مقدمه

مسمومیت کبدی یکی از مشکلات رایج پزشکی  در سراسر دنیا است. نقش کبد به‏عنوان اندامی مرکزی در متابولیسم بسیاری از داروها و مواد شیمیایی، آن را مستعد بسیاری از مسمومیت‏ها می‏سازد(1). بر اساس  منابع موجود، سمیت کبدی با مکانیسم‏های متنوعی به‏وقوع می‏پیوند. یکی از مکانیسم‏های عمده مرتبط با سمیت کبدی شامل تشکیل رادیکال‏های آزاد و ایجاد استرس اکسیداتیودر کبد است (2). در حال حاضر مشخص شده است که رادیکال‏های آزاد و استرس اکسیداتیو دار نقش مهمی در سمیت کبدی و همچنین برخی دیگر از بیماری‏های کبدی است. گونه‏های رادیکال آزاد قادر به برهم کنش با ماکرومولکول های سلولی نظیر؛ لیپیدها، پروتئین ها و نوکلئیک اسیدها هستند که در نهایت می تواند منجر به اکسیداسیون لیپیدهای غشای سلولی شده و آسیب سلولی را ناشی شود. مدل‏های تجربی زیادی برای مطالعه مکانیسم‏های سمیتکبدی و بررسی اثرات درمانی احتمالی ترکیبات مختلف مورد استفاده قرار می‏گیرد. آسیب کبدی ناشی از تتراکلرید کربن (CCL₄)، معمول‏ترین مدل درون تن ( in vivo) است که دهه‏های متمادی به‏طور گسترده  برای مکانیسم آسیب سلولی ناشی از رادیکال‏های آزاد در سلول‏های کبدی مورد استفاده محققان قرار گرفته است (3و4). سیروز القاشده در موش‏های صحرایی تشابه زیادی با نوع انسانی دارد (5). CCL₄  یک مایع فرار است که به‏واسطه کلریناسیون متان، اتان، پروپان یا پروپن تشکیل می‏شود. اعتقاد بر این است که قسمتی از سمیت کبدی ناشی از CCL₄  از برهم‏کنش‏های ناشی از متابولیسم CCL₄  منشا می‏گیرد. در این فرآیند، CCL₄  متحمل یک واکنش دهالوژناسیون احیایی به‏واسطه مونواکسیژنازهای شبکه آندوپلاسمی  سلول‏های کبدی می‏شود. این واکنش CCL₄  به‏وسیله آنزیم‏های سیتوکروم P450  به رادیکال تری کلرومتیل ( CCl3) کاتالیزه می‏شود (6-8). این رادیکال ممکن است با اکسیژن واکنش داده  و تشکیل رادیکال تری کلرو متیل پروکسی دهد (CCl₃·O₂) (9). تشکیل این رادیکال‏ها و شاید دیگر حد واسط‏های رادیکالی که ممکن است در واکنش با اکسیژن در درون سلول‏ها صورت گیرد. در فرآیند پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی سلول  دخالت می‏کنند. این فرآیند سرانجام منجر به ایجاد استرس اکسیداتیو می‏شود که به‏نظر می‏رسد دارای نقش مهمی در آسیب‏زایی و پاتوژنز آسیب کبدی است (10). آسیب کبدی ناشی از CCL₄  منجر به افزایش مارکرهای بیوشیمیایی آسیب کبدی در سرم نظیر؛ گلوتامات اگزالواستات ترانس آمینازسرمی (SGOT)، گلوتامات پیراوت ترانس آمیناز سرمی (SGPT)، آلکالین فسفاتاز (ALP)  و بیلی روبین تام سرمی (TB)  می‏شود (13-11).

عصاره‏های تهیه شده از گیاهان دارویی قرن‏ها برای درمان بیماری‏های مختلف مورد استفاده قرار گرفته است. بسیاری از گیاهان دارویی به‏منظور کشف ترکیبات گیاهی موثر برای مقابلهبا آسیب‏های کبدی ناشی از مسمومیت کبدی، مورد بررسی قرار گرفته است (14). در حقیقت، اعتقاد بر این است که بسیاری از ترکیبات گیاهی جدا شده ازاین گیاهان، قادر به تخفیف شرایط اکسیداتیو سلولی است و بنابراین، در درمان و جلوگیری از آسیب کبدی می تواند موثر باشد.

