نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 دانشجوی کارشناسی ارشد فیزیولوژی گیاهی، دانشگاه اراک، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، اراک، ایران
2 دانشگاه اراک، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، اراک، ایران
چکیده
هدف: دراینتحقیقاثر تنش اکسیداتیو ناشی از حضورپراکسید هیدروژنبرالقای برخی متابولیت‌های ثانویه و همچنین تغییر در محتوی پراکسید هیدروژن درون سلولی در کالوس گیاه پریوش بررسی شد. مواد و روشها: بهمنظور القا کالوس، برگ گیاه پریوش استریل شد و بر روی محیط کشت جامد MS قرار گرفت. کالوسها با غلظت‌های مختلف پراکسید هیدروژن(1، 5 و10 میکرومولار) بهمدت 6 روز تیمارشدند. محتوی آلکالوئید کل، ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی و همچنین توان آنتی‌اکسیدانتی بر اساس احیای آهن مورد سنجش قرار گرفت ودادههاباروشهایآماریآنالیزواریانسیکطرفهتجزیهوتحلیلشدند. نتایج: تنش اکسیداتیو ناشی از حضور پراکسید هیدروژن خارجی بر مقادیر درون سلولی پراکسید هیدروژن تاثیر معنی‌دار(05/0p <) داشته و محتوی پراکسید هیدروژن درون سلولی در کالوس‌های تیمار شده با پراکسید هیدروژن بهمدتششروز نسبت به کنترل افزایش معنی‌دار نشان داد. مقایسه میانگین آلکالوئید کل، محتوی فلاونوئید و فنل کل نشان داد که تیمار با پراکسید هیدروژن باعث میزان افزایش معنی‌دار (05/0p <) محتوی این ترکیبات نسبت به کنترل شده است. از طرفی تیمار با پراکسید هیدروژن موجب افزایش توان آنتی اکسیدانتی نسبت به کنترل شده است. افزایشتوان آنتی‌اکسیدانتی احیا آهن وابسته به غلظت بود. نتیجه گیری:پراکسید هیدروژن موجب افزایش مقادیر درون سلولی پراکسید هیدروژن شد. متابولیت‌های ثانویه‌ای مانند آلکالوئید کل و ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی نیز افزایش یافت. بنابراین ممکن است بتوان با اعمال این تنش میزان تولید برخی از آن‌ها را نیز افزایش داد.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Effect of hydrogen peroxide on induction of secondary metabolites in Periwinkle (Catharanthus roseus L ) callus
نویسندگان [English]
- R K 1
- M M 2
- MH A 2
- MR A 2
چکیده [English]
Aim: In the present study the effect of oxidative stress resulted from hydrogen peroxide on some secondary metabolites and changes on intra cellular hydrogen peroxide has been explored. Material and methods: To induction of callus Periwinkle leaf was sterilized and put on MS medium. Calluses were treated by different concentrations (1, 5 and 10 µM) of hydrogen peroxide for 6 days. Total alkaloid, phenolic components and felavonoids as well as antioxidant potential on the basis of Iron reduction were determined. Data were analyzed using one way ANOVA. Results: Addition of hydrogen peroxide resulted in significant (P≤0.05) increase of intra cellular hydrogen peroxide compared to the control. Total alkaloids, flavonoids and phenols content showed that hydrogen peroxide caused a significant increase (P Conclusion: Hydrogen peroxide increased intra cellular levels of hydrogen peroxide. Secondary metabolites such as alkaloids and phenolic compounds and total flavonoid were boosted as well. Therefore tensions may be applied to increase them.
کلیدواژه‌ها [English]
- Alkaloids
- Antioxidant Callus
- Catharanthus roseus
- Flavonoids
- Hydrogen peroxide
- Phenols
مقدمه
گیاهان دارویی از هزاران سال پیش بهعنوان یکی از مهمترین منابع دارویی کاربرد داشته‌اند (1). پریوش (Catharanthus roeus L.)، گیاهی است دارویی و متعلق به خانواده Apocynaceae که بهدلیل وجود ترکیبات دارویی و آلکالوئیدها مورد توجه قرار گرفته است (2).
