نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسنده
دانشگاه رازی، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، کرمانشاه، ایران
چکیده
هدف: در این تحقیق ویژگیهای مورفولوژیکی، کشت سلولی، ایمونوشیمیایی و القایی سلولهای درمی چنگال موش صحرایی مورد مطالعه قرار گرفت. مواد و روش‌ها: ابتدا انگشتان موش از محل آخرین مفصل منتهی به چنگال قطع و بخش‌های قطع شده برای مطالعات بافت شناسی آماده شد. همچنین بافت درمی زیر صفحه چنگال استخراج و در شرایط in vitro کشت داده شد. سلولهای کشت شده در پاساژ 2 و 3 بهروی لامل متتقل و با آنتی بادی α-smooth muscle actin (ASMA) واکنش داده شدند. در نهایت سلولهای کشت شده با DiI رنگ شده و به نیمه-فولیکولهای ویبرسا و گوش پیوند زده شدند. نتایج: سلولهای درمی چنگال از نظر ویژگیهای ریخت‌شناسی، کشت سلولی، بیان پروتئین ASMA با پاپیلای درمی فولیکول مو شباهت نشان دادند. این سلولها یک مورفولوژی دو قطبی و دوکی شکل را به نمایش گذاشتند که در یک ماتریکس خارج سلولی غنی از گلیکوزآمینوگلیکان قرار داشتند. اکثریت سلولهای کشت شده پروتئین ASMA را در سیتوپلاسم خود بیان کردند و این پروتئین با شدت بیشتری در پاهای تیغهای مشاهده شد. با وجود این، برخلاف سلولهای درمی فولیکول مو این سلولها قادر نبودند اپیدرم اکتوپیک را برای ایجاد یک زائده پوستی القا کنند. نتیجه‌گیری: قابلیت القایی که در سلولهای پاپیلای درمی فولیکول مو مشاهده شده است قابل تعمیم به سلولهای درمی سایر ضمائم پوستی از جمله سلولهای درمی چنگال نیست. از شواهد چنین استنباط میشود که عامل القا کننده موجود در سلولهای پاپیلای درمی فولیکول مو در سلولهای درمی چنگال بیان نمیشود.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Investigating the Properties and Capabilities of Rat’s Claw Dermal Cells on Interacting with Heterotopic Epidermis
نویسنده [English]
- A GH
چکیده [English]
Aim: In this research morphological, cell culture, immunochemical and inductive properties of rat’s claw dermal cells were investigated. Material and Methods: First, the toes and fingers of rat were amputated at the point of the last joint and the amputated parts were processed for histological studies. Moreover, the dermal tissue located beneath the claw’s plate was dissected and cultured in vitro. Cultured cells at passage two or three were transferred on the slide and treated with α-smooth muscle actin (ASMA) antibody. Finally the cultured cells were stained with DiI and implanted into the vibrissae semi-follicles and ears. Results: The rat’s claw dermal cells in terms of morphological, cell culture and expression of ASMA demonstrated similarity with dermal papilla cells of hair follicles. These cells showed a bipolar spindle-shaped morphology having an extracellular matrix rich in glycosaminoglycans. Majority of the cells expressed ASMA in cytoplasm with a higher intensity in lamelopodia. However, with respect to hair follicular dermal papilla cells, the claw dermal cells were not able to induce an ectopic epidermis to form the skin appendage. Conclusion: The inductive capability which has been seen in hair follicle’s dermal papilla cells can not be generalized to dermal cells present in other skin appendages, including claw. Based on the results presented here, the inductive factors exist in hair follicle dermal papilla cells is not expressed in the claw dermal cells.
کلیدواژه‌ها [English]
- Cell culture
- Histology
- Immunochemistry
- induction
- Rat
برهمکنش بین سلولهایی با منشا انتوژنی متفاوت که در نتیجه حرکات سلولی در مجاورت هم قرار میگیرند یکی از اتفاقات معمول طی تکوین جنین است. این برهمکنشهای دو سویه، دقیقا زمانبندی شده، منظم و زنجیر وار اساس تکوین تعدادی از اندامهای جنین را تشکیل میدهد (1، 2، 3 و 4). مطالعات زیادی روی برهم کنشهای مزانشیمی-اکتودرمی پوست و ضمائم پوستی (فولیکول مو، فولیکول پر و غدد پستانی) انجام گرفته و در این مطالعات نقش حیاتی این برهمکنشها در تکوین طبیعی پوست و ضمایم آن نشان داده شده است (12-5). علاوه بر اهمیت این برهمکنشها در طی تکوین جنینی شواهدی وجود دارد که پیشنهاد میکند این برهمکنشها برای رشد و تمایز صحیح اپیتلیوم در موجود بالغ نیز حیاتی میباشند (13). در پی این مطالعات چنین مطرح شده که فاکتورهای پیام رسانی وجود دارند که روی هر یک از اپیتلیوم و مزانشیم عمل کرده و هومئوستازی آنها را تنظیم میکنند (14).