شنگ گیاهی با نام علمی Tragopogon graminifolius L.، یک گیاه دارویی است که استفاده از آن برای درمان بیماری‏های  معدی- روده‏ای  و همچنین بیماری‏های کبدی در غرب ایران مرسوم است. روغن‏های ضروری  و عصاره اتانولی تراگوپوگون گرامینی فولیوس متشکل از ترکیباتی با فعالیت آنتی اکسیدانتی و میکروب کشی است (15).  بنابراین در مطالعه حاضر، اثرات عصاره هیدرواتانولی T. graminifolius Extract(THE) در مدل سمیت کبدی القا شده ناشی از CCL₄  در موش‏های صحرایی نر بالغ مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روش‏ها

حیوانات: موش‏های صحرایی نر بالغ (8 هفته ای)، با وزن تقریبی 220 تا 250 گرم، از موسسه انستیتو پاستور ایران (تهران، ایران) تهیه شد و در شرایط بهداشتی معمولی، نور 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی، دما و رطوبت مناسب به‏منظور تطبیق با شرایط حیوان خانه به‏مدت دو هفته نگه‏داری شد. تمامی حیوانات دارای دسترسی آزاد به غذا و آب بودند. پروتکل این تحقیق بر اساس قوانین بین المللی در مورد حیوانات آزمایشگاهی و همچنین کمیته اخلاق کار با حیوانات آزمایشگاهی دانشگاه بوعلی سینا همدان انجام گردید.

طراحی مطالعه: در مطالعه حاضر تعداد 42 سر موش صحرایی نژاد ویستار به‏صورت تصادفی به 6 گروه (هر گروه 7 سر) تقسیم شد و گروه‏ها در طول 96 ساعت (4 روز) تحت تیمارهای متفاوت قرار گرفتند.  گروه‏های مورد مطالعه به روش زیر تیمار شدند:

1-گروه کنترل: حیوانات این گروه میزان 2 میلی لیتر به ازا هر کیلوگرم وزن بدن (ml/kg B.W) از نرمال سالین را به‏صورت درون صفاقی (i.p)  در طی دروه آزمایش دریافت کردند.

2- گروه شم: حیوانات این گروه میزان ml/kg B.W 2 روغن زیتون استریلیزه را به‏صورت i.p در طی دروه آزمایش دریافت کردند.

3- گروه شاهد: حیوانات این گروه مخلوط ml/kg B.W 2 روغن زیتون استریلیزه به‏علاوه CCL₄ را با نسبت 1:1 به‏صورت i.p در طی دوره آزمایش دریافت کردند.

4- گروه تیمار1: حیوانات این گروه به‏دنبال دریافت مخلوط ml/kg B.W 2 روغن زیتون استریلیزه به‏علاوه CCL₄ را با نسبت 1:1 به‏صورت i.p ، میزان mg/ kg B.W 200 از THE را در طی دروه آزمایش دریافت کردند.

5- گروه تیمار2: حیوانات این گروه به‏دنبال دریافت مخلوط ml/kg B.W 2 روغن زیتون استریلیزه به‏علاوه CCL₄ را با نسبت 1:1 به‏صورت i.p ، میزان mg/ kg B.W 400 از THE را در طی دروه آزمایش دریافت کردند.

6- گروه تیمار3: حیوانات این گروه به‏دنبال دریافت مخلوط ml/kg B.W 2 روغن زیتون استریلیزه به‏علاوه CCL₄ را با نسبت 1:1 به‏صورت i.p ، میزان mg/ kg B.W 800 از THE را در طی دروه آزمایش دریافت کردند.

در گروه های 3 تا 6، عصاره 4 بار تزریق شد که اولین تزریق 2 ساعت بعد از تزریق مخلوط روغن زیتون و CCL₄ انجام شد.

بعد از یک فاصله زمانی 4 روزه از آغاز تیمارها، حیوانات با اتیل اتر بی‏هوش شده و خون‏گیری از قلب در حال تپش حیوانات با استفاده از یک سرنگ هپارینه و با سانتریفیوژ خون در شتاب g 800 به‏مدت 15 دقیقه انجام شد. سرم تهیه شده و برای سنجش مارکرهای بیوشیمیایی ALT، AST و ALP مورد استفاده قرار گرفت. بعد از خون‏گیری، بافت کبد حیوانات از بدن خارج شد و با استفاده از بافر سالین به دقت شستشو داده شد. به‏منظور تهیه لام پاتولوژی و بررسی‏های مورفولوژی بافت کبد، یک بخشی از بافت کبد بریده شده و به‏صورت جداگانه در فرمالین 10 درصد فیکس شده و برای رنگ آمیزی هماتوکسلین – ائوزین (H&E) مهیا گردید.