پراکسید هیدروژن با فرمول مولکولی 2(HO)، جرم مولکولی 014/34 گرم بر مول و دانسیته 135/1 گرم بر سانتی‌متر مکعب ترکیبی ساده، با پیوند یگانه (اکسیژن – اکسیژن ) و مایعی روشن و کمی غلیظتر از آب می‌باشد. پراکسید هیدروژن در سال 1818 توسط لویس جاکوس تنارد کشف شد و بهعنوان یک محصول صنعتی توجه زیادی را جلب کرد (3). منابع اصلی تولید‌کننده پراکسید هیدروژن در سلول‌های گیاهی شامل واکنش‌های زنجیره انتقال الکترون درکلروپلاست ومیتوکندری، واکنش مهلر، آنزیم‌های پراکسیداز و NADPH اکسیداز می‌باشند (4). در برخی از واکنش‌ها پراکسید هیدروژن بهطور مستقیم و در برخی از طریق واکنش حد واسط مثل اکسیژن و سوپراکسید تولید می‌شود (5). هنگامیکه اکسیژن یک الکترون را دریافت می‌کند به رادیکال سوپراکسید تبدیل شده که بسیار ناپایدار است و بهطور خود بهخودی یا توسط آنزیم سوپراکسید‌دیسموتاز با پروتون واکنش داده و تبدیل به پراکسید هیدروژن می‌شود. پراکسید هیدروژن همچنین از طریق احیای سوپراکسید توسط احیا کنندههایی مانند آسکوربات، تیول، فرودوکسین و غیره تولید می‌شود (6). بنابراین سطوح درون سلولی پراکسید هیدروژن ارتباط مستقیم با میزان تولید رادیکال سوپراکسید دارد.
با توجه به نقشی که پراکسید هیدروژن درپیام رسانی دارد لذا می‌تواند باعث افزایش فعالیت و یا القای بیان برخی ترکیبات آنتی‌اکسیدانتی از جمله متابولیت‌های ثانویه شود (7) که این سیستم‌های آنتی‌اکسیدانتی بهعنوان یک سیستم دفاعی در مقابل انواع واکنشگرهای اکسیژن عمل کرده و به سلول کمک می‌کنند تا بهتر بتواند شرایط تنش را تحمل کند. از طرفی نیز می‌توان تحت تنش پراکسید هیدروژن تا حدودی تولید متابولیت‌های ثانویه را نیز افزایش داد که این خود نیاز به تحقیق بیشتر داشته و با توجه به این نکته که مطالعات کمی در مورد بررسی اثر پراکسید هیدروژن بر کشت سلولی گیاه پریوش انجام شده است، لذا در این تحقیق اثر تنش اکسیداتیو ناشی از حضور پراکسید هیدروژن بر کشت کالوس گیاه پریوش مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روشها
تهیه مواد گیاهی و محیط کشت: از برگ گیاه پریوش بهمنظور القا کالوس استفاده شد. برگ‌های جوان از قسمت راسی گیاه جدا استریل شدند. قطعات برگ پس از شستشو با آب مقطر بهمدت 15 دقیقه درهیپوکلریت سدیم 5 درصد (شرکت مرک آلمان) قرار داده شدند و سپس مجددا با آب مقطر اتوکلاو شده شستشو داده شدند. قطعات شستشو داه شده بهمدت 10 دقیقه در اتانول 70 درصد قرار داده شدند و مجددا با آب مقطر اتوکلاو شده شستشو شدند (8). پس از آن، برگ را به قطعات حدود یک سانتی‌متر برش زده و بر روی محیط کشت جامد Murashige and Skoog, Sigma-Aldrich, UK) MS) حاوی ساکارز با غلظت 30 گرم در لیتر بهعنوان منبع کربن و آگار برای جامد کردن محیط کشت باغلظت 8 گرم در لیترو ویتامین‌ها شامل، تیامین با غلظت1/0.میلی‌گرم در لیتر)، پیریدوکسین (با غلظت5/0 میلی‌گرم در لیتر) نیکوتین (با غلظت 5/0 میلی‌گرم در لیتر) و عناصر ماکرو و میکرو و ترکیب هورمونی کینتین (با غلظت 5/0 میلی‌گرم در لیتر) و 2-4D (2,4-Dichloro-phenoxyacetic acid) (با غلظت 5/1 میلی‌گرم در لیتر) بود، قرار داده شدند (کلیه مواد فوق‌الذکر از شرکت Sigma-Aldrich کشور انگلستان تهیه شدند). سپس شیشه‌های حاوی جداکشت‌ها به اتاق کشت با دمای 2±25 درجه سانتی‌گراد منتقل شدند (8) کالوسها بعد از سه هفته واکشت و به محیط کشت جدید منتقل شدند و از کالوس‌های واکشت دوم برای تیمار دهی استفاده شد.
