نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی، تهران، ایران
2 پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست فنآوری جهاد دانشگاهی، مرکز تحقیقات پزشکی تولید مثل، گروه زیست فنآوری جانوری، اصفهان، ایران
چکیده
هدف: هدف از مطالعه حاضر آن است که با استفاده از مزیت کار با حیوانات آزمایشگاهی، تاثیر القا واریکوسل بهصورت تجربی در رتهای نر، بر روی سلامت DNA بررسی گردد.
مواد و روشها: 66 رت نر نژاد ویستار در سه گروه کنترل، شم و واریکوسل تقسیم گردیدند. دو ماه پس از القا واریکوسل، تمامی رتها آسانکشی شده و پارامترهای اسپرمی، آسیب DNA اسپرم، میزان هیستونهای پایدار، جایگزینی هیستون با پروتامین و نیز درصد لیپید پراکسیداسیون مورد بررسی قرار گرفتند.
نتایج: اندازهگیری وزن حیوانات و طول اپیدیدیم در بین گروهها تغییر معنیداری نشان نمیدهد، اما حجم بیضه و پارامترهای اسپرمی میان گروهها تفاوت معنیداری دارد. افزایش معنیدار میزان پراکسیداسیون لیپیدی، درصد جایگزینی هیستون با پروتامین، درصد هیستونهای پایدار و درصد شکست DNA، در گروه واریکوسل مشاهده شد.
نتیجهگیری: بر اساس مطالعات قبلیو نتایج مطالعه حاضر، به نظر میرسد افزایش استرس اکسیداتیو در پی القا واریکوسل موجب پراکسیداسیون لیپیدی، ایجاد آسیب DNA در اسپرم، و بهدنبال آن کاهش پارامترهای اسپرمی میشود. در مطالعه حاضر، با استفاده از مزیت ژنتیک یکسان موشهای صحرایی و تعداد بالا آنها نشان دادیم که واریکوسل بر روی سلامت کروماتین و DNA اثر دارد و باید قبل از اقدام برای باروری در انسانها درمان گردد.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
Evaluation of Sperm DNA Integrity in Varicecolized Rat models
نویسندگان [English]
- E Shaygannia 1
- MH Nasr-Esfahani 2
- F Sotoodehnejadnematalahi 1
- K Parivar 1
1 Department of biology, School of basic sciences, Science and research branch, Islamic Azad university, Tehran, Iran
2 Department of Animal Biotechnology, Reproductive Biomedicine Research Center, Royan Institute for Biotechnology, ACECR, Isfahan, Iran.
چکیده [English]
Aim: The current study aims to utilize varicocele induction in male rat models to evaluate effect and impact of varicocele on DNA integrity.
Material and Methods: 66 male Wistar rats were divided into 3 groups: control, sham and varicocele-induced (VI). 2 months post-VI, Sperm parameters, percentage of sperm DNA damage, persistent histone and lipid peroxidation were assessed.
Results: Animal weight and their epididymal length shown no significant changes but there were significant differences in testis volume and sperm parameters between VI group versus control and sham groups. Similarly, increased level of DNA damage, persistent histone and lipid peroxidation were evaluated, and compared between varicocele and control group.
Conclusion: Based on literature and the result of this study, it is likely that increase oxidative stress following varicocele induction leads to lipide peroxidation, DNA damages and reduced sperm parameters. In the current study, by taking the advantage of homogenous genetic background and high number of animals, we showed that varicocele have damaging effect on DNA and chromatin integrity and should be reversed in human before aiming for pregnancy.
کلیدواژهها [English]
- DNA Damages
- lipid peroxidations
- Oxidative stresses
- Varicocele
مقدمه
واریکوسل، به اتساع غیرطبیعی و بیش از حد ورید بیضوی اطلاق و از مهمترین علل ناباروری مردان محسوب میشد. از نظر شیوع، این بیماری در 35 درصد از افراد، با ناباروری اولیه و 85 درصد افراد با ناباروری ثانویه گزارش شده است و بدین سبب جز شایعترین علل ناباروری مردان بهشمار میآید (1). واریکوسل، از جمله بیماریهایی است که میتواند در نهایت منجر به ناباروری شد. این اختلال، در بیشتر مواقع بهصورت یکطرفه در ورید بیضوی چپ دیده میشود. دلیل آن میتواند اختلاف در ساختار آناتومیک سیاهرگهای اسپرماتیک چپ و راست و اختلاف آنها در الگوی تخلیه وریدی و همچنین طولانیتر بودن ورید اسپرماتیک در سمت چپ نسبت به ورید اسپرماتیک راست باشد. بااینحال، در مواردی نیز واریکوسل را میتوان بهصورت دو طرفه مشاهده نمود (2).
مطالعات چنین نشان دادهاند که اتساع ورید اسپرماتیک در بیضه در شرایط واریکوسل، موجب اختلال در گردش خون وریدی و در نتیجه، افزایش دما و کمبود اکسیژنرسانی در بیضه میشد که متعاقب آن، گونههای فعال اکسیژن (ROS) تولید میشوند. پیامد افزایش بیش از حد ROS میتواند ایجاد وضعیت استرس اکسیداتیو باشد (3).
