فصلنامه

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی، تهران، ایران

2 پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست فنآوری جهاد دانشگاهی، مرکز تحقیقات پزشکی تولید مثل، گروه زیست فنآوری جانوری، اصفهان، ایران

چکیده

هدف: هدف از مطالعه حاضر آن است که با استفاده از مزیت کار با حیوانات آزمایشگاهی، تاثیر القا واریکوسل به‏صورت تجربی در رت‏های نر، بر روی سلامت DNA بررسی گردد.
مواد و روش‏ها: 66 رت نر نژاد ویستار در سه گروه کنترل، شم و واریکوسل تقسیم گردیدند. دو ماه پس از القا واریکوسل، تمامی رت‏ها آسان‌کشی شده و پارامترهای اسپرمی، آسیب DNA اسپرم، میزان هیستون‏های پایدار، جایگزینی هیستون با پروتامین و نیز درصد لیپید پراکسیداسیون مورد بررسی قرار گرفتند.
نتایج: اندازه‏گیری وزن حیوانات و طول اپیدیدیم در بین گروه‏ها تغییر معنی‌داری نشان نمی‌دهد، اما حجم بیضه و پارامترهای اسپرمی میان گروه‌ها تفاوت معنی‌داری دارد. افزایش معنی‌دار میزان پراکسیداسیون لیپیدی، درصد جایگزینی هیستون با پروتامین، درصد هیستون‏های پایدار و درصد شکست DNA، در گروه واریکوسل مشاهده شد.
نتیجه‏گیری: بر اساس مطالعات قبلیو نتایج مطالعه حاضر، به نظر می‌رسد افزایش استرس اکسیداتیو در پی القا واریکوسل موجب پراکسیداسیون لیپیدی، ایجاد آسیب DNA در اسپرم، و به‏دنبال آن کاهش پارامترهای اسپرمی می‌شود. در مطالعه حاضر، با استفاده از مزیت ژنتیک یکسان موش‌های صحرایی و تعداد بالا آن‏ها نشان دادیم که واریکوسل بر روی سلامت کروماتین و DNA اثر دارد و باید قبل از اقدام برای باروری در انسانها درمان گردد.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Evaluation of Sperm DNA Integrity in Varicecolized Rat models

نویسندگان [English]

  • E Shaygannia 1
  • MH Nasr-Esfahani 2
  • F Sotoodehnejadnematalahi 1
  • K Parivar 1

1 Department of biology, School of basic sciences, Science and research branch, Islamic Azad university, Tehran, Iran

2 Department of Animal Biotechnology, Reproductive Biomedicine Research Center, Royan Institute for Biotechnology, ACECR, Isfahan, Iran.

چکیده [English]

Aim: The current study aims to utilize varicocele induction in male rat models to evaluate effect and impact of varicocele on DNA integrity.
 
Material and Methods: 66 male Wistar rats were divided into 3 groups: control, sham and varicocele-induced (VI). 2 months post-VI, Sperm parameters, percentage of sperm DNA damage, persistent histone and lipid peroxidation were assessed.
 
Results: Animal weight and their epididymal length shown no significant changes but there were significant differences in testis volume and sperm parameters between VI group versus control and sham groups. Similarly, increased level of DNA damage, persistent histone and lipid peroxidation were evaluated, and compared between varicocele and control group.
 
Conclusion: Based on literature and the result of this study, it is likely that increase oxidative stress following varicocele induction leads to lipide peroxidation, DNA damages and reduced sperm parameters. In the current study, by taking the advantage of homogenous genetic background and high number of animals, we showed that varicocele have damaging effect on DNA and chromatin integrity and should be reversed in human before aiming for pregnancy.
 
 

کلیدواژه‌ها [English]

  • DNA Damages
  • lipid peroxidations
  • Oxidative stresses
  • Varicocele

مقدمه

واریکوسل، به ‏اتساع غیرطبیعی و بیش از حد ورید بیضوی اطلاق و از مهم‏ترین علل ناباروری مردان محسوب می‏شد. از نظر شیوع، این بیماری در 35 درصد از افراد، با ناباروری اولیه و 85 درصد افراد با ناباروری ثانویه گزارش شده است و بدین سبب جز شایع‏ترین علل ناباروری مردان به‏شمار می‌آید (1). واریکوسل، از جمله بیماری‏هایی است که می‌تواند در نهایت منجر به ناباروری شد. این اختلال، در بیش‏تر مواقع به‏صورت یک‏طرفه در ورید بیضوی چپ دیده می‏شود.  دلیل آن می‏تواند اختلاف در ساختار آناتومیک سیاهرگ‏های  اسپرماتیک چپ و راست و اختلاف آن‏ها در الگوی تخلیه وریدی و هم‏چنین طولانی‌تر بودن ورید اسپرماتیک در سمت چپ نسبت به ورید اسپرماتیک راست باشد. بااین‏حال، در مواردی نیز واریکوسل را می‏توان به‏صورت دو طرفه مشاهده نمود (2).

مطالعات چنین نشان داده‏اند که اتساع ورید اسپرماتیک در بیضه در شرایط واریکوسل، موجب اختلال در گردش خون وریدی و در نتیجه، افزایش دما و کمبود اکسیژن‏رسانی در بیضه می‏شد که متعاقب آن، گونه‏های فعال اکسیژن (ROS) تولید می‏شوند. پیامد افزایش بیش از حد ROS می‏تواند ایجاد وضعیت استرس اکسیداتیو باشد (3).

استرس اکسیداتیو می‌تواند اثرات مخربی بر روی ماکرومولکول‏های سلولی از جمله پروتئین‏ها، لیپیدها و اسیدهای نوکلئیک داشته باشد (4). مطالعات متعددی در این زمینه، نشان داده‏اند که ROSها با حمله به اسیدهای نوکلئیک، می‏توانند موجب شکست در ساختار دو رشته‏ای DNA شوند. افزایش بیش از حد ROSها در سلول اسپرم، به‏دلیل وجود اسیدهای چرب غیراشباع بالا،  حجم کم فضای سیتوپلاسمی و هم‏چنین عدم‏حضور آنزیم‏های ترمیم‏کننده DNA، می‏تواند این سلول را مستعد آسیب بیشتر کرده و پیامدهای مخربی را به‏جای گذارد که حتی اثرات آن تا نسل‏های بعد قابل پیگیری می‌باشد (5). علاوه‏ بر تولید بیش از حد ROS که می‏تواند موجب آسیب DNA شد، کاهش یا عدم جایگزینی پروتامین‏ها با هیستون‏ها در طی فرآیند اسپرمیوژنز، که در شرایط طبیعی می‏تواند منجر به ایجاد تراکم بالا در کروماتین اسپرم شود، نیز می‏‏تواند منجر به آسیب DNA شود (6). 

