نوع مقاله : علمی - پژوهشی
چکیده
هدف: حرکت آب از عرض غشاهای سلولی با حضور پروتئین‌هایی بنام کانال آبی یا آکواپورین تسهیل می‌شود. کانالهای آبی غشاپلاسمایی گیاهان به دو گروه PIP1s و PIP2s تقسیم می‌شوند که فعالیت انتقال آب متفاوتی را نشان می‌دهند به طوری که PIP1s غیرفعال بوده، در حالیکه PIP2s افزایش قابل توجهی را در ضریب نفوذپذیری آبی اسموتیک غشاء (p f) موجب می‌شود. این تفاوت در فعالیت انتقال آب آن‌ها می‌تواند ناشی از مکان متفاوت آن‌ها در سلول باشد. هدف از این تحقیق بررسی مکان درون سلولی دو کانال آبی NtPIP1;1 (عضو گروه PIP1s) و NtPIP2;1 (عضو گروه PIP2s) در سلول‌های زنده مزوفیل برگ گیاه توتون است.
مواد و روش‌ها: در این مطالعه تجربی توالی cDNA دو کانال آبی به توالی ژن کد کننده پروتئین فلورسانت سبز (GFP) متصل گردید و به طور موقتی در پروتوپلاست‌های تهیه شده از مزوفیل برگ توتون بیان شدند. سپس با استفاده از طول موج برانگیختگی نور آبی مکان درون سلولی این دو کانال آبی در زیر میکروسکوپ فلورسانس بررسی شد.
نتایج: نتایج نشان داد که NtPIP1;1 در ساختارهای غشایی داخل سلول باقی مانده در حالیکه NtPIP2;1 به غشا پلاسمایی منتقل می‌شود. بیان همزمان وکتور‌های حامل توالی NtPIP1;1-GFp و HDEL-YFp (نشانگر شبکه اندوپلاسمی متصل به پروتئین با فلورسانس زرد) در پروتوپلاست‌ها نشان داد که NtPIP1;1 در مکان‌هایی مشابه با HDEL (لیزین- آسپارتیک اسید- گلوتامیک اسید-لوسین) در سلول قرار می‌گیرد.
نتیجه گیری: کانال آبی NtPIP2;1 به غشاء پلاسمایی سلول مستقر شده در حالیکه NtPIP1;1 در داخل شبکه آندوپلاسمی باقی مانده و به غشا پلاسمایی منتقل نمی‌شود و به همین دلیل فاقد فعالیت انتقال آب است.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
NtPIP1;1 and NtPIP2;1 Aquaporins have Different Localization in Nicotiana tabacum Cells
چکیده [English]
Aim: Movement of water across cellular membranes is facilitated by the presence of water channels named aquaporins. Plant plasma membrane intrinsic proteins (PIPs) fall into two groups, PIP1s and PIP2s that exhibit different water channel activities. So PIP1s are inactive, whereas PIP2s induce a marked increase in the membrane osmotic water permeability coefficient, p < /em>f. This difference may be due to their subcellular localization. The aim of this research was to determine the subcellular localization of NtPIP1;1 and NtPIP2;1 in living tobacco cells.
Material and methods: In this experimental study, NtPIPs cDNA sequences were fused to green fluorescent protein gene and expressed transiently in tobacco mesophyll protoplasts. Then, cellular localization of aquaporins was investigated using fluorescent microscope under blue excitation wavelength.
Results: When expressed alone, NtPIP1;1 fusion protein was retained in the internal membrane structures, whereas NtPIP2;1 was found in membrane structure within the cell. To identify the internal structures containing NtPIP1;1 fusion proteins, NtPIP1;1-GFP was co-expressed in tobacco protoplasts with the YFP::HDEL protein, an ER marker. As shown, NtPIP1;1-GFP and YFP::HDEL colocalized.
Conclusion: NtPIP2;1 was transported to plasma membrane, but NtPIP1 was retained in the ER of tobacco protoplasts so showed no water transport activity.
کلیدواژه‌ها [English]
- Aquaporin
- Green Fluorescent Protein
- Yellow Fluorescent Protein
- Tobacco
- Water Channel
مقدمه
حرکت آب از عرض غشاهای سلولی در اثر حضور کانالهای آبی به نام آکواپورین‌ها (AQPs) تسهیل می‌شود. این پروتئین‌ها مرکب از شش دومین طی کنندهی عرض غشا بوده که توسط 5 لوپ به یکدیگر متصل شده‌اند بطوریکه N و C ترمینال آن‌ها در داخل سیتوسول قرار دارد (1 و 2).