مطالعه این برهمکنشها و تاثیرات مستقیم آن در شرایط in vivo و طی فرآیند مورفوژنز سخت و دشوار است چرا که متغیرهای بسیاری در این موضوع دخالت دارند و اینکه نمیتوان بهآسانی شرایط آزمایش را تحت کنترل قرار داد. از اینرو، برای درک بهتر ماهیت این برهمکنشها محققین به تکنیکهای نوترکیبی مراجعه میکنند. در این تکنیکها، بافتهای در حال تکوین درمی –اپیدرمی از یکدیگر جدا شده و با بافتهایی از حیوان هم نوع ولی از ناحیه متفاوتی از بدن (Heterotopic)، حیوان همنوع ولی متفاوت از نظر تکوین (Heterochronic) و یا حیوانی که در رده متفاوتی قرار دارد (Heterospecific) مجاور میشوند. این بافتهای نوترکیب شده سپس یا در شرایط in vitro کشت میشوند یا روی پرده کوریوآلانتوئیک جوجه قرار میگیرند و یا به یک میزبان مناسب پیوند میشوند. چنین آزمایشات نوترکیبی نه تنها کرونولوژی و آبشار وقایع را طی تکوین ضمایم پوستی مشخص میکند بلکه نقش هر بافت را در این اتفاقات آشکار میکند (15)
با استفاده از نوترکیبیهای heterospecific که در آغاز بین بافتهای جنین موش و جنین جوجه انجام شد مشخص شد که ویژگی گونهای (species specificity) ضمایم پوستی در اپیدرم نهفته است (16، 17و 18). از این آزمایشات چنین استنتاج میشد که ظاهرا درم یک نقش تعیین کننده در تکوین ضمایم پوستی ندارد. اما مطالعات بعدی مشخص کرد که درم نیز یک نقش غیرقابل انکاری در این فرآیند دارد. همچنین نشان داده شده است که علاوه بر القای اولیه اپیدرم، درم در تمام مراحل تشکیل ضمایم پوستی نقش دارد. بهعلاوه، مشخص شده که مورفولوژی و طرح ضمائم پوستی بهوسیله درم تعیین میشود (19). مطالعات انجام شده روی برهمکنشهای درمی-اپیدرمی طی بلوغ نیز پیشنهاد میکند که حتی در بلوغ نیز درم بهطور مداوم و موثر روی سرنوشت اپیدرم تاثیر میگذارد. این شاهد از انجام نوترکیبیهایی میآید که بین فولیکول پر و فولیکول مو انجام گرفته است (20).
بهدنبال کشت سلولهای پاپیلای درمی حاصل از ضمایم پوستی (مو، پشم و ویبریسا) محققین نشان دادند که این سلولها همچون بافتهای کامل خود ویژگی القایی را حفظ میکنند بهنحویکه این سلولهای کشت شده میتوانستند تولید مو را بر روی پوست گوش القا کنند (21). با وجود این یافتههای جالب توجه، هنوز سوالات بیجواب متعددی در زمینه برهمکنشهای درمی-اپیدرمی وجود دارد. لیکن در این مقاله سعی میشود به یک سوال جواب داده شود و آن اینکه سلولهای درمی مشتق شده از سایر ضمایم اپیدرمی (در اینجا چنگال موش صحرایی) نیز قابلیتهای القایی مشابه آنچه در سلولهای درمی فولیکول مو و پر مشاهده میشود را به نمایش میگذارند یا خیر.
ناخن در انسانها و چنگال در حیوانات غیر-پریمات نیز یک زائده پوستی محسوب میشود که در طی مراحل جنینی در نتیجه برهمکنشهای درمی-اپیدرمی ایجاد میشود. اگرچه، برخلاف فولیکول مو، چنگال و ناخن دارای رشد مداوم بوده و فاقد مرحله استراحت میباشند ولی در سرتاسر حیاتشان بین این دو شباهتهایی وجود دارد. پیشنهاد شده که ناخن و چنگال در واقع شکل تانخورده و باز شده فولیکول مو هستند. همچنین از لحاظ بیوشیمیایی نیز این دو ساختار شباهت زیادی بههم نشان میدهند (22). علیرغم این شباهتها بر اساس سابقه تحقیقات نوترکیبی تاکنون پژوهشی بر روی ویژگیهای القایی بخش درمی ناخن یا چنگال صورت نگرفته است. از اینرو در این مطالعه علاوه بر بررسی ویژگیهای سلولهای درمی چنگال در محیط کشت به این سوال پرداخته میشود که آیا سلولهای درمی حاصل از بستر چنگال موش صحرایی دارای این قابلیت هستند که در پیوند با اپیدرم هتروتوپیک (فولیکول مو) تشکیل ضمائم پوستی را القا کنند؟ و اگر این قابلیت را دارند در نتیجه این نوترکیبی چه زائده پوستی بهوجود میآید؟
مواد و روش‌ها
بافت شناسی: بعد از طی دوره نحوه رفتار با حیوانات و کسب مجوز مربوطه از کمیته اخلاق دانشگاه، بهمنظور دستیابی به دانش و فهم دقیقتری از مورفولوژی و محل دقیق قرارگیری سلولهای درمی در چنگال موش صحرایی نژاد PVG (inbred Piebald Virol Glaxo)، یک نوزاد موش 4 روزه انتخاب شد. حیوان با دوز بالایی از CO2 کشته و انگشتان دست و پای آن با کمک یک تیغه اسکالپل قطع شد. انگشتان در محلول فرمالین نمکی 4 درصد تثبیت شدند و نمونههای تثبیت شده متعاقبا بهطریق معمول برای مطالعات بافت شناسی آماده شد.