مطالعات پیشین نشان داده‏اند که سطوح بالای استرس اکسیداتیو می‏تواند القا پراکسیداسیون لیپید در غشای پلاسمایی اسپرم را به‏همراه داشته باشد که با کاهش تحرک اسپرم و کاهش اتصال اسپرم به تخمک مرتبط است. در این زمینه، احتمال داده شده که  استرس اکسیداتیو به پروتئین‏های درگیر در فرآیند اتصال اسپرم و تخمک آسیب می‏رساند و متعاقبا اسپرم توانایی اتصال به تخمک را از دست می‌دهد و در نهایت منجر به کاهش موفقیت لقاح و باروری می‌شود (7، 8).

 با توجه به این‏که در شرایط واریکوسل، ایجاد وضعیت استرس دمایی بیضه می‏تواند موجب القای استرس اکسیداتیو شود و پیامد نهایی این استرس‏ها کاهش کیفیت اسپرم و پتانسیل باروری می‌باشد، در این مطالعه سعی برآن شد که برخلاف مطالعات انسانی که جمعیت هتروژنی از مردان با واریکوسل در درجات متفاوت با زمینه‏های ژنتیکی متفاوت مورد بررسی قرار می‏گیرند، در جمعیت هموژن ژنتیکی از موش‏های صحرایی نژاد ویستار (Wistar) القا واریکوسل صورت پذیرد و علاوه بر پارامترهای اسپرمی، چهار پارامتر اصلی در شرایط آسیب کروماتین اسپرم ازجمله سطح استرس اکسیداتیو از طریق بررسی لیپید پراکسیداسیون ، آسیب DNA، کمبود پروتامین اسپرم و هیستون باقی‏مانده در کروماتین اسپرم مورد بررسی قرار گیرد.

 

مواد و روش‌ها

حیوان و تیمارها: مطالعه حاضر، از نوع کارآزمایی شاهددار، بر روی 66  موش صحرایی نر آزمایشگاهی (پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست فناوری، اصفهان، ایران)، نژاد ویستار در محدوده وزن (200-150 گرم) صورت پذیرفت. نگه‏داری حیوانات در مرکز پرورش حیوانات آزمایشگاهی پژوهشکده زیست فناوری تحت شرایط استاندارد (12 ساعت تاریکی و 12 ساعت نور و دمای 20 تا  25 درجه سانتی‏گراد) انجام شد. در این پژوهش (IR.ACECR.ROYAN.REC.1397.149) کلیه موازین اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی  رعایت شده است.

رت­های نر به‏طور تصادفی در گروه‏های 22 تایی، به 3 گروه کنترل، شم و واریکوسل، براساس تعاریف زیر طبقه‏بندی شدند:

گروه کنترل: هیچ گونه عمل جراحی برروی رت‏های نر این گروه انجام نشد. گروه کنترل- شم: تنها لاپارتومی ساده برروی حیوانات این گروه صورت گرفت. گروه واریکوسل: واریکوسل تجربی بر اساس روشTurner  برروی رت‌های نر آزمایشگاهی این گروه، القا شد (9). القا واریکوسل در تمامی رت‏های گروه واریکوسل، به‏وسیله یک اپراتور، با یک روش و شدت و در دمای اتاق (25 درجه سانتی‏گراد) صورت پذیرفت. پس از دو ماه از القا واریکوسل، موش‏های صحرایی هر سه گروه با استفاده از کتامین 10 درصد (آلفاسان‏، هلند) و زایلزین 20 درصد (آلفاسان، هلند) با نسبت 3/1 قربانی شدند.

بررسی وزن بدن، حجم بیضه و طول اپیدیدیم: قبل از بی‏هوشی حیوانات، وزن آنها در هر گروه مورد ارزیابی قرار گرفت. پس از بیهوشی، بیضه و اپیدیدیم از بدن حیوانات خارج شدند. طول اپیدیدیم با استفاده از کولیس ورنیه و حجم بیضه رت‏ها با استفاده از روش ولومتریک (cirtemuloV) بررسی شد. قسمت انتهایی اپیدیدیم به قطعات کوچک تقسیم شدند و به‏مدت 1 ساعت در محیط شست‏وشو اسپرم mrepS atiV (شرکت ایناکلون، ایران) با سرم آلبومین ده درصد در دمای 73 درجهسانتی‏گراد قرار داده شدند. سپس، از اسپرم‏های خارج شده به محیط شست‏وشو اسپرم جهت بررسی پارامترهای اسپرمی، پراکسیداسیون لیپید و تست‏های کروماتین اسپرم استفاده شد.

ارزیابی پارامترهای اسپرمی

ارزیابی تحرک اسپرم: جهت ارزیابی میزان تحرک اسپرم‏ها، یک قطره (5میکرولیتر) ازنمونهرا بر رویلام شیشه‏ایاز قبل گرم شده قرارداده، و پس از لامل‏گذاری، بابزرگ‏نمایی400×  توسطمیکروسکوپ نوری  شمارشصورت گرفت. سپس تعداد 200 اسپرمدر چندینمیداندید میکروسکوپی متفاوت بررسی و تعداد اسپرم‏های دارای تحرک پیش‏رونده و  اسپرم‏های غیرمتحرک شمارش شد (10).