آکواپورین‌های گیاهی تنوع ایزوفرمی قابل توجهی را نشان می‌دهند. تعیین توالی ژنوم، تعداد دقیق ژن‌های آکواپورین را تا مرز 35 عدد در گیاه آرابیدوپسیس (2 و 3) و 33 عدد در گیاه ذرت (1 و4) تعیین نموده است. بر پایهی شباهت توالی، آکواپورین‌های گیاهی به 4 زیر گروه که تا حدودی مطابق با مکان آن‌ها در سلول است تقسیم می‌شوند (1، 2 و 5). پروتئین‌های نوع تونوپلاستی (TIPs) و نوع غشا پلاسمایی (PIPs) آکوارپورین‌هایی هستند که به ترتیب در غشاهای واکوئلی و پلاسمایی به وفور بیان می‌شوند. سومین زیر گروه شامل پروتئین‌های غشایی شبه نودولین26 (NIPs) هستند. به عبارتی این زیر گروه همولوگ‌های نزدیک به GmNod26 (آکواپورین فراوان در غشا پری‌باکتروئید گرهک‌های تثبیت کنندهی ازت در ریشه‌های سویا) می‌باشند. NIPs در غیرلگوم‌ها نیز وجود دارند و در این گیاهان در غشاهای پلاسمایی و درون سلولی قرار گرفته‌اند (2). زیر گروه آخر پروتئین‌های بازی کوچک (SIPs) بوده که غالبا در شبکهی آندوپلاسمی قرار دارند (2).
آکواپورین‌های غشا پلاسمایی یا PIPs خود به دو گروه فیلوژنتیکی PIP1 و PIP2 تقسیم می‌شوند. اعضای این دو گروه نه تنها از لحاظ طول N و C ترمینال خود متفاوت می‌باشند بلکه فعالیت کانال آب متفاوتی را هنگام بیان در اووسیت‌های زنوپوس نشان می‌دهند (6). درحالیکه PIP1s عموما در این میزبان هترولوگ خاموش می‌باشند، PIP2s فعالیت کانال آب بالایی را نشان می‌دهند. مطالعات دقیق‌تر بر روی مکان درون سلولی آکواپورین‌های نوع PIP1 و PIP2 در پروتوپلاست‌های مزوفیل گیاه ذرت نشان می‌دهد که دلیل پائین بودن فعالیت انتقال آب در آکواپورین‌های نوع PIP1 به خاطر باقی ماندن این آکواپورین‌ها در داخل شبکه آندوپلاسمی و در نتیجه عدم انتقال آن‌ها به داخل غشا پلاسمایی سلول‌های گیاهی می‌باشد (7). قبلا ما نشان دادیم که آکواپورین NtPIP1;1 گیاه توتون هنگام بیان در اووسیت‌های زنوپوس، به مقدار زیاد در داخل سیتوپلاسم اووسیت باقی مانده و کمتر به غشا مهاجرت می‌کند (8). برای مطالعه دقیق‌تر این مطلب، در این تحقیق محل درون سلولیNtPIP1;1 وNtPIP2;1 در داخل سلول‌های زنده مزوفیل گیاه توتون با استفاده از مارکرهای غشایی مختلف مورد مطالعه قرار گرفت.
مواد و روش‌ها
تهیه گیاه:گیاه توتون (Nicotiana tabacum cv. Samsun) در شرایط آزمایشگاهی در اتاقک رشد در دمای 22 درجه سانتی‌گراد با رژیم نوری 16 ساعت روشنایی 8 ساعت تاریکی با شدت نور 150 میکرومول بر مترمربع بر ثانیه بر روی محیط کشت جامد موراشیک و اسکوگ (MS) (9) با قدرت نصف (8/0درصد آگار) حاوی 1 درصد سوکروز و 5 میلی‌مولار MES- KOH، pH برابر 5/5 به مدت 3 الی 4 هفته به منظور تهیه پروتوپلاست رشد داده شد (8).
