نوع مقاله : علمی - پژوهشی
چکیده
هدف: در این مطالعه میزان انتقال بیان ژن توسط لنتی ویروسهای مشتق از ویروس نقصان ایمنی انسانی “Human immunodeficiency virus”( HIV) با میزان انتقال بیان ژن توسط لنتی ویروس مشتق از ویروس نقصان ایمنی گربهImmunodeficiency virus (FIV) Felineبه سلولهای مزانشیمی مغز استخوان موش مورد مقایسه قرار گرفت.
مواد و روشها: حامل های ویروسی با استفاده از وکتورهای آماده، سلولهایHEK-293T ، شاتلهای لنتی ویروسی با پایههایHIV وFIV حامل ژن GFP به عنوان کنترل، وFIV وHIV حامل ژن Nerve growth factor))NGF تولید شدند. سپس سوپرناتانت سلولهای HEK-293T حاوی ویروسهای ساخته شده در معرض سلولهای مزانشیمی مغز استخوان موش قرار گرفت.
نتایج: نتایج نشان داد که سلولهای مغز استخوان تیمار شده با وکتور HIV-NGF، NGF را بیان کردند. اما پس از تیمار با وکتور FIV-NGF، فاقد این توانایی و قادر به بیان NGF نبودند. نتایج بیان NGF توسط نتایج انتخاب سلولها، به وسیله آنتی بیوتیک، مورد تایید قرار گرفتند.
نتیجه گیری: لنتی ویروسهای مشتق از FIV در مقایسه با لنتی ویروسهای مشتق از HIV جهت آلوده سازی و بیان ژن خارجی در سلولهای مزانشیمی مغز استخوان مناسب نیستند.
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
NGF Gene Transfer to Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells Using FIV and HIV Based Lentiviral Vectors
چکیده [English]
Aim: In this study, gene transfer efficiency of human lentiviral vector (HIV) into rat bone marrow stromal cells was compared with that of the feline lentiviral vector (FIV).
Material and Methods: To produce lentiviral vectors, a triple transfection with a shuttle vector, a backbone which carries either the GFP gene as a control or the NGF gene, and an envelope vector was performed using calcium-phosphate method in HEK-293T cell line. Supernatants of HEK-293T cell line containing the produced viruses were then exposed to bone marrow stromal cells (BMSCs) of the rat.
Results: While bone marrow stromal cells infected with HIV-NGF showed a relatively high immunoreactivity of NGF, those infected with FIV-NGF did not express NGF. Furthermore, BMSCs infected with FIV-NGF viruses containing antibiotic resistant gene could not survive in the culture media containing the antibiotic.
Conclusion: FIV based lentiviral vectors may not have a desirable efficacy for gene transfer into bone marrow stromal cells.
کلیدواژهها [English]
- ّFeline immunodeficiency virus lentiviral vector
- Human immunodeficiency virus lentiviral vector
- Bone marrow stromal cells
- NGF
مقدمه
انتقال ژن در زمره مهمترین تکنیک های مورد استفاده درمطالعات تکاملی و فیزیولوژیکی، تشخیص بیماریها، درمان و پیشگیری از آنها میباشد. به علت توانایی طبیعی ویروسها در انتقال ژن و الحاق به ژنوم میزبان که بخشی ضروری از سیکل زندگی آنها است، از آنها بعنوان ابزاری قوی برای انتقال ژنهای بیگانه به درون سلولهای میزبان استفاده می شود (1). لنتی ویروسها ناقلین ویروسی میباشند که به دلیل ویژگیهای برجستهای مانند اینتگراسیون، تولید آسان و ترانسداکشن فراوان، در سالهای اخیر مورد توجه قرار گرفته اند. لنتی ویروسها از خانواده رتروویریده میباشند و همانند رترو ویروسها قادرند پس از ورود به سلول میزبان، ژنهای خود را به داخل ژنوم میزبان وارد کنند. البته رتروویروسها تنها قادر به آلوده سازی سلولهای در حال تقسیم میباشند در حالیکه لنتی ویروسها قادر به آلوده سازی سلولهای تکثیرشونده و غیرقابل تکثیر هستند (2). وکتورهای رتروویروسی مشابه وکتورهای با پایه ویروس سرطان خون موشی (MLV) (murine leukemiavirus) می باشند ولی نسبت به آدنوویروسها دارای مزایایی مانند بیان طولانی مدت ژن نوترکیب، عدم ایجاد پاسخ ایمنی ناخواسته و توانایی بیان نسبتا بالای یک ژن در انواع سلولهای پستانداران هستند(3). لنتی ویروس ایدز (HIV) توانایی آلوده سازی سلولهای درحال تقسیم و سلولهای تکثیر ناپذیر را دارا بوده که این توانایی به علت عدم نیاز این ویروسها به فاکتورهای مهم هسته ای برای انتقال به هسته می باشد. این وکتورها قابلیت انتقال ژن به سلولهای اولیه در حال رشد و ماکروفاژهای تمایز یافته در شرایط آزمایشگاهی را دارا بوده و در vivo in نیز قابلیت انتقال ژن به نورونهای تمایز یافته، سلولهای شبکیه، کبد، ماهیچه و سلولهای