استرس اکسیداتیو میتواند اثرات مخربی بر روی ماکرومولکولهای سلولی از جمله پروتئینها، لیپیدها و اسیدهای نوکلئیک داشته باشد (4). مطالعات متعددی در این زمینه، نشان دادهاند که ROSها با حمله به اسیدهای نوکلئیک، میتوانند موجب شکست در ساختار دو رشتهای DNA شوند. افزایش بیش از حد ROSها در سلول اسپرم، بهدلیل وجود اسیدهای چرب غیراشباع بالا، حجم کم فضای سیتوپلاسمی و همچنین عدمحضور آنزیمهای ترمیمکننده DNA، میتواند این سلول را مستعد آسیب بیشتر کرده و پیامدهای مخربی را بهجای گذارد که حتی اثرات آن تا نسلهای بعد قابل پیگیری میباشد (5). علاوه بر تولید بیش از حد ROS که میتواند موجب آسیب DNA شد، کاهش یا عدم جایگزینی پروتامینها با هیستونها در طی فرآیند اسپرمیوژنز، که در شرایط طبیعی میتواند منجر به ایجاد تراکم بالا در کروماتین اسپرم شود، نیز میتواند منجر به آسیب DNA شود (6).
مطالعات پیشین نشان دادهاند که سطوح بالای استرس اکسیداتیو میتواند القا پراکسیداسیون لیپید در غشای پلاسمایی اسپرم را بههمراه داشته باشد که با کاهش تحرک اسپرم و کاهش اتصال اسپرم به تخمک مرتبط است. در این زمینه، احتمال داده شده که استرس اکسیداتیو به پروتئینهای درگیر در فرآیند اتصال اسپرم و تخمک آسیب میرساند و متعاقبا اسپرم توانایی اتصال به تخمک را از دست میدهد و در نهایت منجر به کاهش موفقیت لقاح و باروری میشود (7، 8).
با توجه به اینکه در شرایط واریکوسل، ایجاد وضعیت استرس دمایی بیضه میتواند موجب القای استرس اکسیداتیو شود و پیامد نهایی این استرسها کاهش کیفیت اسپرم و پتانسیل باروری میباشد، در این مطالعه سعی برآن شد که برخلاف مطالعات انسانی که جمعیت هتروژنی از مردان با واریکوسل در درجات متفاوت با زمینههای ژنتیکی متفاوت مورد بررسی قرار میگیرند، در جمعیت هموژن ژنتیکی از موشهای صحرایی نژاد ویستار (Wistar) القا واریکوسل صورت پذیرد و علاوه بر پارامترهای اسپرمی، چهار پارامتر اصلی در شرایط آسیب کروماتین اسپرم ازجمله سطح استرس اکسیداتیو از طریق بررسی لیپید پراکسیداسیون ، آسیب DNA، کمبود پروتامین اسپرم و هیستون باقیمانده در کروماتین اسپرم مورد بررسی قرار گیرد.
مواد و روشها
حیوان و تیمارها: مطالعه حاضر، از نوع کارآزمایی شاهددار، بر روی 66 موش صحرایی نر آزمایشگاهی (پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست فناوری، اصفهان، ایران)، نژاد ویستار در محدوده وزن (200-150 گرم) صورت پذیرفت. نگهداری حیوانات در مرکز پرورش حیوانات آزمایشگاهی پژوهشکده زیست فناوری تحت شرایط استاندارد (12 ساعت تاریکی و 12 ساعت نور و دمای 20 تا 25 درجه سانتیگراد) انجام شد. در این پژوهش (IR.ACECR.ROYAN.REC.1397.149) کلیه موازین اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی رعایت شده است.
رتهای نر بهطور تصادفی در گروههای 22 تایی، به 3 گروه کنترل، شم و واریکوسل، براساس تعاریف زیر طبقهبندی شدند:
گروه کنترل: هیچ گونه عمل جراحی برروی رتهای نر این گروه انجام نشد. گروه کنترل- شم: تنها لاپارتومی ساده برروی حیوانات این گروه صورت گرفت. گروه واریکوسل: واریکوسل تجربی بر اساس روشTurner برروی رتهای نر آزمایشگاهی این گروه، القا شد (9). القا واریکوسل در تمامی رتهای گروه واریکوسل، بهوسیله یک اپراتور، با یک روش و شدت و در دمای اتاق (25 درجه سانتیگراد) صورت پذیرفت. پس از دو ماه از القا واریکوسل، موشهای صحرایی هر سه گروه با استفاده از کتامین 10 درصد (آلفاسان، هلند) و زایلزین 20 درصد (آلفاسان، هلند) با نسبت 3/1 قربانی شدند.