اتصال پروتئین فلورسانت سبز (Green Fluorescent Protein, GFP) به C یا N-ترمینال پروتئین آکواپورین:کلیه مراحل مولکولیطبق روش Sambrook و همکاران (10) انجام گرفت. برای اتصال GFP به C-ترمینال آکواپورین‌هایNtPIP1;1 وNtPIP2;1، ابتدا cDNA مربوط به آن‌ها توسط PCR با استفاده از پرایمرهای اختصاصی جهت اتصال سایت‌های با اثر محدود XhoI و SpeI به ترتیب در انتهای َ5 و َ3 آن‌ها تکثیر شدند. توالی پرایمرها در جدول 1 ارائه شده است (8).
محصولات تکثیر برای اطمینان از عدم وجود خطا در توالی پروتئین، در وکتور TOPO کلون و توالی آن‌ها توسط دستگاه توالی‌یابDNA طبق روش Sanger و همکارن (11) تعیین گردید.
برای اتصال GFP به N-ترمینال آکواپورین‌های فوق، از پرایمرهای اختصاصی جهت اتصال سایت‌های با اثر محدود XbaI و BamHI به ترتیب در انتهای َ5 و َ3 cDNA NtPIP1;1 وNtPIP2;1 استفاده شد. توالی پرایمرها در جدول 2 ارائه شده است.
قرار دادن NtPIP1;1 cDNA و NtPIP2;1 در کاست بیانی GFP-JFH: وکتور به کار رفته برای بیان موقتی در پروتوپلاست‌های مزوفیل تنباکو عبارت بود از pUC19 که حاوی کاست بیانی GFP-JFH-1 می‌باشد. شکل 1 محل آنزیم‌های با اثر محدود جهت کلون سازی در این کاست بیانی را نشان می‌دهد. این کاست دارای پروموتر قوی 35S از ویروس موزائیک گل کم (CaMV 35S) و خاتمه دهندهی رونویسی نوپالین سنتاز (NOS) از آگروباکتریوم می‌باشد (12). برای اتصال GFP به C-ترمینال یا N-ترمینال آکواپورین‌های NtPIP1;1 و NtPIP2;1، ابتدا کلون‌های cDNA NtPIP1;1 یا NtPIP2;1 همراه با وکتور بیانی فوق در معرض هضم آنزیمی مضاعف قرار گرفتند (10).
جدول 1: توالی پرایمرهای به کار رفته جهت اتصال سایت‌های XhoI و SpeI به cDNA آکواپورین
|
ژن |
توالی پرایمرهای جلویی (Fw) و معکوس (Rv) |
دمای ذوب ( Cْ) |
|
NtPIP1;1 |
Fw: 5′ CGCTCGAGATGGCAGAAAACAAAGAAG 3′ XhoI Rv: 5′ CGACTAGTGCTCTTGAATGGAATGGC3′ SpeI |
62 1/62 |
|
NtPIP2;1 |
Fw: 5′ CGCTCGAGATGTCAAAGGACGTGATTG 3′ XhoI Rv: 5′ CGACTAGT GTTGGTTGGGTTACTGCG 3′ SpeI |
5/63 6/63 |
جدول 2: توالی پرایمرهای به کار رفته جهت اتصال سایت‌های XbaI و BamHI به cDNA آکواپورین (8).
|
ژن |
توالی پرایمرهای جلویی (Fw) و معکوس (Rv) |
دمای ذوب ( Cْ) |
|
NtPIP1;1 |
Fw: 5′ CGTCTAGAATGGCAGAAAACAAAGAAG 3′ XbaI Rv: 5′ CGGGATCCTTAGCTCTTGAATGGAATG 3′ BamHI |
9/61
62 |
|
NtPIP2;1 |
Fw: 5′ CGTCTAGAATGTCAAAGGACGTGATTC 3′ XbaI Rv: 5′ CGGGATCCTTAGTTGGTTGGGTTACTG 3′ BamHI |
4/63
4/63 |
|
|
|
|
شکل 1: نقشهی کاست بیانی GFP-JFH-I (12).