ارزیابی مورفولوژی اسپرم با استفاده از رنگ‏آمیزی ائوزین-نگروزین: در مطالعه حاضر، جهت ارزیابی مورفولوژی طبیعی و غیرطبیعی اسپرم‏ها از رنگ‏آمیزی ائوزین- نگروزین استفاده‏ شد. به‏صورت خلاصه، 20 مایکرولیتر از نمونه شسته شده با 40 مایکرولیتر از ائوزین 1 درصد (سیگما، آمریکا) مخلوط و پس از 5 دقیقه، 60 مایکرولیتر از محلول نگروزین 10 درصد (سیگما، آمریکا) نیز به‏آن اضافه شد. سپس از این مخلوط، اسمیر بر روی لام تهیه شد. درنهایت، 200 اسپرم در هر لام در میدان‏های دید متفاوت با میکروسکوپ نوری عدسی 100× بررسی شد و درصد اسپرم‏های دارای مورفولوژی غیرطبیعی ثبت شدند (11).

ارزیابی آسیب DNA اسپرم با رنگ آمیزی آکریدین ارنج: ارزیابی میزان شکست DNA اسپرم توسط رنگ‏آمیزی آکریدین ارنج صورت پذیرفت. آکریدین ارنج، به‏درون سلول نفوذ می‏کند و به DNA سلول متصل می‏شود. هنگامی‏که این رنگ به DNA دو رشته‏ای متصل می‏شد، رنگ فلورسنت سبز رنگ از خود ساطع می‏کند که نشانه سلامت DNA می‏باشد. درمقابل، این رنگ، هنگام اتصال به DNA تک رشته‏ای (شکسته شده یا آسیب دیده)، رنگ فلورسنت قرمز رنگ از خود ساطع می‏کند (10). از نمونه شسته شده توسط بافر فسفات سالین (PBS: Phosphate Buffer Saline)، برروی لام شیشه‏ای اسمیر تهیه شد و اجازه داده شد تا در معرض هوا خشک شود. سپس، اسمیر تهیه شده،با استفاده از محلول فیکساتیوکارنوی (Carnoy) (الکل متانول و اسید استیک گلاسیال به نسبت 3 به 1 به‏مدت حدود 12 ساعت، در دمای آزمایشگاه تثبیت­ شد و سپس توسط بافر فسفات مورد شست‏وشو قرار گرفت. در ادامه، رنگ آکریدین اورانژ (80 میلی‏لیتر اسید استیک 1/0 مولار + 5 میلی‏مولار NaH2PO4 3/0 مولار با غلظت نهایی 19/0 درصد در 5/2 pH=) (مرک، آلمان) تازه تهیه شده به‏مدت 90 دقیقه برروی لام قرار داده شد و به‏دنبال آن مجددا به‏وسیله بافر فسفات سالین شست‏وشو داده شد. لام‏های رنگ‏آمیزی شده با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس (BX51 TRF، المپیوس، ژاپن) با فیلتر 460 نانومتر و بزرگ‏نمایی 1000× بررسی شد. برروی هر لام 200 اسپرم شمارش و درصد اسپرم‏های سبز رنگ (دارای DNA سالم) و اسپرم‏های قرمز رنگ (دارای DNA آسیب دیده) ثبت شد (11).

ارزیابی میزان هیستون باقیمانده اسپرم با استفاده از رنگ آمیزی آنیلین بلو:در آخرین مرحله اسپرمیوژنز، هیستون‏ها توسط پروتامین‏ها جایگزین می‏شوند. سلول‏های نابالغ، به ‏علت عدم انجام کامل و صحیح  این جایگزینی، دارای تعداد بیش‏تری از پروتئین هیستون می‏باشند و از آن‏جا که این پروتئین، غنی از  اسید آمینه لیزین می‏باشد دارای خاصیت بازی است که در نتیجه آن می‌تواند با رنگهای اسیدی مانند آنیلین بلو واکنش داده و به‏رنگ آبی درآیند. از این خاصیت شیمیایی اسیدهای آمینه، جهت ارزیابی میزان هیستون باقیمانده در تست رنگ آمیزی آنیلین بلو استفاده می‏شود. براین اساس، اسپرم‏هایی که به رنگ آبی درمی‏آیند نشان‏دهنده اسپرم‏های نابالغ با درصد بالا هیستون اضافی است (01). 

از نمونه شسته شده بر روی لام شیشه‏ای اسمیر تهیه شد و اجازه داده شد که در معرض هوا خشک شوند. محلول گلوتارآلدهید (3 درصد در بافر فسفات سالین، 2/7pH = مرک، آلمان) به‏مدت 30 دقیقه بر روی نمونه‏ها اضافه شد. جهت رنگ‏آمیزی، از محلول آبی آنیلین بلو (غلظت نهایی 5 درصد با 5/3pH=) )سیگما، آمریکا( به‏مدت 5 دقیقه صورت می‏گیرد درنهایت لام‏های رنگ‏آمیزی شده توسط میکروسکوپ نوری با بزرگ‏نمایی 1000× مورد ارزیابی قرار گرفتند. 200 اسپرم برروی هر لام در میدان‏های دید متفاوت شمارش ‏شد. اسپرم‏های آبی رنگ به‏عنوان AB+ ارزیابی شدند که بیان‏گر حضور درصد بالایی از هیستون باقیمانده در کروماتین می‌باشند (12).

ارزیابی میزان کمبود پروتامین اسپرم با استفاده از رنگ‏آمیزی کرومایسین A3: به‏منظور ارزیابی میزان کمبود پروتامین از روش رنگ‏آمیزی ایمنوفلورسنت کرومومایسینA3  (CMA3) استفاده شد. با کمک این روش می‏توان نقص در بسته‏بندی کروماتین، بلوغ هسته و متراکم شدن هسته را مورد ارزیابی قرار داد. کرومایسین A3،  به‏صورت اختصاصی به‏توالی‏های غنی از گوانین–سیتوزین موجود در DNA متصل می‏شد و در واقع برای اتصال به ‏این توالی‏ها با پروتئین پروتامین رقابت می‏کند (10). جهت انجام این رنگ‏آمیزی، به نسبت مساوی فیکساتیو کارنوی، به نمونه‌ی اسپرمی اضافه شد (5 دقیقه، 4 درجه سانتی‏گراد). از سلول‏های فیکس شده برروی لام، اسمیر تهیه شد. لام‏ها توسط رنگ کرومومایسین A3 (با غلظت  25/0 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر با 7=pH در بافر مک الوین حاوی کلرید منیزیوم 10 میلی‏مولار) کاملا پوشانده شدند (90 دقیقه در محیط تاریک). سپس رنگ‏های اضافه از روی لام‏ها با PBS، شسته شدند و پس از لامل‏گذاری، لام‏ها با میکروسکوپ فلورسانس (BX51 TRF، المپیوس، ژاپن) با بزرگ‏نمایی 1000× بررسی شد. برای هر نمونه تعداد 200 اسپرم در چندین میدان دید متفاوت شمارش صورت گرفت و نتایج به‏صورت درصد اسپرم‏های با رنگ زرد درخشان یا +CMA3 که گویای اسپرم‏های دارای کمبود پروتامین هستند، گزارش شد (11).

