نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 سازمان تحقیقات آموزش و ترویج کشاورزی، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران، بخش فیزیولوژی مولکولی، کرج، ایران
2 دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، تهران.، ایران
چکیده
هدف: اثرات غلظتهای مختلف کیتوزان (با وزن مولکولی کم) بهعنوان الیسیتور، بر رشد و تولید سیلیمارین و شاخصهای بیوشیمیایی در ریشههای مویین گیاه خار مریم بررسی شد. مواد و روشها: غلظتهای مختلف کیتوزان (0، 5، 10، 20 و 30 میلیگرم در 50 میلیلیتر محیط کشت) به محیط کشت ریشههای مویین خار مریم (30 روزه) اضافه شد و نمونه برداری 12 ، 24، 48، 72، 96 و 120 ساعت پس از تیمار انجام شد. مقدار سیلیمارین، فعالیت آنزیمهای گایاکول پراکسیداز، آسکوربات پراکسیداز و میزان H2O2 در نمونهها اندازهگیری شد. نتایج: بیشترین وزن خشک 48 و 96 ساعت پس از اعمال 10 میلیگرم کیتوزان در محیط کشت مشاهده شد. تجمع سیلیمارین نیز بهطور قابل ملاحظهای از 37/0 در نمونههای شاهد، به mg g-1 DW19/1 در نمونههای تیمار شده رسید، که 4/1 برابر بیشتر از نمونههای کنترل بود. گایاکول پراکسیداز بهوسیله کیتوزان فعال شد و 120 ساعت پس از تیمار به بیشترین میزان خود رسید ∆OD g-1 FW min-1) 86/21(، که 2/2 برابر بیشتر از کنترل بود. روند افزایشی فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز تا 96 ساعت پس از اعمال ادامه پیدا کرد (∆ODg-1 FW 14/5). نتیجه گیری: نتایج نشان داد که این الیسیتور، باعث افزایش تجمع سیلیمارین میشود. افزایش فعالیت آنزیمها در نتیجه افزایش مهار رادیکالهای آزاد اتفاق میافتد و مبین واکنش به تنشهای اعمال شده توسط کیتوزان است.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
The role of Chitosan (low molecular weight) on elevation of flavonolignans production in Silybum marianum hairy root culture
نویسندگان [English]
- T H 1
- S E 2
- F N 2
چکیده [English]
Aim: The effect of chitosan (low molecular weight) as elicitor was evaluated on silymarin production and biochemical factors in hairy root cultures of Silybum marianum. Material and methods: Different concentrations of chitosan (0, 5, 10, 20 and 30 mg/50 ml of culture media) was added to hairy root cultures of S. marianum (30 days) and sampling were carried out after 12, 24, 48, 72, 96 and 120 hours. The silymarin level, activity of guaiacol peroxidase and ascorbate peroxidase as well as concentration of H2O2 were determined in the samples. Results: The results indicated that the highest dry weight was in cultures treated with 10 mg /50 ml culture chitosan after 48 and 96 h. Silymarin production was significantly increased from 0.37 in control to 1.19 mg g-1 dry weight in the treated samples, at which the increased level was 1.4-fold higher than the control. Guaiacol peroxidase was activated by chitosan and reaching a pick after 120 h (21.86 ∆OD g-1FW min-1) which was 2.2 fold higher than the control. The ascorbate peroxidase activity kept increasing until 96 h after elicitation (5.14 ∆ODg-1FW). Conclusion: The results showed that the silymarin production has been promoted by chitosan (low molecular weight). Increased of enzymes activity occurs as a result of free radical elimination and represents a reaction to chitosan as a stress factor.
کلیدواژه‌ها [English]
- Elicitor
- Flavonolignans
- Hairy root
گیاه خار مریم (Silybum marianum) بومی مناطق مدیترانهای است، اما بهصورت وحشی در اکثر مناطق جهان رویش دارد (1). این گیاه در بسیاری از مناطق شمالی و غربی ایران مشاهده میشود (2). میوههای رسیده گیاه، بخش دارویی آن را تشکیل میدهد. گیاه خار مریم چندین قرن بهعنوان گیاه دارویی در درمان بیماریهای کبدی مورد استفاده قرار گرفته است. دانههای خشک حاوی 1 الی 4 درصد سیلیمارین هستند. سیلیمارین ترکیبی از سه فلاونولیگنان میباشد، که شامل سیلیبین، سیلی دیانین و سیلی کریستین و تاکسی فولین بهعنوان پیش ساز میباشد (3).
