فصلنامه

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد زیست شناسی سلولی- مولکولی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران

2 پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، پژوهشکده پزشکی، دپارتمان سلول‏های بنیادی و پزشکی ترمیمی، تهران، ایران

10.29252/JCT.7.2.141

چکیده

هدف: هدف از این مطالعه بررسی تاثیر DJ-1 بر افزایش بقای سلول‏های دوپامین ساز در برابر سمیت پارکینسونی  می‏باشد.
مواد و روش‏ها:  ابتدا لنتی ویروس‏های نوترکیب ناقل توام ژن های DJ-1 و گزارش‏گر Jred تولید شده و برای آلوده سازی سلول‏ها استفاده شدند. بدین منظور سه پلاسمید لنتی ویروسی به‏نام‏های ناقل، بسته بندی و غشا برای ترانسفکشن سلول‏های HEK-293T به‏عنوان رده سلولی مولد ویروس به‏کار برده شدند. محیط سلول‏های ترانسفکت شده 24 و 48 ساعت جمع آوری و تغلیظ شد تا ذخیرة لنتی ویروسی به‏دست آید. به‏دنبال ترانسدوکشن سلول‏های دوپامین ساز PC12 با این ذخیرة غلیظ ویروسی، سلول‏های مزبور افزایش بیان DJ-1 را آغاز کردند. پس از تیمار این سلول‏ها با توکسین 6-OHDA، میزان بقای آن‏ها در مقایسه با شاهد اندازه‏گیری شد.
نتایج: مراحل ترانسفکشن سلول‏های HEK-293T و آلودگی سلول‏های PC12 با ذخیرة ویروسی به‏طور موفقیت آمیز به انجام رسید، زیرا بیان ژن گزارش‏گر Jred با استفاده از میکروسکوپ فلورسنس در هر دو مرحله مشاهده شد. سپس افزایش بیان DJ-1 با تکنیک RT- PCR اثبات شد. آزمایش‏های بعدی نشان داد که افزایش بیان DJ-1 باعث افزایش چشم‏گیری در بقای سلول‏های PC12 در برابر سمیت ناشی از 6-OHDA می‏شود. درصد بقای سلول‏های PC12 که افزایش بیان DJ-1 داشتند، در حدود 30 درصد بیشتر از درصد بقای سلول‏های کنترل برآورد شد و این افزایش از نظر آماری معنی‏دار بود.
نتیجه‏گیری: افزایش بیان ژن DJ-1 در سلول‏های دوپامین ساز PC12 مقاومت و بقای این سلول‏ها را در برابر سمیت نورونی 6-OHDA به‏طور معنی‏دار و چشم‏گیری افزایش می‏دهد.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Increased of dopaminergic PC12 cell survival against 6-OHDA-mediated toxicity following overexpression of DJ-1 factor

نویسندگان [English]

  • S Lasemi 1
  • M Gardane 2
  • P Akbari 1

1

2

چکیده [English]

Aim: The purpose of this study is to examine DJ-1effect on increasing survival of dopaminergic (DAergic) cells against parkinsonian toxicity.
Material and Methods: First recombinant lenti-viruses transporters were produced with both DJ-1 and reporter Jred genes and were used to cells infection. To this end, three lentiviruses vectors namely transporter, packaging and envelope were applied for co-transfection of HEK-293T cells as virus-producing cell line. 24 and 48 hours transfected cell media were collected and concentrated till lentivirus stock generation. Following transduction of DAergic PC12 cells with this concentrated virus stock, the infected cells overexpressed DJ-1. After treatment of these transduced cells with the 6-OHDA toxin, their survival rate was measured in comparison with control.
Results: Transfection HEK-293T cells steps and PC12 cells transduction with the virus stock were done successful, because reporter Jred gene expression was observed using fluorescence microscope in both steps. Then DJ-1 overexpression was proofed using RT-PCR method. Next experiments indicated that DJ-1 overexpression causes significant increase in PC12 cells survival against produced toxicity of 6-OHDA. PC12 cell survival percentage that had DJ-1-overexpressing was 30% more than control cells survival percentage and this increasing was statistically significant.
Conclusion: increasing of DJ-1 expression in DAergic PC12 cells significantly increased their resistance and perpetuity against 6-OHDA neurotoxicity.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Parkinson
  • DJ-1
  • dopaminergic
  • neuroprotection

