مقدمه

واریکوسل، به ‏اتساع غیرطبیعی و بیش از حد ورید بیضوی اطلاق و از مهم‏ترین علل ناباروری مردان محسوب می‏شد. از نظر شیوع، این بیماری در 35 درصد از افراد، با ناباروری اولیه و 85 درصد افراد با ناباروری ثانویه گزارش شده است و بدین سبب جز شایع‏ترین علل ناباروری مردان به‏شمار می‌آید (1). واریکوسل، از جمله بیماری‏هایی است که می‌تواند در نهایت منجر به ناباروری شد. این اختلال، در بیش‏تر مواقع به‏صورت یک‏طرفه در ورید بیضوی چپ دیده می‏شود.  دلیل آن می‏تواند اختلاف در ساختار آناتومیک سیاهرگ‏های  اسپرماتیک چپ و راست و اختلاف آن‏ها در الگوی تخلیه وریدی و هم‏چنین طولانی‌تر بودن ورید اسپرماتیک در سمت چپ نسبت به ورید اسپرماتیک راست باشد. بااین‏حال، در مواردی نیز واریکوسل را می‏توان به‏صورت دو طرفه مشاهده نمود (2).

مطالعات چنین نشان داده‏اند که اتساع ورید اسپرماتیک در بیضه در شرایط واریکوسل، موجب اختلال در گردش خون وریدی و در نتیجه، افزایش دما و کمبود اکسیژن‏رسانی در بیضه می‏شد که متعاقب آن، گونه‏های فعال اکسیژن (ROS) تولید می‏شوند. پیامد افزایش بیش از حد ROS می‏تواند ایجاد وضعیت استرس اکسیداتیو باشد (3).

استرس اکسیداتیو می‌تواند اثرات مخربی بر روی ماکرومولکول‏های سلولی از جمله پروتئین‏ها، لیپیدها و اسیدهای نوکلئیک داشته باشد (4). مطالعات متعددی در این زمینه، نشان داده‏اند که ROSها با حمله به اسیدهای نوکلئیک، می‏توانند موجب شکست در ساختار دو رشته‏ای DNA شوند. افزایش بیش از حد ROSها در سلول اسپرم، به‏دلیل وجود اسیدهای چرب غیراشباع بالا،  حجم کم فضای سیتوپلاسمی و هم‏چنین عدم‏حضور آنزیم‏های ترمیم‏کننده DNA، می‏تواند این سلول را مستعد آسیب بیشتر کرده و پیامدهای مخربی را به‏جای گذارد که حتی اثرات آن تا نسل‏های بعد قابل پیگیری می‌باشد (5). علاوه‏ بر تولید بیش از حد ROS که می‏تواند موجب آسیب DNA شد، کاهش یا عدم جایگزینی پروتامین‏ها با هیستون‏ها در طی فرآیند اسپرمیوژنز، که در شرایط طبیعی می‏تواند منجر به ایجاد تراکم بالا در کروماتین اسپرم شود، نیز می‏‏تواند منجر به آسیب DNA شود (6). 

مطالعات پیشین نشان داده‏اند که سطوح بالای استرس اکسیداتیو می‏تواند القا پراکسیداسیون لیپید در غشای پلاسمایی اسپرم را به‏همراه داشته باشد که با کاهش تحرک اسپرم و کاهش اتصال اسپرم به تخمک مرتبط است. در این زمینه، احتمال داده شده که  استرس اکسیداتیو به پروتئین‏های درگیر در فرآیند اتصال اسپرم و تخمک آسیب می‏رساند و متعاقبا اسپرم توانایی اتصال به تخمک را از دست می‌دهد و در نهایت منجر به کاهش موفقیت لقاح و باروری می‌شود (7، 8).

 با توجه به این‏که در شرایط واریکوسل، ایجاد وضعیت استرس دمایی بیضه می‏تواند موجب القای استرس اکسیداتیو شود و پیامد نهایی این استرس‏ها کاهش کیفیت اسپرم و پتانسیل باروری می‌باشد، در این مطالعه سعی برآن شد که برخلاف مطالعات انسانی که جمعیت هتروژنی از مردان با واریکوسل در درجات متفاوت با زمینه‏های ژنتیکی متفاوت مورد بررسی قرار می‏گیرند، در جمعیت هموژن ژنتیکی از موش‏های صحرایی نژاد ویستار (Wistar) القا واریکوسل صورت پذیرد و علاوه بر پارامترهای اسپرمی، چهار پارامتر اصلی در شرایط آسیب کروماتین اسپرم ازجمله سطح استرس اکسیداتیو از طریق بررسی لیپید پراکسیداسیون ، آسیب DNA، کمبود پروتامین اسپرم و هیستون باقی‏مانده در کروماتین اسپرم مورد بررسی قرار گیرد.