گیاهان دارویی مهمترین منبع تولید دارو هستند. زیست فناوری، ابزار مهمی برای گزینش، ازدیاد و حفظ ژنوتیپهای گیاهان دارویی محسوب میشوند. تولید متابولیتهای ثانویه در شرایط آزمایشگاهی خصوصا کشت سوسپانسیون سلولی در گیاهان دارویی زیادی گزارش شده است و بیورآکتورها نقش کلیدی در تولید صنعتی متابولیتهای ثانویه در بیوتکنولوژی گیاهان دارویی ایفا میکنند. همچنین مهندسی متابولیت یک روش بسیار قدرتمند در افزایش تولید متابولیتهای ثانویه میباشد (4). کشت ریشههای مویین بر پایه آلوده سازی گیاه با Agrobacterium rhizogenes در دو دهه اخیر بهعنوان روشی مناسب برای تولید متابولیتهای ثانویه بسیار رایج شده است. متابولیتهای ثانویه تولید شده توسط ریشههای مویین که نتیجه آلوده کردن گیاه توسط A. rhizogenes بهدست میآیند، مشابه متابولیتهای تولید شده در گیاه مادری میباشند و مقادیر آنها برابر و یا بیشتر از گیاه مادری است. در طول مراحل آلوده کردن گیاه با A. rhizogenes بخشی از DNA تحت عنوان T-DNA که در پلاسمید القا کننده ریشه یا پلاسمید Riواقع شده است، به سلولهای گیاهی منتقل میکند و در نتیجه ژنهای در بردارنده این بخش مشابه ژنهای اندوژن سلولهای گیاهی تکثیر پیدا میکنند (5).
بزرگترین مزیت ریشههای مویین، توان بالای تولید متابولیتهای ثانویه در مقایسه با گیاهان مادری است. بسیاری از متابولیتهای ثانویه با ارزش که در شرایط طبیعی در ریشه سنتز میشوند، اغلب در ارتباط با تمایز ریشه هستند و حتی در مواردی متابولیتهای ثانویهای که فقط در قسمتهای هوایی یک گیاه تجمع مییابند، قادر به سنتز و تجمع در کشت ریشههای مویین نیز میباشند (6).
الیسیتورها منابع مختلفی از عوامل زیستی یا شیمیایی هستند که میتوانند سبب تغییرات فیزیولوژیکی در موجود زنده شوند. محرکها در سلول گیاهی سبب ارسال پیامهای شیمیایی میشوند که در نتیجه آن پاسخهای فیزیولوژیکی و مورفولوژیکی را در پی خواهد داشت. محرکها به ترکیبات و دیواره سلولی حمله میکنند و در پی پاسخ به پیام محرک، سیستم دفاعی گیاه فعال میشود و برخی از عوامل نظیر کانالهای یونی کلسیم، پروتئینهای متصل شونده به GTP، اسیدی شدن سیتوپلاسم، قلیایی شدن خارج سلول، انفجار اکسیداتیو و اکسیژن فعال، سالیسیلیک اسید، اکسید نیتریک، تولید جاسمونیک اسید، تولید اتیلن و بیان ژنهای دفاعی فعال میشوند که نتیجه آن تجمع متابولیتهای ثانویه میباشد (7، 8، 9 و 10).
از جمله الیسیتورهای کاربردی میتوان کربوهیدراتهای قارچی، عصاره مخمر، متیل جاسمونات و کیتوزان را نام برد. متیل جاسمونات موثرترین الیسیتور برای تولید تاکسول (Taxol) درTaxus chinensis و جینسنوئید (Ginsenoside) در Panax ginseng میباشد (11).
کیتوزان (Chitosan) مشتق اصلی کیتین و فرم داستیله شده آن میباشد که در نتیجه داستیلاسیون آلکالین کیتین حاصل میشود . همچنین کیتوزان بهطور طبیعی در برخی از قارچها تولید میگردد که میزان آن بسیار کمتر از میزان کیتین میباشد (12 و 13). Vasconsuelo و همکاران (14) نشان دادند، استفاده از کیتوزان بهعنوان محرک، باعث افزایش تولید آنتراکوئینون در گیاه Rubia tinctorum میشود. Abdul rahman و همکاران (15)، گزارش کردند که استفاده از محرک کیتوزان سبب افزایش تجمع لیمونن و لینالول در کشت سلول گیاه Citrus Grandis میشود. بر اساس تحقیقات انجام شده توسطPutalun و همکاران (16)، نشان داده شد که کیتوزان باعث افزایش تولید آرتمیزینین در گیاه Artemisia annua L. میشود. Falcon-Rodriguez و همکاران (17)، نشان دادند که کیتوزان باعث افزایش فعالیت سه آنزیم دفاعی پراکسیداز، فنیل آلانین آمونیولیاز و گلوکاناز، در برگها و ریشه گیاه Nicotiana tabacum میشود. اسماعیل زاده و همکاران (18) افزایش تولید لیگنان و فنیل پروپانویید را در کشت سوسپانسیون سلولیLinum album تیمار شده با کیتوزان و کیتین گزارش نمودند.