مقدمه

آسیب پذیر شدن سیستم‏های عصبی ویژگی بارز بیماری‏های دژنراتیو مغزی وابسته به سن می‏باشد. از جمله این بیماری‏ها Parkinson’s disease(PD)، Huntington’s disease(HD) و Amyotrophic lateral sclerosis(ALS) را می‏توان نام برد (1). بخش وسیعی از تحقیقات بر روی استرس اکسیداتیو متمرکز شده است که عامل تباهی و زوال نورون‏ها در این بیماری‏ها می‏باشند. گونه‏های واکنش‏گر اکسیژن مانند آنیون سوپراکسید، رادیکال هیدروکسیل و هیدروژن پروکسید در جریان متابولیزه شدن اکسیژن به‏عنوان محصولات فرعی در سلول‏ها تولید می‏شوند که از جمله مهم‏ترین عوامل آسیب رسان به نورون‏ها می‏باشند (1).

 بیماری پارکینسون (PD) یک بیماری وابسته به سن است که در آن با پیشرفت سن، زوال سلول‏های دوپامین ساز رخ داده و نشانه‏های بیماری بروز می‏کند. تقریبا 90 درصد کل نورون‏های دوپامین ساز مغز در بخش شکمی مزنسفالون قرار گرفته‏اند (2). در پستانداران نورون‏های دوپامین ساز مزونسفالیک (Mes-Daergic) در سه زیرناحیه ی متمایز مغز مستقر می‏شوند: Substantia nigra pars compacta(SNpc)، Ventral tegmental area(VTA) و Retrorubral field (RRF) (3). شاخص‏ترین تقسیم بندی مسیرهای دوپامین ساز، مسیر نیگرو-استریاتال (SN-ST) است که از SNpc منشا گرفته و به استریاتوم پشتی که شامل بخش های Putamen و Caudate است ادامه می‏یابد (4).

یکی از ژن‏های مهم دخیل در بروز PD، ژن DJ-1 می‏باشد. DJ-1 در آغاز به‏عنوان یک انکوژن شناسایی شد (5). سیزده جهش شامل جهش‏های نقطه‏ای و حذفی در ژن DJ-1 در PD شناسایی شده است (6-9). DJ-1 عملکردهای متفاوتی دارد از جمله تنظیم رونویسی ژن‏های پایین دست و فعالیت‏های ضد استرس اکسیداتیو. فرض بر این است که نقص در فعالیت‏های ضد استرس اکسیداتیو منجر به بروز PD می‏شود (10-12). بیان DJ-1  در سلول‏هایی که در معرض استرس اکسیداتیو قرار گرفته اند افزایش می‏یابد. در هنگام افزایش استرس اکسیداتیو آمینو اسید سیستئین در پروتئین DJ-1 در موقعیت 106 (C 106) اکسیده شده و به این ترتیب گونه‏های واکنش‏گر اکسیژن (ROS) را از محیط جمع آوری و خنثی می‏کند (13-15). کاهش فعالیت‏های آنتی اکسیدانتی در موارد جهش یافته‏ی DJ-1 در بیماران مبتلا به PD گزارش شده است  (17). بررسی‏های ساختاری و بیوشیمیایی نشان داده اند که DJ-1 به‏صورت همودایمر درمی‏آید و بیشترین کارآیی را در فرم همودایمر از خود نشان می‏دهد (14، 16و17). این آنالیزها نشان می‏دهند که DJ-1 به‏عنوان پروتئاز (16و18) و چاپرون (19و20) نیز فعالیت می‏کند. مطالعاتی که بر روی موش‏های فاقد ژن  DJ-1 انجام شد نشان داد که فقدان این ژن منجر به از بین رفتن فعالیت گیرنده دوپامین و حساس شدن سلول‏ها در برابر استرس اکسیداتیو می‏شود، این یافته‏ها پیشنهاد می‏کنند که نقص عملکرد DJ-1 با PD مرتبط است (21-23). در مطالعات In vivo که بر روی Rat های مدل پارکینسونی انجام شد نشان داد که پروتئین DJ-1 پس از تزریق 6-OHDA مرگ نورون‏های دوپامین ساز را در Substantia nigra مهار کرده، اختلالات رفتاری القا شده با 6-OHDA را بهبود بخشیده و سطح ROS را در سلول‏ها کاهش می‏دهد (24).