مواد و روش‌ها

حیوان و تیمارها: مطالعه حاضر، از نوع کارآزمایی شاهددار، بر روی 66  موش صحرایی نر آزمایشگاهی (پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست فناوری، اصفهان، ایران)، نژاد ویستار در محدوده وزن (200-150 گرم) صورت پذیرفت. نگه‏داری حیوانات در مرکز پرورش حیوانات آزمایشگاهی پژوهشکده زیست فناوری تحت شرایط استاندارد (12 ساعت تاریکی و 12 ساعت نور و دمای 20 تا  25 درجه سانتی‏گراد) انجام شد. در این پژوهش (IR.ACECR.ROYAN.REC.1397.149) کلیه موازین اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی  رعایت شده است.

رت­های نر به‏طور تصادفی در گروه‏های 22 تایی، به 3 گروه کنترل، شم و واریکوسل، براساس تعاریف زیر طبقه‏بندی شدند:

گروه کنترل: هیچ گونه عمل جراحی برروی رت‏های نر این گروه انجام نشد. گروه کنترل- شم: تنها لاپارتومی ساده برروی حیوانات این گروه صورت گرفت. گروه واریکوسل: واریکوسل تجربی بر اساس روشTurner  برروی رت‌های نر آزمایشگاهی این گروه، القا شد (9). القا واریکوسل در تمامی رت‏های گروه واریکوسل، به‏وسیله یک اپراتور، با یک روش و شدت و در دمای اتاق (25 درجه سانتی‏گراد) صورت پذیرفت. پس از دو ماه از القا واریکوسل، موش‏های صحرایی هر سه گروه با استفاده از کتامین 10 درصد (آلفاسان‏، هلند) و زایلزین 20 درصد (آلفاسان، هلند) با نسبت 3/1 قربانی شدند.

بررسی وزن بدن، حجم بیضه و طول اپیدیدیم: قبل از بی‏هوشی حیوانات، وزن آنها در هر گروه مورد ارزیابی قرار گرفت. پس از بیهوشی، بیضه و اپیدیدیم از بدن حیوانات خارج شدند. طول اپیدیدیم با استفاده از کولیس ورنیه و حجم بیضه رت‏ها با استفاده از روش ولومتریک (cirtemuloV) بررسی شد. قسمت انتهایی اپیدیدیم به قطعات کوچک تقسیم شدند و به‏مدت 1 ساعت در محیط شست‏وشو اسپرم mrepS atiV (شرکت ایناکلون، ایران) با سرم آلبومین ده درصد در دمای 73 درجهسانتی‏گراد قرار داده شدند. سپس، از اسپرم‏های خارج شده به محیط شست‏وشو اسپرم جهت بررسی پارامترهای اسپرمی، پراکسیداسیون لیپید و تست‏های کروماتین اسپرم استفاده شد.

ارزیابی پارامترهای اسپرمی

ارزیابی تحرک اسپرم: جهت ارزیابی میزان تحرک اسپرم‏ها، یک قطره (5میکرولیتر) ازنمونهرا بر رویلام شیشه‏ایاز قبل گرم شده قرارداده، و پس از لامل‏گذاری، بابزرگ‏نمایی400×  توسطمیکروسکوپ نوری  شمارشصورت گرفت. سپس تعداد 200 اسپرمدر چندینمیداندید میکروسکوپی متفاوت بررسی و تعداد اسپرم‏های دارای تحرک پیش‏رونده و  اسپرم‏های غیرمتحرک شمارش شد (10).

ارزیابی مورفولوژی اسپرم با استفاده از رنگ‏آمیزی ائوزین-نگروزین: در مطالعه حاضر، جهت ارزیابی مورفولوژی طبیعی و غیرطبیعی اسپرم‏ها از رنگ‏آمیزی ائوزین- نگروزین استفاده‏ شد. به‏صورت خلاصه، 20 مایکرولیتر از نمونه شسته شده با 40 مایکرولیتر از ائوزین 1 درصد (سیگما، آمریکا) مخلوط و پس از 5 دقیقه، 60 مایکرولیتر از محلول نگروزین 10 درصد (سیگما، آمریکا) نیز به‏آن اضافه شد. سپس از این مخلوط، اسمیر بر روی لام تهیه شد. درنهایت، 200 اسپرم در هر لام در میدان‏های دید متفاوت با میکروسکوپ نوری عدسی 100× بررسی شد و درصد اسپرم‏های دارای مورفولوژی غیرطبیعی ثبت شدند (11).