سنجش محتوی پراکسید هیدروژن درون سلولی: برای سنجش محتوی پراکسید هیدروژن 5/0 گرم از بافت کالوس در یخ با 1 میلی‌لیتر تری‌کلرواستیک اسید 1/0درصد سائیده شد و مخلوط هموژن در دمای 4 درجه سانتی‌گراد، با سرعت g12000، بهمدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس 700 میکرولیتر از محلول رویی به 700 میکرولیتر بافر فسفات پتاسیم 10 میلی‌مولار (7pH=) و700 میکرولیتر یدید پتاسیم یک مولار اضافه و میزان جذب در طول موج 390 نانومتر اندازه‌گیری شد. محتوی پراکسید هیدروژن با کمک منحنی استاندارد (x212/0y= با 99/0 R2=) که با مقادیر مشخص پراکسید هیدروژن رسم شده بود سنجیده شد و بهصورت میکرومول بر گرم وزن تر کالوس گزارش گردید (9).
اندازه‌گیری آلکالوئید کل: میزان آلکالوئید کل با استفاده از روش اسپکتروفتومتری (مدل T80+ساخت شرکتPG instrument کشور انگلستان) و معرف دراژندروف برای شناسایی آلکالوئیدها محاسبه شد (10). میزان 3 گرم بافت تازه کالوس را با 10 میلی‌لیتر متانول 96 درصد در حضور نیتروژن مایع سائیده و سپس نمونه‌ها بهمدت 24 ساعت به انکوباتور شیکردار با دور g8/0 و دمای 25 درجه سانتی‌گراد منتقل شدند. در مرحله بعد نمونه‌ها در g24000 بهمدت 10 دقیقه سانتریفوژ شد. محلول رویی به آون 80 درجه سانتی‌گراد برای مدت 1 تا 2 ساعت انتقال داده تا حجم نهایی محلول به 1 میلی‌لیتر تبخیر شود. به عصاره باقیمانده 10 میلی‌لیتر اسید سولفوریک 5/0 نرمال اضافه گردید. با استفاده از سود 10 نرمال، pH محلول را به 10 رسانده و 10 میلی‌لیتر کلروفرم به آن اضافه و سپس محلول به دکانتور منتقل شد. در این مرحله دو فاز تشکیل شد: فاز اسیدی در بالا و فاز کلروفرمیک حاوی عصاره در پایین تشکیل شد. حجم محلول کلروفرمیک با اتانول 96 درصد به 10 میلی‌لیتر رسانده شد. به 5 میلی‌لیتر از محلول فوق HCl رقیق اضافه تا pH آن بین 2 تا 5/2 تنظیم شود. سپس به محلول حاصل 1 میلی‌لیتر معرف دراژندورف اضافه و این ترکیب بهمدت 5 دقیقه در g24000 سانتریوفوژ شد. محلول رویی را دور ریخته و رسوب باقیمانده با اتانول 96 درصد شستشو شد. پس از دور ریختن محلول رویی به رسوب 1 میلی‌لیتر دی‌سدیم سولفید1 درصد اضافه و پس از تکان دادن محلول بهمدت 5 دقیقه در g24000 سانتریوفوژ شد. در این مرحله پس از حذف محلول روئی به رسوب قهوه‌ای تشکیل شده 2 میلی‌لیتر دی سدیم سولفید 1 درصد اضافه و مجددا بهمدت 5 دقیقه در g24000 سانتریوفوژ شد. پس از دور ریختن محلول رویی 2 میلی‌لیتر اسید نیتریک غلیظ به رسوب اضافه و با آب مقطر دو بار تقطیر حجم محلول به 5 میلی‌لیتر رسانیده شد. از محلول فوق 1 میلی‌لیتر برداشته، به آن 5/2 میلی‌لیتر محلول تیوره 3 درصد اضافه و با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل T80+PG InstruentUV/Vis.Spectrometer) جذب نمونههای تیمار شده در طول موج 435 نانومتر قرائت شد. دستگاه اسپکتروفتومتر با محلول تیوره 3 درصد صفر شد. برای رسم منحنی استاندارد از غلظت‌های مختلف بیسموت (شرکت سیگما آمریکا) استفاده شد و غلظت آلکالوئید کل نمونههای تیمار شده بعد از رسم نمودار استاندارد توسط فرمول خطی0320/0- x 0291/0y= با 99/0 R2= تعیین شد.