اندازه‏گیری پارامترهای بیوشیمیایی: فعالیت سرمی آنزیم‏های ALT  و AST با استفاده از کیت‏های سنجش تجاری  زیست شیمی ( ایران) و فعالیت سرمی آنزیم ALP با استفاده از کیت تجاری درمانکاو (ایران) سنجش شد.

تهیه عصاره گیاهی:گیاه شنگ از باغ گیاهان دارویی سازمان جهاد کشاورزی استان همدان تهیه و توسط کارشناس گیاه‏شناس آن مرکز شناسسایی شد. پس از جداسازی برگ گیاه شنگ، برگ‏ها در سایه خشک شدند و سپس توسط دستگاه میکسر پودر شد و 120 گرم از آن در 100 میلی لیتر اتانول 80 درصد به‏مدت یک هفته قرار گرفت. سپس محلول رویی عصاره توسط کاغذ صافی فیلتر شد. محلول جدا شده توسط دستگاه روتاری تبخیر و عصاره غلیظ شده جدا و در ظروف پتری قرار داده شد. عصاره مذکور جهت خشک شدن به‏مدت 48 ساعت در زیر هود قرار گرفت.

آنالیز آماری

در این مطالعه بسته نرم افزاری SPSS 20 برای آنالیز داده‏ها مورد استفاده قرار گرفت. جهت تعیین نرمال بودن داده‏ها از آزمون کولموگروف- اسمیرنوف استفاده شد. داده‏های مورد بررسی همه نرمال بودند. در صورت عدم نرمال بودن توزیع داده‏ها، تفاوت بین گروه‏ها با استفاده از تست آماری کوریسکال- والیس تعیین می‏شود. آزمون مورد استفادهANOVA یک‏طرفه بین آزمودنی بوده و تست توکی برای آنالیز تفاوت بین دو گروه  به‏کار گرفته شد. ارزش P  کمتر از 05/0 به‏عنوان سطح معنی‏داری تفاوت‏های آماری در این تحقیق مورد نظر گرفته شد.

نتایج

مطالعات هیستوپاتولوژی

مشاهدات میکروسکوپی برش‏های بافتی در شکل 1 نشان می‏دهد که معماری بافتی بافت کبد در نمونه‏های کنترل و شم نرمال بوده است و هیچ ناحیه نکروتیک در اطراف سیاهرگ‏های مرکزی دیده نمی‏شود. با این‏حال، تزریق دوز ml/kg B.W 2 از CCL₄ منجر به القای نکروز گسترده بافتی  و فراخوانی سلول‏های ایمنی در نواحی اطراف سیاهرگ‏های مرکزی می‏شود. از طرف دیگر، بافت کبدی موش‏های صحرایی تحت مسمومیتCCL₄ که  با غلظت‏های افزایشی THE( از mg/kg B.W 200 تا 800) تیمار شده بودند، کاهش قابل توجهی را از نظر مورفولوژی در آسیب‏های بافتی کبد نشان دادند.  این نمونه‏ها دارای کاهش نسبی قابل توجهی در تعداد سلول‏های نکروتیک و بافتی و همچنین تعداد سلول‏های فراخوان شده التهابی به نواحی اطراف سیاهرگ‏های مرکزی بودند (شکل 1).

شکل 1: کبد یک موش صحرایی کنترل که میزان ml/kg B.W 2 بافر نرمال سالین را به‏صورت درون صفاقی دریافت کرده است. b ) کبد یک موش از گروه شم که میزان ml/kg B.W 2 از روغن زیتون را به‏صورت درون صفاقی دریافت کرده است، c) موش صحرایی تیمار شده با مخلوطی حاوی ml/kg B.W 2 از روغن زیتون به همراه CCL4 با نسبت 1:1 که به‏صورت درون صفاقی تزریق شده است d، e و f) نمونه‏های بافتی تهیه شده از موش‏های صحرایی که مخلوطی از روغن زیتون استریل و CCL4 ( با نسبت 1:1) را همراه با به‏ترتیب mg/kg B.W 200، 400 و 800  از THE، به‏صورت درون صفاقی دریافت کرده‏اند. پیکان‏های تیره نمایانگر نواحی متحمل نکروز حاد سلولی است و پیکان‏های روشن نواحی از تجمعات سلولی می‏باشد. دایره‏های نشان دهنده نواحی از بافت است که تهاجم سلول‏های التهابی در آن دیده می‏شود. رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین (H&E) برش‏های بافت کبد (‏بزرگنمایی 100 ×)

پارامترهای بیوشیمیایی

نمودارهای 1 تا 3 شامل داده‏های به‏دست آمده از ارزیابی مارکرهای بیوشیمیایی برای تعیین آسیب کبدی می‏باشد. این مارکرها شامل: ALT،  AST  و ALP سرم موش‏های صحرای مورد مطالعه است.