ارزیابی آسیب DNA اسپرم با رنگ آمیزی آکریدین ارنج: ارزیابی میزان شکست DNA اسپرم توسط رنگ‏آمیزی آکریدین ارنج صورت پذیرفت. آکریدین ارنج، به‏درون سلول نفوذ می‏کند و به DNA سلول متصل می‏شود. هنگامی‏که این رنگ به DNA دو رشته‏ای متصل می‏شد، رنگ فلورسنت سبز رنگ از خود ساطع می‏کند که نشانه سلامت DNA می‏باشد. درمقابل، این رنگ، هنگام اتصال به DNA تک رشته‏ای (شکسته شده یا آسیب دیده)، رنگ فلورسنت قرمز رنگ از خود ساطع می‏کند (10). از نمونه شسته شده توسط بافر فسفات سالین (PBS: Phosphate Buffer Saline)، برروی لام شیشه‏ای اسمیر تهیه شد و اجازه داده شد تا در معرض هوا خشک شود. سپس، اسمیر تهیه شده،با استفاده از محلول فیکساتیوکارنوی (Carnoy) (الکل متانول و اسید استیک گلاسیال به نسبت 3 به 1 به‏مدت حدود 12 ساعت، در دمای آزمایشگاه تثبیت­ شد و سپس توسط بافر فسفات مورد شست‏وشو قرار گرفت. در ادامه، رنگ آکریدین اورانژ (80 میلی‏لیتر اسید استیک 1/0 مولار + 5 میلی‏مولار NaH2PO4 3/0 مولار با غلظت نهایی 19/0 درصد در 5/2 pH=) (مرک، آلمان) تازه تهیه شده به‏مدت 90 دقیقه برروی لام قرار داده شد و به‏دنبال آن مجددا به‏وسیله بافر فسفات سالین شست‏وشو داده شد. لام‏های رنگ‏آمیزی شده با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس (BX51 TRF، المپیوس، ژاپن) با فیلتر 460 نانومتر و بزرگ‏نمایی 1000× بررسی شد. برروی هر لام 200 اسپرم شمارش و درصد اسپرم‏های سبز رنگ (دارای DNA سالم) و اسپرم‏های قرمز رنگ (دارای DNA آسیب دیده) ثبت شد (11).

ارزیابی میزان هیستون باقیمانده اسپرم با استفاده از رنگ آمیزی آنیلین بلو:در آخرین مرحله اسپرمیوژنز، هیستون‏ها توسط پروتامین‏ها جایگزین می‏شوند. سلول‏های نابالغ، به ‏علت عدم انجام کامل و صحیح  این جایگزینی، دارای تعداد بیش‏تری از پروتئین هیستون می‏باشند و از آن‏جا که این پروتئین، غنی از  اسید آمینه لیزین می‏باشد دارای خاصیت بازی است که در نتیجه آن می‌تواند با رنگهای اسیدی مانند آنیلین بلو واکنش داده و به‏رنگ آبی درآیند. از این خاصیت شیمیایی اسیدهای آمینه، جهت ارزیابی میزان هیستون باقیمانده در تست رنگ آمیزی آنیلین بلو استفاده می‏شود. براین اساس، اسپرم‏هایی که به رنگ آبی درمی‏آیند نشان‏دهنده اسپرم‏های نابالغ با درصد بالا هیستون اضافی است (01). 

از نمونه شسته شده بر روی لام شیشه‏ای اسمیر تهیه شد و اجازه داده شد که در معرض هوا خشک شوند. محلول گلوتارآلدهید (3 درصد در بافر فسفات سالین، 2/7pH = مرک، آلمان) به‏مدت 30 دقیقه بر روی نمونه‏ها اضافه شد. جهت رنگ‏آمیزی، از محلول آبی آنیلین بلو (غلظت نهایی 5 درصد با 5/3pH=) )سیگما، آمریکا( به‏مدت 5 دقیقه صورت می‏گیرد درنهایت لام‏های رنگ‏آمیزی شده توسط میکروسکوپ نوری با بزرگ‏نمایی 1000× مورد ارزیابی قرار گرفتند. 200 اسپرم برروی هر لام در میدان‏های دید متفاوت شمارش ‏شد. اسپرم‏های آبی رنگ به‏عنوان AB+ ارزیابی شدند که بیان‏گر حضور درصد بالایی از هیستون باقیمانده در کروماتین می‌باشند (12).