ارزیابی پراکسیداسیون لیپید با استفاده از رنگ‏آمیزی بادی پای: جهت ارزیابی پراکسیداسیون لیپیدی از رنگ‏آمیزی ایمنوفلورسنت BODIPY- C11 (اینویتروژن، آمریکا) استفاده شد. این رنگ توانایی رنگ‏آمیزی اسیدهای چرب آسیب دیده را در غشا سلول دارد. به‏صورت خلاصه رنگ بادی پای با غلظت نهایی 5 میلی‏مولار به 2 میلیون اسپرم درون یک میکروتیوب تیره اضافه و در 37 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 30 دقیقه نگه‏داری شد. سپس، نمونه‏ها توسط دستگاه فلوسایتومتر FACS Calibur (بکتون دیکسون، آمریکا)، خوانش شد. لازم به‏ذکر است که علاوه ‏بر کنترل منفی، از نمونه کنترل مثبت (اضافه نمودن H2O2 به نمونه اسپرمی) نیز استفاده شد (13).

A

B

D درصد لیپیدپراکسیداسیون اسپرم(97/2±57/46)، کمبود پروتامین اسپرم(15/1 ±10/23)، میزان هیستون باقیمانده اسپرمی (54/4  ± 76/53)و آسیب DNA اسپرمی(42/2  ± 93/61)

C

B

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1 : ارزیابی تستهای عملکردی اسپرم در سه گروه مطالعه : A) درصد هیستون پایدار، B) درصد کمبود پروتامین، C) درصد شکستگی AND اسپرم، D) درصد پراکسیداسیون لیپیدی .*: افزایش معنی دار در گروه واریکوسل نسبت به دو گروه شم و کنترل.  50/0

 

آنالیز آماری

اطلاعات به‏دست آمده از این مطالعه توسط نرم­افزار آماری  SPSS(ویراست 19) آنالیز شد. جهت بررسی توزیع نرمال داده‌ها، از تست کولموگروف-اسمیرنوف (kolmogorov-smirnov) استفاده شد. سپس داده‌ها توسط روش آماریone way ANOVA، (Tukey post hock)، مورد ارزیابی قرار گرفتند. در صورتی که 05/0p-value< بود، از لحاظ آماری معنی‌دار محسوب شد.

جهت ارزیابی ارتباط میان پارامترهای اسپرمی و تست‌های عملکردی اسپرم (درصد آسیب DNA، درصد کمبود پروتامین، درصد هیستون پایدار و لیپید پراکسیداسیون)، تمامی دادهها تجمیع شدند و ضریب همبستگی پیرسون)nosreaP( بین پارامترهای مورد نظر بررسی شد. جهت بررسی وجود تفاوت معنی‏دار از نظر آماری بین پارامترهای مورد نظر تستdeliat owT ارزیابی شد. درصورتی‏که 50/0<eulav-pبود، از لحاظ آماری معنی‌دار محسوب شد.

 

نتایج

در این مطالعه، وزن بدن، حجم بیضه و طول اپیدیدیم در بین سه گروه کنترل، شم و واریکوسل مورد مقایسه قرار گرفت. همان‏گونه که در جدول یک نشان داده شده است، میانگین وزن بدن و طول اپیدیدیم بین گروه‏ها اختلاف معنی‏داری از لحاظ آماری ندارد (50/0<eulav-p). حجم بیضه بهطور معنی‏داری در گروه القا واریکوسل (60/0±60/1) نسبت به گروه کنترل (500/0= eulav-p، 70/0±63/1) و شم (000/0= eulav-p، 60/0±94/1) کاهش یافته است. در رابطه با غلظت، تحرک و مورفولوژی اسپرم، همان‏گونه که در جدول یک نشان داده شده است، میانگین درصد مورفولوژی غیرطبیعی در گروه واریکوسل (000/0= eulav-p، 49/1±03/71) و نیز تحرک اسپرم  (000/0= eulav-p، 93/2±40/83) بهطور معنی‏داری بالاتر از مورفولوژی غیرطبیعی (38/0±22/9) و نیز تحرک اسپرم (56/3±16/96) در گروه کنترل و هم‏چنین، درصد مورفولوژی غیرطبیعی در گروه شم (16/1±04/01، 700/0= eulav-p) و درصد تحرک (11/4±11/16، 000/0= eulav-p) نیز در این گروه نسبت به گروه واریکوسل تفاوت معنی‏داری را نشان می‌دهد. بهعلاوه میانگین درصد غلظت اسپرم بهطور معنی‏داری در گروه القا واریکوسل (31/7±51/85) پایین‏تر از گروه کنترل (600/0= eulav-p، 89/7±18/19) می‏باشد.

 

جدول 1: مقایسه وزن بدن، حجم بیضه، طول اپیدیدیم . پارامترهای اسپرمی بین گروه‏های کنترل، شم و واریکوسل (تعداد در هر گروه 22 است)

حروف مشابه نشان دهنده اختلاف معنی‏دار می باشند. 05/0p-value≤ محاسبه شد.