در مطالعه جاری، بر آن شدیم که اولا لنتی ویروس‏های ناقل ژن DJ-1 را به‏طور موفقیت آمیز تولید نمائیم، دوما با انتقال این ویروس‏ها به‏داخل سلول‏های دوپامین ساز PC12 بیان آن‏را در سلول‏های مزبور افزایش دهیم و ثالثا تاثیر این افزایش بیان را بر بقای سلول‏ها در برابر سمیت با 6-OHDA بسنجیم.

 

مواد و روش‏ها

ناقل‏های ویروسی شامل ناقل انتقال، ناقل غشا و ناقل بسته بندی با استفاده از کیت ماکسی پرپ کیاژن تهیه و تخلیص شدند.  سلول‏های HEK-293T از آزمایشگاه KL OMALLEY از دانشگاه واشنگتن در سنت لوئیس میسوری تهیه شده است.

کشت سلول: سلول‏های HECK-293T که نقش مولد ویروس را بازی می‏کنند در محیط DMEM حاوی FBS 10 درصد، در دمای 37 درجه سانتی‏گراد و  CO2 5 درصد کشت و پاساژ داده شدند. حدود دو و نیم میلیون سلول در پتری دیش‏های 10 سانتی‏متری مخصوص کشت سلول، کشت داده شدند تا در روز بعد 60 درصد پتری دیش را پر کنند. همچنین سلول‏های نورونی PC12 به‏عنوان سلول‏های هدف ویروس، در دمای 37 درجه سانتی‏گراد و CO2 5 درصد کشت و پاساژ داده شدند. برای آلوده سازی ویروسی تعداد 50 هزار سلول PC12 در پلیت 24 خانه، 24 ساعت قبل از آلوده سازی کشت داده شدند.

تولید ویروس: برای تولید لنتی ویروس‏های نوترکیب، سلول‏های مولد ویروس یعنی HEK-293T هم‏زمان با سه ناقل لنتی ویروسی به مقدار 20 میکروگرم از ناقل ترانسفر و 15 میکروگرم از هر یک از ناقلین بسته بندی و غشایی، با روش رسوب DNA- فسفات کلسیم ترانسفکت شد. این سه ناقل همراه با 50 میکرولیتر از کلرید کلسیم 5/2 میلی مولار، با آب استریل به حجم 500 میکرولیتر رسیدند و هم حجم آن HEPES اضافه شد. محلول حاصل 30 دقیقه در زیر هود و در دمای اتاق انکوبه شد تا رسوب مورد نظر به‏دست آید. سپس این رسوب قطره قطره به محیط سلول‏های HEK-293T اضافه شد. سلول‏ها به‏مدت 8 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد انکوبه شدند و سپس محیط آن‏ها با محیط جدید تعویض شد. این سلول‏ها جهت تولید ویروس و رها سازی آن به محیط کشت، در انکوباتور دمای 37 درجه سانتی‏گراد و فشار CO2 5 درصد نگه‏داری شدند. 

تغلیظ ویروس و آلوده سازی سلول‏های هدف: محیط سلول‏های ترنسفکت شده، 24، 48 و 72 ساعت جمع آوری و از فیلتر 45/0 میکرون عبور داده شد. سپس محیط فیلتر شده به‏درون ستون‏های آمیکون 100 MW منتقل و مدت 10 الی 15 دقیقه در دور 4000 rpm سانتریفیوژ شد. محلول حاصل باقی مانده پشت فیلتر که سرشار از ذرات ویریونی بود جمع آوری شد. حجم‏های مختلف از این محلول برای آلوده سازی سلول‏های هدف یعنی PC12 استفاده شد. سپس سلول‏های مزبور در شرایط انکوباتوری ذکر شده قرار داده شدند تا بیان ژن J-RED  موجود در ناقل انتقالی، توسط میکروسکوپ فلورسنت مشاهده و بررسی شود.

استخراج RNA و آزمایش RT-PCR: نود و شش ساعت پس از ترانسدوکشن، کل RNA سلولی توسط کیت حاوی RNX (سیناژن) استخراج شده و پس از اطمینان از سلامت کامل آن روی ژل، 2 میکروگرم از آن برای سنتز cDNA به‏کار برده شد. ساخت cDNA به‏کمک آنزیم ترانسکریپتاز معکوس از (Fermentas, Lithuania) و در حضور هگزامرهای رندوم و مهار‏کننده RNase صورت گرفت. برای تکثیر یک قطعه 260 جفت بازی از cDNA ی مربوط به DJ-1 انسانی، جفت پرایمر زیر بر اساس توالی کد‏کننده آن طراحی و سنتز شد  (Genebank accession no.NG008271)