دیگری را دارند (4 و 5). توانایی لنتی ویروسها بهعنوان حاملین مناسب انتقال ژن به سلولهای مختلف انسان و پستانداران مخصوصا به بافت هایی مثل سیستم عصبی یا بافت کبد که دارای سلولهای تقسیم ناپذیر می باشند، منجر به اهمیت روز افزون استفاده از آنها شده است. از مهمترین حاملهای لنتیویروسی میتوان حاملهای لنتیویروسیFIV مشتق ازFeline Immunodeficiency virus” ، حاملهای لنتیویروسی HIV مشتق از “Human immunodeficiency virus” و حامل های لنتی ویروسی SIV مشتق از Simian Immunodeficiency virus را نام برد که عموما برای انتقال ژن مورد استفاده قرار میگیرند (6، 7 و 8). اگر چه لنتی ویروسهای پریماتها مانند SIV وHIV دارای ساختاری توسعه یافته می باشند، اما لنتی ویروسهای غیرپریماتها نیز دارای تواناییهای مشابهی میباشند که کمتر مورد توجه محققان قرار گرفته است. ویروس نقص ایمنیFIV دارای ساختاری نسبتا مشابه با ویروس HIV است و میتواند مدل بسیار مناسبی برای گسترش تولید واکسنهای نوترکیب و درمان بیماریهای ویروسی باشد. از سوی دیگر این لنتیویروس را میتوان به منظور ایجاد وکتورهای مناسبتر جهت سازگاری با میزبان های مختلف بکار برد (9). آنالیز فیلوژنیک وکتور FIV نشان میدهد که این ویروس دارای فاصله نسبتا زیادی با لنتیویروسهای پریمات می باشد و شواهد اپیدمیولوژیک وقوع sero conversion (تولید آنتی بادی های اختصاصی قابل تشخیص برای میکروارگانیسمها در سرم خونی که در نتیجه آلوده سازی یا ایمنی زایی تولید می شوند) در جوامع انسانی را نشان نمیدهد (10). بعضی از ویژگی های چرخه زندگی لنتیویروس FIV شامل ورود و خروج از هسته، ادغام (integration) و سازماندهی پروموتر متفاوت از ویروسهای پریماتها است. به همین دلیل این وکتورها می توانند به عنوان حاملهای لنتی ویروسی دارای ایمنی بالاتر، برای انتقال ژن به انواع سلولهای انسانی مورد استفاده قرار گیرند. ویروس FIV که از طریق قرار گرفتن در معرض مخاط منتقل می شود دارای ساختار کلی مشابه با ویروسهای HIV می باشد، ولی تفاوتهایی از جمله تفاوت در اندازه ژنوم (9400 نوکلئوتید در ژنوم (FIV، نوع گیرنده موجود در سطح سلول هدف CXCR4) گیرنده ورود FIV به سلول هدف گیرنده) و در بعضی از پروتئینهای کمکی بهچشم میخورد (9، 10 و 11). یکی از ژنهای کاندید جهت درمان بسیاری از بیماریهای نورولوژیک، ژن نوروتروفینها است که با بکارگیری از وکتورهای لنتی ویروسی به سلولهای بنیادی قابل انتقال میباشد. نوروتروفینها خانوادهای از فاکتورهای رشد میباشند که در تنظیم رشد، تعیین سرنوشت سلول، تمایز، عملکرد، و بقای سلولهای عصبی نقش های مهمی دارند. سالهاست که بر نقش نوروتروفین ها در تمایز و بقای سلول های عصبی تاکید میشود. نوروترفینها پروتئینهای اندوژن حل شونده ای هستند (12، 13، 14، 15، 16 و 17) که باعث تنظیم بقا رشد، تغییرات مورفولوژیک و همچنین سنتز پروتئینهای دخیل در تمایز نورون ها میگردند. از میان سلولهای بنیادی سلولهای بنیادی مزانشیمی با قابلیت تبدیل به انواع سلولها از جمله سلولهای عصبی و عدم تحریک سیستم ایمنی گزینه ای جذاب بهحساب می آیند. بررسی بیان نوروتروفین NGF در این سلولها حاکی از آن است که آنها بطور ذاتی این نوروتروفین را بیان می کنند (18). لذا در این مطالعه جهت افزایش بیان ژن NGF در سلولهای بنیادی مزانشیمی از وکتورهای ویروسی FIV و HIVحامل NGF استفاده گردید و میزان توانایی این وکتورها در انتقال و بیان ژن NGF به این سلولها مقایسه شد.
مواد و روشها
تکثیر وکتورهای لنتی ویروسی: در این تحقیق از باکتری E.coli سویه Top 10استفاده شد و طبق دستورالعمل زیر باکتریها برای پذیرش پلاسمید مستعد شدند و سپس پلاسمیدها به آنها انتقال داده شد.
تهیه سلول مستعد با استفاده از کلرید کلسیم ( :(CaCl2 برای تهیه سلولهای باکتریایی مستعد از محلول 100 میلی مولارCaCl2 و آنتیبیوتیک های آمپیسیلین با غلظتهای نهایی (50 میکروگرم بر میلی لیتر) در محیط کشت، مورد استفاده قرار گرفت. پس از تهیه پلیت آگار حاوی آمپیسیلین، از استوک باکتری E.coli سویه Top10 بر روی پلیت کشت داده و سپس یک تک کلون از پلیت باکتری Top10را تحت شرایط استریل برداشته و در محیط کشت مایع کشت داده شد تا جذب نوری آن در طول موج 500 نانومتر به 450 برسد. سپس محیط کشت داده شده حاوی گونه باکتری Top10را سانتریفیوژ (10 دقیقه5000 rpm ) و پس از تخلیه محلول رویی به رسوب حاصل از سانتریفیوژ 100 میلی مولارCaCl2 اضافه شد. پس از انکوبه شدن (30 دقیقه در 4 درجه سانتی گراد)، سانتریفوژ، مراحل بالا تکرار و در ویال های استریل به دمای 70 - درجه سانتی گراد انتقال داده شدند.