 

واریکوسل

 

شم

کنترل

 

پارامترها

 

359/68±12/68

366/9±8/64

353/27±11/93

وزن بدن (گرم)

1/06±0/06ab

1/49±0/06b

1/36±0/07a

حجم بیضه (سی سی)

3/55±0/07

3/63±0/07

3/87±0/08

طول اپیدیدیم (سانتیمتر)

58/15±7/13a

80/76±7/21

91/81±7/98a

غلظت اسپرم (میلیون در هر سی سی)

38/04±2/39ab

61/11±4/11b

69/61±3/65a

تحرک اسپرم (درصد)

17/30±1/94ab

10/40±1/61b

9/22±0/83a

مورفولوژی غیر طبیعی اسپرم (درصد)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

در این مطالعه، سلامت کروماتین اسپرم با استفاده از رنگ‏آمیزی‏های آکریدین ارنج ، آنیلین بلو و کرومایسین A3 مورد بررسی قرار گرفت، هم‏چنین وضعیت استرس اکسیداتیو در سلول‏های اسپرمی از طریق بررسی پراکسیداسیون لیپید مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج در شکل یک نشان می‏دهد که در گروه القا واریکوسل آسیب DNA اسپرم (42/2±39/61)، میزان هیستون باقی‏مانده (54/4±76/53)، کمبود پروتامین (15/1±10/23) و درصد پراکسیداسیون لیپید (97/2±57/46) در اسپرم، بیش‏تر از میانگین درصد آسیب DNA (000/0=p-value، 57/2± 72/20)، میزان هیستون باقی‏مانده (000/0=p-value، 87/4 ± 12/29)، کمبود پروتامین (006/0=p-value، 39/1±57/17)و پراکسیداسیون لیپید اسپرم (000/0=p-value، 72/1±33/12) در گروه کنترل می‏باشد. آسیب DNA اسپرمی (000/0=p-value، 30/2±66/29)، میزان هیستون باقیمانده اسپرمی (000/0=p-value، 27/2±02/26)، کمبود پروتامین اسپرم (003/0=p-value، 57/1±23/16) و درصد پراکسیداسیون لیپید اسپرم (000/0=p-value،55/1 ± 90/14) در گروه شم نیز به‏صورت معنی‌داری پایین تر از گروه واریکوسل می‏باشد.

دراین مطالعه هم‏چنین، ارتباط میان پارامترهای اسپرمی و درصد آسیب DNA، کمبود پروتامین، درصد هیستون پایدار و لیپید پراکسیداسیون مورد بررسی قرار گرفت (جدول 2). غلظت اسپرم با درصد آسیبDNA  (000/0=,p-value778/0-=r)، میزان هیستون پایدار (000/0=,p-value847/0-=r) و لیپید پراکسیداسیون (000/0=,p-value584/0-=r) ارتباط معکوس و معنی‏داری را نشان می‏دهد. اما با میزان کمبود پروتامین ارتباط معنیداری را نشان نمی‏دهد. میزان تحرک اسپرم، با درصد آسیب (000/0=,p-value781/0-=r) DNA، کمبود پروتامین (021/0=,p-value300/0-=r)، درصد هیستون پایدار (000/0=,p-value661/0-=r) و لیپید پراکسیداسیون (000/0=,p-value704/0=r) ارتباط معکوس و معنیداری را نشان می‌دهد.

هم‏چنین بررسی ارتباط میان درصد موفولوژی غیرطبیعی و درصد آسیب DNA (000/0=,p-value670/0=r)، درصد هیستون پایدار (000/0=,p-value650/0=r) و لیپید پراکسیداسیون (000/0=,p-value488/0-=r) ارتباط مستقیم و معنی‏داری را نشان می‌دهد اما بررسی آن با میزان کمبود پروتامین، ارتباط معنیداری را نشان نمی‌دهد.

 

 

جدول 2: ارزیابی ارتباط میان پارامترهای اسپرمی با آسیبDNA، کمبود پروتامین، هیستون پایدار و درصد لیپیدپراکسیداسیون.

برای بررسی ضریب همبستگی از تست پیرسون(Pearson) ، استفاده گردید. در صورتی که p-value ≤ 0.05 بود، از لحاظ آماری معنی‌دار محسوب شد.

 

 

لیپید پراکسیداسیون

میزان هیستون پایدار

کمبود پروتامین

آسیب DNA

پارامترها

       

غلظت اسپرم

-0/584

-0/847

-0/104

-0/778

r

0/000

0/000

0/501

0/000

p-value

       

تحرک اسپرم

-0/704

-0/661

-0/300

-0/781

r

0/000

0/000

0/021

0/000

p-value

       

مورفولوژی غیر طبیعی

0/488

0/650

0/065

0/670

r

0/000

0/000

0/652

0/000

p-value

 

 

 

 

 

 

بحث

واریکوسل یکی از شایع‏ترین علت‌های ناباروری اولیه و ثانویه در مردان است که با افزایش سن، میزان شیوع آن بالا می‏رود. مطالعات پیشین اذعان داشته‏اند که شیوع واریکوسل در مردان به‏ازای هر دهه از حیات فرد، به‏میزان 10 درصد افزایش می­یابد و این میزان در دهه­ی هشتم حیات فرد به 75 درصد می­رسد. به‏علاوه، محققان نشان داده‏اند که تغییرات هورمونی نیز وابسته به سن می‏باشند به‏طوری‏که در مردان به‏طورسالانه بین یک تا دو درصد سطح تستوسترون سرم کاهش می­یابد و این کاهش سطح سرم با افزایش سن می‏تواند بر روند اسپرماتوژنز، تولید و تمایز اسپرم تاثیر بگذارد (14). چنان‏چه بیان شد به‏علت شیوع بالای این نوع ناباروری، محققان و متخصصان در تلاش برای بررسی اتیولوژی این بیماری می‏باشند (15) و در این زمینه مطالعات گوناگونی تاکنون صورت گرفته است. باتوجه به ‏این‏که جهت بررسی اتیولوژی واریکوسل، تحقیق بر روی نمونه‏های حیوانی می‏تواند نتایج پایدارتری را برای محققان فراهم کند، در این مطالعه سعی بر آن شد که با ایجاد مدل واریکوسل در رت‏های صحرایی، وضعیت کروماتین اسپرم که نقش اساسی و مهمی را در نیمی از ژنوم جنین آینده می‏تواند ایفا نماید، بررسی شد. در این مطالعه، با استفاده از تعداد بالای حیوانات آزمایشگاهی در مقایسه با مطالعات پیشین‏، علاوه بر بررسی تاثیر القا واریکوسل بر پارامترهای اسپرمی، هدف مطالعه، بررسی القا واریکوسل برروی سلامت کروماتین اسپرم بوده است. نتایج این مطالعه حاکی از آن است که غلظت و تحرک اسپرم به‏طور معنی‏داری روند کاهشی، و درصد مورفولوژی غیرطبیعی به‏طور معنی‏داری روند افزایشی را در رت‏های القا واریکوسل نسبت به کنترل و سم داشته‏اند. بنابراین این نتایج مطابق با نتایج مدل‏های انسانی و حیوانی است که واریکوسل می‏تواند بر روند طبیعی اسپرماتوژنز اثر گذارد و منجر به کاهش تعداد، ایجاد آسیب و افزایش اسپرم غیرطبیعی به‏همراه کاهش تحرک شد (16-19).  