Forward: 5′-CGGGGTGCAGGCTTGTAAA-3′

Reverse: 5′-ACCACATCACGGCTACACTG-3′

مقادیر یکسان از نمونه‏های cDNA برای آزمایش PCR مورد استفاده قرار گرفت. پس از 2 دقیقه از دناتوراسیون نمونه‏ها در دمای 95 درجه سانتی‏گراد، واکنش PCR با سیکل دناتوراسیون در 95 درجه سانتی‏گراد به‏مدت یک دقیقه، Annealing در 57 درجه سانتی‏گراد برای یک دقیقه و مرحله‏ی Extension در 72 درجه ی سانتی‏گراد به‏مدت 45 ثانیه به انجام رسید. محصولات PCR با استفاده از ژل آگاروز 5/1 درصد آنالیز و عکس برداری شد.

ایجاد سمیت پارکینسونی و سنجش بقا: سلول‏های آلوده شده و سلول‏های کنترل در معرض غلظت 100 میکرومولار از توکسین 6-OHDA به‏عنوان LD50  قرار گرفتند و پس از 48 ساعت میزان بقای آن‏ها با روش 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT)  اندازه‏گیری شد. استوک 5 میلی‏مولار 6-OHDA (سیگما) حاوی 9/0 درصد سالین (Phosphate buffered saline)،
1/0 درصد آسکوربات و 10 میلی diethylenetriaminepentaacetic acid (DETAPAC) در نیتروژن حل شده و قبل از ذخیره سازی در دمای 20- درجه سانتی‏گراد توسط فیلتراسیون، استریل شد. برای تعیین LD50 توکسین، سلول‏ها توسط رقت‏های سریالی از 6-OHDA برای مدت 24 ساعت تیمار شدند و غلظتی از توکسین که در آن نیمی از سلول‏ها از بین می‏رفتند به‏عنوان LD50 انتخاب شد. همچنین برای سنجش MTT، با حل کردن استوک این ماده در سالین، غلظت 5 میلی‏گرم در میلی‏لیتر از آن تهیه شد و پس از استریل کردن آن توسط فیلتراسیون، 20 میکرولیتر از آن به 180 میکرولیتر از محیط DMEM فاقد FBS در هر چاهک اضافه شد و به‏مدت 3 ساعت در شرایط انکوباتوری ذکر شده نگه‏داری شد. سپس این محیط با 200 میکرولیتر از Dimethyl Sulfoxide(DMSO) جایگزین شد و پس از 5 دقیقه انکوبه شدن، میزان جذب در طول موج 580 نانومتر اندازه‏گیری شد.

نتایج

تولید لنتی ویروس‏های نوترکیب pLV-DJ1

 

سلول‏های ترانسفکت شده در فواصل زمانی متوالی در زیر میکروسکوپ فلورسنت مشاهده گردید. این مشاهدات آغاز بیان ژن Jred را در سلول‏های HEK-293T، 9 ساعت پس از ترانسفکشن نشان داد. در ساعات بعدی بیان این ژن تشدید شد تا نهایتا 48 ساعت پس از ترانسفکشن این بیان به حدود 70 درصد رسید (شکل1).

 

 

شکل1: بیان ژن Jred در سلول‏های HEK-293T. این تصاویر 48 ساعت پس از ترانسفکشن سلول‏های HEK-293T، با استفاده از میکروسکوپ فلورسنس تهیه شده است (A= سلول‏های طبیعی، B= سلول‏های پس از ترانسفکشن). بزرگ‏نمایی: 100x.

 

 

ترانسداکشن سلول‏های PC12 و بیان ژن گزارشگر

حدود 48 ساعت پس از افزودن استوک ویروسی به سلول‏های PC12 اولین نشانه‏های بیان Jred با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت مشاهده شد. بیان Jred در فاصله زمانی 96 ساعت به حداکثر خود رسید (شکل2).

 

 

B

A

شکل2: بیان ژن Jred در سلول‏های PC12. این تصاویر 96 ساعت پس از پس از آلوده سازی ویروسی (ترانسدوکشن) سلول‏های PC12 که با استفاده از میکروسکوپ فلورسنس تهیه شده است (A= سلول‏های طبیعی B= سلول‏ها پس از ترانسدوکشن). بزرگ‏نمایی: 50x.