ترانسفورماسیون:برای ازدیاد پلاسمید هریک از پلاسمیدها به باکتری اشرشیاکلی Top10وارد شدند. برای ترانسفورماسیون پلاسمیدها، ابتدا به 500 میکرو لیتر از باکتری مستعد شده اشرشیاکلی Top10، یک نوع پلاسمید (5 میکرولیتر) اضافه شد و پس ازمخلوط شدن آرام 30 دقیقهای در دمای اتاق (90 ثانیه در بن ماری 42 درجه سانتی گراد) قرار گرفتند. پس از افزودن LB مایع به هریک از لولهها (1ساعت،rpm 1000، 37 درجه سانتی گراد) هریک از سوسپانسیونهای سلولی، روی پلیت LB-آگار دارای آمپی سیلین کشت شد و به این ترتیب اجازه رشد به تک کلنی های حاوی پلاسمید مقاوم به آمپی سیلین over night) ،37 درجه سانتیگراد) داده شد.
استخراج پلاسمیدها به مقدار زیاد (Maxi prep):ابتدا یک تک کلنی از پلیت کشت داده شده از پلاسمیدهای نوترکیب در محیط کشت مایع استریل حاوی آنتی بیوتیک آمپی سیلین کشت داده شد و سپس به روش ارائه شده در بروشور شرکت (Qiagen) و از فیلتر مخصوص کیت برای جدا سازی DNA استفاده شد. بعد از عبور محلول از فیلتر بافر شستشو از ستون فیلتردار عبور داده شد. پس از خشک شدن، رسوب DNA های نوترکیب با آب مقطر شستشو داده شد. پلاسمیدهای استخراج شده در دمای20- درجه سانتی گراد تا زمان انجام آزمایش ذخیره شدند.
انتقال وکتورهای لنتی ویروسی به رده سلولی 293THEK (Transfection): سلولهای HEK-293T به دلیل توانایی بالا در تکثیر و پروتئین سازی به عنوان سلول بسته بندی کننده وکتورهای لنتی ویروسی به صورت گستردهای برای تولید انواع ویروسها مورد استفاده قرار میگیرند. برای تولید لنتیویروسهای نوترکیب فعال، سلولهای مولد ویروس همزمان با سه ناقل لنتی ویروس شاملpackage envelope با روش رسوب DNA–کلسیم ترانسفکت شدند. تولید لنتی ویروس با کمک وکتورهای pMD2G ، pPSPAX2 و وکتور ترانسفر (ژن مورد نظر ما توسط شرکتGeneCoepia کلون و خریداری شد). این وکتورهای لنتی ویروسی از نسل دوم بوده که ذیلا راجع به خصوصیات آنها اشاره شده است. مخلوط DNA ویروسی شامل 2/10میکروگرم از وکتور pMD2G (بیان کننده پوشش گلیکوپروتئینی ویروس تورم تاولی دهان)، 2/10 میکروگرم از وکتور pSPAX2 (بیان کننده پروتئینهای gag, pol, tatو rev) و 2/13 میکروگرم از وکتور 156 pEZLV و یا pEZLV2 (شاتلهای لنتیویروسی حامل NGFو GFP خریداری شده از شرکت GeneCoepia) بود. پلاسمیدهای ترانسفر برایHIV based- NGF ((Lv156و برایFIV based-NGF (Lv23) (شرکت (GeneCoepia بودند. جهت Transfection از یکسو به ناقلین لنتی ویروسی و از سوی دیگر به سلولهای مولد ویروس نیاز بود. تولید لنتی ویروسی با انتقال ژن به داخل سلول مولد ویروس صورت پذیرفت که اصطلاحا ترانسفکشن خوانده میشود. برای این کار 24 ساعت قبل سلولها به تعداد تقریبی 5/2 تا 3 میلیون برای هر پلیت 10 سانتی در محیط DMEM + 10درصد سرم کشت داده شدند. سپس سه پلاسمید لنتی ویروسی شامل ناقل وکتورtransfer (5/11 میکروگرم) در دو وکتور HIV based وFIV based ، ناقل بسته بندی ویروس (Packaging Vector) (7 میکروگرم) و ناقل مربوط به غشاء ویروسی (5/4 میکروگرم)، بودند استفاده شدند. پلاسمید لنتیویروسی وکتور GFP نیز به عنوان کنترل مورد آزمون قرار گرفت. ترانسفکشن به روش رسوب DNA – کلسیم فسفات انجام شد. مخلوط DNA - کلرید کلسیم قطره قطره به سلولها اضافه شد و به مدت 6 تا 8 ساعت انکوبه گردید تا DNA وارد سلولها گردد. برای ممانعت از آسیب فسفات کلسیم به سلولها، محیط سلولها تعویض و یکبار با PBS شستشو شده و با افزودن محیط جدید به آنها (24 تا 48 ساعت و 37 درجه سانتیگراد) کشت داده شدند. در این فاصله زمانی ذرات ویریونی پس از تشکیل در درون سلولها به فضای خارج سیتوپلاسمی رها شدند.