علت اصلی آسیب وارده به سلول‌های اسپرم در طول فرآیند اسپرماتوژنز در افراد واریکوسل افزایش دمای بیضه عنوان شده است. براساس مطالعات، ارتباط مستقیم بین واریکوسل و افزایش دمای کیسه بیضوی در مطالعات حیوانی و انسانی، نتایج متناقضی را نشان می­دهد. شاید این نتایج به‏این دلیل است که دمای بیضه در مطالعات حیوانی به­طور مستقیم، ولی در مطالعات بالینی دمای اسکروتوم بررسی می‏شد (16). از طرفی در انسان درجات متفاوتی از شدت واریکوسل دیده می‏شود که با زمینه‏های ژنتیکی‏، تغذیه و سبک زندگی متفاوت دارای اثرات گوناگونی بر روند اسپرماتوژنز و باروری هستند. در این زمینه، مطالعات نشان داده‏اند که القای واریکوسل در بیضه­ی میمون رزوس و موش­های نر، سبب اختلال در فرآیند اسپرماتوژنز شده، و دمای بیضه به‏اندازه­ی یک درجه­ی سانتی­گراد نسبت به گروه کنترل افزایش می‏یابد هم‏چنین درمان واریکوسل در این حیوانات منجر به بازگشت دمای بیضه به حالت اولیه شده است (16، 21). برخی مطالعات اذعان داشته‏اند که دمای اسکروتوم در مردان نابارور با واریکوسل بیشتر از افراد بارور است، در حالی‏که، تعدادی از مطالعات نشان داده­اند که واریکوسل سبب اختلال در فرایند اسپرماتوژنز و پارامتر­های اسپرمی می­شود، ولی تفاوتی در دمای اسکروتوم در مردان مبتلا به واریکوسل و بدون واریکوسل وجود ندارد (22، 23).

محققان این‏گونه بیان داشته‏اند که افزایش دما بیضه در واریکوسل، احتمالا موجب ایجاد استرس گرمایی می‏شد و در نتیجه موجب افزایش پروتئین‌های شوک حرارتی (Heat shock protein) می‏شود. این پروتئین‏ها، در ترمیم پروتئین‏های تخریب شده در اثر استرس نقش ایفا می‌کنند (24، 25). این پروتئین‏ها براساس وزن مولکولی به 4 گروهHSP90 ،HSP70،HSP60  وHSP27  تقسیم می‏شوند. براساس مطالعات پیشین،  HSPA2که مهم‏ترین عضو خانواده HSP70 می‌باشد در بیضه و اسپرم حضور دارد و با بلوغ، عمل‏کرد و باروری اسپرم ارتباط دارد (11، 26). افزایش دما هم‏چنین می‏تواند موجب ایجاد استرس اکسیداتیو به‏واسطه افزایش تولید گونه‏های فعال اکسیژن بیش از میزان فیزیولوزیک توسط میتوکندری سلول اسپرم شد. استرس اکسیداتیو ایجاد شده متعاقب مقادیر بالای گونه‏های فعال اکسیژن، می‏تواند به‏علت اکسیداسیون اسیدهای چرب موجود در غشای اسپرمها و بهویژه در ناحیه دم، موجب ایجاد آسیب به ساختار و عمل‏کرد اسپرم ازجمله مورفولوژی طبیعی و تحرک می‌شد (8). هم‏چنین  استرس‏های اکسیداتیو، می‏تواند با تاثیر بر روی میتوکندری اسپرم و راه‏اندازی آبشار آپوپتوزیس تاثیر مستقیم بر روی AND  اسپرم و آسیب به ساختار آن شد که این آسیب نیز می‌تواند موجب کاهش عمل‏کرد اسپرم ‌شود. در مطالعات پیشین افزایش میزان آسیب AND متعاقب افزایش استرس اکسیداتیو در افراد واریکوسلی گزارش شده است (02). در مطالعه حاضر نیز، یکپارچگی کروماتین اسپرم به‏وسیله تست رنگ‏آمیزی آکریدین ارنج مورد بررسی قرار گرفت که در گروه واریکوسل به‏طور معنی‏داری میزان شکست AND نسبت به گروه شم و کنترل افزایش داشته است که در راستای مطالعات پیشین ذکر شده می‏باشد. سلامت کروماتین اسپرم همانند سلامت کروماتین تخمک، نقش بسزایی در فرآیندهای تولید­مثل ازجمله لقاح، تکوین جنین، کیفیت زندگی فرزندان متولد شده و به­طور کلی تداوم گونه دارد. حتی اگر کروماتین اسپرم در یک حالت کاملا متراکم بسته­بندی شود، هنوز هم می­تواند تحت تاثیر آسیب­های مختلف قرار گیرد (27). مطالعات متعددی نشان داده است که آسیبAND اسپرم می­تواند نتایج تولید­مثل را از طریق تداخل در تکوین جنینی، افزایش خطر مرگ نوزادان، ازدیاد بیماری­هایی مانند سرطان در دوران کودکی، ناباروری در فرزندان و وقوع خود­به­خودی بیماری­های ژنتیکی در لقاح طبیعی هم‏چنین در لقاح حاصل از تکنیک‏های کمک باروری تحت تاثیر قرار دهد (03-82).