بعد از انجام الکتروفورز ژل آگارز 2 درصد، باندهای با اندازهی مورد نظر از ژل بریده و توسط کیت استخراج از ژل (Qiagen)، DNA استخراج گردید. برای انجام واکنش اتصال از نسبت مولی 3 به 1 (insert:vector) و میزان 100 نانوگرم وکتور استفاده شد. میزان insert بر حسب نانوگرم طبق رابطه زیر محاسبه شد:
واکنش اتصال با استفاده از کیت Ligation High (شرکت TOYOBO، ژاپن) در طول شب در دمای 16 درجه سانتی‌گراد انجام گرفت. سپس محصول واکنش اتصال به باکتری سوش JIM109 با استفاده از شوک حرارتی منتقل شد و انتخاب باکترهای ترانسفرم شده بر روی پلیت‌های LB حاوی 50 میکروگرم بر میلی‌لیتر آنتی‌بیوتیک آمپی‌سیلین انجام شد (10). بعد از تایید حضور ژن در وکتور توسط کلنی PCRو هضم آنزیمی، کلنی‌های مثبت در محیط LB مایع تکثیر و پلاسمید نوترکیب توسط کیت Plasmid Miniprep (BioRad) استخراج گردید. از این پلاسمید جهت ترانسفرم کردن پروتوپلاست‌های مزوفیل توتون استفاده شد.
جداسازی پروتوپلاست مزوفیل برگ توتون:جداسازی پروتوپلاست‌های مزوفیل توتون مطابق روش Hosy و همکاران (12) انجام شد. به طور خلاصه برگ‌های توتون به طول 5 سانتی‌متر از گیاهان 4 هفته‌ای رشد یافته در شرایط آزمایشگاهی در محیط MS با قدرت نصف تحت شرایط استریل برداشت شدند و سطح تحتانی آن‌ها با کاغذ سمباده ساییده شدند. سپس برگ‌ها در داخل پتری دیش‌های حاوی 10 میلی‌لیتر محیط هضم استریل EF به مدت 19 ساعت در تاریکی در دمای 25 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند.
بعد از هضم آنزیمی، قطعات هضم شدهی برگ‌های دور ریخته شدند و 4 میلی لیتر محیط شناورسازی MLO6 به داخل پتری دیش اضافه شد. سپس سوسپانسیون پروتوپلاست ازخلال فیلتر نایلونی 100 میکرونی فیلتر شد و با سرعت g110 به مدت 7 دقیقه سانتریفیوژ شد. پروتوپلاست‌های قرار گرفته در باند شناور در سطح لوله‌های سانتریفیوژ برداشت شدند و با 4 حجم از محیط شستشوی W5 اتوکلاو شده رقیق شدند. سپس سلول‌ها در سرعت g110 به مدت 7 دقیقه رسوب داده شدند و رسوب در40 میلی‌لیتر و سپس 20 میلی‌لیتر محلول مانیتول/ Mg شستشو داده شد. در پایان، پروتوپلاست‌ها در محلول فوق در غلظت 6 10 سلول در میلی‌لیتر معلق شدند.
ترانسفرم کردن پروتوپلاست‌ها:در یک لوله اپندروف، 150 میکرولیتر از پروتوپلاست‌های غلیظ شده و 150 میکرولیتر محلول PEG به 5 الی 10 میکروگرم DNA پلاسمیدی مورد نظر اضافه شدند و به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شدند. سپس نمونه با 8 میلی‌لیتر از محیط K3M استریل تکمیل شده با 45/0 مولار گلوکز رقیق شده و به مدت 7 دقیقه در سرعت g110 رسوب داده شدند (12). سرانجام پروتوپلاست‌ها در 3 میلی لیتر محیط K3M استریل معلق شده و به مدت 16 الی 24 ساعت در دمای 20 درجه سانتی‌گراد در تاریکی قبل از آنالیز انکوبه شدند (12). برای بیان توام NtPIP1;1-GFP یا NtPIP1;1 GFP- با YFP:HDEL (مارکر شبکه آندوپلاسمی (13)، هدیه از پروفسور کریس هاوز از دانشگاه بروکس آکسفورد)، 5 میکروگرم از هر یک از پلاسمیدها به طور همزمان با هم به پروتوپلاست‌ها انتقال داده شدند (12).