تغلیظ ویروسی و آلوده سازی سلولهای هدف (Infection): محیطهای ویروسی جمع آوری شده در مرحله تولید ترانسفکشن با رعایت تمام شرایط ایمنی و استریل به ستونهای تغلیظ پروتئین (Amicon) منتقل (15 تا 20 دقیقه، 4 درجه سانتیگراد و rpm3500 ( سانتریفوژ گردیدند. در موارد کافی نبودن مقدار محیط حاوی ویروس نوترکیب این مرحله برای 10 تا 15 دقیقه دیگر تکرار شد. محیط حاوی ویروس پس از گذشت 24 ساعت از تعویض محیط ترانسفکشن، جمع آوری و پس از سانتریفوژ به محیط سلولهای هدف افزوده گردید. سلولهای هدف شامل 293T HEK و یا سلولهای مزانشیمی مغز استخوان موشی BMSC بودند. سلولهای مزانشیمی مغز استخوان موشی پس از استخراج از استخوان فمور رت در پتریدیش کشت داده شدند. برای آزمون آلودگی (infection) به وسیله ویروس، رقتهای سریالی از هر یک از ویروسهای نوترکیب به سلولهای هدف کشت شده در پلیت 24 خانه اضافه شد. مشاهده GFP پس از 48 ساعت، بیانگر آلوده شدن به ویروس بود. حداکثر بیان GFP در این مطالعه پس از 144 ساعت بود.
روش وسترن بلات: استخراج پروتئین: پس از اتمام زمان آلودگی، محیط سلولها خارج و فلاسک 2 بار با PBS سرد شستوشو داده شد. سپس به هر فلاسک T25 ، تریپسین اضافه و فلاسک برای 5 دقیقه در انکوباتور قرار گرفت. بعد از اطمینان از جدا شدن سلولها از کف فلاسک، PBS دارای 10 درصد FBS به سلولها اضافه شد و سوسپانسیون سلولی منتقل گردید. پس از (5 دقیقه،rpm 1500) محلول رویی دور ریخته و رسوب سلولی در PBS تعلیق و به یک ویال انتقال یافت. پس از سانتریفو,ژ (5 دقیقه، 4 درجه سانتیگراد، rpm500 (محلول رویی دور ریخته شد و رسوب سلولی یا برای نگهداری طولانی مدت در 70- درجه سانتیگراد قرار داده شد و یا مستقیما برای استخراج پروتئین، مورد استفاده قرار گرفت. به رسوب سلولی حاوی 500 تا 800 هزار سلول، بافر لیز کامل اضافه گردید. سپس به کمک یک سرنگ انسولین، رسوب سلولی حدود 10 بار پیپتاژ شد تا هیچ تودهی سلولی باقی نماند و ویالها (20 دقیقه در دمای آزمایشگاه روی شیکر) و سپس (20 دقیقه، 4 درجه سانتیگراد و rpm12000 (انجام شد. محلول رویی شامل پروتئین به یک ویال جدید منتقل شد تا غلظت آن اندازهگیری گردد.
پس از الکتروفورز پروتئینها، آنها بر روی PVDF ترانسفر و مراحل ایمونوبلاتینگ انجام شد:
1- قرار دادن بلات در محلول بلوک کننده (4 درجه سانتیگراد، overnight، شیکر) موجب میشود تا پروتئینهای موجود در شیر خشک مانع از اتصال آنتی بادیها به نواحی فاقد پروتئین گردد.
2- آبکشی سریع توسط TBST و اضافه نمودن آنتی بادی اولیه شامل:
آنتی بادی β-Actin (Sigma): رقیق شده با نسبت 1:25000 در TBST ، 1 ساعت در دمای آزمایشگاه و روی شیکر
آنتی بادی NGF Millipore)): رقیق شده با نسبت 1:2500 در TBST ، 1 ساعت در دمای آزمایشگاه و روی شیکر
3- جمع آوری آنتی بادی اولیه و 3 شستوشوی 10 دقیقهای با TBST در دمای آزمایشگاه و روی شیکر
4- اضافه نمودن Anti-rabbit IgG HRP-Conjugated (SantaCruz): رقیق شده با نسبت 1:10000 در TBST، 1 ساعت در دمای آزمایشگاه و روی شیکر (برعلیه آنتی بادی NGF ( و یا آنتی بادی ثانویه موشیAnti-mouse IgG HRP-Conjugated (SantaCruz): رقیق شده با نسبت 1:10000 در TBST، 1 ساعت در دمای آزمایشگاه و روی شیکر (برعلیه آنتی بادی β-Actin)
5- جمع آوری آنتی بادی ثانویه و 3 شستوشوی 10 دقیقهای با TBST در دمای آزمایشگاه و روی شیکر
6- اضافه کردن ECL(شرکت زیست فناوران نجم) بر روی بلات به حدی که سطح را بپوشاند. پس از 5 دقیقه بلات درون یک نایلون و سپس در کاست عکاسی قرار گرفت. در اتاق تاریک فیلم X-ray ، بسته به شدت نور، برای مدت زمان 1 ثانیه تا چند دقیقه روی بلات قرار گرفت. سپس فیلم درون داروی ظهور انداخته شد. پس از شستوشو با آب مقطر، فیلم را در داروی ثبوت قرار داده و پس از آن با آب شسته شد.
