نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه پیام نور، دانشکده کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، تهران، ایران
2 دانشگاه شاهد، دانشکده کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی، تهران، ایران
چکیده
هدف: هدف از این مطالعه بررسی اثر امواج فراصوت بر رشد و برخی شاخصهای فیزیولوژیکی در کشت جلبک تک سلولی Dunaliella salina بود. مواد و روش‌ها: امواج فراصوت با فرکانس 40 کیلو هرتز و توان W/Cm35، به کشتهای سلولی در روز چهاردهم واکشت در قالب طرح کاملا تصادفی با 3 تکرار اعمال شد. مدت زمان تابش امواج فراصوت به سلولها 0، 5/2، 5 و 10 دقیقه بود. شاخصهای مورد اندازهگیری عبارت بود از: رشد سلولی، پروتئین کل، رنگیزههای فتوسنتزی، پتانسیل آنتیاکسیدانتی، میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی، مقدار ترکیبات فنلی، فلاونوئیدها، آنتوسیانینها، قندهای محلول، بتا-کاروتن و گلیسرول. نتایج: نتایج نشان داد که با افزایش مدت زمان تابش امواج فراصوت رشد سلولی و مقدار رنگیزههای فتوسنتزی کاهش یافت. در مقابل مقدار پروتئین کل، پتانسیل آنتیاکسیدانتی، پراکسیداسیون لیپیدهای‌غشایی، ترکیبات فنلی، فلاونوئیدها، آنتوسیانینها، بتا-کاروتن و گلیسرول افزایش یافت. بیشترین میزان بتا-کاروتن و گلیسرول بهعنوان متابولیتهای مهم در حالت تیمار 10 دقیقه تابش امواج فراصوت بهدست آمد که بهترتیب 3/12 و 5/13 میلیگرم در لیتر بود. نتیجه‌گیری: بهنظر میرسد امواج فراصوت با تحریک سلولها و القای پاسخهای دفاعی و متابولیت ثانوی، باعث افزایش مقدار بتا-کاروتن و گلیسرول در سلولها گردید.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Increased production of beta-carotene and glycerol in Dunaliella salina cell culture by ultrasound
نویسندگان [English]
- R M 1
- A R 2
- A K 2
چکیده [English]
Aim: The purpose of this study was to investigate the effect of ultrasound on growth and some physiological parameters in cultures of unicellular alga Dunaliella salina. Material and Methods: Ultrasound waves were applied with a frequency of 40 kHz, and 5W/Cm3 power, at the fourteenth day of subculture in a completely randomized design with 3 replications. Ultrasound exposure times to cells were 0, 2.5, 5 and 10 minutes. The parameters measured were: cell growth, total protein content, photosynthetic pigments, antioxidant potential, membrane lipid peroxidation, amount of phenolic compounds, flavonoids, anthocyanins, soluble sugars, beta-carotene and glycerol. Results: The results showed, due to increase of ultrasound irradiation time, cell growth and photosynthetic pigments were decreased. In contrast, total protein content, antioxidant potential, membrane lipid peroxidation, phenolic compounds, flavonoids, anthocyanins, beta-carotene and glycerol were increased. Maximum amount of beta-carotene (12.3 mg/l) and glycerol (13.5 mg/l) as the main metabolites were obtained at 10 minutes treatment. Conclusion: It seems that ultrasound waves increased beta-carotene, and glycerol production of the cell by induction of defensive responses and secondary metabolism.
کلیدواژه‌ها [English]
- Dunaliella salina
- Cell culture
- Ultrasound
- Beta-carotene
- Glycerol
مقدمه
امروزه متابولیتهای بهدست آمده از سلولهای جلبکی و گیاهی منبع ترکیبات مهم دارویی، بهداشتی، طعم دهنده‌های طبیعی، عطرها و رنگ‌ها میباشند. استفاده از کشت سلولی در تولید متابولیتها در شرایط آزمایشگاهی مورد توجه قرار دارد. تولید متابولیتهای سلولی با خصوصیات اقتصادی از طریق کشت سلولی در شرایط آزمایشگاهی، فواید زیادی در مقایسه با استخراج این ترکیبات تحت شرایط طبیعی دارد. کنترل دقیق شاخصهای مختلف، سبب میشود که کیفیت مواد حاصل در طول زمان تغییر نکند، درحالیکه در شرایط طبیعی مرتب تحت تاثیر شرایط آب و هوایی و آفات و بیماری‌ها قرار دارد (1).