جداسازی و کشت سلولهای درمی از بستر چنگال: برای این بخش موشهایی با سنین بین 4 تا 30 روز استفاده شد. حیوانات با دوز بالایی از CO2 کشته و سپس انتهای اندامهای حرکتی آنها با اتانول 70 درصد شستشو داده شد. با استفاده از یک تیغه اسکالپل نوک انگشتان از محل آخرین مفصل منتهی به چنگال قطع گردید (شکل a1) و قطعههای جدا شده بلافاصله در یک پتری دیش حاوی MEM و آنتیبیوتیکها (100 U/ml پنیسیلین، 100 میکروگرم بر میلیلیتر دوز استروپتومایسین، 5/2 میکروگرم بر میلیلیتر فونگیزون، همگی تهیه شده از شرکت Gibco) قرار گرفت. در زیر استرئومیکرسکوپ و با استفاده از قیچی جراحی ظریف یک برش طولی در طول پوست بخش قطع شده ایجاد شد تا ساختارهای داخلی آشکار گردند. پوست نمونهها متعاقبا جدا شده و دور انداخته شد. ساختارهای داخلی قطعهها عبارت بودند از استخوان آخرین بند انگشت بهاضافه بافتهای مربوط به چنگال که بههمراه هم به یک ظرف جدید MEM و آنتیبیوتیک منتقل شد. در اینجا با کمک پنسهای ظریف صفحه کراتینه چنگال بهآرامی از استخوان جدا و دور انداخته شد. بافت پاپیلای درمی که درست زیر صفحه کراتینه قرار میگیرند اکنون تنها بافتی بودند که چسبیده به سطح استخوان آخرین بند انگشت باقی مانده بود. اکنون این بافت بهآرامی با کمک پنس و نوک سوزن سرنگ از استخوان جدا شده (شکل b1) و به ظروف کشت 35 میلیمتر انتقال یافت. این بافتها ابتدا در یک یا دو قطره محیط کشت ] MEM + 20 درصد سرم جنین گاوی (FCS) + آنتیبیوتیکها[ کشت داده شد.شرایط داخلی انکوباتور برای کشت عبارت بود از دمای 37 درجه سانتیگراد، 95 درصد اکسیژن و 5 درصد .CO2 ظروف چهار روز پس از کشت در زیر میکروسکوپ اینورت مورد مشاهده قرار گرفته و پس از دیدن نشانهای دال بر چسبیدن بافتها به کف ظرف و شروع رشد سلولها، 2 میلیلیتر از همان محیط کشت به ظروف اضافه شد. پس از ایجاد، رشد و خروج کامل سلولها از بافتها (tissue explants) و همچنین در ادامه کار تا رسیدن به مرحله پاساژ سلولها با محیط کشت ] MEM + 10 درصد سرم جنین گاوی (FCS) + آنتیبیوتیکها[ تغذیه شد (شکل c1).
رنگ آمیزی سلولهای کشت شده با رنگ حیاتی 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate یا DiI
برای آشکار کردن قابلیت القایی سلولهای درمی حاصل از چنگال در برهمکنش با اپیدرم هتروتوپیک (اپیدرم فولیکول ویبریسا و اپیدرم گوش) در شرایط in vivo، ابتدا سلولهای درمی کشت داده شده بعد از پاساژ 2 و 3 با رنگ حیاتیDiI رنگ آمیزی شدند (شکل d1). هدف از اینکار این بود که ما بتوانیم تا بدون آسیب رساندن به سلولها در انتهای کار سرنوشت سلولهای پیوند شده را در محل پیوند تعقیب کنیم. برای این منظور بعد از تریپسینه کردن و سانتریفوژ نمودن سلولها، پلیت سلولی کف لوله سانتریفوژ در یک میلیلیتر MEM حاوی 5 میکرومول FM-DiI (مولکولار پروبز، آمریکا) بهحالت سوسپانسیون درآمد. سوسپانسیون سلولی متعاقبا ابتدا برای مدت 5 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد و بعد برای 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد انکوبه شد. سلولها سپس در شرایط rpm1800 سانتریفوژ و محلول رویی (supernatant) حاوی رنگ اضافی دور ریخته شد. پلت سلولی با 5 میلیلیتر MEM بهصورت سوسپانسون درآمد و سوسپانسیون دوباره بهصورت قبل سانتریفوژ شد. در این مرحله پلت سلولی در MEM حاوی 10 درصد FCS بهحالت سوسپانسیون درآمد و در همین محیط به ظروف کشت 35 میلیمتر منتقل شد. ظروف برای مدت 3 روز در شرایط تاریکی و دمای 37 درجه سانتیگراد خوابانده شدند. بعد از پایان این مدت محیط کشت سلولها با محیط کشت MEM تنها تعویض شد. ظروف در این محیط برای 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند تا اینکه برای پیوند زدن بهطریقی که شرح آن در زیر میآید آماده شوند.