بررسی وزن بدن، حجم بیضه و طول اپیدیدیم: قبل از بیهوشی حیوانات، وزن آنها در هر گروه مورد ارزیابی قرار گرفت. پس از بیهوشی، بیضه و اپیدیدیم از بدن حیوانات خارج شدند. طول اپیدیدیم با استفاده از کولیس ورنیه و حجم بیضه رتها با استفاده از روش ولومتریک (cirtemuloV) بررسی شد. قسمت انتهایی اپیدیدیم به قطعات کوچک تقسیم شدند و بهمدت 1 ساعت در محیط شستوشو اسپرم mrepS atiV (شرکت ایناکلون، ایران) با سرم آلبومین ده درصد در دمای 73 درجهسانتیگراد قرار داده شدند. سپس، از اسپرمهای خارج شده به محیط شستوشو اسپرم جهت بررسی پارامترهای اسپرمی، پراکسیداسیون لیپید و تستهای کروماتین اسپرم استفاده شد.
ارزیابی پارامترهای اسپرمی
ارزیابی تحرک اسپرم: جهت ارزیابی میزان تحرک اسپرمها، یک قطره (5میکرولیتر) ازنمونهرا بر رویلام شیشهایاز قبل گرم شده قرارداده، و پس از لاملگذاری، بابزرگنمایی400× توسطمیکروسکوپ نوری شمارشصورت گرفت. سپس تعداد 200 اسپرمدر چندینمیداندید میکروسکوپی متفاوت بررسی و تعداد اسپرمهای دارای تحرک پیشرونده و اسپرمهای غیرمتحرک شمارش شد (10).
ارزیابی مورفولوژی اسپرم با استفاده از رنگآمیزی ائوزین-نگروزین: در مطالعه حاضر، جهت ارزیابی مورفولوژی طبیعی و غیرطبیعی اسپرمها از رنگآمیزی ائوزین- نگروزین استفاده شد. بهصورت خلاصه، 20 مایکرولیتر از نمونه شسته شده با 40 مایکرولیتر از ائوزین 1 درصد (سیگما، آمریکا) مخلوط و پس از 5 دقیقه، 60 مایکرولیتر از محلول نگروزین 10 درصد (سیگما، آمریکا) نیز بهآن اضافه شد. سپس از این مخلوط، اسمیر بر روی لام تهیه شد. درنهایت، 200 اسپرم در هر لام در میدانهای دید متفاوت با میکروسکوپ نوری عدسی 100× بررسی شد و درصد اسپرمهای دارای مورفولوژی غیرطبیعی ثبت شدند (11).
ارزیابی آسیب DNA اسپرم با رنگ آمیزی آکریدین ارنج: ارزیابی میزان شکست DNA اسپرم توسط رنگآمیزی آکریدین ارنج صورت پذیرفت. آکریدین ارنج، بهدرون سلول نفوذ میکند و به DNA سلول متصل میشود. هنگامیکه این رنگ به DNA دو رشتهای متصل میشد، رنگ فلورسنت سبز رنگ از خود ساطع میکند که نشانه سلامت DNA میباشد. درمقابل، این رنگ، هنگام اتصال به DNA تک رشتهای (شکسته شده یا آسیب دیده)، رنگ فلورسنت قرمز رنگ از خود ساطع میکند (10). از نمونه شسته شده توسط بافر فسفات سالین (PBS: Phosphate Buffer Saline)، برروی لام شیشهای اسمیر تهیه شد و اجازه داده شد تا در معرض هوا خشک شود. سپس، اسمیر تهیه شده،با استفاده از محلول فیکساتیوکارنوی (Carnoy) (الکل متانول و اسید استیک گلاسیال به نسبت 3 به 1 بهمدت حدود 12 ساعت، در دمای آزمایشگاه تثبیت شد و سپس توسط بافر فسفات مورد شستوشو قرار گرفت. در ادامه، رنگ آکریدین اورانژ (80 میلیلیتر اسید استیک 1/0 مولار + 5 میلیمولار NaH2PO4 3/0 مولار با غلظت نهایی 19/0 درصد در 5/2 pH=) (مرک، آلمان) تازه تهیه شده بهمدت 90 دقیقه برروی لام قرار داده شد و بهدنبال آن مجددا بهوسیله بافر فسفات سالین شستوشو داده شد. لامهای رنگآمیزی شده با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس (BX51 TRF، المپیوس، ژاپن) با فیلتر 460 نانومتر و بزرگنمایی 1000× بررسی شد. برروی هر لام 200 اسپرم شمارش و درصد اسپرمهای سبز رنگ (دارای DNA سالم) و اسپرمهای قرمز رنگ (دارای DNA آسیب دیده) ثبت شد (11).
ارزیابی میزان هیستون باقیمانده اسپرم با استفاده از رنگ آمیزی آنیلین بلو:در آخرین مرحله اسپرمیوژنز، هیستونها توسط پروتامینها جایگزین میشوند. سلولهای نابالغ، به علت عدم انجام کامل و صحیح این جایگزینی، دارای تعداد بیشتری از پروتئین هیستون میباشند و از آنجا که این پروتئین، غنی از اسید آمینه لیزین میباشد دارای خاصیت بازی است که در نتیجه آن میتواند با رنگهای اسیدی مانند آنیلین بلو واکنش داده و بهرنگ آبی درآیند. از این خاصیت شیمیایی اسیدهای آمینه، جهت ارزیابی میزان هیستون باقیمانده در تست رنگ آمیزی آنیلین بلو استفاده میشود. براین اساس، اسپرمهایی که به رنگ آبی درمیآیند نشاندهنده اسپرمهای نابالغ با درصد بالا هیستون اضافی است (01).
