می­گذارد. این فیتواستروژن هم‏چنین می­تواند با تقویت تشکیل استخوان و جلوگیری از جذب استخوان، متابولیسم استخوان را بهبود بخشد. جنستئین هم‏چنین یک روش قابل دوام بیش‏تر برای درمان‏های بیماری­های جذب استخوان­، به‏عنوان مثال پوکی استخوان فراهم می­کند (31). که این موید اثرات مثبت جنستئین در افزایش رسوب کلسیم می­باشد که در این آزمایش نیز مشاهده شد با افزایش غلظت جنستئین و گذشت 14 و 21 روز، میزان رسوبات کلسیمی زیاد شد و تشکیل استخوان را تشدید کرد که با نتایج آزمایشات ذکر شده هم‏خوانی دارد.

 بافت استخوانی از ماتریکسی معدنی شده به‏همراه سلول­های استخوانی تشکیل شده است. استئوبلاست­ها سلول­های بالغ و فعال بافت استخوانی محسوب می­شوند که سبب ساختن این ماتریکس آلی و هم‏چنین مسئول معدنی کردن آن می­باشند. آنزیم آلکالین فسفاتاز نقش کلیدی در پروسه تمایز سلول­های استخوانی ایفا کرده و اندازه­گیری میزان فعالیت این آنزیم به‏عنوان یکی از مارکرهای اصلی تمایز به استخوان محسوب می­شود (32). ژن‌های فاکتور رونویسی مربوط به runt 2 (Runx2) و استریکس (Osx) دو فاکتور اثرگذار در تمایز استئوبلاست می­باشند (33) نقش اصلی Runx2 در تنظیم استئوژنیک با تشکیل عامل اصلی فاکتور بتا (Cbf ß) و اتصال با DNA می‌باشد علاوه براین تمایز سلول­های مزانشیمال به سلول استخوانی با افزایش بیان ژن مارکر اولیه آنزیم آلکالین فسفاتاز همراه است (34). که این تمایز با روش­های مختلفی مانند تشخیص بیان ژن Runx2یا تست آلیزارین‏رد قابل تشخیص است (33) مکانیسم عمل رنگ آلیزارین‏رد بدین صورت است که با کلسیم تشکیل کیلات می­دهد و به‏رنگ قرمز دیده میشود. البته تشکیل کیلات تنها منحصر به کلسیم نمی­باشد بلکه با عناصر فلزی دیگری مثل منیزیم، منگنز و آهن نیز کلات تشکیل می­شود اما در اغلب موارد میزان این عناصر به‏حدی نیست که سبب واکنش موثر شود. در نتیجه رنگ­آمیزی آلیزارین رد روش مناسبی برای سنجش کیفی میزان کلسیم می­باشد (53) از آن‏جایی‏که نتیجه­ی تست آلیزارین رد با میزان رسوبات کلسیمی سلول ارتباط مستقیم دارد پس تصور بر این بود که با توجه به‏شکل 4 با گذشت زمان و نزدیک شدن به‏روز 21 سلول­ها به‏دلیل افزایش میزان رسوبات کلسیمی رنگ قرمز بیشتری را از خود بروز دهند.  با توجه به این مطالب و آن‏چه به‏عنوان نتیجه از تست آلیزارین رد به‏دست آمد سلول­های بنیادی با محیط تمایزی همراه با جنستئین،  بهتر و بیش‏تر از سلول­های کنترل به‏سمت سلول­های استخوانی تمایز پیدا کردند. هرچه میزان غلظت جنستیین افزایش پیدا کرده میزان رسوب معدنی در سلول نمایان تر است. نتایج نشان داد که قدرت جنستئین در افزایش میزان آنزیم آلکالین فسفاتاز معنی‏دار بود که به‏طور غیرمستقیم موید افزایش بیان ژن Runx2 است که با تمایز به استئوبلاست رابطه مستقیم دارد (33). افزایش غلظت آنزیم آلکالین فسفاتاز در این تحقیق با نتایج سایر محققین شباهت داشت.

نتیجه گیری

در مجموع یافته­ها تاییدی بر این اسـت کـه سلول­های بنیادی مزانشیمی جـدا شـده از  چربی اسب ، توانـایی تمـایز بـه سـلول­هـای استئوبلاسـت را دارنـد و فاکتورهای تمـایز دهنـدههایی چـون دگزامتـازون، بتـا- گلیسروفســفات و اســید اســکوربیک، قــادر هســتند ایــن سلول­ها را به سمت سلول­های استئوبلاسـتی تمـایز دهنـد. براساس نتایج به‏دست آمده از انجام این پژوهش می­توان گفت که جنستئین اثر مثبتی بر روند تمایزی سلول­های بنیادی مزانشیمی به سلول‏های استخوانی در اسب ترکمن داشته است که شاخص ان فعالیت آنزیم الکالین فسفاتاز است. بررسی نتایج فعالیت آنزیم  آلکالین فسـفاتاز، بیـانگر تمـایز بهتر سلول­های  MSC در حضور جنستیین با غلظت­های مختلف نسبت به محیط فاقد آن بود.

تشکر و قدردانی

نویسندگان از آقای دکتر احسان سید جعفری  استاد دانشکده زیست فناوری دانشگاه تهران  که با در اختیار قرار دادن ازمایشگاه و تجهیزات، زمینه انجام این  پژوهش را فراهم  و خانم فاطمه سادات مهدوی  برای همه راهنمایی­هایشان تشکر و قدر دانی می­نمایند.