آنالیز بیان GFP، YFP و FM4-64 در پروتوپلاست‌های ترانسفرم شده توسط میکروسکوپ لیزری فلورسانس: تعیین محل زیر سلولی آکواپورین‌های متصل به GFP، پروتئین HDEL متصل به پروتئین فلورسانت زرد (YFP) و مارکر غشایی FM4-64 (Invitrogen) در پروتوپلاست‌های توتون توسط میکروسکوپlaser scanning Biozero (لنزهای اُبژکتیو 40، Bz-8000، شرکت KEYENCE، اُزاکا، ژاپن) انجام شد. برای گرفتن فلورسانت GFP، طول موج برانگیختگی 470 نانومتر و طول موج آشکارسازی 535 نانومتر استفاده شدند. برای گرفتن فلورسانت FM4-64 در پروتوپلاست‌هایی که NtPIP2;1-GFPیا GFP-NtPIP2;1 را بیان میکنند، طول موج برانگیختگی 540 نانومتر و طول موج آشکارسازی 605 نانومتر استفاده شدند. برای گرفتن فلورسانت YFP در پروتوپلاست‌هایی که NtPIP1;1-GFP یا GFP-NtPIP1;1 را همراه با YFP:HDEL بیان میکنند، از طول موج برانگیختگی 514 نانومتر و طول موج آشکارسازی 539-590 نانومتر استفاده شد. تصاویر با نرم افزارBiozero Analyzer آنالیز شدند. نشاندار کردن غشاء پلاسمایی با FM4-64 از طریق انکوبه کردن پروتوپلاست‌ها بر روی یخ به مدت 10 دقیقه در محیط کشت تکمیل شده با 50 میکرومولار FM4-64 انجام گرفت (12).
نتایج
به منظور تعیین توزیع آکواپورین‌های NtPIP1;1 و NtPIP2;1 در یک سلول گیاهی کامل، سازهی ژنی حاوی اتصال قابل ترجمه میان هر یک از آکواپورین‌ها و پروتئین GFP توسط ترانسفرم کردن موقتی به واسطهی PEG به داخل پروتوپلاست‌های مزوفیل برگ‌های توتون منتقل شدند و فلورسانت اختصاصی GFP رویت شد. GFP به C- ترمینال یا N- ترمینال آکواپورین‌های NtPIP1;1 و NtPIP2;1 برای اطمینان از عدم تداخل GFP با انتقال آکواپورین به غشا پلاسمایی متصل شد. محل زیر سلولی هر پروتئین NtPIP متصل به GFP در پروتوپلاست‌های ترانسفرم شدهی توتون با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس تعیین شد.
نتایج نشان داد سلول‌هایی که به طور موقتی NtPIP2;1-GFP (GFP متصل به C- ترمینال) یا GFP-NtPIP2;1 (GFP متصل به N-ترمینال) را بیان میکنند فلورسانت سبز رنگ شدیدی (شکل2 b و d) را در غشاء پلاسمایی نسبت به کنترل منفی (شکل2 a) نشان می‌دهند که توسط مارکر غشاء پلاسمایی FM4-64 تایید شد (شکل 2 c و e فلورسانت قرمز). این نتیجه نشان می‌دهد که آکواپورین NtPIP2:1 در غشا پلاسمایی قرار می‌گیرد و اتصال GFP به C- ترمینال یا N- ترمینال این پروتئین تاثیری در هدف‌گیری آن به سمت غشا پلاسمایی ندارد.
فلورسانت سبز رنگ حاصل از GFP-NtPIP2;1 یا NtPIP2;1-GFP بعضی مواقع در ساختارهای وزیکولی در مجاورت غشا پلاسمایی مشاهده می‌شوند (شکل 3) که مربوط به پروتئین‌هایی هستند که در مسیر، از محل سنتزشان در داخل شبکه آندوپلاسمی به مکان استقرارشان در غشا پلاسمایی در حال گذر هستند (7).
شکل 2: تعیین مکان درون سلولی NtPIP2;1 متصل به پروتئین GFP. (a) پروتوپلاست مزوفیل توتون در حالت زمینه روشن. (b) پروتوپلاست مزوفیل که NtPIP2;1-GFP را بیان می‌کند. (c) نشان دار کردن غشاء پلاسمایی پروتوپلاست مزوفیل در شکل (b) با مارکر اختصاصی غشاء پلاسمایی (FM4-64). (d) پروتوپلاست مزوفیل که GFP-NtPIP2;1 را بیان می‌کند. (e) نشان دار کردن غشا پلاسمایی پروتوپلاست مزوفیل در شکل (d) با مارکر اختصاصی غشا پلاسمایی (FM4-64). (f) ادغام تصاویر (d) و (e).
شکل 3: حضور آکواپورین NtPIP2;1 در ساختارهای وزیکولی (فلش) در مجاورت غشا.