القای تولید و تجمع متابولیتهای ثانوی در سلولها بخشی از پاسخهای دفاعی میباشد که توسط الیسیتورها یا محرکها صورت میگیرد. از اینرو تیمار سلولهای جلبکی و گیاهی با چنین عواملی یکی از روشهای سودمند برای افزایش تولید متابولیتها در کشت سلولی میباشد (1). اخیرا مطالعات پراکندهای روی اثرات زیستی امواج فراصوت در کشت سلول گیاهی صورت گرفته اما در خصوص اثرات تحریک کنندگی آن در تولید متابولیتها در سلولهای جلبکی اطلاعات چندانی وجود ندارد. افزایش بیوسنتز متابولیتهای ثانویه در سلولهای گیاهی توسط امواج فراصوت با انرژی کم، گزارش شده است (2 ،3 و 4) و مشخص شده است که این افزایش در بیوسنتز متابولیت ثانوی بیشتر ناشی از القای فعالیت فیزیولوژیک سلولها توسط فراصوت میباشد. بههمین دلیل امواج فراصوت با شدت و انرژی کم بهعنوان الیسیتور فیزیکی یا غیر زیستی مد نظر قرار میگیرد.
مطالعات نشان داده است که فراصوت با شدت زیاد برای ترکیبات زیستی مخرب بوده و غشای سلولها را تخریب کرده و مولکولهای زیستی نظیر آنزیم‌ها و DNA را غیر فعال میسازد (5). از طرف دیگر نشان داده شده است که فراصوت با شدت و انرژی کم، طیف وسیعی از اثرات زیستی غیر کشنده داشته که از اهمیت بالقوهای در بیوتکنولوژی برخوردار است. یکی از گستردهترین اثرات غیر مخرب فراصوت روی سلولهای زنده، افزایش در نفوذپذیری غشا است که جذب ترکیبات خارجی و دفع فراوردههای درونسلولی را توسط سلولها افزایش میدهد. گزارش‌هایی مبنی بر تغییر در بیان ژن، افزایش فعالیت آنزیم‌ها و هورمون‌های خاص توسط تابش امواج فراصوت به سلولها وجود دارد (6 ، 7 ، 8 و 9). امواج فراصوت کاربردهای فراوانی در کشاورزی دارد و از جمله این کاربردها میتوان به تیمار بذرهای گیاهان برای کاهش فاصله رشدی، کاهش و حذف آفات و بیماری‌ها و استفاده از آن در مهندسی ژنتیک و انتقال ژن اشاره کرد.
جلبک سبز تک سلولی Dunaliella salina از تولیدکنندگان مهم در دریا و دریاچههای نمکی فوق اشباع است (10 و 11). از ترکیبهای مهم درون سلولی این جلبک میتوان به انواع کاروتنوئیدها، گلیسرول، پروتئین و ویتامینها اشاره نمود. بخش عمده این ترکیبها دارای خاصیت ضداکسیدانتی و ضدسرطانی میباشند (12 و 13).
در زیست فناوری بر روشهای تولیدی جایگزین برای افزایش محصولات طبیعی تمرکز زیادی وجود دارد. یکی از روشهایی که امروزه بیش از هر موضوع دیگر در زمینه بررسی متابولیتهای اولیه و ثانوی سلولها مورد توجه قرار دارد، روش کشت سلولی است. دستورزی کشتهای سلولی با الیسیتورها یکی از استراتژیهای مهم جهت القای متابولیتهای ارزشمند در بیوتکنولوژی است. درارتباط با تاثیر عوامل فیزیکی از جمله امواج فراصوت بر سلولهای جلبک D. salinaمطالعهای تاکنون صورت نگرفته است. بنابراین در این تحقیق سعی بر آن است تا با تابش امواج فراصوت بر سلولهای این جلبک در محیط کشت تعلیقی، مقدار رشد و تولید متابولیتها از جمله بتا-کاروتن و گلیسرول مورد مطالعه قرار گیرد.
مواد و روش‌ها
شرایط کشت و رشد: مقدار 10 میلی‌لیتر از سوسپانسیون سلولی در شرایط استریل به 100 میلی‌لیتر از محیط کشت مایع جانسون استریل، با غلظت نمک دو مولار NaCl و اسیدیته 5/7 در ارلن مایرهایی با حجم 250 میلی‌لیتر افزوده شد بهطوریکه تعداد سلولها در هر ارلن مایر تقریبا 103×300 در هر میلی‌لیتر از سوسپانسیون جلبکی بود. سوسپانسیونهای تهیه شده جلبکی در انکوباتور در دمای 25 درجه سانتیگراد و بهمدت 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی بر روی شیکر با سرعت 90 دور در دقیقه تحت تابش نور فلورسنت با شدت 2500 لوکس قرار گرفتند. بعد از گذشت 2 هفته که کشتهای جلبکی در اواسط مرحله خطی دوره رشد خود قرار گرفتند، تیمار فراصوت اعمال شد.