ارزیابی میزان کمبود پروتامین اسپرم با استفاده از رنگ‏آمیزی کرومایسین A3: به‏منظور ارزیابی میزان کمبود پروتامین از روش رنگ‏آمیزی ایمنوفلورسنت کرومومایسینA3  (CMA3) استفاده شد. با کمک این روش می‏توان نقص در بسته‏بندی کروماتین، بلوغ هسته و متراکم شدن هسته را مورد ارزیابی قرار داد. کرومایسین A3،  به‏صورت اختصاصی به‏توالی‏های غنی از گوانین–سیتوزین موجود در DNA متصل می‏شد و در واقع برای اتصال به ‏این توالی‏ها با پروتئین پروتامین رقابت می‏کند (10). جهت انجام این رنگ‏آمیزی، به نسبت مساوی فیکساتیو کارنوی، به نمونه‌ی اسپرمی اضافه شد (5 دقیقه، 4 درجه سانتی‏گراد). از سلول‏های فیکس شده برروی لام، اسمیر تهیه شد. لام‏ها توسط رنگ کرومومایسین A3 (با غلظت  25/0 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر با 7=pH در بافر مک الوین حاوی کلرید منیزیوم 10 میلی‏مولار) کاملا پوشانده شدند (90 دقیقه در محیط تاریک). سپس رنگ‏های اضافه از روی لام‏ها با PBS، شسته شدند و پس از لامل‏گذاری، لام‏ها با میکروسکوپ فلورسانس (BX51 TRF، المپیوس، ژاپن) با بزرگ‏نمایی 1000× بررسی شد. برای هر نمونه تعداد 200 اسپرم در چندین میدان دید متفاوت شمارش صورت گرفت و نتایج به‏صورت درصد اسپرم‏های با رنگ زرد درخشان یا +CMA3 که گویای اسپرم‏های دارای کمبود پروتامین هستند، گزارش شد (11).

ارزیابی پراکسیداسیون لیپید با استفاده از رنگ‏آمیزی بادی پای: جهت ارزیابی پراکسیداسیون لیپیدی از رنگ‏آمیزی ایمنوفلورسنت BODIPY- C11 (اینویتروژن، آمریکا) استفاده شد. این رنگ توانایی رنگ‏آمیزی اسیدهای چرب آسیب دیده را در غشا سلول دارد. به‏صورت خلاصه رنگ بادی پای با غلظت نهایی 5 میلی‏مولار به 2 میلیون اسپرم درون یک میکروتیوب تیره اضافه و در 37 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 30 دقیقه نگه‏داری شد. سپس، نمونه‏ها توسط دستگاه فلوسایتومتر FACS Calibur (بکتون دیکسون، آمریکا)، خوانش شد. لازم به‏ذکر است که علاوه ‏بر کنترل منفی، از نمونه کنترل مثبت (اضافه نمودن H₂O₂ به نمونه اسپرمی) نیز استفاده شد (13).

شکل 1 : ارزیابی تستهای عملکردی اسپرم در سه گروه مطالعه : A) درصد هیستون پایدار، B) درصد کمبود پروتامین، C) درصد شکستگی AND اسپرم، D) درصد پراکسیداسیون لیپیدی .*: افزایش معنی دار در گروه واریکوسل نسبت به دو گروه شم و کنترل.  50/0

آنالیز آماری

اطلاعات به‏دست آمده از این مطالعه توسط نرم­افزار آماری  SPSS(ویراست 19) آنالیز شد. جهت بررسی توزیع نرمال داده‌ها، از تست کولموگروف-اسمیرنوف (kolmogorov-smirnov) استفاده شد. سپس داده‌ها توسط روش آماریone way ANOVA، (Tukey post hock)، مورد ارزیابی قرار گرفتند. در صورتی که 05/0p-value< بود، از لحاظ آماری معنی‌دار محسوب شد.

جهت ارزیابی ارتباط میان پارامترهای اسپرمی و تست‌های عملکردی اسپرم (درصد آسیب DNA، درصد کمبود پروتامین، درصد هیستون پایدار و لیپید پراکسیداسیون)، تمامی دادهها تجمیع شدند و ضریب همبستگی پیرسون)nosreaP( بین پارامترهای مورد نظر بررسی شد. جهت بررسی وجود تفاوت معنی‏دار از نظر آماری بین پارامترهای مورد نظر تستdeliat owT ارزیابی شد. درصورتی‏که 50/0<eulav-pبود، از لحاظ آماری معنی‌دار محسوب شد.