پیوند سلولهای رنگ آمیزی شده با DiI به داخل فولیکول ویبریسای قطع شده (فاقد پاپیلای درمی): برای پیوند 2 موش صحرایی با سن 4 ماه بهعنوان پذیرنده سلولهای پیوندی انتخاب شدند و محل پیوند فولیکولهای ویبرسا (موهای زبر و درشت پشت لب فوقانی جوندگان و سایر پستانداران) بود. موشها با کمک فلوتن (Mallinckrodt Veterinary Ltd, UK) بیهوش شدند. سپس با کمک قیچی و تیغه اسکالپل ظریف پوست ناحیه لب فوقانی از عقب ناحیهای که ویبریسا قرار دارند بریده و ناحیه بریده با روشی که با جزئیات در جای دیگر شرح داده شده است (22) معکوس شد تا فولیکولها در معرض قرار گرفتند. فولیکولها سپس بهطور مجزا از بافتهای همبند اطراف آزاد شدند و موقعیت آنها بر مبنای فرمول اولیور (23) ثبت شد. عملیات پیوند روی فولیکولهای بزرگتر که در آخرین ردیف پشتی-شکمی قرار میگیرند انجام گرفت. فولیکولها بر طبق روش معمول و استاندارد برای پذیرش سلولهای پیوندی آماده شدند (24). بهطور خلاصه، ابتدا با استفاده از پنس فولیکولها از محل اتصال به سطح پوست گرفته شده و سپس طولی از فولیکول با کمک قیچی ظریفی قطع شدند (شکل a2). محل قطع شدگی درست در بالای محل ورود عصب به دیواره کپسول فولیکول بود و با اینکار بهعبارتی نیمه فوقانی فولیکول (شکل b2) از نیمه تحتانی فولیکول (شکل b2) جدا شد. نیمه تحتانی سپس دور انداخته شد (ناحیه تحتانی همان محلی است که سلولهای پاپیلای درمی خود فولیکول در آن قرار میگیرند). سپس رشته ویبرسای موجود در نیمه فوقانی و بهجا مانده فولیکول قطع شده از فولیکول کنده شد (شکل c2) تا با اینکار فضای لازم برای جا دادن سلولهای پیوندی مهیا شود. پس از آماده شدن نیمه فولیکولهای پذیرنده بهسراغ ظروف کشت سلولهای درمی چنگال که با DiI رنگ شده بودند رفته و بعد از دور ریختن محیط کشت روی سلولها، تکلایه سلولی روی کف ظرف با کمک یک تیغه لاستیکی تراشیده شده (e1) و بهصورت یک توده (clamp) جمع آوری شد. این توده سلولی سپس بهوسیله پنس به فضایی که در انتهای نیمه فولیکولها قرار داشت و از کندن رشته ویبرسا ایجاد شده بود منتقل شد (شکل d2). بهطور کلی تعداد 9 نیمه فولیکول به این طریق سلولهای درمی رنگ شده با DiI را دریافت نمودند. بعد از تزریق سلولها به این نیمه فولیکولها، پوست این ناحیه بهحالت اول برگردانده شده و بریدگی ایجاد شده بخیه زده شد. موشها سپس بههوش آورده شده و به قفسهای مجزا منتقل شدند. ذکر این نکته ضروری است که پس از بههوش آمدن، این حیوانات مشکلی در خوردن و آشامیدن نداشتند. بعد از 20 روز از عملیات پیوند شدن، موشهای میزبان کشته شده و نیمه فولیکولهای دریافت کننده پیوند جدا و بهطور فوری با مایع tissue-tek (میلز، آمریکا) قالب گیری و با نیتروژن مایع فریز شدند. با استفاده از میکروتوم کرایوستات (برایت، انگلستان) برشهای 6 میکرومتری تهیه و بر روی لام قرار داده شدند. سپس بهطور سریع برشها در زیر میکروسکوپ فلورسنس مجهز به فیلتر فلورسنس رودامین و همچنین عدسیهای فازکنتراست مورد مشاهده قرار گرفتند.
شکل 1: مراحل آماده سازی و پیوند سلولهای پاپیلای درمی چنگال به نیمه فولیکول ویبریسا. محل قرار گیری بافت پاپیلای درمی در چنگال (1a)، خارج کردن بافت پاپیلا (1b)، کشت بافت در محیط کشت (1c)، رنگ آمیزی سلولهای کشت شده با DiI (1d)، پیوند سلولها به نیمه بالایی نیمه فولیکول ویبریسا.دو نیمه کردن فولیکول ویبریسا (2a) دور انداختن نیمه پائینی فولیکول (2b)، کندن رشته مو از نیمه بالایی فولیکول (2c)، پذیرش سلولهای درمی چنگال به فضای برجای مانده از محل رشته مو (2d).
پیوند زدن سلولهای رنگ آمیزی شده با1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate (DiI) بهداخل زخمهای ایجاد شده در لاله گوش: تعداد 3 موش بالغ با کمک فلوتن بهطور سبک بیهوش شده و لاله گوشهای آنها با الکل 70 درصد شستشو داده شد. سپس با در دست گرفتن گوشها با کمک یک تیغه اسکالپل شماره 11 یک زخم طولی کوچکی بهطول 3 تا 4 میلیمتر در مرکز گوش ایجاد شد. سپس یک سر سوزن سرنگ از طریق این زخم بهداخل درم عبور داده شد تا فضای لازم برای سلولهای پیوندی را ایجاد کند. حال هر گونه خون و ترشحات دیگر زخم و اطراف آن با کمک دستمال استریل پاک شد تا کار برای پیوند سلولهای درمی رنگ شده با DiI آماده گردد. برای پیوند زدن این سلولها دوباره به همان طریقی که در قسمت قبل شرح داده سلولها از کف ظروف تراشیده شده و توده سلولی بهدست آمده با کمک پنس ظریفی بهداخل فضای ایجاد شده در زخم گوش جاسازی شد. حال محل زخم برای چند دقیهای بهحال خود رها شد تا لایه سطحی سلولهای پیوندی و ترشحات خونی پوست خشک شود. سپس به موشها اجازه داده شد تا بههوش آیند و به قفسهای خود منتقل شوند. 7 تا 10 روز بعد از پیوند زدن، حیوانات مذکور کشته شده و بافت محل زخم بعد از جدا سازی به روش آنچه برای فولیکولها ذکر شد برای بررسیهای بافتی آماده شد.