اندازه‌گیری فلاونوئید کل: میزان فلاونوئید با استفاده از روشMarinova و همکاران (11) محاسبه شد. به تعداد نمونه‌ها لوله آزمایش آماده و به هر کدام از لوله‌ها 1245 میکرولیتر آب مقطر، 75 میکرولیتر محلول سدیم نیترات 5 درصد و 50 میکرولیتر عصاره آنزیمی اضافه شد. برای تهیه نمونه شاهد کلیه ترکیبات شرکت کننده به میزان‌های فوق الذکر بدون حضور عصاره در لوله آزمایش تحت نام کنترل ریخته شد. لوله‌ها بهمدت 6 دقیقه در تاریکی قرار گرفتند. سپس به هر لوله مقدار 150 میکرولیتر محلول کلرید آلومینیوم 10 درصد اضافه و برای مدت 5 دقیقه در دمای آزمایشگاه قرار گرفتند. در مرحله آخر به هر لوله میزان 500 میکرولیتر سود 1 مولار اضافه و جذب نمونه‌ها با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 510 نانومتر ثبت شد. از محلول فاقد عصاره جهت صفر کردن دستگاه استفاده شد. برای رسم منحنی استاندارد از غلظت‌های مختلف کاتچین (شرکت سیگما آمریکا) استفاده شد و غلظت فلاونوئید در نمونههای تیمار شده با استفاده از فرمول خطی 041/0+ x0002/0 y=0با 99/ R2= و بر حسب میلی‌گرم کاتچین در گرم وزن تر بافت بیان گردید.
اندازه‌گیری میزان فنل کل
تهیه عصاره فنلی: میزان 1/0 گرم از بافت کالوس با 1 میلی‌لیتر متانول 80 درصد در حضور نیتروژن مایع سائیده شد. سپس بهمدت 5 دقیقه در g17000 سانتریفوژ گردید. از محلول شفاف رویی بهعنوان عصاره در سنجش میزان فنل کل استفاده شد. میزان فنل کل با استفاده از روش Singleton و همکاران (12) مطابق مندرجات زیر تعیین شد. به تعداد نمونههای تیماری لوله آزمایش برداشته و به هر کدام مقدار 470 میکرولیتر آب مقطر، 30 میکرولیتر عصاره آنزیمی و 500 میکرولیتر سدیم کربنات 1 درصد اضافه شد. برای تهیه نمونه شاهد کلیه ترکیبات شرکت کننده به میزان‌های فوق الذکر بدون حضور عصاره در لوله آزمایش تحت نام کنترل ریخته شد. لوله‌ها بهمدت 3 دقیقه در دمای آزمایشگاه قرار گرفتند. سپس به هر کدام 500 میکرولیتر فولین سیوکالتیو اضافه و نمونه‌ها بهمدت 10 دقیقه در تاریکی انکوبه شدند. سپس جذب نمونه‌ها با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 765 نانومتر ثبت شد. بهمنظور صفر کردن دستگاه از نمونه کنترل استفاده شد. بهمنظور تهیه منحنی استاندارد از غلظت‌های مختلف گالیک اسید (شرکت سیگما آمریکا) استفاده شد و مقادیر فنل تام عصاره با استفاده از منحنی استاندارد ( 0016/0 x+ 0213/0 y= با 989/0 R2= ) بر حسب میلی‌گرم اسید گالیک در گرم وزن تر بافت بیان گردید.