یکی از مسیرهای پاسخ دفاعی سلول گیاهی در برابر پاتوژن یا
محرک، انفجار اکسیداتیو و اکسیژن فعال است. در برخی از کشتهای سلول گیاهی نشان داده شده است که، ROS موجب تجمع متابولیتهای ثانویه شده و در برخی دیگر تاثیری ندارد. در برخی از گیاهان پس از تیمار، الیسیتور با میانجیگری O2-و H2O2 سبب تجمع متابولیتهای ثانویه میشود. ROS شامل یون سوپراکسید (O2-) و پراکسید هیدروژن (H2O2) و رادیکال هیدروکسیل است و بهوسیله اکسید کردن رنگدانههای فتوسنتزی، چربیهای غشایی، پروتئینها و اسید های نوکلئیک باعث خسارتهای اکسید کننده میشود. بنابراین گیاه نیاز به یک سیستم دفاعی ضد اکسید کننده دارد (9، 10، 19 و20).
نتایج پژوهشهای قبلی نشان داده است که کشت ریشههای مویین گیاه خار مریم قادر به تولید فلاونولیگنانها یا سیلیمارین میباشد. همچنین مشخص شد که بهکارگیری الیسیتورهای مختلف موجب افزایش تولید سیلیمارین میشود (21 و 22). تعیین بهترین الیسیتور بهعنوان محرک افزایش تولید متابولیتها در شرایط In vitro و همچنین ساز و کار اثر آن الیسیتور، دارای اهمیت فراوانی میباشد. لذا این پژوهش بهمنظور بررسی اثرات غلظتهای مختلف کیتوزان (با وزن مولکولی کم) بهعنوان الیسیتور، بر رشد و تولید سیلیمارین در ریشههای مویین گیاه خار مریم و نیز فعالیت آنزیمهای پراکسیداز و آسکوربات پراکسیداز انجام شد.
مواد و روشها
مواد گیاهی مورد استفاده: ریشههای مویین گیاه خارمریم از تحقیق در حال انجام در پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران تهیه شد (21).
کشت ریشههای مویین: بهمنظور کشت ریشههای مویین از ریشههای 28 روزه، شش قطعه یک سانتیمتری تهیه شد و در ظروف ارلن مایر 100 میلیلیتری حاوی 50 میلیلیتر محیط موراشیج و اسکوگ (MS) کشت شد (5 و23).
تهیه محلول مادرکیتوزان: گام اول در آماده سازی کیتوزان، هیدرولیز این ماده زیستی میباشد. برای همین منظور، مقدار 2 گرم کیتوزان با وزن مولکولی کم، بهصورت جداگانه، در داخل هاون ریخته شد و توسط ازت مایع خرد شد. سپس کیتوزان بهوسیله 80 میلیلیتر اسید کلریدریک 37 درصد در بن ماری و در دمای 37 درجه سانتیگراد بهخوبی حل شد. کیتوزان پس از هیدرولیز، بهوسیله یک قیف و پشم شیشه صنعتی، در ارلن حاوی 800 میلیلیتر آب مقطر سرد (4 درجه سانتیگراد)، فیلتر شد. در تمام مدت فیلتراسیون، ارلن باید در ظرف حاوی یخ و روی هم زن مغناطیسی قرار گیرد. محلول بهدست آمده بهمدت 24 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد. بعد از 24 ساعت، محلول را با کاغذ صافی و پمپ خلا فیلتر شد. لایههای نقش بسته روی فیلتر، کلوئیدهای کیتوزان میباشند (13). این رسوبها توسط تیغ اسکالپل جمع آوری شده و در درون 500 میلیلیتر محیط MS فاقد هورمون ریخته شده و سپس اتوکلاو میشود. غلظتهای 0، 5، 10، 20 و 30 میلیگرم کیتوزان به ارلنهای حاوی 50 میلیلیتر محیط کشت دارای ریشههای مویین 30 روزه اضافه شد. بهمنظور تعیین بهترین غلظت از کیتوزان نمونه برداری 96 ساعت پس از تیمار انجام شد. به جهت تعیین اثر زمان کشت آزمایش با بهکارگیری بهترین غلظت از کیتوزان تکرار شد و نمونه برداری در زمانهای 12، 24، 48، 72، 96 و 120 ساعت پس از اعمال تیمار انجام شد.