نتایج

در این مطالعه، وزن بدن، حجم بیضه و طول اپیدیدیم در بین سه گروه کنترل، شم و واریکوسل مورد مقایسه قرار گرفت. همان‏گونه که در جدول یک نشان داده شده است، میانگین وزن بدن و طول اپیدیدیم بین گروه‏ها اختلاف معنی‏داری از لحاظ آماری ندارد (50/0<eulav-p). حجم بیضه به‏طور معنی‏داری در گروه القا واریکوسل (60/0±60/1) نسبت به گروه کنترل (500/0= eulav-p، 70/0±63/1) و شم (000/0= eulav-p، 60/0±94/1) کاهش یافته است. در رابطه با غلظت، تحرک و مورفولوژی اسپرم، همان‏گونه که در جدول یک نشان داده شده است، میانگین درصد مورفولوژی غیرطبیعی در گروه واریکوسل (000/0= eulav-p، 49/1±03/71) و نیز تحرک اسپرم  (000/0= eulav-p، 93/2±40/83) به‏طور معنی‏داری بالاتر از مورفولوژی غیرطبیعی (38/0±22/9) و نیز تحرک اسپرم (56/3±16/96) در گروه کنترل و هم‏چنین، درصد مورفولوژی غیرطبیعی در گروه شم (16/1±04/01، 700/0= eulav-p) و درصد تحرک (11/4±11/16، 000/0= eulav-p) نیز در این گروه نسبت به گروه واریکوسل تفاوت معنی‏داری را نشان می‌دهد. به‏علاوه میانگین درصد غلظت اسپرم به‏طور معنی‏داری در گروه القا واریکوسل (31/7±51/85) پایین‏تر از گروه کنترل (600/0= eulav-p، 89/7±18/19) می‏باشد.

جدول 1: مقایسه وزن بدن، حجم بیضه، طول اپیدیدیم . پارامترهای اسپرمی بین گروه‏های کنترل، شم و واریکوسل (تعداد در هر گروه 22 است)

حروف مشابه نشان دهنده اختلاف معنی‏دار می باشند. 05/0p-value≤ محاسبه شد.

در این مطالعه، سلامت کروماتین اسپرم با استفاده از رنگ‏آمیزی‏های آکریدین ارنج ، آنیلین بلو و کرومایسین A3 مورد بررسی قرار گرفت، هم‏چنین وضعیت استرس اکسیداتیو در سلول‏های اسپرمی از طریق بررسی پراکسیداسیون لیپید مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج در شکل یک نشان می‏دهد که در گروه القا واریکوسل آسیب DNA اسپرم (42/2±39/61)، میزان هیستون باقی‏مانده (54/4±76/53)، کمبود پروتامین (15/1±10/23) و درصد پراکسیداسیون لیپید (97/2±57/46) در اسپرم، بیش‏تر از میانگین درصد آسیب DNA (000/0=p-value، 57/2± 72/20)، میزان هیستون باقی‏مانده (000/0=p-value، 87/4 ± 12/29)، کمبود پروتامین (006/0=p-value، 39/1±57/17)و پراکسیداسیون لیپید اسپرم (000/0=p-value، 72/1±33/12) در گروه کنترل می‏باشد. آسیب DNA اسپرمی (000/0=p-value، 30/2±66/29)، میزان هیستون باقیمانده اسپرمی (000/0=p-value، 27/2±02/26)، کمبود پروتامین اسپرم (003/0=p-value، 57/1±23/16) و درصد پراکسیداسیون لیپید اسپرم (000/0=p-value،55/1 ± 90/14) در گروه شم نیز به‏صورت معنی‌داری پایین تر از گروه واریکوسل می‏باشد.

دراین مطالعه هم‏چنین، ارتباط میان پارامترهای اسپرمی و درصد آسیب DNA، کمبود پروتامین، درصد هیستون پایدار و لیپید پراکسیداسیون مورد بررسی قرار گرفت (جدول 2). غلظت اسپرم با درصد آسیبDNA  (000/0=,p-value778/0-=r)، میزان هیستون پایدار (000/0=,p-value847/0-=r) و لیپید پراکسیداسیون (000/0=,p-value584/0-=r) ارتباط معکوس و معنی‏داری را نشان می‏دهد. اما با میزان کمبود پروتامین ارتباط معنی‏داری را نشان نمی‏دهد. میزان تحرک اسپرم، با درصد آسیب (000/0=,p-value781/0-=r) DNA، کمبود پروتامین (021/0=,p-value300/0-=r)، درصد هیستون پایدار (000/0=,p-value661/0-=r) و لیپید پراکسیداسیون (000/0=,p-value704/0=r) ارتباط معکوس و معنی‏داری را نشان می‌دهد.

هم‏چنین بررسی ارتباط میان درصد موفولوژی غیرطبیعی و درصد آسیب DNA (000/0=,p-value670/0=r)، درصد هیستون پایدار (000/0=,p-value650/0=r) و لیپید پراکسیداسیون (000/0=,p-value488/0-=r) ارتباط مستقیم و معنی‏داری را نشان می‌دهد اما بررسی آن با میزان کمبود پروتامین، ارتباط معنی‏داری را نشان نمی‌دهد.