اندازه‌گیری فعالیت آنتی اکسیدانت کل به روش FRAP( (Ferric Reducing Antioxidant Power: فعالیت آنتی‌اکسیدانتی کل با استفاده از روشBenzie and Strain (13) تعیین شد. به تعداد نمونه‌ها لوله آزمایش تهیه و به هر کدام 1700 میکرولیتر محلول FRAP، 970 میکرولیتر آب مقطر و 30 میکرولیتر عصاره آنزیمی اضافه شد. برای تهیه نمونه شاهد کلیه ترکیبات شرکت کننده به میزان‌های فوق الذکر بدون حضور عصاره در لوله آزمایش تحت نام کنترل ریخته شد. لوله‌ها برای مدت 10 دقیقه در تاریکی قرار داده شدند. با استفاده از دستگاه اسپکتوفتومتر جذب نمونه‌ها در طول موج 593 نانومتر ثبت شد.برای تهیه منحنی استاندارد از محلول سولفات آهن (FeSO4.7H2O) (شرکت Merck آلمان) استفاده شد. کلیه مراحل تهیه نمونههای استاندارد مانند مراحل فوق انجام شد با این تفاوت که به‌جای عصاره از غلظت‌های مختلف سولفات آهن استفاده شد. فعالیت آنتی اکسیدانتی نمونههای تیمار شده پس از رسم منحنی استاندارد با استفاه از فرمول خطی 0277/0+ 0132/0 y=با 99/0R2= و بر حسب میکرو مول آهن در میلی‌گرم وزن تر بافت μM/mg FW) ) محاسبه شد.
آنالیزهای آماری: آزمایشهای انجام شده برای هر تیمار در سه تکرار انجام شد. داده‌های بهدست آمده با استفاده از نرم افزا‌ر آماری SPSS و با استفاده از آنالیز واریانس (ANOVA) و تستDuncan آنالیز شدند. در هر اندازه‌گیری ارتباط بین گروه‌ها بررسی و وجود تفاوت معنی‌دار در سطح 05/0p< در نظر گرفته شد.
نتایج
داده‌های حاصل از اندازه‌گیری محتوی پراکسید هیدروژن درون سلولی در کالوس‌های گیاه پریوش تیمار شده در مقایسه با کنترل نشان داد که اثر پراکسید هیدروژن بر مقادیر درون سلولی این ماده (H2O2) تاثیر معنی‌دار (05/0p<) داشته است (جدول1). محتوی پراکسید هیدروژن درون سلولی در کالوس‌های تیمار شده با 1، 5 و 10 میکرومولار نسبت به کنترل بهترتیب بهمیزان 43/31 ،13/69 و82/44 درصد افزایش داشته است. گرچه محتوی پراکسید هیدروژن درون سلولی، درگروه تیمار شده با غلظت10 میکرومولار نسبت به گروه تیمار شده با غلظت 5 میکرومولار، کاهش معنی‌داری را نشان داد (05/0p<).
جدول 1: مقایسه میانگین پراکسید هیدروژن درون سلولی(µM g-1FW) کالوس گیاه پریوش، شش روز پس از تیمار با پراکسید هیدروژن (1، 5 و 10 میکرومولار) با گروه کنترل. مقادیر بهصورت ±SD means می‌باشد. میانگین‌ها با کد حرف‌های متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنی‌دار می‌باشند (05/0 (one way ANOVA, Duncan test, p<
|
H2O2 (µM) |
پراکسید هیدروژن درون سلولی (µM g-1FW) |
|
0 |
482 /0 d ±53/10 |
|
1 |
091/0c±84/13 |
|
5 |
371/0a±81/17 |
|
10 |
781/0b±25/15 |
مقایسه میانگین آلکالوئید کل نشان داد که تیمار با غلظت‌های 1، 5 و 10 میکرومولار باعث افزایش معنی‌دار (05/0p<) محتوی آلکالوئید کل نسبت به کنترل شده است و مقدار آلکالوئید کل، درگروه تیمار شده با غلظت 10 میکرومولار نسبت به گروه تیمار شده با غلظت 5 میکرومولار، کاهش معنی‌داری را نشان داد (001/0p<) و افزایش در محتوی آلکالوئید کل درگروه های تیمار شده با 1، 5 و10 میکرومولار نسبت به کنترل بهترتیب بهمیزان 30/62 ، 38/132 و 98/ 66 درصد نسبت به کنترل می‌باشد ( نمودار1). علاوه بر این مقایسه میانگین محتوی فلاونوئید نشان داد که تیمار با غلظت‌های 1، 5 و 10 میکرومولار پراکسید هیدروژن موجب افزایش معنی‌دار محتوی فلاونوئید نسبت به کنترل شده است که در این سه غلظت محتوی فلاونوئید نسبت به کنترل بهترتیب