ALT

 براساس نمودار  1 سطوح سرمی ALT  در موش‏های صحرایی تیمار شده باml/kg B.W 2 مخلوط روغن زیتون استریلیزه و CCL4 با نسبت 1:1 به‏صورت معنی‏داری(P< 0.05)  به بالاتر از سطوح آن در مقایسه با گروه‏های کنترل و شم رسید. تیمار توام غلظت‏های مختلف THE (mg/kg B.W 200، 400 و 800 ) با CCL4 یک پاسخ حفاظتی وابسته به دوز را نشان داد به‏طوری‏که: هر چه غلظت THE مورد استفاده بالاتر بود، سطوح ALT سرم پایین‏تری مشاهده می‏شد. همان گونه که در شکل 2 نشان داده شده است، استفاده از غلظت‏های mg/kg B.W 400 و 800  از THE همراه با CCL₄ ، باعث جلوگیری از افزایش معنی‏دار ALT در مقایسه با حالتی است که CCL4 به‏تنهایی استفاده می‏شود. در حالی‏که، اثر مشابهی در دوز mg/kg B.W 200 مشاهده نشد (نمودار 1).

نمودار1: اثرات وابسته به دوز THE بر میزان فعالیت سرمی ALT در موش‏های تیمار شده با CCL4 در مقایسه با گروه‏های کنترل، شم و گروه تیمار شده تنها با CCL4. گروه کنترل: میزان ml/kg B.W 2 بافر نرمال سالین گروه شم: میزان ml/kg B.W 2 از روغن زیتون گروه CCL4: مخلوطی حاوی ml/kg B.W 2 از روغن زیتون به‏همراه CCL4 با نسبت 1:1. گروه های THE+ CCL4: مخلوطی از روغن زیتون استریل و CCL4 ( با نسبت 1:1) را همراه با به‏ترتیب mg/kg B.W 200، 400 و 800  از THE. تمامی تزریق­ها به‏صورت درون صفاقی. ارزش P  کمتر از 05/0 به‏عنوان سطح معنی‏داری تفاوت‏های آماری در این تحقیق مورد نظر گرفته شد. هر یک از مقادیر نشان دهنده میزان میانگین± انحراف معیار است.  a نشان دهنده تفاوت معنی‏دار سطح سرمی آنزیمی در هر یک از گروه‏ها نسبت به گروه کنترل است.b نشان دهنده تفاوت معنی‏دار سطح سرمی آنزیمی در هر یک از گروه‏ها نسبت به گروه شم است.  cنشان دهنده تفاوت معنی‏دار سطح سرمی آنزیمی در هر یک از گروه‏ها نسبت به گروه CCL4 است  dنشان دهنده تفاوت معنی‏دار میزان فعالیت آنزیمی در هر یک از گروه‏ها نسبت به گروه(mg/kg B.W200CCL4+THE ( است.

AST

سطوح سرمی AST در گروه موش‏های صحرایی تیمار شده با ml/kg B.W 2 مخلوط روغن زیتون استریلیزه و CCL4 با نسبت 1:1 منجر به افزایش معنی دار (05/0p< ) در سطوح سرمی آنزیم در مقایسه با میزان آن در گروه‏های کنترل و شم شد که به‏ترتیب، ml/kg B.W 2 نرمال سالین و روغن زیتون استریلیزه را دریافت کرده بودند. تیمار توام غلظت‏های متفاوت THE با CCL₄ در موش‏ها نشان دهنده رفتار حفاظتی وابسته به دوزی از THE شد که در آن، با دو برابر شدن دوز THE، سطوح سرمی آنزیم نیز به‏میزان معنی‏داری همراه با کاهش شد. استفاده از غلظت mg/kg B.W 800 از THE همراه با CCL₄ ، با جلوگیری از افزایش معنی‏دار (05/0p< )، AST  نسبت به گروه‏های کنترل و شم شد (نمودار 2).