استخراج و مطالعه کمی و کیفی فلاونولیگنانها از ریشههای مویین گیاه خارمریم: ریشههای برداشت شده در زمانهای مورد نظر بهوسیله کاغذ خشک کن، خشک شدند، در فویل قرار داده شده و در دستگاه فریز درایر در دمای 60- درجه سانتیگراد بهمدت 48 ساعت خشک شدند. پس از خشک شدن کامل نمونهها وزن خشک آنها اندازه گیری و یادداشت شد (24). چربی زدایی نمونهها توسط پترولیوم بنزن در دمای 40 درجه سانتیگراد انجام شد، نمونهها در دستگاه فریز درایر خشک شده و جهت عصاره گیری از آنها 10 میلیلیتر متانول استفاده گردید و نمونهها بهمدت 8 ساعت در دمای 40 درجه سانتیگراد در داخل بن ماری قرار گرفتند. سپس محلولهای متانولی جهت تغلیظ به دستگاه فریز درایر با دمای 60 درجه سانتیگراد، انتقال داده شدند. پودر زرد رنگ حاصله در نتیجه تغلیظ در متانول حل شد و به حجم 1 میلیلیتر رسانده شد و پس از رساندن به حجم مورد نظر نمونهها فیلتر شده و جهت بررسی دقیق کمی ترکیبات، به دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) تزریق شدند (25). اندازهگیری سیلیمارین توسط دستگاه HPLC (Knauer) شامل پمپ 1001 K، دتکتور UV (280 نانومتر)، ستون C18، حلالهای آب و استونیتریل (50:50)، نرم افزار ChromGate انجام شد. حداقل 20 میکرولیتر از نمونههای استخراج شده که به حجم 1 میلیلیتر رسانده شده بودند به دستگاه تزریق شدند و با جریان یک میلیلیتر در دقیقه از ستون Nucleosil C18 به قطر ذرات 5 میکرومتر و ابعاد 6/4 Ï150 میلمتر عبور کرده و در طول موج 280 نانومتر اندازهگیری و شناسایی شدند. کل زمان هر تجزیه 10 دقیقه بود. زمان خروج منحنیهای مربوط به ترکیبات فلاونولیگنانها با سیلیمارین استاندارد (سیگما) مقایسه شده و مقادیر هر یک بر اساس منحنی استاندارد سیلیبین، محاسبه شد (26 و 27).
سنجش میزان H2O2 در ریشههای مویین گیاه خارمریم: میزان 05/0 گرم بافت گیاهی خشک شده توسط خشک کن در دمای 60- درجه سانتیگراد و در خلا وزن شد. نمونهها در ویال 2 میلیلیتری ریخته و پودر شد. دو میلیلیتر بافر فسفات 1/0 مولار (5/6= pH) به ویالهای حاوی نمونه پودر شده، اضافه شد و در دمای 4 درجه سانتیگراد همگن شد. ویالها در دمای درجه سانتیگراد بهمدت 25 دقیقه با دور g 6000 سانتریفیوژ شدند. 1 میلیلیتر از فاز رویی برداشته شده و به آن 330 میکرولیتر محلول 20 درصد حجمی اسید سولفوریک حاوی 1/0 درصد تتراکلرید تیتانیوم افزوده شد. محلول بهدست آمده بهمدت 15 دقیقه در دمای 25 درجه سانتیگراد و با دور g 6000 سانتریفیوژ شد. فاز رویی جدا شد. میزان جذب در طول موج 410 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتری قرائت شد. با استفاده از فرمول A=εbc غلظت H2O2 هر نمونه، محاسبه و بر حسب وزن خشک گزارش شد (9 و 10).