از نمونه شسته شده بر روی لام شیشهای اسمیر تهیه شد و اجازه داده شد که در معرض هوا خشک شوند. محلول گلوتارآلدهید (3 درصد در بافر فسفات سالین، 2/7pH = مرک، آلمان) بهمدت 30 دقیقه بر روی نمونهها اضافه شد. جهت رنگآمیزی، از محلول آبی آنیلین بلو (غلظت نهایی 5 درصد با 5/3pH=) )سیگما، آمریکا( بهمدت 5 دقیقه صورت میگیرد درنهایت لامهای رنگآمیزی شده توسط میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی 1000× مورد ارزیابی قرار گرفتند. 200 اسپرم برروی هر لام در میدانهای دید متفاوت شمارش شد. اسپرمهای آبی رنگ بهعنوان AB+ ارزیابی شدند که بیانگر حضور درصد بالایی از هیستون باقیمانده در کروماتین میباشند (12).
ارزیابی میزان کمبود پروتامین اسپرم با استفاده از رنگآمیزی کرومایسین A3: بهمنظور ارزیابی میزان کمبود پروتامین از روش رنگآمیزی ایمنوفلورسنت کرومومایسینA3 (CMA3) استفاده شد. با کمک این روش میتوان نقص در بستهبندی کروماتین، بلوغ هسته و متراکم شدن هسته را مورد ارزیابی قرار داد. کرومایسین A3، بهصورت اختصاصی بهتوالیهای غنی از گوانین–سیتوزین موجود در DNA متصل میشد و در واقع برای اتصال به این توالیها با پروتئین پروتامین رقابت میکند (10). جهت انجام این رنگآمیزی، به نسبت مساوی فیکساتیو کارنوی، به نمونهی اسپرمی اضافه شد (5 دقیقه، 4 درجه سانتیگراد). از سلولهای فیکس شده برروی لام، اسمیر تهیه شد. لامها توسط رنگ کرومومایسین A3 (با غلظت 25/0 میلیگرم بر میلیلیتر با 7=pH در بافر مک الوین حاوی کلرید منیزیوم 10 میلیمولار) کاملا پوشانده شدند (90 دقیقه در محیط تاریک). سپس رنگهای اضافه از روی لامها با PBS، شسته شدند و پس از لاملگذاری، لامها با میکروسکوپ فلورسانس (BX51 TRF، المپیوس، ژاپن) با بزرگنمایی 1000× بررسی شد. برای هر نمونه تعداد 200 اسپرم در چندین میدان دید متفاوت شمارش صورت گرفت و نتایج بهصورت درصد اسپرمهای با رنگ زرد درخشان یا +CMA3 که گویای اسپرمهای دارای کمبود پروتامین هستند، گزارش شد (11).
ارزیابی پراکسیداسیون لیپید با استفاده از رنگآمیزی بادی پای: جهت ارزیابی پراکسیداسیون لیپیدی از رنگآمیزی ایمنوفلورسنت BODIPY- C11 (اینویتروژن، آمریکا) استفاده شد. این رنگ توانایی رنگآمیزی اسیدهای چرب آسیب دیده را در غشا سلول دارد. بهصورت خلاصه رنگ بادی پای با غلظت نهایی 5 میلیمولار به 2 میلیون اسپرم درون یک میکروتیوب تیره اضافه و در 37 درجه سانتیگراد بهمدت 30 دقیقه نگهداری شد. سپس، نمونهها توسط دستگاه فلوسایتومتر FACS Calibur (بکتون دیکسون، آمریکا)، خوانش شد. لازم بهذکر است که علاوه بر کنترل منفی، از نمونه کنترل مثبت (اضافه نمودن H2O2 به نمونه اسپرمی) نیز استفاده شد (13).
A |
B |
D درصد لیپیدپراکسیداسیون اسپرم(97/2±57/46)، کمبود پروتامین اسپرم(15/1 ±10/23)، میزان هیستون باقیمانده اسپرمی (54/4 ± 76/53)و آسیب DNA اسپرمی(42/2 ± 93/61) |
C |
B |
شکل 1 : ارزیابی تستهای عملکردی اسپرم در سه گروه مطالعه : A) درصد هیستون پایدار، B) درصد کمبود پروتامین، C) درصد شکستگی AND اسپرم، D) درصد پراکسیداسیون لیپیدی .*: افزایش معنی دار در گروه واریکوسل نسبت به دو گروه شم و کنترل. 50/0
آنالیز آماری
اطلاعات بهدست آمده از این مطالعه توسط نرمافزار آماری SPSS(ویراست 19) آنالیز شد. جهت بررسی توزیع نرمال دادهها، از تست کولموگروف-اسمیرنوف (kolmogorov-smirnov) استفاده شد. سپس دادهها توسط روش آماریone way ANOVA، (Tukey post hock)، مورد ارزیابی قرار گرفتند. در صورتی که 05/0p-value< بود، از لحاظ آماری معنیدار محسوب شد.