استخراج RNA:سلولها پس از رسیدن به 80 درصد فراوانی سلولی (پس از 2 هفته) باPBS شستشو و سپس تریپسینه گردیدند و تریپسین با محیط کشت حاوی سرم خنثی شد. سوسپانسیون سلولی سانتریفیوژ') 5, ºC4, rpm1500 ( شد. رسوب سلولی در PBS سوسپانس و دوباره سانتریفوژ (5دقیقه، 4 درجه سانتیگراد و rpm1500( گردید. رسوب سلولی برای استخراج RNA مورد استفاده قرار گرفت. رسوب سلولی به همان روش که در بخش قبل تشریح شد، آماده گردید. از محلول easy BLUE® (,INtron نانومهر) به این رسوب اضافه گردید. سپس به کمک سرنگ انسولین و سرسرنگهای G21، رسوب سلولی حدود 7 تا 8 بار پیپتاژ شد تا سلولهای لیز شده RNA سلولی خارج شود. پس از گذشت 10 تا 15 دقیقه، کلروفرم به محلول اضافه شد (30 ثانیه تکان شدید در جهت بالا و پایین) و پس از 5 دقیقه سانتریفوژ (10 دقیقه، 4 درجه سانتیگراد و rpm 12000 (شد که منجر به تشکیل سه فاز تشکیل گردید. فاز آبی رنگ حاوی پروتئین و ضایعات سلولی در پایین، فاز کدر شیری رنگ شامل DNA در وسط و فاز بیرنگ رویی حاوی RNA تمام سلولها است. فاز رویی به یک ویال جدید منتقل و ایزوپروپانول به آن اضافه شد. ویال چند بار به آرامی واژگون گشت. ایزوپروپانول، RNA را رسوب میدهد. پس از 15 دقیقه انکوباسیون در دمای آزمایشگاه، سانتریفوژ (15 دقیقه، 4 درجه سانیگراد و rpm12000 (انجام شد. ایزوپروپانول دور ریخته شد و اتانول 75% به رسوب RNA اضافه و دوباره سانتریفوژ) 7 دقیقه، 4 درجه سانتیگراد و rpm7500 (گردید. اتانول خارج و رسوب RNA در ویال با در باز قرار گرفت تا اتانول آن به طور کامل ولی نه در حد خیلی خشک تبخیر گردد. پس از آن رسوب درآب-DEPC حل شد. سپس 1 میکرولیتر از آن برداشته و با رقت 1:100 جذب آن در طول موجهای 260 و 280 نانومتر خوانده شد. غلظت RNA استخراج شده به کمک فرمول زیر محاسبه گشت.
غلظت RNA (µg/ml) = عکس رقت × OD260 × 40
سنتز cDNA : پیش از سنتز cDNA ، جهت حذف آلودگی احتمالی به DNA،RNA با (Roche (10u/μl) DNase I انکوبه شد. به این ترتیب که 2 میکروگرم از RNA با 1 میکرولیتر از DNase I مخلوط و حجم نهایی با آب-DEPC به 11 میکرولیتر رسانده شد. این مخلوط ابتدا (15 دقیقه، 4 درجه سانتی گراد) و سپس (10 دقیقه، 4 درجه سانتی گراد) قرار گرفت تا پس از حذف DNA ، آنزیم DNase I نیز غیرفعال گردد.در این مرحله 1 میکرولیتر از (40u/μl) Rando Hexamer به مخلوط اضافه گشت و ویال (5 دقیقه، 65 درجه سانتی گراد) تا loop احتمالی موجود در mRNAها وجود دارد، از بین رفته و هگزامر به خوبی به آن متصل گردند. سپس ویال به سرعت روی یخ قرار داده شد و سایر مواد به آن اضافه گردیدند:
5X Buffer µl4
dNTPs Mix (10mM) µl2
RNase Inhibitor (40u/μl) µl1
M-MuLV Reverse Transcriptase (20u/μl) µl1
Total µl20
ویالها درون دستگاه Thermal Cycler قرار داده شدند و ابتدا (10 دقیقه، 25 درجه سانتی گراد) سپس (1ساعت، 42 درجه سانتی گراد) و در نهایت ) 5 دقیقه، 72 درجه سانتی گراد) انکوبه شدند. پس از اتمام مراحل، cDNA سنتز شده برای نگهداری طولانی مدت در فریزر 70- درجه سانتی گراد قرار داده شد.
RT-PCR ژنهای β-ACTIN و NGF
توالی پرایمرهای β-ACTIN (طول قطعه= bp102)
F: 5`AAGGCCAACCGTGAAAAGAT 3`
R: 5’ACCAGAGGCATACAGGGACA 3`
توالی پرایمرهای NGF )طول قطعه= bp117(
F: 5`AAT TAG GCT CCC TGG AGG TG3`
R: 5`TGA GCT TGG GTC CAG CAT 3`
جهت انجام PCR:
Template (cDNA) µl 1
PCR buffer (10X) µl 2
dNTPs (10mM) µl 6/1
MgCl2 (50mM) µl 1
Primers (5µM) µl 2
ddH2O µl12
Taq DNA Polymerase µl4/0
Total µl20
طبق جدول زیر برنامه به دستگاه داده شد.