 

 

افزایش بیان ژن DJ-1

ده روز پس از آلوده سازی سلول‏های PC12 توسط ویروس‏های هدف و اطمینان از بیان ترانس‏ ژن، RNA این سلول‏ها استخراج شد و با استفاده از تکنیک RT-PCR میزان بیان ژن DJ-1 قبل و بعد از ترانسدوکشن مشاهده شد (شکل3). این آزمایش‏ها نشان داد که میزان بیان DJ-1 در سلول‏های آلوده شده به ویروس PLV-DJ1 نسبت به سلول‏های طبیعی و سلول‏های آلوده شده با ویروس کنترل (pLV-Jred) افزایش یافته است (شکل 3).

 

 

 

 

M

WT

pLV-

Jred

pLV-DJ1

1000

800

600

500

400

300

200

100

260 bp

شکل 3: افزایش بیان DJ-1 در سلول‏های PC12. این تصویر ژل الکتروفورز، از نمونه‏ی واکنش مزبور بر روی قطعه ی 260 جفت بازی در ناحیه کد‏کننده ژن DJ-1 تهیه شده است. اندازه باندها بر اساس جفت باز مشخص شده است. M (مارکر 1000 جفت بازی RNAWT (Wild-type سلول‏های طبیعی PC12PLV-Jred (سلول PC12 آلوده شده با ویروس کنترل حاوی ژن JredPLV-DJ1 (سلول PC12 آلوده شده با ویروس حاوی ژن DJ-1 ).

 

 

افزایش بقای سلول‏های PC12 با افزایش بیان DJ-1

پس از اینکه سلول‏های PC12  افزایش بیان DJ-1 را به روشنی نشان دادند، توکسین 6-OHDA به گروه‏های مختلف سلولی اضافه شد تا میزان مقاومت آن‏ها در برابر سمیت پارکینسونی تعیین شود. شکل 4 تصویری از سلول‏ها را 24 ساعت پس از افزودن 6-OHDA نشان می‏دهد.

 

 

 

WT+

pLV-Jred

pLV-DJ1

WT-

 

شکل4: بقای سلول‏های PC12 در برابر سمیت پارکینسونی. این تصاویر میکروسکوپی 24 ساعت پس از تیمار سلول‏ها با توکسین 6-OHDA تهیه شده است. سلول‏های گروه WT- تنها گروه تیمار نشده است. بزرگ‏نمایی= 200x.

 


 

 

افزایش کمی بقا نورون‏ها در حضور DJ-1

داده‏های حاصل از سنجش MTT در شکل 5 نشان داده شده است. سلول‏های طبیعی و سلول‏های گروه PLV-Jred پس از تیمار به‏ترتیب به‏میزان 2±51 درصد و 4±52 درصد زنده ماندند که این میزان نسبت به درصد بقای سلول‏های هم گروه قبل از تیمار با 6-OHDA بسیار معنی‏دار بود (01/0p< ). در عین حال پس از تیمار با توکسین، بین سلول‏های طبیعی و سلول‏های گروه pLV-Jred اختلاف معنی‏داری مشاهده نشد. این در حالی است که سلول‏های pLV-DJ1 پس از تیمار با 6-OHDA به‏میزان 3 ±78 درصد زنده ماندند. این میزان بقا نسبت به‏میزان بقای سلول‏های کنترل (چه طبیعی و چه pLV-Jred) بسیار معنی‏دار بود (01/0p< ).

 

 

 

6-OHDA

-

-

+

+

+

 

شکل5: افزایش بقای سلول‏های PC12 پس از افزایش بیان DJ-1. این نمودار درصد بقای سلول‏های PC12 را پس از افزایش بیان ژن DJ-1 نشان می‏دهد که از سنجش MTT به‏دست آمده است. هر ستون نماینده 3 آزمایش مستقل است که به‏صورت تریپلیکیت انجام شده است. اختلاف آماری داده‏ها بین گرو‏ه‏های تیمار شده PLV-DJ1 و گروه طبیعی (WT)  با کنترل تیمار نشده آن‏ها با علامت ** نشان داده شده است. این اختلاف بین گروه تیمار شده pLV-DJ1  و دو گروه تیمار شده WT و pLV-Jred با علامت  ## نشان داده شده است.