تیمار سلولها با امواج فراصوت: برای بهکارگیری امواج فراصوت در دامنههای کیلوهرتز پایین، از یک سیستم حمام اولتراسونیک (FALC Instruments, Italy) با فرکانس 40 کیلو هرتز و پهنای باند 320 هرتز بهصورت پیوسته مطابق روش Rezae و همکاران (14) استفاده گردید. امواج فراصوت با فرکانس 40 کیلو هرتز و توان W/cm35، در مدت زمانهای 0، 5/2، 5 و 10 دقیقه در روز چهاردهم واکشت سلولها به کشتهای سلولی در قالب طرح کاملا تصادفی و در سه تکرار اعمال شد. سطح آب در داخل حمام اولتراسونیک حدودا یک سانتیمتر بالاتر از سطح محیط کشت درون ارلنها بود. کشتهای سلولی بهمدت دو هفته در انکوباتور در دمای 5/0 ±25 درجه سانتیگراد و بهمدت 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی بر روی شیکر با سرعت 90 دور در دقیقه تحت تابش نور فلورسنت با شدت 2500 لوکس قرار گرفتند.
اندازهگیری رشد و شاخصهای بیوشیمیایی رشد: توسط سمپلر از هر نمونه جلبکی مقدار کمی برداشته شد و روی لام مخصوص شمارش (لام نئوبار) ریخته شد و زیر میکروسکوب با بزرگنمایی 10 سلولها شمارش شد. تعداد سلولهای موجود در 10 مربع از این لام شمارش شده و میانگین آن ثبت گردید. از آنجائیکه سلولها متحرک بودند سلولهای موجود در نمونه قبلا توسط بلور ید بیحرکت شدند .
کلروفیل و کاروتنوئید کل: مقدار کلروفیل a و b، کلروفیل کل (a+b) و کاروتنوئیدها با استفاده از روش اسپکتروفتومتری اندازهگیری شد. 5 میلی‌لیتر از سوسپانسیون جلبکی بهمدت 10 دقیقه با 5000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد و محلول رویی دور ریخته شد. بر روی رسوب سلولی باقی مانده 5 میلی‌لیتر استون 85 درصد ریخته شد و بعد از همزدن در تاریکی بهمدت 5 دقیقه قرار داده شد. مخلوط حاصل مجددا بهمدت 10 دقیقه با دور 5000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. میزان جذب نور محلول رویی در طول موج‌های 663 و 644 و 452 نانومتر بهکمک اسپکتروفتومتر (PerkinElmer, Lambda 650) خوانده شد. بهکمک رابطههای زیر میزان کلروفیل a و b و کاروتنوئید بر حسب میلیگرم در میلی‌لیتر بهدست آمد (15).
C chla = 10.3 × E633 - 0.918 × E644
C chlb = 19.7 × E644 - 3.87 × E633
C car = 4.20 × E452.5 - 0.0264 × C chl.a - 0.496 × C chl.b
ترکیبات فنلی: پنج میلی‌لیتر از سوسپانسیون جلبکی سانتریفیوژ شد. پس از اتمام سانتریفیوژ مایع رویی در ظرف جداگانه برای اندازهگیری میزان ترکیبات فنلی خارج سلولی نگهداری شد. مقدار 25/1 میلی‌لیتر از معرف Folin-cicolteu رقیق شده (10/1 ) و 1 میلی‌لیتر کربنات سدیم 7 درصد به رسوب سلولی و 5/0 میلی‌لیتر از مایع رویی نمونهها اضافه شد. نمونهها بهمدت نیم ساعت در حرارت 45 درجه سانتیگراد قرار داده شد. بعد نمونهها بهمدت 5 دقیقه با سرعت 5000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. در انتها میزان جذب مایع رویی در طول موج 765 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (PerkinElmer, Lambda 650) خوانده شد و مقدار کل ترکیبات فنلی با استفاده از استاندارد اسید سالیسیک تعیین شد.
پروتئین: مقدار پروتئین بهروش برادفورد (16) اندازهگیری گردید. برای تعیین غلظت پروتئین‌های سلول جلبک، 1 میلی‌لیتر از کشت سلولی نمونهبرداری شد. نمونهها بهمدت 10 دقیقه با سرعت 12 هزار دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. به رسوب سلولی بافر فسفات سدیم 100 میلی مولار (8/6pH= ) اضافه شد. برای متلاشی شدن سلولهای جلبک و تسهیل در خروج پروتئین‌های داخل سلولها، سوسپانسیونهای سلولی بهمدت 15 دقیقه در معرض امواج فراصوت با فرکانس40 کیلوهرتز قرار داده شد. پس از انجام سانتریفیوژ بهمدت 10 دقیقه با سرعت 12 هزار دور در دقیقه، 100 میکرولیتر از محلول رویی برداشته شد و به آن 1 میلی‌لیتر محلول برادفورد اضافه شد. مقدار جذب نمونهها در طول موج 595 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (PerkinElmer, Lambda 650) قرائت شد و در انتها با استفاده از نمودار استاندارد آلبومین سرم گاوی غلظت پروتئین نمونهها بهدست آمد.