ایمونوسیتوشیمی پروتئین NGF: برای اثبات ثولید پروتئینNGF تست ICC انجام شد.ابتدا 104 × 5 سلول BMSCs آلوده شده با لنتیویروس نو ترکیب دارای NGF و به همان میزان سلول BMSC آلوده نشده به عنوان کنترل در چاهکهای جداگانه در پلیت 24 خانه کشت شدند (البته در چاهکها لامل قرار داده شده بود و سلولها روی لامل در پلیت 24 خانه کشت شدند). پس از دو روز، محیط کشت لاملهای حاوی سلول خارج و با PBS شستشو گردیدند. پس از آن، سلولها با پارافرمالدهید سرد فیکس و با PBS شستشو شدند. در مرحله بعد، محلول بلاکینگ حاوی 1 درصدBSA (20 دقیقه) اضافه و بعد از شستشوی مجدد با PBST1درصد (PBS دارای 1 درصد Tween 20)، در آنتی بادی اولیه علیه NGF (60 دقیقه) انکوبه گردید. پس از شستشو، سلولها با آنتی بادی ثانویه (45 دقیقه) انکوبه شدند. بعد از خارج کردن آنتی بادی ثانویه و شستشوی سلولها، DAPI برای رنگ کردن هسته سلولها استفاده شد. با استفاده از گلیسرول 90 درصدCover slip های حاوی سلول بر گلیسرول 90 درصد بر روی لام قرار گرفته و با میکروسکوپ مشاهده شدند.
قسمت |
دما |
زمان |
تعداد سیکل |
Initial Denaturation |
°C94 |
'5 |
1 |
Denaturation |
°C94 |
"30 |
35 (ژن β-ACTIN) |
Annealing |
°C56( β-ACTIN) |
"30 |
|
°C60 (NGF)
|
|||
Extension |
°C72 |
"30 |
45 (ژنNGF) |
Final Extension |
°C72 |
'5 |
1 |
آنالیز آماری
باندهایRT-PCR و Western blottingتوسط نرم افزار Labimage اسکن و دانسیته باندهای NGF نسبت به باند بتا اکتین نیمه کمی گردیدند و با آزمون Student t-Test مورد آنالیز آماری قرار گرفتند. سطح معنی داری 05/0P< در نظر گرفته شد.
نتایج
لنتی ویروسهایFIV و HIV حاوی GFP قادربه ترانسفکت کردن سلول های HEK-293T میباشند.
سلولهای HEK-293T بعد از ترانسفکشن با هر دو نوع وکتور حاوی GFP درصد بالایی از بیان GFP را نشان دادند و تفاوت محسوسی مشاهده نگردید (شکل 1).
لنتی ویروسهایFIV و HIV حاوی NGF هردو قادر به آلوده سازی سلولهای HEK-293T میباشند.
بطور طبیعی ژن NGF در سلولهای HEK-293T بیان میشود که پس از آلوده سازی HEK-293T با ویروس FIV-NGF ، این افزایش بیان مشاهده شد. نتایج آزمون بیان NGFmRNA توسط RT-PCR در سلولهای HEK-293T آلوده شده با ویروس FIV-NGF نسبت به سلولهای آلوده نشده نشان داد که این میزان 2 برابر شده است (شکل 2). البته همان طور که در شکل 2 مشاهده می گردد، این بیان هنوز کمتر از سلولهای BMSC دست نخورده است که بطور طبیعی NGF را به میزان بالاتری از سلولهای HEK-293T آلوده شده توسط ویروس FIV-NGF (7/1) برابر بیان میکنند. نتایج بدست آمده از تکنیک وسترن بلات (شکل3) نیز نشان داد که بیان نسبی پروتئین NGF (13 کیلو دالتون) به پروتئین بتا اکتین )98 کیلو دالتون( در سلولهای HEK-293T آلوده شده توسط ویروس FIV-NGF 9/1 برابر افزایش داشته است، در حالیکه در سلولهای آلوده نشده، نسبت بیان NGF به بتا اکتین به میزان 7/0 برابر کمتر است.
شکل 1: مقایسه بیان GFP در سلولهای آلوده شده HEK-293T توسط سازه های(A FIV-GFP و(B HIV-GFP. بررسی بیان GFP در سلولهای HEK-293T بعد از ترانسفکشن با هر دو نوع وکتور حاوی GFPFIV based- GFP) و( HIV based GFP درصد بالایی از بیان GFP را نشان دادند و تفاوت محسوسی میان دو وکتور مشاهده نگردید.
شکل 2:مقایسه بیان ژن NGF در سلولهای HEK-293T آلوده شده توسط ویروس NGF–FIV و سلولهای BMSC آلوده نشده.1- DNA marker 100 bp 2- سلولهای HEK-293T آلوده شده به ویروس FIV-NGF3- سلول BMSC دست نخورده 4- سلول HEK-293T آلوده نشده 5- کنترل منفی (واکنش بدون cDNA). لنتی ویروسFIV قادر آلوده سازی سلول های HEK-293T میباشد.