جهت ارزیابی ارتباط میان پارامترهای اسپرمی و تستهای عملکردی اسپرم (درصد آسیب DNA، درصد کمبود پروتامین، درصد هیستون پایدار و لیپید پراکسیداسیون)، تمامی دادهها تجمیع شدند و ضریب همبستگی پیرسون)nosreaP( بین پارامترهای مورد نظر بررسی شد. جهت بررسی وجود تفاوت معنیدار از نظر آماری بین پارامترهای مورد نظر تستdeliat owT ارزیابی شد. درصورتیکه 50/0<eulav-pبود، از لحاظ آماری معنیدار محسوب شد.
نتایج
در این مطالعه، وزن بدن، حجم بیضه و طول اپیدیدیم در بین سه گروه کنترل، شم و واریکوسل مورد مقایسه قرار گرفت. همانگونه که در جدول یک نشان داده شده است، میانگین وزن بدن و طول اپیدیدیم بین گروهها اختلاف معنیداری از لحاظ آماری ندارد (50/0<eulav-p). حجم بیضه بهطور معنیداری در گروه القا واریکوسل (60/0±60/1) نسبت به گروه کنترل (500/0= eulav-p، 70/0±63/1) و شم (000/0= eulav-p، 60/0±94/1) کاهش یافته است. در رابطه با غلظت، تحرک و مورفولوژی اسپرم، همانگونه که در جدول یک نشان داده شده است، میانگین درصد مورفولوژی غیرطبیعی در گروه واریکوسل (000/0= eulav-p، 49/1±03/71) و نیز تحرک اسپرم (000/0= eulav-p، 93/2±40/83) بهطور معنیداری بالاتر از مورفولوژی غیرطبیعی (38/0±22/9) و نیز تحرک اسپرم (56/3±16/96) در گروه کنترل و همچنین، درصد مورفولوژی غیرطبیعی در گروه شم (16/1±04/01، 700/0= eulav-p) و درصد تحرک (11/4±11/16، 000/0= eulav-p) نیز در این گروه نسبت به گروه واریکوسل تفاوت معنیداری را نشان میدهد. بهعلاوه میانگین درصد غلظت اسپرم بهطور معنیداری در گروه القا واریکوسل (31/7±51/85) پایینتر از گروه کنترل (600/0= eulav-p، 89/7±18/19) میباشد.
جدول 1: مقایسه وزن بدن، حجم بیضه، طول اپیدیدیم . پارامترهای اسپرمی بین گروههای کنترل، شم و واریکوسل (تعداد در هر گروه 22 است)
حروف مشابه نشان دهنده اختلاف معنیدار می باشند. 05/0p-value≤ محاسبه شد.
واریکوسل
|
شم |
کنترل |
پارامترها
|
359/68±12/68 |
366/9±8/64 |
353/27±11/93 |
وزن بدن (گرم) |
1/06±0/06ab |
1/49±0/06b |
1/36±0/07a |
حجم بیضه (سی سی) |
3/55±0/07 |
3/63±0/07 |
3/87±0/08 |
طول اپیدیدیم (سانتیمتر) |
58/15±7/13a |
80/76±7/21 |
91/81±7/98a |
غلظت اسپرم (میلیون در هر سی سی) |
38/04±2/39ab |
61/11±4/11b |
69/61±3/65a |
تحرک اسپرم (درصد) |
17/30±1/94ab |
10/40±1/61b |
9/22±0/83a |
مورفولوژی غیر طبیعی اسپرم (درصد) |
در این مطالعه، سلامت کروماتین اسپرم با استفاده از رنگآمیزیهای آکریدین ارنج ، آنیلین بلو و کرومایسین A3 مورد بررسی قرار گرفت، همچنین وضعیت استرس اکسیداتیو در سلولهای اسپرمی از طریق بررسی پراکسیداسیون لیپید مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج در شکل یک نشان میدهد که در گروه القا واریکوسل آسیب DNA اسپرم (42/2±39/61)، میزان هیستون باقیمانده (54/4±76/53)، کمبود پروتامین (15/1±10/23) و درصد پراکسیداسیون لیپید (97/2±57/46) در اسپرم، بیشتر از میانگین درصد آسیب DNA (000/0=p-value، 57/2± 72/20)، میزان هیستون باقیمانده (000/0=p-value، 87/4 ± 12/29)، کمبود پروتامین (006/0=p-value، 39/1±57/17)و پراکسیداسیون لیپید اسپرم (000/0=p-value، 72/1±33/12) در گروه کنترل میباشد. آسیب DNA اسپرمی (000/0=p-value، 30/2±66/29)، میزان هیستون باقیمانده اسپرمی (000/0=p-value، 27/2±02/26)، کمبود پروتامین اسپرم (003/0=p-value، 57/1±23/16) و درصد پراکسیداسیون لیپید اسپرم (000/0=p-value،55/1 ± 90/14) در گروه شم نیز بهصورت معنیداری پایین تر از گروه واریکوسل میباشد.