فلاونوئیدکل: برای سنجش فلاونوئیدها ابتدا 5/1 میلی‌لیتر از سوسپانسیون جلبکی با سرعت 6000 هزار دور در دقیقه بهمدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد و سپس مایع رویی دور ریخته شد. به سلولهای باقی مانده به نسبت 99 به 1 اتانول و اسید کلریدریک اضافه گردید. نمونهها بهمدت نیم ساعت در معرض امواج فراصوت با فرکانس 40 کیلوهرتز قرار گرفته شد. سپس نمونهها بهمدت 10 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 80 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. پس از خنک شدن، نمونهها بهمدت 5 دقیقه با سرعت 6000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. میزان جذب نمونهها توسط اسپکتروفتومتر (PerkinElmer, Lambda 650) در سه طول موج 270، 300 و 330 نانومتر خوانده شد و مقدار فلاونوئید کل با استفاده از منحنی استاندارد آپیژنین محاسبه شد (17).
قندهای محلول: یک میلی‌لیتر از سوسپانسیونهای جلبکی با سرعت 5000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. مایع رویی دور ریخته شد و به سلولهای جلبکی باقی مانده 5/0 میلی‌لیتر فنل 5 درصد و 5/2 میلی‌لیتر اسیدسولفوریک 98 درصد اضافه گردید. نمونهها بهمدت نیم ساعت در معرض امواج فراصوت با فرکانس40 کیلوهرتز قرار گرفته شد. منحنی استاندارد با استفاده از غلظت‌های مختلف گلوکز ترسیم گردید. جذب نوری نمونهها و استانداردها با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (PerkinElmer, Lambda 650) در طول موج 490 نانومتر اندازهگیری شد (18).
آنتوسیانین کل: 3 میلی‌لیتر از سوسپانسیونهای سلولی بهمدت 5 دقیقه با سرعت 5000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. مایع رویی دور ریخته شد و 3 میلی‌لیتر متانول اسیدی (شامل متانول و اسید کلریدریک به نسبت 99 به 1) به آن اضافه شد. نمونهها بهمدت نیم ساعت در معرض امواج فراصوت با فرکانس 40 کیلوهرتز قرار گرفته شد. سپس نمونهها بهمدت 15 دقیقه با سرعت 12 هزار دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. مایع رویی نمونهها برداشته شد و نمونهها بهمدت یک شب در تاریکی قرار داده شدند و در انتها جذب آنها در طول موج 550 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر (PerkinElmer, Lambda 650) خوانده شد. برای محاسبه غلظت آنتوسیانین، از ضریب خاموشی Cm-1M-133000 استفاده شد (19).
تعیین سطح پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی: مقدار آسیب به غشا‌ها با اندازهگیری مقدار مالونیل دی آلوئید (MDA) بهعنوان فرآورده نهایی پراکسیداسیون لیپیدهای غشا تعیین شد. پنج میلی‌لیتر از سوسپانسیون جلبکی بهمدت 5 دقیقه با سرعت 5000 هزار دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. محلول رویی دور ریخته شد و به نمونهها 3 میلی‌لیتر تری کلرواستیک اسید 10 درصد اضافه شد. پس از همزدن نمونهها آنها بهمدت نیم ساعت در معرض امواج فراصوت با قدرت 100 و فرکانس 40 کیلوهرتز قرار گرفتند. سپس نمونهها بهمدت 15 دقیقه با rpm12000 سانتریفیوژ شدند. پس از اتمام سانتریفیوژ، 1 میلی‌لیتر از هر کدام از نمونهها برداشته شده و به آنها 1 میلی‌لیتر تیوباربیتوریک اسید 25/0 درصد اضافه شد و سپس بهمدت نیم ساعت نمونهها در دمای 100 درجهسانتیگراد قرار داده شدند. پس از سرد شدن نمونهها، در طول موج های 532 و 600 نانومتر مقدار جذب توسط اسپکتروفتومتر (PerkinElmer, Lambda 650) اندازهگیری گردید و مقدار MDA به کمک ضریب خاموشی /mM/cm 155 محاسبه گردید (20).
پتانسیل آنتیاکسیدانتی: دو میلی‌لیتر از سوسپانسیونهای سلولی بهمدت 10 دقیقه با سرعت 12 هزار دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. به رسوب سلولی 2 میلی‌لیتر اتانول اضافه شد. نمونهها بهمدت نیم ساعت در معرض امواج فراصوت با فرکانس 40 کیلوهرتز قرار گرفته شد. به نمونهها 8/0 میلی‌لیتر DPPH (2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 3/0 میلیمولار اضافه شد. بعد از گذشت نیم ساعت و انجام واکنش میزان پتانسیل آنتیاکسیدانتی سلولها در طوح موج 517 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (PerkinElmer, Lambda 650) خوانده شد. درصد فعالیت آنتیاکسیدانتی طبق فرمول زیر محاسبه شد:
12AA%=100-Aظ†ظ…ظˆظ†ظ‡-Aط¨ظ„ط§ظ†ظƒ أ—100Aظƒظ†طھط±ظ„'>
محلول بلانک: 8/0 میلی‌لیتر اتانول + 2 میلی‌لیتر از نمونه و محلول کنترل: 8 /0 میلی‌لیتر DPPH + 2 میلی‌لیتر اتانول. A: جذب نور
بتا-کاروتن: از سوسپانسیون سلولی هرکدام از نمونه‌های جلبک 1 میلی‌لیتر بهمدت 10 دقیقه با سرعت 5000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. محلول رویی دور ریخته شد و به نسبت 2 به 1 هگزان و اتانول به رسوب باقی مانده اضافه شد. بهمدت 1 دقیقه نمونهها با ورتکس شدیداً همزده شدند و سپس مجددا بهمدت 10 دقیقه با سرعت 5000 دور در دقیقه نمونهها سانتریفیوژ گردید. با جدا کردن فاز رویی (هگزان) و خواندن جذب در 450 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (PerkinElmer, Lambda 650) میزان بتا-کاروتن سلولها از طریق فرمول زیر بهدست آمد.