جدول 2: ارزیابی ارتباط میان پارامترهای اسپرمی با آسیبDNA، کمبود پروتامین، هیستون پایدار و درصد لیپیدپراکسیداسیون.

برای بررسی ضریب همبستگی از تست پیرسون(Pearson) ، استفاده گردید. در صورتی که p-value ≤ 0.05 بود، از لحاظ آماری معنی‌دار محسوب شد.

بحث

واریکوسل یکی از شایع‏ترین علت‌های ناباروری اولیه و ثانویه در مردان است که با افزایش سن، میزان شیوع آن بالا می‏رود. مطالعات پیشین اذعان داشته‏اند که شیوع واریکوسل در مردان به‏ازای هر دهه از حیات فرد، به‏میزان 10 درصد افزایش می­یابد و این میزان در دهه­ی هشتم حیات فرد به 75 درصد می­رسد. به‏علاوه، محققان نشان داده‏اند که تغییرات هورمونی نیز وابسته به سن می‏باشند به‏طوری‏که در مردان به‏طورسالانه بین یک تا دو درصد سطح تستوسترون سرم کاهش می­یابد و این کاهش سطح سرم با افزایش سن می‏تواند بر روند اسپرماتوژنز، تولید و تمایز اسپرم تاثیر بگذارد (14). چنان‏چه بیان شد به‏علت شیوع بالای این نوع ناباروری، محققان و متخصصان در تلاش برای بررسی اتیولوژی این بیماری می‏باشند (15) و در این زمینه مطالعات گوناگونی تاکنون صورت گرفته است. باتوجه به ‏این‏که جهت بررسی اتیولوژی واریکوسل، تحقیق بر روی نمونه‏های حیوانی می‏تواند نتایج پایدارتری را برای محققان فراهم کند، در این مطالعه سعی بر آن شد که با ایجاد مدل واریکوسل در رت‏های صحرایی، وضعیت کروماتین اسپرم که نقش اساسی و مهمی را در نیمی از ژنوم جنین آینده می‏تواند ایفا نماید، بررسی شد. در این مطالعه، با استفاده از تعداد بالای حیوانات آزمایشگاهی در مقایسه با مطالعات پیشین‏، علاوه بر بررسی تاثیر القا واریکوسل بر پارامترهای اسپرمی، هدف مطالعه، بررسی القا واریکوسل برروی سلامت کروماتین اسپرم بوده است. نتایج این مطالعه حاکی از آن است که غلظت و تحرک اسپرم به‏طور معنی‏داری روند کاهشی، و درصد مورفولوژی غیرطبیعی به‏طور معنی‏داری روند افزایشی را در رت‏های القا واریکوسل نسبت به کنترل و سم داشته‏اند. بنابراین این نتایج مطابق با نتایج مدل‏های انسانی و حیوانی است که واریکوسل می‏تواند بر روند طبیعی اسپرماتوژنز اثر گذارد و منجر به کاهش تعداد، ایجاد آسیب و افزایش اسپرم غیرطبیعی به‏همراه کاهش تحرک شد (16-19).  

علت اصلی آسیب وارده به سلول‌های اسپرم در طول فرآیند اسپرماتوژنز در افراد واریکوسل افزایش دمای بیضه عنوان شده است. براساس مطالعات، ارتباط مستقیم بین واریکوسل و افزایش دمای کیسه بیضوی در مطالعات حیوانی و انسانی، نتایج متناقضی را نشان می­دهد. شاید این نتایج به‏این دلیل است که دمای بیضه در مطالعات حیوانی به­طور مستقیم، ولی در مطالعات بالینی دمای اسکروتوم بررسی می‏شد (16). از طرفی در انسان درجات متفاوتی از شدت واریکوسل دیده می‏شود که با زمینه‏های ژنتیکی‏، تغذیه و سبک زندگی متفاوت دارای اثرات گوناگونی بر روند اسپرماتوژنز و باروری هستند. در این زمینه، مطالعات نشان داده‏اند که القای واریکوسل در بیضه­ی میمون رزوس و موش­های نر، سبب اختلال در فرآیند اسپرماتوژنز شده، و دمای بیضه به‏اندازه­ی یک درجه­ی سانتی­گراد نسبت به گروه کنترل افزایش می‏یابد هم‏چنین درمان واریکوسل در این حیوانات منجر به بازگشت دمای بیضه به حالت اولیه شده است (16، 21). برخی مطالعات اذعان داشته‏اند که دمای اسکروتوم در مردان نابارور با واریکوسل بیشتر از افراد بارور است، در حالی‏که، تعدادی از مطالعات نشان داده­اند که واریکوسل سبب اختلال در فرایند اسپرماتوژنز و پارامتر­های اسپرمی می­شود، ولی تفاوتی در دمای اسکروتوم در مردان مبتلا به واریکوسل و بدون واریکوسل وجود ندارد (22، 23).