دراین مطالعه همچنین، ارتباط میان پارامترهای اسپرمی و درصد آسیب DNA، کمبود پروتامین، درصد هیستون پایدار و لیپید پراکسیداسیون مورد بررسی قرار گرفت (جدول 2). غلظت اسپرم با درصد آسیبDNA (000/0=,p-value778/0-=r)، میزان هیستون پایدار (000/0=,p-value847/0-=r) و لیپید پراکسیداسیون (000/0=,p-value584/0-=r) ارتباط معکوس و معنیداری را نشان میدهد. اما با میزان کمبود پروتامین ارتباط معنیداری را نشان نمیدهد. میزان تحرک اسپرم، با درصد آسیب (000/0=,p-value781/0-=r) DNA، کمبود پروتامین (021/0=,p-value300/0-=r)، درصد هیستون پایدار (000/0=,p-value661/0-=r) و لیپید پراکسیداسیون (000/0=,p-value704/0=r) ارتباط معکوس و معنیداری را نشان میدهد.
همچنین بررسی ارتباط میان درصد موفولوژی غیرطبیعی و درصد آسیب DNA (000/0=,p-value670/0=r)، درصد هیستون پایدار (000/0=,p-value650/0=r) و لیپید پراکسیداسیون (000/0=,p-value488/0-=r) ارتباط مستقیم و معنیداری را نشان میدهد اما بررسی آن با میزان کمبود پروتامین، ارتباط معنیداری را نشان نمیدهد.
جدول 2: ارزیابی ارتباط میان پارامترهای اسپرمی با آسیبDNA، کمبود پروتامین، هیستون پایدار و درصد لیپیدپراکسیداسیون.
برای بررسی ضریب همبستگی از تست پیرسون(Pearson) ، استفاده گردید. در صورتی که p-value ≤ 0.05 بود، از لحاظ آماری معنیدار محسوب شد.
لیپید پراکسیداسیون |
میزان هیستون پایدار |
کمبود پروتامین |
آسیب DNA |
پارامترها |
غلظت اسپرم |
||||
-0/584 |
-0/847 |
-0/104 |
-0/778 |
r |
0/000 |
0/000 |
0/501 |
0/000 |
p-value |
تحرک اسپرم |
||||
-0/704 |
-0/661 |
-0/300 |
-0/781 |
r |
0/000 |
0/000 |
0/021 |
0/000 |
p-value |
مورفولوژی غیر طبیعی |
||||
0/488 |
0/650 |
0/065 |
0/670 |
r |
0/000 |
0/000 |
0/652 |
0/000 |
p-value |
بحث
واریکوسل یکی از شایعترین علتهای ناباروری اولیه و ثانویه در مردان است که با افزایش سن، میزان شیوع آن بالا میرود. مطالعات پیشین اذعان داشتهاند که شیوع واریکوسل در مردان بهازای هر دهه از حیات فرد، بهمیزان 10 درصد افزایش مییابد و این میزان در دههی هشتم حیات فرد به 75 درصد میرسد. بهعلاوه، محققان نشان دادهاند که تغییرات هورمونی نیز وابسته به سن میباشند بهطوریکه در مردان بهطورسالانه بین یک تا دو درصد سطح تستوسترون سرم کاهش مییابد و این کاهش سطح سرم با افزایش سن میتواند بر روند اسپرماتوژنز، تولید و تمایز اسپرم تاثیر بگذارد (14). چنانچه بیان شد بهعلت شیوع بالای این نوع ناباروری، محققان و متخصصان در تلاش برای بررسی اتیولوژی این بیماری میباشند (15) و در این زمینه مطالعات گوناگونی تاکنون صورت گرفته است. باتوجه به اینکه جهت بررسی اتیولوژی واریکوسل، تحقیق بر روی نمونههای حیوانی میتواند نتایج پایدارتری را برای محققان فراهم کند، در این مطالعه سعی بر آن شد که با ایجاد مدل واریکوسل در رتهای صحرایی، وضعیت کروماتین اسپرم که نقش اساسی و مهمی را در نیمی از ژنوم جنین آینده میتواند ایفا نماید، بررسی شد. در این مطالعه، با استفاده از تعداد بالای حیوانات آزمایشگاهی در مقایسه با مطالعات پیشین، علاوه بر بررسی تاثیر القا واریکوسل بر پارامترهای اسپرمی، هدف مطالعه، بررسی القا واریکوسل برروی سلامت کروماتین اسپرم بوده است. نتایج این مطالعه حاکی از آن است که غلظت و تحرک اسپرم بهطور معنیداری روند کاهشی، و درصد مورفولوژی غیرطبیعی بهطور معنیداری روند افزایشی را در رتهای القا واریکوسل نسبت به کنترل و سم داشتهاند. بنابراین این نتایج مطابق با نتایج مدلهای انسانی و حیوانی است که واریکوسل میتواند بر روند طبیعی اسپرماتوژنز اثر گذارد و منجر به کاهش تعداد، ایجاد آسیب و افزایش اسپرم غیرطبیعی بههمراه کاهش تحرک شد (16-19).