β-Carotene (µg/ml) = 25.2 × A450
گلیسرول: پنج میلی‌لیتر از نمونه جلبکی بهمدت 5 دقیقه با سرعت 5000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. مایع رویی پس از سانتریفیوژ دور ریخته شد، به این ترتیب گلیسرولی که از قبل درون نمونه بوده خارج گردید. به سلولهای باقی مانده بهمیزان 2 میلی‌لیتر از محیط کشت جانسون اضافه شد. چند ثانیه نمونهها بهآرامی تکان داه شد، سپس میزان 200 میکرولیتر نمونه جلبکی جدا و به آن 1 میلی‌لیتر پریودات و 5/2 میلی‌لیتر استیلاستن افزوده گردید و بهآرامی تکان داده شد. سپس بهمدت 20 دقیقه در دمای 45 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. نمونهها مجددا بهمدت 5 دقیقه با سرعت 5000 هزار دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. پس از آن میزان جذب نور مایع رویی در طول موج 410 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (PerkinElmer, Lambda 650) خوانده شد و بهوسیله رسم منحنی استاندارد غلظت گلیسرول محاسبه شد (21).
نتایج
رشد سلولی و محتوی پروتئین
طبق نتایج بهدست آمده میزان رشد سلولها با افزایش زمان تابش امواج فراصوت تا زمان ده دقیقه نسبت به گروه شاهد تفاوت معنیداری داشت، بهطوریکه با افزایش زمان تابش تا زمان ده دقیقه از میزان رشد سلولها کاسته شد و کمترین رشد سلولی در زمان 10 دقیقه تابش امواج فراصوت مشاهده شد. در خصوص مقدار پروتئین محلول نیز با افزایش زمان تابش امواج فراصوت تا زمان10 دقیقه، افزایش معنیداری نسبت به گروه شاهد مشاهده شد. بهطوریکه بیشترین میزان پروتئین محلول مربوط به تیمار 10 دقیقه تابش امواج فراصوت بود (شکل 1).
شکل 1: تغییرات میزان رشد (A) و میزان پروتئین (B) تحت اثر امواج فراصوت در کشت سلولی جلبکD. salina (مقادیر نشان داده شده میانگین 3 تکرار ± SD (انحراف معیار) میباشد.حروف متفاوت نشان دهنده معنیدار بودن تفاوتها در سطح 01/0≤ P است).
رنگیزههای فتوسنتزی
در تحقیق انجام شده افزایش زمان تابش امواج فراصوت باعث کاهش میزان کلروفیل a، کلروفیلb وکلروفیلکل و همچنین تاحدودی کاروتنوئیدها شده، بهاینصورتکه میزان کاروتنوئیدها تا زمان پنج دقیقه تابش فراصوت کاهش داشت و با افزایش زمان تابش امواج فراصوت تا زمان 10دقیقه میزان کاروتنوئید افزایش یافت (شکل 2).
قندهای محلول و پراکسیداسیون لیپیدها
در این آزمایش با افزایش زمان تابش امواج فراصوت تا زمان 10 دقیقه مقدار قندهای محلول نسبت به گروه شاهد دارای اختلاف معنیدار بود و افزایش داشت (شکل 3) در خصوص میزان پراکسیداسیون لیپیدها نیز با افزایش مدت زمان تابش امواج روند افزایشی مشاهده گردید و بیشترین آن در زمان ده دقیقه تابش اندازهگیری شد (شکل 3).
تولید آنتوسیانینها و پتانسیل آنتیاکسیدانتی
تیمار امواج فراصوت باعث القای تولید ترکیبات آنتوسیانینی در کشتهای سلولی شد. بهطوریکه با گذشت زمان بهتدریج بر میزان تولید آنها بهصورت معنیدار نسبت به گروه شاهد افزوده شد. بیشترین مقدار این ترکیبات در زمان ده دقیقه تابش امواج فراصوت اندازهگیری شد. در تحقیق حاضر درصد پتانسیل آنتیاکسیدانتی با افزایش زمان تابش امواج فراصوت بهعنوان یک الیسیتور و محرک سلولها افزاش یافت. بیشترین پتانسیل آنتیاکسیدانتی نیز در مدت زمان تابش ده دقیقه امواج مشاهده شد (شکل 4).