 

 

 

بحث

در این مطالعه، تاثیرافزایش بیان پروتئین DJ-1 بر حفظ سلول‏های دوپامین ساز PC12 در برابر سمیت ناشی از 6-OHDA مورد بررسی قرار گرفت. در بدو امر لنتی ویروس‏های نوترکیب ساخته شد که ژن DJ-1 را با خود حمل می‏کردند (25). سلول‏های PC12 با این ویروس‏ها آلوده شده و شروع به بیان ژن گزارشگر Jred کردند که توام با DJ-1 در سازه لنتی ویروسی گنجانده شده بود. متعاقبا افزایش بیان DJ-1 نیز در سلول‏های مزبور با تکنیک RT-PCR به اثبات رسید. سلول‏های مهندسی شده فوق در معرض توکسین پارکینسونی 6-OHDA قرار گرفت. بررسی میزان بقای سلولی نشان داد که سلول‏های فوق در مقایسه با سلول‏های کنترل مقاومت معنی‏دار بیشتری نسبت به سمیت 6-OHDA نشان می‏دهند. متعاقبا آنالیز MTT نشان داد که سلول‏های PC12 با بیان فزاینده DJ-1 مقاومت بیشتر و معنی‏داری نسبت به سلول‏های کنترل در برابر توکسین پارکینسونی از خود بروز می‏دهند.

حفاظت سلول‏های دوپامین ساز در برابر سیگنال‏های مرگ یکی از استراتژی‏های مهم برای مقابله با PD و بیماری‏های وابسته به‏شمار می‏رود (26). سیگنال‏های مرگ در اثر افزایش استرس اکسیداتیو و نیز از التهاب عصبی در مغز بیماران فوق منشا می‏گیرد. در این زمینه گزارش‏ها حکایت از افزایش رادیکال‏های آزاد در جسم سیاه مغز پارکینسونی دارد و این تغییرات با اختلالات نوروبیولوژیکی مشاهده شده در مبتلایان به PD هم‏خوانی دارد (27). به این دلیل، تلاش‏ها برای به حداقل رساندن می‏تواند ارزش درمانی زیادی داشته باشد.

چندین مکانیسم دفاعی در برابر استرس اکسیداتیو وجود دارد که شامل آنتی اکسیدانت‏های غیر آنزیمی از جمله: آسکوربیک  اسید، گلوتاتیون، ویتامین E و غیره می‏باشد (28-30). همچنین مکانیسم‏های آنتی اکسیدانت آنزیمی از قبیل سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، گلوتاتیون پراکسیداز و پروکسی ردوکسین را می‏توان نام برد که جزو دفاع ضد اکسیدانی سلول به‏شمار می‏روند. علاوه بر این، مکانیسم سوم دفاع آنتی اکسیدانتی شامل تعمیر پروتئین‏های آسیب دیده و یا تجزیه آن‏ها وجود دارد که تیو رودوکسین‏ها وسیستم پروتئازومی در آن دخیل می‏باشند (31).

اینک با مسجل شدن نقش استرس اکسیداتیو در آسیب رساندن به مولکول‏های حیاتی استراتژی‏های حفاظت نورونی در این راستا تدوین و تنظیم می‏شوند که از طریق مقابله با استرس اکسیداتیو از مرگ سلول‏ها و شکل‏گیری یا پیشرفت بیماری‏های نورودژنراتیو جلوگیری نماید. شکل‏گیری چنین شیوه‏هایی حداقل در مورد PD در بدو امر مستلزم آن است که منابع باز تولید و یا افزایش استرس اکسیداتیو در مغز میانی شناسایی شوند تا سپس مکانیسم آسیب‏های وارده از آن به سلول‏های دوپامین ساز بررسی شود. با داشتن این اطلاعات می‏توان به‏دنبال یافتن راه‏ها و ابزاری رفت که این مکانیسم‏ها را مختل کرده  و با آسیب اکسیداتیو به سلول‏های مزبور مقابله نماید.

در این مطالعه مکانیسم ایجاد‏کننده و تشدید‏کننده رادیکال‏های آزاد و سیگنال‏های مرگ آفرین مغز میانی مد نظر قرار گرفت: استرس اکسیداتیو در اثر سمیت پارکینسونی که 6-OHDA آن‏را شبیه سازی می‏کند. فرضیه کانونی این مطالعه بر این اساس استوار شد که پروتئین DJ-1 به‏علت دارا بودن ویژگی‏های منحصر به‏فرد خود از نظر ضدآپوپتوزیس و ضد التهاب عصبی می‏تواند سلول‏ها را در برابر توکسین محافظت نماید.