شکل 3: وسترن بلاتینگ بیان پروتئین NGF در سلولهای HEK-293TA)) آلوده نشده و B)). آلوده شدهبه ویروس NGF– FIV. در این سلولها باندNGF ، 13 کیلودالتونی می باشد. بیان NGF در سلولهای HEK-293T آلوده شده توسط ویروس FIV-NGF نسبت به ژن بتا اکتین حدود 2 برابر بیشتر و درسلولهای آلوده نشده 7/0 برابر کمتر میباشد.
فقط لنتی ویروس HIV و نهFIV قادر به آلوده سازی سلولهای BMSC میباشد.
آلوده سازی سلولهای BMSC توسط سوپرناتانت بدست آمده از سلولهای HEK-293T و سپس تیمار سلولهای آلوده شده توسط آنتی بیوتیک G418، هیچ گونه مقاومتی نسبت به این آنتی بیوتیک در این سلولها ایجاد نکرد. همچنین اگر چه در سلولهایBMSC آلوده شده باHIV-GFP پس از گذشت 48 ساعت بیان پروتئین GFP مشاهده گردید و بیان آن با استفاده از ایمونوسیتوشیمی تایید شد (شکل 4)، اما بیان مارکر (GFP) در سلولهای CBMS آلوده شده با ژن FIV-GFP حتی با گذشت 48 تا 72 ساعت پس از آلوده سازی هم دیده نشد. بهعلاوه به دلیل آنکه این سلولها ژن مقاومت به G418 را دریافت نکرده بودند، پس از 4 روز تیمار با G418 مرگ سلولی رخ داد. با تغییر زمان تیمار با G418 به مدتهای 24، 48 و 72 ساعت نیز تغییری در نتایج ایجاد نشد. همچنین با تغییر میزان دفعات آلودگی (2 الی 3 بار در روزهای متواالی) تغییری در نتایج ایجاد نشد و کماکان مرگ سلولی رخ داد. به علاوه در یکسری از آزمایشات دیگر (نشان داده نشده است) ترنسفکشن مستقیم وکتور FIV-GFP بدون مداخلهی سلولهای HEK-293T با استفاده از الکتروپوریشن (electroporation) سلولهای هدف (BMSC) صورت گرفت، باز هم بیان قابل ملاحظهای از GFP در BMSC دیده نشد. با تغییر در تعداد سلولهای BMSC، به نسبت محیط ویروسی نیز تفاوتی در نتیجه اینفکشن ژن FIV-NGF مشاهده نگردید و سه روز پس از تیمار با G418 سلول زندهای مشاهده نشد.
شکل 4: بیان ژن HIV-NGFدر سلولهای BMSC:. سیتوپلاسم سلولهای BMSC آلوده شده با ویروس نوترکیب HIV- NGF (فلش) دارای ژن NGF بوده و با آنتی بادی NGF قابل شناسایی هستند.
بحث
لنتیویروسها گزینه ای مناسب جهت انتقال ژن به سلولهای بنیادی بهحساب میآیند. روشهای لنتیویروسی بر روشهای غیر ویروسی و بر روشهای متکی بر سایر ویروسها نظیر رتروویروسها ارجح است. علل استفاده از لنتیویروسهای نوترکیب 1- تولید این ویروسها در تیتر بالا در عرض 48 ساعت 2- کارایی و تولید بالا 3 -عدم نیاز به عوامل ترنسفکت شده گران در سلولهای مولد ویروس 4- سهولت آلوده سازی سلولهای تقسیم ناپذیر میباشند. لذا استفاده از لنتیویروسها علاوه بر بکارگیری سازههای تولید شده به منظور آلوده سازی سلولهای بنیادی، مزایای دیگری نیز دارا هستند که از آنها میتوان 1- افزایش مقاومت نسبت به خاموشی ژنی (Gene Silencing) 2- مسئله امنیت و سلامت استفاده از لنتیویروس در مقایسه با سایر ویروسها و وجود امکانات تشخیصی حساس به HIV در صورت تولید لنتی ویروسهای بیماریزا را نام برد (19). وکتورهای لنتی based-FIV بهدلیل ایمن بودن برای انسان از لحاظ انتقال ژن در مقایسه با لنتی ویروسهای-based HIV مورد توجه خاصی قرار گرفته اند. Poeschla و همکاران (8)، وکتورهای FIV را با عملکردی مناسب در مغز، چشم، گوش، ریه، کبد، ماهیچه، پانکراس و سیستم هماتوپویتیک معرفی کردند، اگر چه تا کنون مطالعات اندکی در مورد میزان موفقیت و کارآیی وکتورهای FIV جهت انتقال ژن به سلولهای بنیادی صورت گرفته است (8). یافتههای زیادی دال بر ژن درمانی با فاکتورهای رشد عصبی یا نوروتروفینها درجهت تعدیل و یا پیشگیری از بیماریهای نورولوژیک است. Bonner و همکاران با استفاده از لنتیویروس حاوی ژن نوروتورفین BDNF در سلولهای پیش ساز نورونی در موشهای مدل جراحت نخاعی باعث رشد اعصاب قطع شده به سمت بافتهای هدف شدند (20). Park و همکاران با استفاده از لنتی ویروس حاوی ژنهای نوروتورفین VEGF, IGF-I, GDNF،NT3، BDNF در موشهای مدل ALS باعث بهبود عملکرد آنها شدند (21). Zhang و همکاران (22) با استفاده از لنتیویروس