بهمیزان 79/138 ،05/152 و49/368 درصد افزایش داشته است (نمودار2). اثر پراکسید هیدروژن بر محتوی فنل کل نیز معنی‌دار (05/0p<) بود (جدول 2). مقایسه میانگین محتوی فنل نشان داد تیمار با غلظت‌های 1، 5 و 10 میکرومولار باعث میزان افزایش معنی‌دار محتوی فنل نسبت به کنترل شده است و بهترتیب نسبت به کنترل به میزان 79/102 ،40/194 و17/125 درصد افزایش می‌یابد. این در حالی است که محتوی فنل، درگروه تیمار شده با غلظت 10 میکرومولار نسبت به گروه تیمار شده با غلظت 5 میکرومولار، کاهش معنی‌داری را نشان داد (p<0.05). از طرفی مقایسه میانگین توان آنتی‌اکسیدانتی نیز نشان داد که تیمار با غلظت 1، 5 و 10 میکرومولار پراکسید هیدروژن موجب افزایش توان آنتی‌اکسیدانتی نسبت به کنترل شده است. داده‌های جدول مقایسه میانگین بیانگر این واقعیت است که افزایش توان آنتی‌اکسیدانتی احیای آهن وابسته به غلظت بود و در این سه گروه تیمار شده بهترتیب بهمیزان 44/85 ، 14/255 و 44/360 درصد نسبت به کنترل افزایش می‌یابد (جدول2).
نمودار1: مقایسه میانگین آلکالوئید (mg g-1FW) کالوس برگ گیاه پریوش شش روز پس از تیمار با پراکسید هیدروژن (1، 5 و 10 میکرومولار) با گروه کنترل. مقادیر بهصورت ±SDmeans می‌باشد. میانگین‌ها با کد حرف‌های متفاوت دارای تفاوت معنی‌دار می‌باشند (one way ANOVA, Duncan test, P<0.05)
نمودار2: مقایسه میانگین فلاونوئید (mg g-1FW) کالوس برگ گیاه پریوش شش روز پس از تیمار با پراکسید هیدروژن (1، 5 و 10 میکرومولار) با گروه کنترل. مقادیر بهصورت ±SDmeans می‌باشد. میانگین‌ها با کد حرف‌های متفاوت دارای تفاوت معنی‌دار می‌باشند (one way ANOVA, Duncan test, P<0.05)
جدول 2: مقایسه میانگین محتوی فنلوآنتی اکسیدان کل کالوس برگ گیاه پریوش شش روز پس از تیمار با پراکسید هیدروژن (1، 5 و 10 میکرومولار) با گروه کنترل. مقادیر بهصورت ±SDmeans می‌باشد. میانگین‌ها با کد حرف‌های متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنی‌دار می‌باشند(one way ANOVA, Duncan test, p<0.05).
|
H2O2 (µM) |
فنل (mg g-1FW) |
آنتی‌اکسیدانت‌کل (μM mg-1 FW) |
|
0 |
060/0d±43/1 |
018/0d ±680/0 |
|
1 |
042/0 c ±90/2 |
067/0 c ±261 /1 |
|
5 |
026/0 a ±21/4 |
181/0b±415/2 |
|
10 |
097/0 b ±22/3 |
391/0a ±131/3 |
بحث
تیمار با پراکسید هیدروژن می‌تواند کانال‌های کلسیمی را فعال کرده و غلظت کلسیم سیتوپلاسمی را افزایش دهد و از طرفی نیز کلسیم سیتوزولی بهنوبه خود آنزیم NADPH اکسیداز غشایی پلاسمایی را فعال کرده که منجر به انفجار اکسیداتیو و تولید پراکسید هیدروژن می‌شود (14). در تحقیق حاضر، اثر پراکسید هیدروژن بر مقادیر درون سلولی این ماده ( H2O2) معنی‌دار (05/0p<) بود. نتایج تحقیق حاضر در راستای نتایج دیگران بوده است. Tangو همکاران (15) در تحقیقات خود بر روی گیاه پریوش نشان دادند که 100 میلی‌مولار پراکسید هیدروژن باعث افزایش معنی‌دار (05/0p<) پراکسید هیدروژن درون‌سلولینسبت به کنترل شده است. از طرفی Tian و همکاران (16) در تحقیقات خود بر روی کالوس گیاه توت فرنگی تحت تیمار با 50 میکرومولار پراکسید هیدروژن، به نتیجه مشابه‌ای دست یافتند. در صورتیکه نتایج Yu و همکاران (17) بر رویVigna radiata (L.) نشان داد که پس از تیمار با 200 میلی‌مولار پراکسید هیدروژن محتوی درون سلولی این ماده کاهش می‌یابد. تفاوت‌ها در نتایج ممکن است بدلیل اختلاف در گونه گیاهی و متعاقبا اختلاف در پاسخ سلولی این گونه باشد.