علت اصلی آسیب وارده به سلولهای اسپرم در طول فرآیند اسپرماتوژنز در افراد واریکوسل افزایش دمای بیضه عنوان شده است. براساس مطالعات، ارتباط مستقیم بین واریکوسل و افزایش دمای کیسه بیضوی در مطالعات حیوانی و انسانی، نتایج متناقضی را نشان میدهد. شاید این نتایج بهاین دلیل است که دمای بیضه در مطالعات حیوانی بهطور مستقیم، ولی در مطالعات بالینی دمای اسکروتوم بررسی میشد (16). از طرفی در انسان درجات متفاوتی از شدت واریکوسل دیده میشود که با زمینههای ژنتیکی، تغذیه و سبک زندگی متفاوت دارای اثرات گوناگونی بر روند اسپرماتوژنز و باروری هستند. در این زمینه، مطالعات نشان دادهاند که القای واریکوسل در بیضهی میمون رزوس و موشهای نر، سبب اختلال در فرآیند اسپرماتوژنز شده، و دمای بیضه بهاندازهی یک درجهی سانتیگراد نسبت به گروه کنترل افزایش مییابد همچنین درمان واریکوسل در این حیوانات منجر به بازگشت دمای بیضه به حالت اولیه شده است (16، 21). برخی مطالعات اذعان داشتهاند که دمای اسکروتوم در مردان نابارور با واریکوسل بیشتر از افراد بارور است، در حالیکه، تعدادی از مطالعات نشان دادهاند که واریکوسل سبب اختلال در فرایند اسپرماتوژنز و پارامترهای اسپرمی میشود، ولی تفاوتی در دمای اسکروتوم در مردان مبتلا به واریکوسل و بدون واریکوسل وجود ندارد (22، 23).
محققان اینگونه بیان داشتهاند که افزایش دما بیضه در واریکوسل، احتمالا موجب ایجاد استرس گرمایی میشد و در نتیجه موجب افزایش پروتئینهای شوک حرارتی (Heat shock protein) میشود. این پروتئینها، در ترمیم پروتئینهای تخریب شده در اثر استرس نقش ایفا میکنند (24، 25). این پروتئینها براساس وزن مولکولی به 4 گروهHSP90 ،HSP70،HSP60 وHSP27 تقسیم میشوند. براساس مطالعات پیشین، HSPA2که مهمترین عضو خانواده HSP70 میباشد در بیضه و اسپرم حضور دارد و با بلوغ، عملکرد و باروری اسپرم ارتباط دارد (11، 26). افزایش دما همچنین میتواند موجب ایجاد استرس اکسیداتیو بهواسطه افزایش تولید گونههای فعال اکسیژن بیش از میزان فیزیولوزیک توسط میتوکندری سلول اسپرم شد. استرس اکسیداتیو ایجاد شده متعاقب مقادیر بالای گونههای فعال اکسیژن، میتواند بهعلت اکسیداسیون اسیدهای چرب موجود در غشای اسپرمها و بهویژه در ناحیه دم، موجب ایجاد آسیب به ساختار و عملکرد اسپرم ازجمله مورفولوژی طبیعی و تحرک میشد (8). همچنین استرسهای اکسیداتیو، میتواند با تاثیر بر روی میتوکندری اسپرم و راهاندازی آبشار آپوپتوزیس تاثیر مستقیم بر روی AND اسپرم و آسیب به ساختار آن شد که این آسیب نیز میتواند موجب کاهش عملکرد اسپرم شود. در مطالعات پیشین افزایش میزان آسیب AND متعاقب افزایش استرس اکسیداتیو در افراد واریکوسلی گزارش شده است (02). در مطالعه حاضر نیز، یکپارچگی کروماتین اسپرم بهوسیله تست رنگآمیزی آکریدین ارنج مورد بررسی قرار گرفت که در گروه واریکوسل بهطور معنیداری میزان شکست AND نسبت به گروه شم و کنترل افزایش داشته است که در راستای مطالعات پیشین ذکر شده میباشد. سلامت کروماتین اسپرم همانند سلامت کروماتین تخمک، نقش بسزایی در فرآیندهای تولیدمثل ازجمله لقاح، تکوین جنین، کیفیت زندگی فرزندان متولد شده و بهطور کلی تداوم گونه دارد. حتی اگر کروماتین اسپرم در یک حالت کاملا متراکم بستهبندی شود، هنوز هم میتواند تحت تاثیر آسیبهای مختلف قرار گیرد (27). مطالعات متعددی نشان داده است که آسیبAND اسپرم میتواند نتایج تولیدمثل را از طریق تداخل در تکوین جنینی، افزایش خطر مرگ نوزادان، ازدیاد بیماریهایی مانند سرطان در دوران کودکی، ناباروری در فرزندان و وقوع خودبهخودی بیماریهای ژنتیکی در لقاح طبیعی همچنین در لقاح حاصل از تکنیکهای کمک باروری تحت تاثیر قرار دهد (03-82).