نتایج این مطالعه بر آن است که سازه لنتی ویروسی که به سلول‏های PC12 منتقل شده است در بدو امر به‏طور موفقیت آمیز منجر به افزایش بیان ژن DJ-1 شده است. در گام بعدی این تغییر در میزان بیان DJ-1 توانسته است مقاومت سلول‏ها در برابر سمیت ناشی از 6-OHDA را به‏طور معنی‏داری افزایش دهد. این نتایج نشانگر آن است که مقدار پروتئین DJ-1 که در سلول‏های مهندسی شده PC12 بیان شده است برای مقابله با افزایش رادیکال‏های آزاد و یا خنثی سازی اثر مخرب آن‏ها تاثیرگذار  بوده و این تاثیر DJ-1 از نظر آماری محسوس بوده است. بدین ترتیب، ما در طی مطالعه حاضر لنتی ویروس DJ-1 را تولید کرده و با موفقیت آزمودیم که می‏تواند ابزار مفیدی در مطالعات حفاظت نورونی در برابر استرس اکسیداتیو و التهاب عصبی به‏شمار آید. 

نتیجه‏گیری

به‏طور خلاصه نتایج این مطالعه را می‏توان در موارد زیر خلاصه کرد:

1- افزایش بیان DJ-1 در سلول‏های PC12 با انتقال ژن آن توسط لنتی ویروس‏های نوترکیب امکانپذیر است.

2- افزایش بیان DJ-1 در سلول‏های PC12 می‏تواند با استرس اکسیداتیو ناشی از 6-OHDA مقابله کرده و سلول‏ها را حفظ نماید.

تشکروقدردانی

از کمک آقای عمران اسماعیل زاده در تهیه کلون‏ها و همکاری تکنیکی سپاسگزاری می‏شود.