بر خلافNtPIP2;1، پروتئین‌های GFP-NtPIP1;1 یا NtPIP1;1-GFP در غشا پلاسمایی مشاهده نشدند، بلکه درون ساختارهای داخلی در اطراف هسته، سیتوسول و نزدیک غشا پلاسمایی وجود دارند (همانگونه که از فلورسانت سبز حاصل از آن‌ها مشخص می‌باشد) (شکل 4).
شکل 4: تعیین مکان درون سلولی NtPIP1;1 متصل به GFP در ناحیه N-ترمینال آکواپورین
برای شناسایی ساختارهای داخلی حاوی پروتئین‌های NtPIP1;1-GPF و یا GFP-NtPIP1;1، پروتئین NtPIP1;1-GPF همراه با پروتئین YFP::HDEL (مارکر شبکهی آندوپلاسمی متصل به پروتئین با فلورسانت زرد) (1) در پروتوپلاست‌های توتون با هم بیان شدند.
همانگونه که در شکل5 (a) و (b) نشان داده شده،NtPIP1;1-GFP مکان درون سلولی مشابه با YFP::HDEL را نشان می‌دهد که ثابت می‌کند NtPIP1;1-GFP احتمالا در داخل شبکه آندوپلاسمی پروتوپلاست‌های توتون باقی می‌ماند.
شکل5: بیان توام NtPIP1;1-GFP با مارکر شبکه آندوپلاسمی، YFP::HDEL. (a) پروتوپلاست مزوفیل که NtPIP1;1-GFP را به طور موقت بیان می‌کند، (b) همان پروتوپلاست که مارکر شبکه آندوپلاسمی را بیان می‌کند.
بحث
در گیاهان آکواپورین‌های غشا پلاسمایی یا PIPsبه دو گروه وابسته از لحاظ توالی تقسیم می‌شوند: PIP1s و PIP2s. که اعضای آن‌ها نه تنها از لحاظ طول N و C ترمینال خود متفاوت هستند، بلکه فعالیت کانال آب متفاوتی را هنگام بیان در اووسیت‌های زنوپوس نشان می‌دهند (6). درحالیکه PIPls عموما در این میزبان هترولوگ خاموش می‌باشند، PIP2s فعالیت کانال آب بالایی را نشان می‌دهند.
مطالعات قبلی ما نشان داد هنگامی که NtPIP1;1 در اووسیت‌های Xenopus بیان شود فاقد فعالیت کانال آبی می‌باشد، در حالیکه NtPIP2;1 فعالیت انتقال آب بالایی را در این سیستم نشان می‌دهد (8). بعلاوه مشاهد شد که NtPIP1;1 متصل به GFP، سیگنال سبز ضعیفی را در غشا اووسیت تولید می‌کند، در حالی که هنگام بیان توام باNtPIP2;1، نه تنها میزان NtPIP1;1 درغشا پلاسمایی افزایش یافته (شدت سیگنال سبز در غشا افزایش می‌یابد)، بلکه نفوذ پذیری آبی اسموتیک غشا نیز افزایش می‌یابد (8). اینطور به نظر می‌رسد که NtPIP1;1 به این دلیل فاقد فعالیت کانال آبی است که در غشا پلاسمایی قرار نمی‌گیرد. در تایید این مطلب ما نشان دادیم هنگامی که NtPIP1;1 متصل به GFP درپروتوپلاست‌های مزوفیل توتون به طور موقت بیان شود، این آکواپورین به غشا پلاسمایی منتقل نشده (شکل4) و در داخل شبکهی آندوپلاسمی باقی می‌ماند (شکل 5). اضافه کردن فلوروکروم GFP به NtPIP1;1 با حرکت آن در سلول تداخل نمی‌کند، زیرا هنگامی که GFP به C ترمینال یا N ترمینال NtPIP1;1 اضافه می‌شود در هر دو حالت، NtPIP1;1 در شبکة آندوپلاسمی باقی می‌ماند. بر خلاف NtPIP1;1، آکواپورینNtPIP2;1 درغشا پلاسمایی قرار می‌گیرد (شکل 2).