حاوی ژنهای نوروتورفین NT3 در موشهای مدل ایسکمی باعث بهبود عملکرد آنها شدند (23). سلولهای بنیادی غیرخونی در مغزاستخوان از گزینههای سلول درمانی در بیماریهای نورولوژیک محسوب میشوند. این سلولها دارای قابلیت تبدیل شدن به سلولهای پیش سازعصبی هستند و بهعلاوه بطور ذاتی دارای توانایی تولید فاکتورهای رشد عصبی نوروتروفینها هستند. از آنجا که میزان نوروتروفینهای پایه این سلولها اندک است، بایستی اقدام به افزایش بیان نوروتروفینها در آنها با استفاده از ژن درمانی کرد. لذا در این تحقیق سلولهای بنیادی مغز استخوان دست ورزی شده با بکار گیری سیستمهای لنتیویروسی ژن نوروتروفین NGF به منظور استفاده از آن در مدل حیوانی بیماری مالتیپل اسکلروزیس مورد هدف قرار گرفتند. الحاق ژنی با بکارگیری سیستمهای لنتیویروسی صورت پذیرفت و تفاوتهای کارآمدی دو وکتور ویروسیHIV based،FIV based که هر دو حامل ژن NGF بودند مقایسه گردید. وکتورهای based-FIV بدلیل ایمن بودن برای انسان از لحاظ انتقال ژن در مقایسه با لنتی ویروسهای-based HIV مورد توجه خاصی قرار گرفته اند. وکتور FIV با وجود مزایایی در مقابل HIV ازجمله عدم القا پاسخ ایمنی در انسان و کارآمدی بالای انتقال ژن و آلوده سازی سلولهای تقسیم ناپذیر پس از ایجاد تغییرات در پروموتر و ژنوم آن، هنوز کاملا مورد ارزیابی کامل واقع نشده است. در مطالعه حاضر، بررسی آلوده سازی سلولهای بنیادی مغز استخوان با وکتورهای لنتی ویروسی FIV و HIV و آنالیز بیان ژن NGF صورت گرفت. نتایج بخش سلولی و آنالیز ایمونوراکتیویته NGF پس از استفاده از وکتور HIV-NGF در مقایسه باNGF-FIV ، تجمع سیتوپلاسمی پروتئین NGF در سلولهای مغز استخوان را پس از استفاده از وکتور HIV-NGF و نه NGF-FIV نشان میدهد. همچنین آزمایشات RT-PCR نیز بیان mRNA NGF در این سلولها را پس از HIV-NGF و نه FIV-NGF تائید کرد. به منظور تایید هر چه بیشتر این نتایج، آلودگی با استفاده از سلولهای T293 نیز انجام شد. بر خلاف انتظار ما، بررسی سطح ترشحی میزان NGF در سلولهای T293 ترنسفکت شده با لنتی ویروسHIV based-NGF نسبت به سلولهای T293 ترنسفکت شده با لنتی ویروس FIV based-NGF نشان داد که در این فاز هر دو وکتور قادر به آلوده سازی سلولهای T293 هستند. این افزایش در میزان بیان پروتئین NGF تا حدی بالا بود که قابل سنجش و نمایش با تکنیکهای وسترن بلاتینگ بود. این درحالی است که به ندرت میتوان رفرانسی در مورد القای بیان این ژن و سنجش میزان بیان پروتئین NGF یافت. در مطالعات مختلف به بررسی بیان پروتئین گیرندهTrkA توسط وسترن بلات بسنده شده است و نتایج حاصل از بیان پروتئین NGF ارائه نشده است (23). در هر صورت علیرغم آنکه وکتورهای ویروسی FIV-NGF و HIV-NGF هر دو دارای توانایی آلودگی سلولهای T293 بودند، عدم توانایی FIV-NGF در آلوده سازی سلولهای بنیادی مغز استخوان مشاهده شد که دلیل آن برای ما مشخص نیست و نیاز به بررسیهای بیشتر ملکولی و ساختاری در وکتور FIV-NGF را دارد. در مجموع پیشنهاد میشود تا در استفاده از وکتور FIV جهت ژن درمانی سلولهای بنیادی پستانداران با تامل بیشتری گام برداشته شود.
نتیجه گیری
علیرغم آنکه در وکتورهای ویروسی با پایه FIV تغییراتی جهت پایدار سازی، تسهیل ورود ویروس و الحاق ژنی گزارش شده است، ولی در این مطالعه این امر اثبات نشد. سلولهای مغز استخوان موش دریافت کننده وکتور FIV الحاق شده با ژن NGF قادر به زنده ماندن در محیط حاوی آنتی بیوتیک ایجاد کننده مقاومت در وکتور نبودند. در مجموع بر اساس یافته های این تحقیق، استفاده از وکتورهای با پایه FIV جهت الحاق ژنی در سلولهای پستانداران پیشنهاد نمیشود.
تشکروقدردانی
این مقاله با حمایت مالی پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری به انجام رسیده است. در ضمن از سرکار خانم فاطمه وحید دستجردی و آقای مصطفی جمشیدی بابت خرید و در اختیار قرار دادن وکتور های کلون شده HIV-NGF و FIV-NGF صمیمانه سپاسگزاری میشود.