نتایج
بافت شناسی
چنگال در نتیجه برهمکنشهای مداوم و پیوستهای که در انتهای پشتی انگشتان اتفاق میافتد تولید میشود. بخش درمی یا پاپیلای چنگال با ماتریکس اپیدرمی (مکان تولید سلول) که در بالای انتهای دیستال آخرین بند انگشت قرار دارد برهمکنش میکند. پاپیلای درمی چنگال ویژگیها و مشخصاتی را به نمایش میگذارند که در سلولهای پاپیلای درمی فولیکول موی در حال رشد دیده میشود. به این ترتیب که پاپیلا با سلولهای شبه فیبروبلاستی اشغال میشود که در یک ماتریکس خارج سلولی فراوان پراکندهاند (شکل 2). ماتریکس خارج سلولی این پاپیلا بهخوبی با آبی آلسین رنگ میگیرد که نشانه این است که این ماتریکس غنی از ترکیبات گلیکوزآمینوگلیکان میباشد. درست در بالای این پاپیلای درمی اپیتلیومی قرار دارد که در واقع ادامهای از اپیدرم پوست است که لایههای سلولی آن همچنانکه بهطرف سطح حرکت میکنند دچار تمایز میشوند. این سلولها در مسیر حرکت به سطح بزرگتر، پهنتر و طویلتر شده و هسته خود را از دست میدهند. آنها سرانجام صفحه ضخیم چنگال را میسازند که از سلولهای متراکم کراتینه شده تشکیل میگردد.
شکل 2: ساختار بافتشناسی چنگال موش صحرائی 4 روزه: (A) بزرگنمائی پائین از انتهای انگشت. چنگال بهطور اساسی از 2 بخش اپیدرمی (پیکان) و درمی (d) تشکیل میشود. استخوان آخرین بند انگشت (b) هنوز استخوانی نشده و شامل سلولهای غضروفی است. (B) بزرگنمائی بالاتر از همان ناحیه. بافت درمی یا پاپیلای چنگال (پیکان) از سلولهایی که در ماتریکس غنی از گیکوزآمینوگلیکان قرار دارند تشکیل میشود. از این بافت درمی برای کشت سلولی استفاده شد.رنگ آمیزی: آبی آلسین- هماتوکسیلین-پونسوای S کورتیس. خط نشانه در A برابر با 100 میکرومتر و در B برابر 50 میکرومتر.
کشت سلولی
ظروف کشت سلولهای پاپیلای درمی چنگال سه روز بعد از انجام کشت مورد مشاهده قرار گرفتند. در این زمان سلولها از تمام جهات شروع به خروج از پیرامون قطعههای بافتی (tissue explants) کرده بودند. با وجود بعضی تغییرات، این سلولها در حالت کلی کوچک و دوکی شکل بودند. در ابتدا هیچ تفاوتی از نظر اندازه و تراکم بین سلولهای مجاور قطعههای بافتی و سلولهای حاشیهای وجود نداشت (شکل A3). با اینحال، بعد از گذشت 2 تا 3 روز، سلولهای مجاور بافتها متراکمتر از سلولهای نواحی حاشیهای ظاهر میشدند (شکل B3). سلولهای حاشیهای دارای پاهای تیغهای متعددی بودند که اشاره به این داشت که فعالانه در حال حرکت و مهاجرت هستند. قابلیت تکثیر سلولهای پاپیلای درمی بالا بود و سلولهای در حال تقسیم به فراوانی در محیط کشت دیده میشدند (شکل C3). در نتیجه این سرعت تکثیر بالا و مهاجرت فعال سلولها، فرآیند گسترش سلولی در اطراف قطعات بافتی سریع بود و به تبع آن سلولها در زمان کوتاهی (طی دو هفته) تمام فضای کف ظروف کشت را میپوشاندند (شکل D3). این ویژگی حتی بعد از پاساژ سلولها در آنها حفظ میشد بهطوریکه آنها طی فقط چند روز بعد از پاساژ بهحالت تک لایه پیوسته یا کانفلوئنت (confluent) میرسیدند. در حالت کانفلوئنت، سلولها مجتمع شده و تودههای سلولی متراکم (clumps) ایجاد میکردند ولی این تودههای سلولی از لحاظ بزرگی به اندازه آنچه در مورد تودههای سلولهای پاپیلای فولیکول مو دیده شده (21) نمیرسیدند (شکل D3).
شکل 3: میکروگرافهای فاز-کنتراست از سلولهای پاپیلای درمی چنگال در محیط کشت. (A) سلولهای درمی خارج شده از قطعههای بافتی 4 روز پس از شروع کشت. سلولها عمدتا دوکی شکل بوده و دارای پاهای تیغهای مشخص هستند. (B) بعد از 7 روز از شروع کشت سلولهای مجاور قطعههای بافتی متراکمتر از سلولهای پیرامونی مشاهده میشوند. (C) سلولهای در حال تقسیم متعددی (پیکان) در میان سلولهای درمی محیط کشت وجود داشت. (D) در مرحله کانفلوئنت سلولهای درمی تشکیل مجتمعها و تودههای کوچکی از سلولها (پیکان) را میدادند. خط نشانه در A، B و C برابر 25 میکرومتر، در D برابر با 150 میکرومتر.