با توجه به تاثیر استرس اکسیداتیو بر سلامت کروماتین اسپرم و همچنین ارتباطی که بین بستهبندی غیرطبیعی کروماتین و آسیب DNA وجود دارد، در مطالعه حاضر، بهطور همزمان سلامت DNA، کمبود پروتامین، هیستون باقیمانده و استرس اکسیداتیو در شرایط واریکوسل بررسی شد. نتایج نشان می دهد که میانگین فاکتورهای قید شده بهطور معنیداری در رتهای واریکوسل در مقایسه با رتهای کنترل و سم، متفاوت است و بیانگر کاهش سلامت DNA اسپرم در گروه واریکوسل متعاقب افزایش میزان لیپید پراکسیداسیون سلولی میباشد. همچنین، کاهش پارامترهای اسپرمی و حجم بیضه، در گروه واریکوسل نسبت به گروه سم و کنترل نیز موید القا واریکوسل در گروههای مورد بررسی میباشد. در ادامه، ارتباط میان پارامترهای اسپرمی و نیز آسیب DNA اسپرم، کمبود پروتامین، هیستون باقیمانده و لیپید پراکسیداسیون مورد ارزیابی قرار گرفت و مشاهده شد که ارتباط قوی و معکوسی میان کاهش کیفیت پارامترهای اسپرمی (غلظت، تحرک و مورفولوژی غیرطبیعی اسپرم) و آسیب DNA اسپرم و میزان هیستون باقیمانده و پراکسیداسیون لیپید وجود دارد و بهروشنی بیان میدارد که هر چه میزان سلامت کروماتین اسپرم کاهش یابد، کیفیت پارامترهای اسپرمی نیز کاهش پیدا میکند که باتوجه بهتعداد بالا حیوانات و زمینه ژنتیکی یکسان حیوانات مورد مطالعه، این نتایج قابل اعتماد میباشند و نیز هدف مطالعه را تامین و تایید مینماید.
مطالعات مختلفی نشان دادهاند که افزایش سطح استرس در افراد با واریکوسل، میتواند سبب ایجاد آسیب DNA اسپرم شود. اگرچه میزان دقیق آسیب DNA، بهروش ارزیابی آسیب DNA بستگی دارد. آسیب DNA اسپرم ممکن است در روند اسپرماتوژنز در داخل بیضه یا در طول بلوغ اسپرم و یا انتقال آن رخ دهد. بهعلاوه اخیرا هم نشان داده شده است که ارتباط معنیداری بین افزایش استرس اکسیداتیو و آسیب DNA اسپرم با شرایط القا واریکوسل دارد (33-31).
اخیرا مشخص شده که آسیبهای اکسیداتیو DNA اسپرم بهدلیل لوکوسیتواسپرمی همراه با عفونت و التهاب، اختلالات ژنتیکی و متابولیسمی نظیر دیس لیپیدمیا(dyslipidemia) و بیماریهایی نظیر واریکوسل، در معرض قرار گرفتن با مواد سمی، مواد مخدر، داروها، سیگار کشیدن توتون و تنباکو یا عوامل تنشزای فیزیکی مانند گرما، اشعهی یونیزان و ماکروویو رخ دهد که پیامد نهایی آن میتواند کاهش میزان لقاح، تکوین جنین، سقط جنین و حتی تولد فرزندان ناقص باشد (5، 30).
از نقاط قوت این مطالعه میتوان بهتعداد بالای نمونهها در هر گروه برشمرد که تاکنون در مطالعات شبیهسازی شده برای واریکوسل این تعداد بررسی نشده است و نتایج مطالعه را قابل اعتماد میسازد. همچنین، بررسی همزمان لیپید پراکسیداسیون لیپیدی و تستهای بررسی سلامت DNA، دیدگاه روشنی از تاثیر واریکوسل برروی لیپید پراکسیداسیون اسیدهای چرب غیراشباع و در نتیجه آن کاهش پارامترهای اسپرمی و آسیبDNA میباشد. از نقاط ضعف مطالعه حاضر نیز میتوان به عدم اندازهگیری دمای بیضه در گروهها اشاره کرد.
نتیجهگیری
از نتایج مطالعه کنونی میتوان اینگونه استنباط نمود که شرایط واریکوسل با افزایش استرس اکسیداتیو همراه است که این شرایط پاتولوژیک میتواند بر عملکرد اسپرم تاثیر منفی داشته باشد و منجر به آسیب DNA در اسپرم شد. افزایش آسیبهای اسپرمی میتواند سلول را بهسمت آپوپتوزیس پیش ببرد و تعداد اسپرم تولید و تمایز یافته نسبت به وضعیت طبیعی کاهش یابد و این اسپرمها با درصد بالایی از مورفولوژی غیرطبیعی و کاهش تحرک مواجه هستند. لذا افراد نابارور با واریکوسل بهدلیل کاهش تعداد اسپرم کارا با کاهش پتانسیل باروری مواجه هستند. از مزایای مهم این مطالعه میتوان به اثبات این تئوری در وضعیت هموژن بدون زمینه ژنتیک متفاوت در رتهای صحرایی با تعداد بالایی از رت در هر گروه آزمایشگاهی، اشاره نمود.
تشکر وقدردانی
مقاله حاضر برگرفته از طرح مصوب ما بین دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات و پژوهشگاه رویان اصفهان با شماره قرارداد 2198/19/98/ص تصویب شده در تاریخ 13/6/ 1398میباشد. در پایان جا دارد از زحمات گروه آندرولوژی پژوهشگاه رویان اصفهان تقدیر و تشکر بهعمل آید.