شکل2: تغییر در میزان کلروفیل a (A)،کلروفیل b (B)، کلروفیل کل (C) و کاروتنوئیدها (D) تحت اثر امواج فراصوت در کشت سلولی کشت سلولی جلبک D. salina . (مقادیر نشان داده شده میانگین 3 تکرار ± SD (انحراف معیار) میباشد. حروف متفاوت نشان دهنده معنیدار بودن تفاوتها در سطح 01/0 ≤P است).
شکل3: تغییر در میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی (A) و قندهای محلول (B) تحت اثر امواج فراصوت در کشت سلولی جلبکD. salina (مقادیر نشان داده شده میانگین 3 تکرار ± SD (انحراف معیار) میباشد. حروف متفاوت نشان دهنده معنیدار بودن تفاوتها در سطح 01/0 ≤ P است).
شکل4: تغییر در میزان آنتوسیانینها (A) و پتانسیل آنتیاکسیدانی (B) تحت اثر امواج فراصوت در کشت سلولی جلبکD. salina . (مقادیر نشان داده شده میانگین 3 تکرار ± SD (انحراف معیار) میباشد.حروف متفاوت نشان دهنده معنیدار بودن تفاوتها در سطح 01/0 ≤P است).
تولید ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی
تیمار امواج فراصوت باعث القای تولید ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی در کشتهای سلولی گردید. بهطوریکه با گذشت زمان بهتدریج بر میزان تولید آنها بهصورت معنیدار نسبت به گروه شاهد افزوده شد. هر دو نوع ترکیبات فنلی با افزایش مدت زمان تابش امواج با یک روند صعودی و معنیدار نسبتبه کنترل افزایش نشان دادند. البته بیشتر ترکیبات فنلی تولید شده از نوع درون سلولی بود. در خصوص فلاونوئیدها نیز در هر سه طول موج اندازهگیری شده، افزایش معنیدار نسبت به کشتهای کنترل در کلیه مدت زمانهای تابش مشاهده شد. بیشترین مقدار تولید این ترکیبات در زمان ده دقیقه تابش امواج بود (شکل 5).
تولید گلیسرول و بتا-کاروتن
در این تحقیق مشاهده شد که با افزایش مدت زمان تابش امواج فراصوت تا زمان ده دقیقه، میزان گلیسرول و بتا-کاروتن اندازهگیری شده سلولهای جلبک نسبت به کشتهای شاهد افزایش معنیداری داشت که بیشترین مقادیر آنها بهترتیب 3/12 و 5/13 میلیگرم در لیتر بود که در مدت زمان تابش ده دقیقه اندازهگیری شد (شکل 6).
شکل 5: تغییر در میزان ترکیبات فنلی (A) و فلاونوئیدی (B) تحت اثر امواج فراصوت در کشت سلولی جلبکD. salina (مقادیر نشان داده شده میانگین 3 تکرار ±SD (انحراف معیار) میباشد.حروف متفاوت نشان دهنده معنیدار بودن تفاوتها در سطح 01/0 ≤ P است).
شکل 6: تغییر در میزان گلیسرول (A) و بتا کاروتن (B) تحت اثر امواج فراصوت در کشت سلولی جلبکD. salina (مقادیر نشان داده شده میانگین 3 تکرار ± SD (انحراف معیار) میباشد. حروف متفاوت نشان دهنده معنیدار بودن تفاوتها در سطح 01/0≤ P است).
بحث
در ارتباط با اثر امواج فراصوت بر سلول گزارش شده است که افزایش مدت زمان تیمار امواج فراصوت با کاهش رشد و زنده مانی در سلولهای گیاهی همراه بود (22). Wang و همکاران (3) نیز مشاهده نمودند که تابش امواج فراصوت به سلولهای سرخدار (Taxus yunnanensis) منجربه کاهش محسوس درصد زنده بودن سلولی شد. ازطرفی تابش کوتاهمدت فراصوت اثر معنیداری روی تولید ذیتوده در کشت سلولی سرخدار (Taxus chinensis) نداشت (23). بهکارگیری فراصوت در خصوص کشتهای تعلیقی سبب ایجاد وقایع هیدرودینامیکی پر انرژی نظیر حفرهزایی آکوستیک و جریانات میکروسکوپی میشود که باعث آسیبهای مکانیکی و تنش برشی به سلولها میشود (23). بنابراین احتمال وجود تنشهای مکانیکی در اثر امواج فراصوت وجود داشته که رشد سلولها را تحت تاثیر قرار میدهد. نتایج نشان داد که با گذشت زمان و تحت اثر تیمار تا حدودی تولید پروتئین سلولی القا گردید. در خصوص اثرات بیوسنتزی امواج فراصوت در سلول گزارشاتی وجود دارد. مشاهده شده است که این امواج با شدت پائین، بیوسنتز پروتئینها را در سلولها و پروتوپلاستهای چغندرقند افزایش داد (24). همچنین امواج فراصوت بهعنوان یک الیسیتور باعث تحریک ژنها شده و بهدنبال آن منجر به افزایش پروتئینها و آنزیم‌های سیگنالدهی و تولید متابولیتهای ثانوی شده، بهصورتی که با تابش امواج فراصوت بر سلولهای بنیادی گل داوودی محتوای RNA افزایش یافت و در پی آن محتوای پروتئین محلول نیز افزایش یافت و بین میزان RNA و پروتئین ضریب همبستگی 98 درصد وجود داشت (26،25،3 و 27).