نشاندار کردن سلولهای کشت شده یا آنتیبادی ASMA
برای آشکار کردن سایر ویژگیهای سلولهای پاپیلای درمی چنگال، این سلولها بعد از پاساژ 2 و 3 با آنتیبادی ASMA نشاندار شدند. تقریبا 85 تا 90 درصد این سلولها با این آنتیبادی نشاندار و این ترکیب در تمام میکروفیلامنتهای سیتوپلاسمی بیان گردید (شکل 4). با این وجود شدت رنگ گرفتن فیلامنتهای موجود در پاهای تیغهای بیشتر از بقیه سیتوپلاسم بود. همچنین این آنتیبادی در سلولهای پهن و پراکنده با شدت بیشتری نسبت به سلولهای کوچک و متراکم ظاهر میشد.
شکل 4: رنگ آمیزی ایمونوفلورسنس از سلولهای درمی چنگال در محیط کشت با آنتی بادی ASMA. اکثریت سلولها این پروتئین اسکلت سلولی را در سیتوپلاسم (بهویژه در پاهای تیغهای) بیان میکنند ولی بیان این پروتئین در سلولهای پهن (پیکان بزرگ) شدیدتر از سلولهای کوچک و متراکم (نوک پیکان) است. خط نشانه برابر 50 میکرومتر.
توانایی برهمکنشی سلولهای درمی پاپیلای چنگال
بهمنظور ارزیابی قابلیتهای برهمکنشی، سلولهای کشت شده چنگال ابتدا با DiI رنگ شده و سپس بهداخل زخمهای ایجاد شده در لاله گوش و یا نیمه بالایی فولیکول ویبریسا موش صحرایی وارد شد. بررسیهای بافتشناسی گوشهای دریافت کننده سلول در 7 تا 10 روز پس از وارد نمودن سلولها نشان داد که ناحیه پذیرنده سلول بهدلیل گسیختگی بافتها بهراحتی از نواحی اطراف قابل تشخیص است (شکل A5). اما هیچگونه ساختار بافتی در محل سلولهای وارد شده مشاهده نشد. برای پی بردن به موقعیت و مکان سلولهای کاشته شده، برشهای بافتی تهیه شده از گوش میزبان زیر میکروسکوپ فلورسانس مجهز به فیلتر رودامین مورد مشاهده قرار گرفتند. سلولهای کاشته شده پاپیلای چنگال عمدتا بهصورت تودههای مجتمعی در عمق بافت گوش وجود داشتند، هر چند که تعدادی از این سلولها نیز بهطور پراکنده در پیرامون محل زخم دیده میشدند (شکل B5). اما، این سلولها در ساختمان و یا در ارتباط با هیچ ساختار بافتی (از قبیل فولیکول مو و یا غیره) مشاهده نشدند. علاوه براین، هیچ اثری از سلولهای درمی وارد شده در ساختار بافتهای میزبان و ضمائم آن مشاهده نشد.
همچنین بررسی نیمه فولیکولهای ویبریسای دریافت کننده سلولهای پاپیلای چنگال بعد از 20 روز از آزمایش مشخص کرد که قسمت تحتانی این نیمه فولیکولها ظاهرا با کمک همکاری سلولهای پیوندی التیام یافته و یک بافت جوشگاهی در این ناحیه شکل گرفته است. اما از این نیمه فولیکولها هیچ ساختاری (از قبیل رشته مو و ...) منشا نگرفته بود (شکل C5). مشاهدات بافتشناسی نیز نشان داد که هیچ نشانهای از ترمیم فولیکول و ایجاد مو یا تشکیل یک زائده پوستی دیگر در این نیمه فولیکولها مشاهده نمیشود. بررسی برشهای تهیه شده از این نیمه فولیکولها زیر میکروسکوپ فلورسانس تایید کرد که هرچند تعدادی از سلولهای رنگ شده بهطور پراکنده در بخش فوقانی این فولیکولها دیده میشوند لیکن بخش اصلی سلولهای پیوند شده هنوز در انتهای تحتانی فولیکولها، یعنی همان جایی که سلولها به آ ن وارد شدند، باقی ماندهاند (شکل D5).
شکل 5: میکروگرافهای فاز-کنتراست و فلورسنس از بافتهای دریافت کننده سلولهای پاپیلای درمی کشت شده. (A) برش بافتی از ناحیهای از گوش که سلولهای درمی رنگ شده با DiI را دریافت کرده بود. هیچ نشانهای از تشکیل ساختار پوستی در محل پیوند دیده نمی شود. محل وارد کردن سلولها (der)، موقعیت زخم ایحاد شده (پیکان). (B) تصویر گرفته شده از محل پیوند با استفاده از میکروسکوپ فلورسنس. همانطور که مشاهده میشود سلولهای درمی چنگال (رنگ قرمز) هنوز هم در محل پیوند مشاهده میشوند. (C) نیمه فولیکول دریافت کننده سلولهای درمی نیز نشانهای از ایجاد برهمکنش بین سلولهای پیوندی و اپیدرم بافت میزبان (پیکان) در آن دیده نمیشود. (D) مشاهده نیمه فولیکول دریافت کننده سلول نیز نشان داد که بعد از گذشت 2 روز هنوز نیز سلولهای درمی (رنگ قرمز) در محل پیوند مشاهده میشوند. خط نشانه در A برابر 25 میکرومتر، در B و C برابر 100 میکرومتر و در D برابر با 50 میکرومتر.