از طرفی آلکالوئیدها نیز بهعنوان یک دفاع شیمیایی در پاسخ به تنش افزایش می‌یابند، اما مکانیسم واقعی در این پاسخ سلولی هنوز بهطور کامل شناخته نشده است (15). نتایج حاصل از آنالیز داده‌ها در آزمایش حاضر نشان داد که اثر پراکسید هیدروژن بر محتوی آلکالوئید کل در کالوس‌های گیاه پریوش تیمار شده در مقایسه با کنترل معنی‌دار است (05/0p<) و با افزایش غلظت، محتوی آلکالوئید افزایش می‌یابد. نتایج حاضر در تایید نتایج Tang و همکاران (15) بود، آن‌ها نیز در تحقیق خود بر روی گیاه پریوش نشان دادند که تیمار100 میلی‌مولار پراکسید هیدروژن باعث افزایش معنی‌دار (05/0p<) غلظت آلکالوئید وین بلاستین نسبت به کنترل شده است. از طرفی با توجه به اینکه اهمیت آلکالوئیدها در حفاظت سلول‌های گیاهی تحت تنش مشخص شده است (18). لذا می‌توان گفت که افزایش یا کاهش میزان آلکالوئید کل در یک گیاه متناسب با نوع تنش بوده و تفاوت این نتایج ممکن است بهدلیل اختلاف در گونه گیاهی باشد.
علاوه بر این پراکسید هیدروژن محتوی فلاونوئید در کالوس‌های گیاه پریوش تیمار شده در مقایسه با کنترل را بهطور معنی‌دار (05/0p<) و وابسته به غلظت افزایش داد. Tumova و همکاران (19) در تحقیق خود بر روی کشت کالوس Ononis arvensis گزارش کردند که تنش اکسیداتیو ناشی از حضور پراکسید هیدروژن (1/0 تا 1 میلی‌مولار) باعث تولید فلاونوئید شده است. همچنین Hao و همکاران (20) نیز در مطالعه خود بر روی کالوس Ginkgo biloba مشاهده کردند که UV-B از طریق افزایش فعالیت آنزیمNitric Oxide Synthase (NOS) منجر به تولید رادیکال آزاد NO شده که این رادیکال با افزایش فعالیت آنزیمPhenylalanine Ammonium Lyase (PAL) موجب افزایش تولید فلاونوئیدها گردیده است. از طرفی نیز ترکیبات فنلی بهعنوان شاخص‌های تنش اکسیداتیو محسوب می‌شوند (20)، لذا انباشتگی انواع ترکیبات فنلی در شرایط تنش می‌تواند بهعنوان یک نشانه در جلوگیری از تخریب سلولی عمل کرده و در نهایت به افزایش تحمل در برابر تنش منجر شود (20). ترکیبات فنلی دارای گروه هیدروکسیل هستند که دهنده هیدروژن می‌باشند و این ترکیبات فعالیت رادیکال‌های آزاد را مهار کرده و آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانتی را فعال می‌کنند (21). در این مطالعه پراکسید هیدروژن اثر معنی‌داری بر محتوی فنل در کالوس‌های گیاه پریوش تیمار شده در مقایسه با کنترل داشت و با افزایش غلظت پراکسید هیدروژن محتوی فنل کل نیز افزایش یافت. مطالعات انجام شده توسط Fang و همکاران(22) بر روی کشت سلولی گیاه مریم گلی (Salvia miltiorrhiza) نشان داده است که غلظت 10 میکرومولار پرکسید هیدروژن می‌تواند بهعنوان یک القا کننده موثر تجمع متابولیت ثانویه پلی فنلیک (Depside) را در سوسپانسیون سلولی گیاه مریم گلی القا کند. بدین ترتیب افزایش میزان فلاونوئید و فنل کل در گیاه پریوش می‌تواند در راستای پاسخ به تنش حاصل از پراکسید هیدورژن درگیاه پریوش باشد.