با توجه به تاثیر استرس اکسیداتیو بر سلامت کروماتین اسپرم و هم‏چنین ارتباطی که بین بسته‏بندی غیرطبیعی کروماتین و آسیب DNA وجود دارد، در مطالعه حاضر، به‏طور همزمان سلامت DNA، کمبود پروتامین، هیستون باقی‏مانده و استرس اکسیداتیو در شرایط واریکوسل بررسی شد. نتایج نشان می دهد که میانگین فاکتورهای قید شده به‏طور معنی‏داری در رت‏های واریکوسل در مقایسه با رت‏های کنترل و سم، متفاوت است و بیانگر کاهش سلامت DNA اسپرم در گروه واریکوسل متعاقب افزایش میزان لیپید پراکسیداسیون سلولی می‌باشد. هم‏چنین، کاهش پارامترهای اسپرمی و حجم بیضه، در گروه واریکوسل نسبت به گروه سم و کنترل نیز موید القا واریکوسل در گروه‏های مورد بررسی می‌باشد. در ادامه، ارتباط میان پارامترهای اسپرمی و نیز آسیب DNA اسپرم، کمبود پروتامین، هیستون باقیمانده و لیپید پراکسیداسیون مورد ارزیابی قرار گرفت و مشاهده شد که ارتباط قوی و معکوسی میان کاهش کیفیت پارامترهای اسپرمی (غلظت، تحرک و مورفولوژی غیرطبیعی اسپرم) و آسیب DNA اسپرم و میزان هیستون باقیمانده و پراکسیداسیون لیپید وجود دارد و به‏روشنی بیان می‌دارد که هر چه میزان سلامت کروماتین اسپرم کاهش یابد، کیفیت پارامترهای اسپرمی نیز کاهش پیدا می‌کند که باتوجه به‏تعداد بالا حیوانات و  زمینه ژنتیکی یکسان حیوانات مورد مطالعه، این نتایج قابل اعتماد می‌باشند و نیز هدف مطالعه را تامین و تایید می‌نماید. 

مطالعات مختلفی نشان داده­اند که افزایش سطح استرس در افراد با واریکوسل، می‏تواند سبب ایجاد آسیب DNA اسپرم شود. اگرچه میزان دقیق آسیب DNA، به‏روش ارزیابی آسیب DNA بستگی دارد. آسیب DNA اسپرم ممکن است در روند اسپرماتوژنز در داخل بیضه یا در طول بلوغ اسپرم و یا انتقال آن رخ دهد. به‏علاوه اخیرا هم نشان داده شده است که ارتباط معنی‏داری بین افزایش استرس اکسیداتیو و آسیب DNA اسپرم با شرایط القا واریکوسل دارد (33-31).

اخیرا مشخص شده که آسیب­های اکسیداتیو DNA اسپرم به­دلیل لوکوسیتواسپرمی همراه با عفونت و التهاب، اختلالات ژنتیکی و متابولیسمی نظیر دیس لیپیدمیا(dyslipidemia)  و بیماری­هایی نظیر واریکوسل، در معرض قرار گرفتن با مواد سمی، مواد مخدر، داروها، سیگار کشیدن توتون و تنباکو یا عوامل تنش‏زای فیزیکی مانند گرما، اشعه­ی یونیزان و ماکروویو رخ دهد که پیامد نهایی آن می­تواند کاهش میزان لقاح، تکوین جنین، سقط جنین و حتی تولد فرزندان ناقص باشد (5، 30). 

از نقاط قوت این مطالعه می‌توان به‏تعداد بالای نمونه‏ها در هر گروه برشمرد که تاکنون در مطالعات شبیه‏سازی شده برای واریکوسل این تعداد بررسی نشده است و نتایج مطالعه را قابل اعتماد می‏سازد. همچنین، بررسی همزمان لیپید پراکسیداسیون لیپیدی و تست‌های بررسی سلامت DNA، دیدگاه روشنی از تاثیر واریکوسل برروی لیپید پراکسیداسیون اسیدهای چرب غیراشباع و در نتیجه آن کاهش پارامترهای اسپرمی و آسیبDNA می‏باشد. از نقاط ضعف مطالعه حاضر نیز می‌توان به عدم اندازه‌گیری دمای بیضه در گروه‏ها اشاره کرد.  

 

نتیجه­گیری

از نتایج مطالعه کنونی می‏توان این‏گونه استنباط نمود که شرایط واریکوسل با افزایش استرس اکسیداتیو همراه است که این شرایط پاتولوژیک می‏تواند بر عملکرد اسپرم تاثیر منفی داشته باشد و منجر به آسیب DNA در اسپرم شد. افزایش آسیب‏های اسپرمی می‏تواند سلول را به‏سمت آپوپتوزیس پیش ببرد و تعداد اسپرم تولید و تمایز یافته نسبت به وضعیت طبیعی کاهش یابد و این اسپرم‏ها با درصد بالایی از مورفولوژی غیرطبیعی و کاهش تحرک مواجه هستند. لذا افراد نابارور با واریکوسل به‏دلیل کاهش تعداد اسپرم کارا با کاهش پتانسیل باروری مواجه هستند. از مزایای مهم این مطالعه می‏توان به اثبات این تئوری در وضعیت هموژن بدون زمینه ژنتیک متفاوت در رت‏های صحرایی با تعداد بالایی از رت در هر گروه آزمایشگاهی، اشاره نمود.

تشکر وقدردانی

مقاله حاضر برگرفته از طرح مصوب ما بین دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات و پژوهشگاه رویان اصفهان با شماره قرارداد 2198/19/98/ص تصویب شده در تاریخ 13/6/ 1398می‏باشد. در پایان جا دارد از زحمات گروه آندرولوژی پژوهشگاه رویان اصفهان تقدیر و تشکر به‏عمل آید.