بحث
در این پژوهش بررسی بافتشناسی چنگال نشان داد این ساختار نیز همچون سایر ضمائم پوستی از دو بخش درمی و اپیدرمی تشکیل میشود و در نتیجه برهمکنش همین دو بخش است که بهطور ممتد صفحه کراتینی چنگال و یا ناخن در طول عمر حیوان رشد میکند. این برهمکنش نه تنها در دوره جنینی که در تمام دوره بلوغ ادامه دارد. فاکتورهای متعددی شناسایی شده که در این برهمکنش میان درم و اپیدرم دخالت دارند (25). تحقیقات انجام شده اهمیت نقش فاکتور رونویسی LIM 1B را در تشکیل چنگال (و همچنین اندام حرکتی) در جنین موش نشان داده است. این فاکتور همچنین در ایجاد قطبیت پشتی-شکمی اندام حرکتی در حال نمو نقش دارد (26). چنین تصور میرود که LIM 1B نقش خود را از طریق مسیر اسپوندین بهانجام میرساند. اسپوندینها خانوادهای از پروتئینها هستند که در ارتباطات درون سلولی مشارکت دارند. نشان داده شده که برای مثال، اسپوندین 4 در تعیین فعالیت سیستم پیام رسانی Wnt/بتا کتنین دخالت دارد و این مسیر نیز بهنوبه خود در شروع فرآیند تشکیل چنگال نقش بازی میکند (27 و 28). موشهایی که در تولید اسپوندین دارای نقص هستند انواعی از ناهنجاریها از جمله نداشتن چنگال را به نمایش میگذارند (29). عقیده بر این است که در ضمائم پوستی اسپوندین موجود در سلولهای درمی در القا اپیدرم رویی و شروع فرآیند نمو این ضمائم نقش دارد و نشان داده شده که سلولهای درمی که فاقد اسپوندین هستند (فیبروبلاست) این خاصیت القایی را بروز نمیدهند (30). علاوه بر اسپوندین ژن Akt نیز در تشکیل چنگال اهمیت دارد. موشهای ترنسژنیکی که واجد تغییراتی در این ژن هستند فاقد چنگال میباشند. محصول ژن Akt یک پروتئین کیناز سرین/ترئونین است که در پیام رسانی سلولی نقش دارد (31). برخلاف اسپوندین که در بافت مزانشیمی وجود دارد و مسئول برهمکنش بین مزانشیم و اکتودرم است، Akt در اپیتلیال قرار دارد و تصور میشود یک نقشی در عملکرد پروتئین ریخت زای استخوان یا Bone morphgenic protein (BMP) بازی میکند. این پروتئین علاوه بر اینکه در تشکیل چنگال دخالت دارد یک نقش حمایتی در نمو چنگال بازی میکند، ضمن اینکه در قابلیت ترمیم آخرین بند انگشت انسان در دوره نوزادی نیز نقش دارد (32). بنابراین چنین بهنظر میرسد که این ارتباطات دوجانبه (اپیدرم-درم) لازمه تشکیل چنگال است و اگر اختلالی در این ارتباطات بهوجود آید نتیجه آن ایجاد عدم تشکیل چنگال و یا ناهنجاریهای همچون هیپوپلاستیک چنگال میشود (33).
مطالعات ایمونوهیستوشیمی انجام شده وجود ترکیبات متعددی را در بخش اپیدرمی و درمی چنگال نشان داده است. انواعی از کراتینهای نرم (soft)، کراتین 10-1، و کراتینهای سخت (hard)، کراتین 14، 16، 17، 31، 32، 81، 85 و 86 در بخش اپیدرمی چنگال یافت شده است (34 و 35). همچنین در بخش درمی نیز مولکولهای مختلفی بیان میشود. در این تحقیق نشان داده شد که سلولهای درمی در یک ماتریکس غنی از گلیکوزآمینوگلیکان (جزئی از ساختار پروتئوگلیکانها) وجود دارند.گزارش شده که سلولهای مزانشیمی بستر چنگال واجد ورسیکان (versican) هستند و این یک پروتئوگلیکان کوندروئیتین سولفات است که عضوی از خانواده لکتیکانها (lecticans) میباشد (36). همچنین مشخص شده که در بخش درمی ویمنتین، دسمین و مهار کننده فعال کننده پلاسمینوژن نوع 2 ( plasminogen activator inhibitor type 2) بهشدت بیان میشود (26 و 37). در این پژوهش نشان داده شد که سلولهای درمی چنگال در محیط کشت پروتئین ASMA بیان میکنند و این مشاهده در راستای مطالعهای است که نشان داده سلولهای درمی با آنتیبادی HHF35 بهشدت واکنش نشان میدهند. آنتیبادی مذکور بهطور اختصاصی به اکتین متصل میشود. پروتئین اکتین بههمراه سایر پروتئینها ضمن فراهم آوردن حمایت مکانیکی برای سلول در اعمال مختلف سلولی همچون انقباض، چسبندگی و حرکت دخالت دارد (38). در بافتهای یوکاریوتها سه نوع ایزوفرم اکتین ( آلفا، بتا. گاما) وجود دارد. در حالیکه اکتین بتا بهطور غیرافتراقی در تمام سلولهای یوکاریوت وجود دارد، اکتین آلفای قلبی، اکتین آلفای اسکلتی و اکتین آلفای ماهیچه صاف (ASMA) بهعنوان اکتین خاص-بافت در نظر گرفته میشوند. البته باید توجه داشت که علاوه بر سلولهای ماهیچه صاف ASMA در سایر سلولها نظیر میوفیبروبلاست، میواپیتلیال و فیبروبلاست و سایر سلولهایی که خاصیت انقباضی دارند یافت میشود (39 و 40). بیش از چند دهه است که مشخص شده سلولهای فیبروبلاست بافت همبند نیز فعالیت انقباضی شبه ماهیچهای از خود نشان میدهند. گزارشهایی وجود دارد که نشان میدهد انقباض فیبروبلاستها در بافت همبند یک نقش کلیدی در بسته شدن زخمها در جریان التیام جراحت پوست بازی میکند و تایید شده که این رفتار انقباضی فیبروبلاستها ناشی از وجود ASMA در آنها میباشد (41). نقش ASMA در سلولهای درمی بستر چنگال احتمالا اعمال نیروی انقباضی در جهت آرایش و سازمانبندی سلولهای کراتینی چنگال یا ناخن و همچنین راندن بافت ساخته شده بهسمت بیرون میباشد، چیزی مشابه وظیفهای که برای این پروتئین در دیگر ساختار پوستی یعنی غده پستانی مشخص شده است. گزارشی وجود دارد که ASMA موجود در سلولهای میواپیتلیال غده پستانی در انقباض این سلولها و آزاد سازی شیر از سلولهای لومینال دخالت دارد (42). ولی اینکه این پروتئین در چنگال نیز دقیقا نقش انقباضی دارد یا در اعمال دیگر نیز مشارکت دارد یا خیر احتیاج به شواهد و مدارک بیشتری دارد.
نتایج حاصل از کشت سلولی در این مطالعه نشان داد که سلولهای درمی چنگال از لحاط ویژگیهای رشد مشخصات فیبروبلاستها را به نمایش میگذارند. اما اینکه آنها برخلاف فیبروبلاستها (که معمولا تجمع سلولی تشکیل نمیدهند) همچون سلولهای پاپیلای درمی تجمع سلولی (aggregation) مختصری در مرحله کانفلوئنت را بهنمایش میگذارند (21) این احتمال را مطرح کرد که سلولهای درمی چنگال ممکن است ویژگیهای مشابهی با سلولهای پاپیلای درمی فولیکول مو داشته باشند. با بهرهگیری و اتکا به این احتمال در این تحقیق قابلیتهای سلولهای درمی حاصل از چنگال در برهمکنش با سلولهای اکتودرمی ضمایم دیگر (هتروتوپیک) مورد بررسی قرار گرفت، چرا که قبلا نشان داده شده بود که سلولهای پاپیلای درمی و غلاف درمی فولیکول مو قادر به القا اپیدرم اکتوپیک هستند (43 و 44). لیکن نتایج حاصل از پیوند سلولهای درمی چنگال به مجاورت اپیدرم اکتوپیک در مطالعه حاضر حاکی از این بود که قطع نظر از تعداد دفعات پاساژ، سلولهای کشت شده درمی چنگال قادر به القای اپیدرم در سایر ضمایم پوستی نیستند و بهنظر میرسید فاقد قدرت القایی هستند. بهعلاوه این مشاهده که توده سلولهای پیوند شده حتی تا موقع برداشت هنوز هم در محل پیوند وجود داشتند تایید میکرد که عدم القای اپیدرم هتروتوپیک ناشی از پراکنده شدن سلولها و عدم وجود تعداد کافی از سلولها برای القا نبوده است. بنابراین، در مقایسه با ویژگیهای القایی پاپیلای درمی فولیکول مو که در مطالعات قبلی نشان داده شده است (45)، مطالعه حاضر مشخص کرد که این ویژگی سلولهای درمی بهطور فراگیر در تمام ضمائم پوستی دیده نمیشود یا اگر بخواهیم دقیقتر صحبت کنیم حداقل در مورد سلولهای درمی چنگال دیده نمیشود. گزارش شده که آنچه باعث هویت سلولهای پاپیلای درمی فولیکول مو و قابلیت آنها برای شروع مورفوژنز مو میشود فاکتور shh است که از طریق حلقه تنظیمی نوگین/shh نقش خود را باز میکند (46). از فاکتورهای مطرح دیگر در اعطای قابلیت القایی به سلولهای پاپیلای درمی فولیکول مو BMP، TGF-β2 و wnt است (50-47). اینکه آیا دلیل عدم قابلیت القایی در سلولهای درمی چنگال بهدلیل فقدان این فاکتورها است دقیقا مشخص نیست چرا که تاکنون تحقیقی در این رابطه بر روی این سلولها انجام نگرفته است و انتظار میرود که در پژوهشهای آینده این موضوع آشکار گردد.
نتیجه گیری
نتایج این آزمایش نشان داد که سلولهای پاپیلای درمی چنگال از نظر ویژگیهای مورفولوژیکی، کشت سلولی و بیان اکتین آلفای عضله صاف شباهتهایی را با سلولهای پاپیلای درمی فولیکول مو نشان میدهند. لیکن با وجود این شباهتها، این سلولها مانند همتایان خود در فولیکول مو و بافت همبند گوش قادر به القای اپیدرم هتروتوپیک و ایجاد یک زائده پوستی جدید نمیباشند.
)