A = جذب خوانده شده توسط دستگاه ، ε (ضریب جذب) = 28/0 µmol-1cm-1، c , H2O2 =غلظت،b (طول کووت) = 1 cm
سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز (POD): سنجش فعالیت آنزیم پراکسیداز بهروش چانس و مهلی (28) اندازه گیری شد. به مخلوط واکنشی (بافر فسفات پتاسیم 100 میلیمولار (7= pH) بهمیزان 250 میکرولیتر، گائیکول (Guaiacol) 10 میلیمولار محلول در آب دوبار تقطیر بهمیزان 250 میکرولیتر (56 میکرولیتر گوئیکول بهوسیله آب دوبار تقطیر به حجم50 میلیلیتر رسانده شد، H2O270 میلیمولار محلول در فسفات پتاسیم 100 میلیمولار (7 = pH) بهمیزان 34 میکرولیتر (60 میکرولیتر بهوسیله بافر 100 میلیمولار فسفات پتاسیم به حجم 10 میلیلیتر رسانده شد، آب دوبار تقطیر استریل شده بهمیزان 466 میکرولیتر) 20 میکرولیتر از عصاره آنزیمی در یک کووت شیشهای 1 میلیلیتری ریخته شده و با قرار گرفتن در دستگاه اسپکتروفتومتر، میزان فعالیت آنزیم پراکسیداز در طـول موج
470 نانومتر و در مدت زمان واکنش 180 ثانیه اندازهگیری شد.
سنجش فعالیت آسکوربات پراکسیداز(APX): فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز بهروش ناکانو و اسدا (1987) اندازهگیری شد. فعالیت این آنزیم بر اساس میزان تجزیه شدن H2O2، در طول موج 290 نانومتر و با استفاده از ضریب خاموشی cm-1 mM-1 8/2 تعیین شد (29). 850 میکرولیتر از آسکوربات 5/0 میلیمولار بههمراه 150 میکرولیتر از H2O2، 2 میلیمولار را درون کووت ریخته و از آن بهعنوان بلنک دستگاه در طول موج 290 نانومتر استفاده میشود. 20 میکرولیتر از عصاره آنزیمی به مخلوط واکنشی فوق اضافه و فعالیت آنزیم APX در مدت 180 ثانیه قرائت شده و منحنی فعالیت آنزیم در مدت زمان 180 ثانیه و بر حسب Abs/min ترسیم شد.
آنالیز آماری: دادهها با حداقل 3 تکرار انجام شد. برای مقایسه میانگینها از تستDuncan استفاده شد. آنالیز آماری توسط نرم افزار SAS نسخه 9.1 انجام شد.
نتایج
بررسی اثر غلظتهای مختلف کیتوزان بر میزان بیوماس ریشه و سیلیمارین
شکل 1، تغییرات وزن خشک و تجمع سیلیمارین را 96 ساعت پس از اعمال تیمار با غلظتهای مختلف کیتوزان (با وزن مولکولی کم)، نشان میدهد. همانطور که نشان داده شد، در مقایسه با کشت تیمار نشده (22/0 گرم)، بیشترین میزان وزن خشک، 96 ساعت پس از تیمار (41/0 گرم) در کشتهای تیمار شده با 10 میلیگرم کیتوزان، ثبت شد که 15/3 برابر شاهد بود. درحالیکه مقدار وزن خشک در تیمارهای با غلظتهای 5، 20 و 30 میلیگرم در لیتر بهترتیب، 38/0، 39/0 و 25/0 گرم، گزارش شد. افزودن کیتوزان با غلظت 10 میلیگرم در لیتر، 96 ساعت پس از تیمار، منجر به افزایش قابل ملاحظهای در میزان انباشتگی سیلیمارین از 37/0 در نمونههای شاهد به 19/1 میلیگرم بر گرم وزن خشک در ریشههای مویین شد. بهطوریکه اختلاف معنیداری در سطح احتمال 5 درصد نشان دادند (شکل 1 و جدول 1). این در حالی است که میزان سیلیمارین در ریشههای تیمار شده با غلظت 5 ، 20 و 30 میلیگرم در لیتر کیتوزان، 96 ساعت پس از تیمار، بهترتیب 92/0، 56/0 و 66/0 میلیگرم بر گرم وزن خشک، مشاهده شد.