1. Coyle JT, Puttfarcken P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 1993; 262(5134): 689-95.
2. Chinta SJ, Andersen JK. Dopaminergic neurons. The international journal of biochemistry & cell biology. 2005; 37(5): 942-6.
3. Gardaneh M. Dopamine-synthesizing neurons: An overview of their development and application for cell therapy. Iran J Biotechnol. 2010; 8(4): 8.
4. Smith Y, Kieval JZ. Anatomy of the dopamine system in the basal ganglia. Trends in neurosciences. 2000; 23: S28-S33.
5. Nagakubo D, Taira T, Kitaura H, Ikeda M, , et al. DJ-1, a novel oncogene which transforms mouse NIH3T3 cells in cooperation withras. Biochemical and biophysical research communications. 1997; 231(2): 509-13.
6. Hedrich K, Djarmati A, Schäfer N, Hering R, et al. DJ-1 (PARK7) mutations are less frequent than Parkin (PARK2) mutations in early-onset Parkinson disease. neurology. 2004; 62(3): 389-94.
7. Annesi G, Savettieri G, Pugliese P, D'Amelio M, et al. DJ 1 mutations and parkinsonism dementia amyotrophic lateral sclerosis complex. Annals of neurology. 2005; 58(5): 803-7.
8. Hague S, Rogaeva E, Hernandez D, Gulick C, et al. Earlyonset Parkinson's disease caused by a compound heterozygous DJ‐1 mutation. Annals of neurology. 2003; 54(2): 271-4.
9. Abou Sleiman PM, Healy DG, Quinn N, Lees AJ, Wood NW. The role of pathogenic DJ‐1 mutations in Parkinson's disease. Annals of neurology. 2003; 54(3): 283-6.
10. Takahashi K, Taira T, Niki T, Seino C, et al. DJ-1 positively regulates the androgen receptor by impairing the binding of PIASxα to the receptor. Journal of Biological Chemistry. 2001; 276(40): 37556-63.
11. Niki T, Takahashi-Niki K, Taira T, Iguchi-Ariga SM, et al. DJBP: A Novel DJ-1-Binding Protein, Negatively Regulates the Androgen Receptor by Recruiting Histone Deacetylase Complex, and DJ-1 Antagonizes This Inhibition by Abrogation of This Complex1 1 Ministry of Education, Science, Sport, Culture and Technology of Japan. 2 2 The nucleotide sequence reported in this paper has been submitted to the DDBJ/GenBank/EBI Data Bank with accession number AB073862. Molecular Cancer Research. 2003;1(4): 247-61.
12. Sekito A, Taira T, Niki T, Iguchi-Ariga SM, et al. Stimulation of transforming activity of DJ-1 by Abstrakt, a DJ-1-binding protein. International journal of oncology. 2005; 26(3): 685-9.
13. Kinumi T, Kimata J, Taira T, Ariga H, et al. Cysteine-106 of DJ-1 is the most sensitive cysteine residue to hydrogen peroxide-mediated oxidation in vivo in human umbilical vein endothelial cells. Biochemical and biophysical research communications. 2004; 317(3): 722-8.
14. Taira T, Saito Y, Niki T, Iguchi Ariga SM, et al. DJ 1 has a role in antioxidative stress to prevent cell death. EMBO reports. 2004; 5(2): 213-8.
15. Canet-Avilés RM, Wilson MA, Miller DW, Ahmad R, et al. The Parkinson's disease protein DJ-1 is neuroprotective due to cysteine-sulfinic acid-driven mitochondrial localization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2004; 101(24): 9103-8.
16. Honbou K, Suzuki NN, Horiuchi M, Niki T, et al. The crystal structure of DJ-1, a protein related to male fertility and Parkinson's disease. Journal of Biological Chemistry. 2003; 278(33): 31380-4.
17. Takahashi-Niki K, Niki T, Taira T, Iguchi-Ariga SM, et al. Reduced anti-oxidative stress activities of DJ-1 mutants found in Parkinson’s disease patients. Biochemical and biophysical research communications. 2004; 320(2): 389-97.
18. Olzmann JA, Brown K, Wilkinson KD, Rees HD, et al. Familial Parkinson's disease-associated L166P mutation disrupts DJ-1 protein folding and function. Journal of Biological Chemistry. 2004; 279(9): 8506-15.
19. Shendelman S, Jonason A, Martinat C, Leete T, et al. DJ-1 is a redox-dependent molecular chaperone that inhibits α-synuclein aggregate formation. PLoS biology. 2004; 2(11): e362.
20. Zhou W, Zhu M, Wilson MA, Petsko GA, at al. The oxidation state of DJ-1 regulates its chaperone activity toward α-synuclein. Journal of molecular biology. 2006; 356(4): 1036-48.
21. Chen L, Cagniard B, Mathews T, Jones S, et al. Age-dependent motor deficits and dopaminergic dysfunction in DJ-1 null mice. Journal of Biological Chemistry. 2005; 280(22): 21418-26.
22. Kim RH, Smith PD, Aleyasin H, Hayley S, et al. Hypersensitivity of DJ-1-deficient mice to 1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyrindine (MPTP) and oxidative stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2005; 102(14): 5215-20.
23. Goldberg MS, Pisani A, Haburcak M, Vortherms TA, et al. Nigrostriatal dopaminergic deficits and hypokinesia caused by inactivation of the familial Parkinsonism-linked gene DJ-1. Neuron. 2005; 45(4): 489-96.
24. Inden M, Taira T, Kitamura Y, Yanagida T, et al. PARK7 DJ-1 protects against degeneration of nigral dopaminergic neurons in Parkinson’s disease rat model. Neurobiology of disease. 2006; 24(1): 144-58.
25. Naldini L, Dull T, Farson DA, Witt R. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors. US PATENT 6165782 A, 2000.
26. Kitamura Y, Kosaka T, Kakimura J-I, Matsuoka Y, et al. Protective effects of the antiparkinsonian drugs talipexole and pramipexole against 1-methyl-4-phenylpyridinium-induced apoptotic death in human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Molecular pharmacology. 1998; 54(6): 1046-54.
27. Dexter DT, Holley AE, Flitter WD, Slater TF, et al. Increased levels of lipid hydroperoxides in the parkinsonian substantia nigra: an HPLC and ESR study. Movement Disorders. 1994; 9(1): 92-7.
28. Frei B. Ascorbic acid protects lipids in human plasma and low-density lipoprotein against oxidative damage. The American journal of clinical nutrition. 1991; 54(6 Suppl): 1113S-8S.
29. Dhitavat S, Ortiz D, Rogers E, Rivera E, S, et al. Folate, vitamin E, and acetyl-L-carnitine provide synergistic protection against oxidative stress resulting from exposure of human neuroblastoma cells to amyloid-beta. Brain research. 2005; 1061(2): 114-7.
30. Grant CM, MacIver FH, Dawes IW. Glutathione is an essential metabolite required for resistance to oxidative stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Current genetics. 1996; 29(6): 511-5.
31. Jung T, Catalgol B, Grune T. The proteasomal system. Molecular aspects of medicine. 2009; 30(4): 191-296.