بهعلت وجود تنشهای مکانیکی در اثر امواج فراصوت ساختمان مولکولی کلروپلاستها نیز ممکن است تخریب شود، و همین عامل میتواند دلیل خوبی برای کاهش میزان کلروفیل باشد. همچنین کاروتنوئیدها بهعنوان یکی از رنگیزههای کلیدی و مهم سیستم آنتیاکسیدانتی (27) گروه بزرگی از مولکولهای ایزوپرونوئیدی هستند که توسط اندام‌های فتوسنتزی ساخته می‌شوند (28) اما آنها به تخریب اکسیداتیو بسیار حساس هستند، بهطوریکه در این آزمایش با افزایش زمان تابش امواج فراصوت تا زمان 5 دقیقه از میزان ترکیبات کاروتنوئید بهطور معنیداری نسبت به گروه شاهد کاسته شد. اما در زمان تابش 10 دقیقه امواج فراصوت مجددا میزان کاروتنوئید افزایش یافت و بدون داشتن تفاوت معنیدار با گروه شاهد هر دو گروه به یک میزان و دارای بیشترین مقدار بودند (شکل 3) که این واقعه را میتوان اینگونه توجیه کرد که تابش امواج فراصوت در زمان بیشتر بهعنوان یک تنش اکسیداتیو برای سلول بهشمار میرود و سلول با افزایش میزان کاروتنوئید درون سلولی خود بهعنوان آنتیاکسیدانت به مقابله با تنش میپردازد. برطبق نتایج بهدست آمده توسط Chen و همکاران (25) تابش امواج فراصوت بر سلولهای جلبک Porphyridium ceruentum باعث افزایش 27 درصد در میزان کاروتنوئید سلولها شد (25).
نتایج بهدست آمده از تحقیق حاضر نشان داد که با افزایش زمان تابش امواج فراصوت، میزان مالوندیآلدهید اندازهگیری شده در سلولهای جلبکD. salina افزایش یافت (شکل 4). امواج فراصوت با انرژی کم در کشت سلولی تعلیقی سرخدار چینی (T. chinensis) باعث القای پراکسیداسیون لیپید گردید (29) و همچنین در تحقیقات Rezae و همکاران (14) مشخص شد که امواج فراصوت بههمراه متیل جاسمونات باعث افزایش در تولید مالوندیآلدهید در سلولهای فندق شد. ایجاد گونههای فعال اکسیژن در استرسهای مختلف میتواند باعث پراکسیداسیون لیپیدهای غشا شده که افزایش مالوندیآلدهید بهعنوان محصول نهایی این اکسیداسیون نشان دهنده تخریب و افزایش نفوذپذیری غشای سلولها است (30). آنزیم پراکسیداز بهعنوان گیرنده و جمع کننده پراکسیدها عمل کرده و از اثرات مخرب این مولکولها میکاهد (31 و 32). گونههای فعال اکسیژن دارای نقشهای دوگانه میباشند، این گونهها علاوه بر آسیب به گیاه میتوانند با القای مسیرهای سیگنال باعث فعال شدن واکنشهای دفاعی در گیاه شده و درنتیجه باعث افزایش تولید متابولیتهای ثانوی شوند (33). در تحقیقی که توسط Wu & Lin (34) انجام شد تابش امواج فراصوت بر سلولها ، باعث پراکسیداسیون لیپیدهای غشا در داخل و خارج سلولها و بهدنبال آن افزایش مالوندیآلدهید شد. همچنین در جای دیگر افزایش محتوای مالوندیآلدهید و یک افزایش 6/48 درصدی در نشت الکترولیتها در سلولهای جلبک قرمز (Cruentum porphyridium)، پس از تابش امواج فراصوت مشاهده شد (27). افزایش ترکیبات آنتیاکسیدانتی بهعنوان بخشی از پاسخهای دفاعی سلولها محسوب میشود که اثر امواج فراصوت بر تولید و افزایش ترکیبات آنتیاکسیدانتی در تحقیقات گذشته نیز اثبات شده است (33 ،35 و 36).