مطالعات نشان می‌دهد که بالا بودن ترکیبات فنلی دلیل عمده بالا بودن فعالیت آنتی‌اکسیدانتی نیز می‌باشد، زیرا بر اساس شواهد موجود ارتباط مثبتی بین میزان ترکیبات فنلی و قدرت آنتی‌اکسیدانتی گیاهان وجود دارد (22). قدرت احیاکنندگی ترکیبات موجود در نمونههای حاضر با احیا آهن III به آهن II سنجیده شدند (15). احیای آهن اغلب بهعنوان شاخص فعالیت الکترون دهی که مکانیزم مهمی در عمل آنتی‌اکسیدانتی مواد فنلی می‌باشد بهکار می‌رود (22). نتایج تحقیق حاضر نشان داد که توان آنتی‌اکسیدانتی بر اساس احیای آهن (FRAP) در کالوس‌های گیاه پریوش تیمار شده در مقایسه با کنترل بهطور معنی‌دار (05/0p<) و وابسته به غلظت افزایش یافت. از آنجا که، در تمام گیاهان بین آنتی‌اکسیدانت کل و ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی ارتباط مستقیمی وجود دارد (23)، در این تحقیق نیز افزایش توان آنتی‌اکسیدانتی بر اساس احیای آهن، با افزایش ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی همراه بود. این نتایج در راستای نتایجSharma -وRamawat (23) می‌باشد که در تحقیقات خود بر روی گیاه ((Salvadora persica Linn گزارش کردند که تیمار با غلظت 50، 100 و 200 میلی‌مولار نمک طعام بهطور معنی‌دار (05/0p<) و وابسته به غلظت باعث افزایش توان آنتی‌اکسیدانتی نسبت به کنترل شده است.
نتیجه گیری
تیمار کالوس گیاهان مختلف با پراکسید هیدروژن می‌تواند باعث القای پاسخهای دفاعی شود (17). بسیاری از مطالعات گزارش کرده‌‌‌‌اند که وقتی گیاه در معرض پراکسید هیدروژن قرار می‌گیرد غلظت آن در درون سلول افزایش می‌یابد (15). چون تیمار با پراکسید هیدروژن می‌تواند کانال‌های کلسیمی را فعال کرده و غلظت کلسیم سیتوزلی را افزایش دهد، کلسیم سیتوزولی نیز بهنوبه خود آنزیم NADPH اکسیداز غشایی پلاسمایی را فعال کرده و منجر به انفجار اکسیداسیونت و تولید پراکسید هیدروژن شود (15). از طرفی پراکسید هیدروژن در درون سلول بهعنوان یک پیامبر ثانویه عمل کرده لذا می‌تواند باعث افزایش فعالیت و یا القای بیان برخی ترکیبات آنتی‌اکسیدانت از جمله متابولیت‌های ثانویه شود (24). این سیستم‌های آنتی‌اکسیدانتی بهعنوان یک سیستم دفاعی در مقابل انواع واکنشگرهای اکسیژن عمل کرده و به سلول کمک می‌کنند تا بهتر بتواند شرایط تنش را تحمل کند. از طرفی نیز می‌توان تحت تنش پراکسید هیدروژن تا حدودی تولید متابولت‌های ثانویه را نیز افزایش داد. از آنجا که برخی متابولیت‌های ثانویه می‌توانند در درمان بیماری‌ها انسانی از قبیل سرطان، هپاتیت، فشار خون و غیره موثر باشند و وجود این ترکیبات در پریوش ممکن است بتوان با اعمال این تنش میزان تولید برخی از آن‌ها را نیز افزایش داد که این خود نیاز به تحقیق بیشتر داشته و با توجه به تحقیقات دارویی اخیر برای جایگزینی داروهای شیمیایی توسط گیاهان دارویی سنتی ایجاد پایه علمی برای شناسایی اثرات آن‌ها ، امری لازم است و از طرف این تیم تحقیقاتی پیشنهاد می‌گردد.
تشکر و قدردانی
با تشکر از معاونت پژوهشی دانشکدهی علوم پایه دانشگاه اراک که امکانات لازم جهت انجام این تحقیق را در اختیار ما قرار دادند.
)