نمودار2: اثرات وابسته به دوز THE بر میزان فعالیت سرمی AST در موش‏های تیمار شده با CCL4 در مقایسه با گروه‏های کنترل، شم و گروه تیمار شده تنها با CCL4. گروه کنترل: میزان ml/kg B.W 2 بافر نرمال سالین را به‏صورت درون صفاقی دریافت کرد، گروه شم: میزان ml/kg B.W 2 از روغن زیتون را به‏صورت درون صفاقی دریافت کرد، گروه CCL4: مخلوطی حاوی ml/kg B.W 2 از روغن زیتون به‏همراه CCL4 با نسبت 1:1 که به‏صورت درون صفاقی تزریق شد. گروه‏های THE+ CCL4: مخلوطی از روغن زیتون استریل و CCL4 ( با نسبت 1:1) را همراه با به‏ترتیب mg/kg B.W 200، 400 و 800  از THE، به‏صورت درون صفاقی دریافت کردند. ارزش P  کمتر از 05/0 به‏عنوان سطح معنی‏داری تفاوت‏های آماری در این تحقیق مورد نظر گرفته شد. هر یک از مقادیر نشان دهنده میزان میانگین± انحراف معیار است. . aنشان دهنده تفاوت معنی‏دار سطح سرمی آنزیمی در هر یک از گروه‏ها نسبت به گروه کنترل است.bنشان دهنده تفاوت معنی‏دار سطح سرمی آنزیمی در هر یک از گروه ها نسبت به گروه شم است. C نشان دهنده تفاوت معنی‏دار سطح سرمی آنزیمی در هر یک از گروه‏ها نسبت به گروه CCL4 است.  dنشان دهنده تفاوت معنی‏دار میزان فعالیت آنزیمی در هر یک از گروه‏ها نسبت به گروه (mg/kg B.W200CCL4+THE ( است. e نشان دهنده تفاوت معنی‏دار سطح سرمی آنزیمی در هر یک از گروه‏ها نسبت به گروه (mg/kg B.W400CCL4+THE ( است.

ALP

تیمار موش‏ها با مخلوط حاوی روغن زیتون استریلیزه و CCL4، با نسبت 1:1، منجر به افزایش معنی­دار سطوح ALP سرمی نسبت به گروه‏های کنترل و شم می‏شود. تیمار توام سه غلظت صعودی THE (mg/kg B.W 200، 400 و 800 ) با CCL₄ منجر به کاهش سطوح ALT سرم می‏شود. با این‏حال، از میان دوزهای استفاده شده، تنها دوز mg/kg B.W 800 از THE منجر به ایجاد تفاوت معنی‏دار نسبت به گروه CCL4 شد (نمودار 3).

نمودار 3: اثرات وابسته به دوز THE بر میزان فعالیت سرمی ALP در موش‏های تیمار شده با CCL4 در مقایسه با گروه‏های کنترل، شم و گروه تیمار شده تنها با CCL4، گروه کنترل: میزان ml/kg B.W 2 بافر نرمال سالین گروه شم: میزان ml/kg B.W 2 از روغن زیتون گروه CCL4: مخلوطی حاوی ml/kg B.W 2 از روغن زیتون به همراه CCL4 با نسبت 1:1. گروه‏های THE+ CCL4: مخلوطی از روغن زیتون استریل و CCL4 ( با نسبت 1:1) را همراه با به‏ترتیب mg/kg B.W 200، 400 و 800  از THE. تمامی تزریق­ها به‏صورت درون صفاقی. ارزش P  کمتر از 05/0 به‏عنوان سطح معنی‏داری تفاوت‏های آماری در این تحقیق مورد نظر گرفته شد. هر یک از مقادیر نشان دهنده میزان میانگین± انحراف معیار است.  a نشان دهنده تفاوت معنی‏دار سطح سرمی آنزیمی در هر یک از گروه‏ها نسبت به گروه کنترل است.b نشان دهنده تفاوت معنی‏دار سطح سرمی آنزیمی در هر یک از گروه‏ها نسبت به گروه شم است. c نشان دهنده تفاوت معنی‏دار سطح سرمی آنزیمی در هر یک از گروه‏ها نسبت به گروه CCL4 است.   dنشان دهنده تفاوت معنی‏دار سطح سرمی آنزیمی در هر یک از گروه‏ها نسبت به گروه (mg/kg B.W200CCL4+THE ( است.