1. Agarwal A, Virk G, Ong C, du Plessis SS. Effect of oxidative stress on male reproduction. World J Mens Health. 2014; 32(1):1-17.
2. Oster J. Varicoceles in children and adolescents. Scand. J Urol Nephrol. 1971; 5(1):27-32.
3. Shiraishi K, Takihara H, Matsuyama H. Elevated scrotal temperature, but not varicocele grade, reflects testicular oxidative stress-mediated apoptosis. World J Urol. 2011; 28(3): 359-364.
4. Koppers AJ, Mitchell LA, Wang P, Lin M, et al. Phosphoinositide 3-kinase signalling pathway involvement in a truncated apoptotic cascade associated with motility loss and oxidative DNA damage in human spermatozoa. Biochem J. 2011; 436(3): 687-98.
5. Drevet JR, Aitken RJ. Oxidation of Sperm Nucleus in Mammals: A Physiological Necessity to Some Extent with Adverse Impacts on Oocyte and Offspring.  Antioxidants. 2020; 9(2): 95.
6- Kemal Duru N, Morshedi M, Oehninger S. Effects of hydrogen peroxide on DNA and plasma membrane integrity of human spermatozoa. Fertil Steril. 2000; 74(1): 200-7.
7- Christova Y, James PS, Jones R. Lipid diffusion in sperm plasma membranes exposed to peroxidative injury from oxygen free radicals. Mol Reprod Dev. 2004; 68(3): 365-372.
8- Aitken RJ, Gibb Z, Baker MA, Drevet J, et al. Causes and consequences of oxidative stress in spermatozoa. Reprod Fertil Dev. 2016; 28(1-2): 1-10.
9- Turner TT. The Study of Varicocele Through the Use of Animal Models. Hum Reprod Update. 2001;7(1):78-84.
10. Rower PJ, Comhaier FH, Hargreave TB, Mellows HJ. WHO Manual for Standardized Investigation and Diagnosis of the Infertile Couple. Cambridge University Press, Cambridge, 1993, 2013 edition.
11. Afiyani, AA, Deemeh MR, Tavalaee M, Razi M. et.al. Evaluation of heat‐shock protein A2 (HSPA2) in male rats before and after varicocele induction. J Mol reprod dev, 2014; 81(8): 766-776.
12. Tavalaee M, Dattilo M, Mohammadi P, Nasr-Esfahani MH. Improvement of sperm function, chromatin damage, and oxidative damage by N-Acetyl cysteine in varicocelized rats model. J Men’s Health. 2020; 4(1): e2.
13. Aitken R J, Baker MA, Nixon B. Are sperm capacitation and apoptosis the opposite ends of a continuum driven by oxidative stress? Asian J Androl. 2015; 17(4), 633-639.
14. Levinger U, Gornish M, Gat Y, Bachar GN. Is varicocele prevalence increasing with age? Andrologia. 2007; 39(3):77-80.
15. Shiraishi K, Matsuyama H, Takihara H. Pathophysiology of varicocele in male infertility in the era of assisted reproductive technology. Int J Urol. 2012; 19(6): 538-50.
16. Kay R, Alexander NJ, Baugham WL. Induced varicoceles in Rhesus monkeys. Fertil Steril. 1979; 31(2): 195-9.
 17. Madhusoodanan V, Patel P, Blachman-Braun R, Ramasamy R. Semen parameter improvements after microsurgical subinguinal varicocele repair are durable for more than 12 months. Can Urol Assoc J. 2020; 14(3): E80‐E83.
18. Cannarella R, Calogero AE, Condorelli RA, Giacone F, et al. Management and Treatment of Varicocele in Children and Adolescents: An Endocrinologic Perspective. J Clin Med. 2019; 8(9):1410.
19. Macey MR, Owen RC, Ross SS, Coward RM. Best practice in the diagnosis and treatment of varicocele in children and adolescents. Ther Adv Urol. 2018; 10(9):273‐282.
 20. Park YS, Lee SH, Choi HW, Lee HS, et al. Abnormal Human Sperm Parameters Contribute to Sperm DNA Fragmentation in Men with Varicocele. World J Mens Health. 2018; 36(3):239-247.
21. Saxena DK. Effect of hypoxia by intermittent altitude exposure on semen characteristics and testicular morphology of male rhesus monkeys. International Journal of Biometeorology. 1995; 38(3): 137–140.
 22. Mieusset R, Bujan L, Mondinat C, Mansat A, et al. Association of scrotal hyperthermia with impaired spermatogenesis in infertile men. Fertil Steril. 1987; 48(6): 1006-11.
 23- Lund L, Nielsen KT. Varicocele testis and testicular temperature. Br J Urol. 1996; 78(1): 113-5.
24. Rao M, Xia W, Yang J, Hu LX, et al. Transient scrotal hyperthermia affects human sperm DNA integrity, sperm apoptosis, and sperm protein expression. J Androl. 2016; 4(6):1054-1063.
25. Durairajanayagam D, Agarwal A, Ong C. Causes, effects and molecular mechanisms of testicular heat stress. Reprod Biomed Online. 2015; 30(1):14-27.
26. Motiei M, Tavalaee M, Rabiei F, Hajihosseini R, et al. Evaluation of HSPA2 in fertile and infertile individuals. J Androl. 2013; 45(1):66-72.
 27. Noblanc A, Kocer A, Drevet JR. Recent knowledge concerning mammalian sperm chromatin organization and its potential weaknesses when facing oxidative challenge. Basic Clin Androl. 2014; 24(6):1-12.
 28. Morris ID, Ilott S, Dixon L, Brison DR. The spectrum of DNA damage in human sperm assessed by single cell gel electrophoresis (Comet assay) and its relationship to fertilization and embryo development. Hum Reprod Oxf Engl. 2002; 17(4):990–998.
29. Khalili MA, Agha-Rahimi A. Use of sperm DNA fragmentation test in ART setting: is it a promising diagnostic test? Transl Androl Urol. 2017; 6(Suppl 4): S673‐S674.
30. Bungum M, Oleszczuk K. Sperm DNA and ART (IUI, IVF, ICSI) Pregnancy. In: Zini A., Agarwal A. (eds) A Clinician's Guide to Sperm DNA and Chromatin Damage. 2018; Springer, Cham, chapter 21, 393-406.
 31. Sadeghi N, Erfani-Majd N, Tavalaee M, Tabandeh MR, et al. Signs of ROS-Associated Autophagy in Testis and Sperm in a Rat Model of Varicocele. Oxid Med Cell Longev. 2020; 2020: 5140383.
32. Dere E, Anderson LM, Hwang K, Boekelheide K. Biomarkers of chemotherapy-induced testicular damage. Fertil Steril. 2013; 100(5): 1192-202.
33. Tahamtan S, Tavalaee M, Izadi T, Barikrow N, et al. Reduced sperm telomere length in individuals with varicocele is associated with reduced genomic integrity. Sci Rep. 2019; 9(1): 4336.