ترکیبات فنلی گروه بزرگی از مواد طبیعی گیاهی شامل فلاونوئیدها، تاننها و آنتوسیانین و غیره میباشند. این مواد منافع قابل توجهی در زمینه مواد غذایی، شیمی، داروسازی و پزشکی دارند. همچنین سلولها با افزایش ترکیبات فلاونوئیدی و آنتوسیانین در شرایط استرس، از اثرات مخرب گونههای فعال اکسیژن میکاهد (37). مطالعات ارتباط مثبتی بین مقدار ترکیبات آنتوسیانینی و فعالیت آنتی اکسیدانتی را نشان دادهاند (38). بهطوریکه در تحقیقات گذشته مشخص شده، بسیاری از ترکیبات فنلی بهطور موثر رادیکال‌های گروه هیدروکسیل و پروکسیل را حذف کنند و از اکسید شدن چربی‌ها ممانعت بهعمل آورند (39). این ترکیبات آنتیاکسیدانتهای نیرومندی تحت شرایط تنش میباشند و این خاصیت بهدلیل ساختار اسکلتی و گروه فنل این متابولیتها میباشد. گروه‌های هیدروکسیل آزاد متصل به حلقه آروماتیک بهوسیله جاروبگری رادیکال‌ها و سایر مکانیسم‌ها مانند فروکشی اکسیژن یکتایی از آسیب اکسیداتیو، سلولها را حفظ کرده و همچنین با جلوگیری از عمل لیپواکسیژناز از اکسیداسیون لیپید جلوگیری می‌کنند. سلول با استفاده از مکانیسمهای آنزیمی و غیر آنزیمی میتواند غلظت گونههای فعال اکسیژن را کاهش دهد و از این طریق از اثرات مخرب آن بکاهد. القای تولید ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی با توجه به افزایش میزان پراکسید هیدروژن و مالوندیآلدیید در سلولها جهت محافظت از اجزای سلولی، اسیدهای چرب غیر اشباع، پروتئینها، کربوهیدراتها و اسیدهای نوکلئیک که از اهداف مهم گونههای فعال اکسیژن بوده و پیشگیری از اختلالات متابولیکی و سلولی میباشد (40). درخصوص اثرات امواج فراصوت بر ترکیبات فنلی در گذشته مطالعات اندکی صورت گرفته ازجمله اینکه امواج فراصوت باعث افزایش تولید ترکیبات فنلی در بادام زمینی شد (41).Wu و همکاران (34) نیز نشان دادند که فراصوت باعث افزایش تولید ترکیبات فنلی در کشت سلولی جینسینگ شد. همچنین Rezae و همکاران (14) مشاهده کردند که در سلولهای فندق قرار گرفته در معرض امواج فراصوت ترکیبات فنلی افزایش داشت.
در تحقیق حاضر با افزایش زمان تابش امواج فراصوت تا زمان ده دقیقه، میزان گلیسرول اندازهگیری شده سلولهای جلبک افزایش یافت. در واقع امواج فراصوت بهعنوان الیسیتوری برای تحریک سلولها جهت تولید گلیسرول بیشتر میباشد. امواج فراصوت باعث افزایش تولید گلیسرول در سلولهای گیاهان روغنی شده که میتواند برای سوخت‌های زیستی کاربرد داشته باشد (42) و همچنین روغن‌های گیاهی را افزایش میدهد (43). در این تحقیق مشاهده شد که با افزایش زمان تابش امواج فراصوت میزان بتا-کاروتن سلولها نیز افزایش یافت. افزایش فعالیت ترکیبات آنتیاکسیدانتی از جمله بتا-کاروتن بهعنوان سریع‌ترین واحدهای مقابله کننده در برابر حمله اکسیژن‌های فعال در شرایط استرس گزارش شده است (44). هماهنگ با یافتههای این تحقیق، افزایش بیوسنتز متابولیتهای ثانوی در سلولهای گیاهی توسط امواج فراصوت با انرژی کم، گزارش شده (2،4 و14) و مشخص شده است که این افزایش در بیوسنتز متابولیت ثانویی صرفا ناشی از اثرات فیزیکی و مکانیکی نبوده بلکه بیشتر ناشی از القای فعالیت فیزیولوژیک سلولها توسط امواج فراصوت میباشد.
نتیجه گیری
در این تحقیق مشاهده شد که بهکارگیری امواج فراصوت، باعث القای متابولیت ثانوی ازجمله ترکیبات فنلی، فلاونوئیدها، آنتوسیانینها، بتا-کاروتن و گلیسرول و همچنین افزایش پتانسیل آنتیاکسیدانتی شد. همچنین بهنظر میرسد امواج فراصوت با تحریک سلولها و القای پاسخهای دفاعی و متابولیت ثانوی، باعث افزایش مقدار بتا-کاروتن و گلیسرول در سلولها گردید. با توجه بهاینکه امکان بهکارگیری این تکنیک در دستورزیهای بیوتکنولوژیک تولید ترکیبات سلولی بسیار راحت و ارزان است، استفاده از آن میتواند کمک شایانی به بالا بردن تولید ترکیبات مهم نماید که یکی از موانع مهم در مسیر تجاری سازی تولید متابولیتها است.
)