محققان این‏گونه بیان داشته‏اند که افزایش دما بیضه در واریکوسل، احتمالا موجب ایجاد استرس گرمایی می‏شد و در نتیجه موجب افزایش پروتئین‌های شوک حرارتی (Heat shock protein) می‏شود. این پروتئین‏ها، در ترمیم پروتئین‏های تخریب شده در اثر استرس نقش ایفا می‌کنند (24، 25). این پروتئین‏ها براساس وزن مولکولی به 4 گروهHSP90 ،HSP70،HSP60  وHSP27  تقسیم می‏شوند. براساس مطالعات پیشین،  HSPA2که مهم‏ترین عضو خانواده HSP70 می‌باشد در بیضه و اسپرم حضور دارد و با بلوغ، عمل‏کرد و باروری اسپرم ارتباط دارد (11، 26). افزایش دما هم‏چنین می‏تواند موجب ایجاد استرس اکسیداتیو به‏واسطه افزایش تولید گونه‏های فعال اکسیژن بیش از میزان فیزیولوزیک توسط میتوکندری سلول اسپرم شد. استرس اکسیداتیو ایجاد شده متعاقب مقادیر بالای گونه‏های فعال اکسیژن، می‏تواند به‏علت اکسیداسیون اسیدهای چرب موجود در غشای اسپرمها و بهویژه در ناحیه دم، موجب ایجاد آسیب به ساختار و عمل‏کرد اسپرم ازجمله مورفولوژی طبیعی و تحرک می‌شد (8). هم‏چنین  استرس‏های اکسیداتیو، می‏تواند با تاثیر بر روی میتوکندری اسپرم و راه‏اندازی آبشار آپوپتوزیس تاثیر مستقیم بر روی AND  اسپرم و آسیب به ساختار آن شد که این آسیب نیز می‌تواند موجب کاهش عمل‏کرد اسپرم ‌شود. در مطالعات پیشین افزایش میزان آسیب AND متعاقب افزایش استرس اکسیداتیو در افراد واریکوسلی گزارش شده است (02). در مطالعه حاضر نیز، یکپارچگی کروماتین اسپرم به‏وسیله تست رنگ‏آمیزی آکریدین ارنج مورد بررسی قرار گرفت که در گروه واریکوسل به‏طور معنی‏داری میزان شکست AND نسبت به گروه شم و کنترل افزایش داشته است که در راستای مطالعات پیشین ذکر شده می‏باشد. سلامت کروماتین اسپرم همانند سلامت کروماتین تخمک، نقش بسزایی در فرآیندهای تولید­مثل ازجمله لقاح، تکوین جنین، کیفیت زندگی فرزندان متولد شده و به­طور کلی تداوم گونه دارد. حتی اگر کروماتین اسپرم در یک حالت کاملا متراکم بسته­بندی شود، هنوز هم می­تواند تحت تاثیر آسیب­های مختلف قرار گیرد (27). مطالعات متعددی نشان داده است که آسیبAND اسپرم می­تواند نتایج تولید­مثل را از طریق تداخل در تکوین جنینی، افزایش خطر مرگ نوزادان، ازدیاد بیماری­هایی مانند سرطان در دوران کودکی، ناباروری در فرزندان و وقوع خود­به­خودی بیماری­های ژنتیکی در لقاح طبیعی هم‏چنین در لقاح حاصل از تکنیک‏های کمک باروری تحت تاثیر قرار دهد (03-82).

با توجه به تاثیر استرس اکسیداتیو بر سلامت کروماتین اسپرم و هم‏چنین ارتباطی که بین بسته‏بندی غیرطبیعی کروماتین و آسیب DNA وجود دارد، در مطالعه حاضر، به‏طور همزمان سلامت DNA، کمبود پروتامین، هیستون باقی‏مانده و استرس اکسیداتیو در شرایط واریکوسل بررسی شد. نتایج نشان می دهد که میانگین فاکتورهای قید شده به‏طور معنی‏داری در رت‏های واریکوسل در مقایسه با رت‏های کنترل و سم، متفاوت است و بیانگر کاهش سلامت DNA اسپرم در گروه واریکوسل متعاقب افزایش میزان لیپید پراکسیداسیون سلولی می‌باشد. هم‏چنین، کاهش پارامترهای اسپرمی و حجم بیضه، در گروه واریکوسل نسبت به گروه سم و کنترل نیز موید القا واریکوسل در گروه‏های مورد بررسی می‌باشد. در ادامه، ارتباط میان پارامترهای اسپرمی و نیز آسیب DNA اسپرم، کمبود پروتامین، هیستون باقیمانده و لیپید پراکسیداسیون مورد ارزیابی قرار گرفت و مشاهده شد که ارتباط قوی و معکوسی میان کاهش کیفیت پارامترهای اسپرمی (غلظت، تحرک و مورفولوژی غیرطبیعی اسپرم) و آسیب DNA اسپرم و میزان هیستون باقیمانده و پراکسیداسیون لیپید وجود دارد و به‏روشنی بیان می‌دارد که هر چه میزان سلامت کروماتین اسپرم کاهش یابد، کیفیت پارامترهای اسپرمی نیز کاهش پیدا می‌کند که باتوجه به‏تعداد بالا حیوانات و  زمینه ژنتیکی یکسان حیوانات مورد مطالعه، این نتایج قابل اعتماد می‌باشند و نیز هدف مطالعه را تامین و تایید می‌نماید. 