Zelazny و همکارانش (7) نیز نشان دادند که تمام ایزوفرم‌های ZmPIP1 ذرت مورد مطالعه نظیر ZmPIP1;1، ZmPIP1;2 و ZmPIP1;6 متصل به mCFP یا mYFP، هنگامی که در پروتوپلاست‌های مزوفیل ذرت بیان شوند، در داخل شبکهی آندوپلاسمی باقی می‌مانند و مکانیسم حفاظت شده‌ای را برای باقی ماندن در ER نشان می‌دهند. این مکان یابی می‌تواند به علت حضور سیگنال‌های حبس در ER، نبود سیگنال‌های خروج و یا نیاز به اجتماع قبلی پروتئین باشد.. از طرفی بیان توام ZmPIP1s با ZmPIP2s متصل به YFP و یا CFP، منجر به اصلاح قرار گرفتن ZmPIP1s در غشا پلاسمایی می‌شود. با استفاده از تکنیک تصویر برداری میکروسکوپی FRET/Fluorescence life-time ، این محققین نشان دادند که این تغییر مکان ZmPIP1s از شبکهی آندوپلاسمی به غشا پلاسمایی نتیجه‌ای از برهم کنش میان ZmPIP1s و ZmPIP2s می‌باشد. این داده‌ها پیشنهاد میکنند که بر هم کنش PIP1-PIP2 برای حرکت PIP1 به غشا پلاسمایی جهت تعدیل نفوذپذیری غشا پلاسمایی در گیاهان نیاز می‌باشند. این بر هم کنش‌ها، برای سلول‌ها یک مکانیسم اضافی را جهت تنظیم نفوذپذیری غشا فراهم می‌نمایند. ترکیب‌های مختلف هترومرهای PIP1-PIP2 در انواع سلولی خاص یا در پاسخ به علایم محیطی مختلف تا حد زیادی تنوع فعالیت کانال در غشاء را افزایش خواهند داد. این مکانیسم ممکن است با دیگر تغییرات پس از ترجمهی آکواپورین‌های گیاهی از جمله فسفریلاسیون، پروتونه شدن، گلیکوزیلاسیون و متیلاسیون که باز و بسته شدن و جابه‌جایی کانال‌ها را در سلول کنترل میکنند، در ارتباط باشد.
تحقیقات اخیر با استفاده از موتان‌های گیاه آرابیدوپسیس که در آکواپورین AtPIP1;2 نقص دارند نشان داد که هدایت آبی هیدرواستاتیک ریشه گیاه موتان بین 20 تا 30 درصد کاهش می‌یابد در حالیکه هدایت آبی اسموتیک ریشه تغییری نمی‌کند (14). این نتایج نشان می‌دهد که ترکیب ایزوفرم‌های مختلف آکواپورین در گیاه نقش مهمی در تعیین میزان هدایت آبی گیاه دارند (14 و 15).
آکواپورین‌های NtPIP1;1 و NtPIP2;1 در بخش‌های مختلف گیاه توتون از جمله ریشه، برگ، گل، بساک و مادگی بیان می‌شوند (3)، ولی مکان دقیق آن‌ها در سلول و در گیاه کاملا مشخص نیست. به هر حال با استناد به مطالعات انجام شده حاضر می‌توان بیان داشت که NtPIP1;1 در داخل شبکهی آندوپلاسمی و NtPIP2;1 در داخل غشا پلاسمایی قرار گرفته ولی برهمکنش و ترکیب این دو آکواپورین می‌تواند موجب اصلاح قرارگیری NtPIP1;1 در غشا پلاسمایی شود. همچنین برای بررسی نقش دقیق این دو آکواپورین در توتون نیاز به انجام مطالعات بر روی گیاهان موتان است که در حال حاضر موتانی که در هر یک از این آکواپورین‌ها نقص داشته باشد برای گیاه توتون موجود نیست.
نتیجهگیری
از مشاهدات میکروسکوپی بر روی پروتوپلاست‌هایی که پروتئین کانال آبی متصل به GFP را بطور موقت بیان میکنند می‌توان چنین نتیجه گرفت که کانال آبی NtPIP2;1 در غشا پلاسمایی سلول مستقر شده در حالیکه NtPIP1;1 در داخل شبکه آندوپلاسمی باقی مانده و به غشا پلاسمایی منتقل نمی‌شود و به همین دلیل فاقد فعالیت انتقال آب است.
تشکر و قدردانی
این تحقیق با حمایت مالی دانشگاه اراک انجام شد. بدین وسیله از معاونت محترم پژوهش و فناوری آن دانشگاه کمال تشکر به عمل میآید.
)