مطالعات مختلفی نشان داده­اند که افزایش سطح استرس در افراد با واریکوسل، می‏تواند سبب ایجاد آسیب DNA اسپرم شود. اگرچه میزان دقیق آسیب DNA، به‏روش ارزیابی آسیب DNA بستگی دارد. آسیب DNA اسپرم ممکن است در روند اسپرماتوژنز در داخل بیضه یا در طول بلوغ اسپرم و یا انتقال آن رخ دهد. به‏علاوه اخیرا هم نشان داده شده است که ارتباط معنی‏داری بین افزایش استرس اکسیداتیو و آسیب DNA اسپرم با شرایط القا واریکوسل دارد (33-31).

اخیرا مشخص شده که آسیب­های اکسیداتیو DNA اسپرم به­دلیل لوکوسیتواسپرمی همراه با عفونت و التهاب، اختلالات ژنتیکی و متابولیسمی نظیر دیس لیپیدمیا(dyslipidemia)  و بیماری­هایی نظیر واریکوسل، در معرض قرار گرفتن با مواد سمی، مواد مخدر، داروها، سیگار کشیدن توتون و تنباکو یا عوامل تنش‏زای فیزیکی مانند گرما، اشعه­ی یونیزان و ماکروویو رخ دهد که پیامد نهایی آن می­تواند کاهش میزان لقاح، تکوین جنین، سقط جنین و حتی تولد فرزندان ناقص باشد (5، 30). 

از نقاط قوت این مطالعه می‌توان به‏تعداد بالای نمونه‏ها در هر گروه برشمرد که تاکنون در مطالعات شبیه‏سازی شده برای واریکوسل این تعداد بررسی نشده است و نتایج مطالعه را قابل اعتماد می‏سازد. همچنین، بررسی همزمان لیپید پراکسیداسیون لیپیدی و تست‌های بررسی سلامت DNA، دیدگاه روشنی از تاثیر واریکوسل برروی لیپید پراکسیداسیون اسیدهای چرب غیراشباع و در نتیجه آن کاهش پارامترهای اسپرمی و آسیبDNA می‏باشد. از نقاط ضعف مطالعه حاضر نیز می‌توان به عدم اندازه‌گیری دمای بیضه در گروه‏ها اشاره کرد.  

نتیجه­گیری

از نتایج مطالعه کنونی می‏توان این‏گونه استنباط نمود که شرایط واریکوسل با افزایش استرس اکسیداتیو همراه است که این شرایط پاتولوژیک می‏تواند بر عملکرد اسپرم تاثیر منفی داشته باشد و منجر به آسیب DNA در اسپرم شد. افزایش آسیب‏های اسپرمی می‏تواند سلول را به‏سمت آپوپتوزیس پیش ببرد و تعداد اسپرم تولید و تمایز یافته نسبت به وضعیت طبیعی کاهش یابد و این اسپرم‏ها با درصد بالایی از مورفولوژی غیرطبیعی و کاهش تحرک مواجه هستند. لذا افراد نابارور با واریکوسل به‏دلیل کاهش تعداد اسپرم کارا با کاهش پتانسیل باروری مواجه هستند. از مزایای مهم این مطالعه می‏توان به اثبات این تئوری در وضعیت هموژن بدون زمینه ژنتیک متفاوت در رت‏های صحرایی با تعداد بالایی از رت در هر گروه آزمایشگاهی، اشاره نمود.

تشکر وقدردانی

مقاله حاضر برگرفته از طرح مصوب ما بین دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات و پژوهشگاه رویان اصفهان با شماره قرارداد 2198/19/98/ص تصویب شده در تاریخ 13/6/ 1398می‏باشد. در پایان جا دارد از زحمات گروه آندرولوژی پژوهشگاه رویان اصفهان تقدیر و تشکر به‏عمل آید.