تغییرات فلاونولیگنانها در ریشههای تیمار شده با غلظتهای مختلف کیتوزان
مطالعه بیوسنتز فلاونولیگنانها در ریشههای تیمار شده با غلظتهای مختلف کیتوزان، میزان سیلیبین، ایزوسیلیبین، سیلی کریستین، سیلی دیانین و تاکسی فولین در نمونههای تیمار شده با غلظت 10 میلیگرم در لیتر کیتوزان، 96 ساعت پس از تیمار به ترتیب 1/0، 092/0، 48/0، 34/0 و 41/0 میلیگرم بر گرم وزن خشک، مشاهده شدند، که بهترتیب 55/5، 6/4، 11/،3 61/2، و 31/9 برابر شاهد بودند (جدول 2). هرچند، اثر تحریکی 10 میلیگرم در لیتر کیتوزان پس از 96 ساعت به تاکسی فولین، سیلیبین و ایزوسیلیبین نسبت داده میشوند که بهترتیب 3/9، 5/5 و 6/4 برابر بیشتر از کنترل افزایش نمودند و اختلاف معنیداری در سطح احتمال 1 درصد نشان دادند (جدول 1).
شکل 1: تغییرات وزن خشک و میزان سیلیمارین در ریشههای تیمار شده با غلظتهای مختلف کیتوزان (0، 5، 10، 20 و 30 میلیگرم در لیتر) 96 ساعت پس از اعمال تیمار (SE ±)
جدول 1: خلاصه جدول تجزیه واریانس غلظتهای مختلف تیمار کیتوزان با وزن مولکولی کم (0، 5، 10، 20 و 30 میلیگرم بر لیتر) بر برخی صفات در کشت ریشههای مویین خارمریم.
|
صفات |
درجه آزادی (df) |
مجموع مربعات (SS) |
میانگین مربعات (MS) |
F |
ضریب تغییرات (CV) |
|
وزن خشک |
29 |
3172/0 |
0109/0 |
ns26/5 |
21/13 |
|
تاکسی فولین |
29 |
6999/0 |
0241/0 |
*64/1 |
67/165 |
|
سیلی کریستین |
29 |
6652/0 |
0229/0 |
**03/12 |
46/21 |
|
سیلی دیانین |
29 |
3845/0 |
0132/0 |
**97/14 |
55/19 |
|
سیلی بین |
29 |
0304/0 |
0010/0 |
**02/11 |
64/30 |
|
ایزوسیلی بین |
29 |
0241/0 |
0008/0 |
**23/9 |
58/41 |
|
سیلیمارین |
29 |
1756/4 |
1439/0 |
**23/64 |
22/10 |
|
پراکسید هیدروژن |
29 |
29/120 |
1481/4 |
**19/916 |
44/1 |
|
آنزیم پراکسیداز |
29 |
06/719 |
7954/24 |
**63/5775 |
5642/0 |
|
آنزیم آسکوربات پراکسیداز |
29 |
1716/71 |
4541/2 |
**04/542 |
7525/1 |
ns : عدم وجود اختلاف معنیدار، *: معنی دار در سطح احتمال 5 درصد، **: معنی دار در سطح احتمال 1درصد.
تاثیر کیتوزان (10 میلیگرم در لیتر) بر وزن خشک و بیوسنتز سیلیمارین در ریشههای مویین گیاه خارمریم در زمانهای مختلف
اثر زمانهای مختلف استفاده از کیتوزان بر رشد ریشه و محتوای سیلیمارین در شکل 2 نشان داده شده است. وزن خشک ریشههای مویین تیمار شده با 10 میلیگرم در لیتر کیتوزان پس از 12 ساعت (33/0 گرم) نزدیک به کنترل (39/0 گرم)، کمی کاهش نشان داد. میزان وزن خشک پس از گذشت 24 ساعت تغییر چندانی نکرد (33/0 گرم). وزن خشک با افزایش تا 38/0 گرم پس از 48 ساعت دنبال شد، که بیشتر از وزن خشک کنترل (3/0 گرم) در همان زمان بود. وزن خشک پس از گذشت 72 ساعت تفاوت معنیداری نداشت (35/. گرم)، اما پس از گذشت 96 ساعت مجددا افزایش پیدا کرد و به 41/0 گرم رسید (شکل A2).
تغییرات بیوسنتز سیلیمارین در ریشههای شاهد و تیمار شده در زمانهای مختلف در ریشههای مویین گیاه خارمریم، در شکل B2 نشان داده شده است. تولید سیلیمارین پس از 12، 24 و 48 ساعت بهترتیب 27/0 ، 33/0 و 24/0 میلیگرم بر گرم وزن خشک بود. میزان سیلیمارین در ریشههای مویین، 72 ساعت پس از تیمار با 10 میلیگرم در لیتر کیتوزان، 51/0 میلیگرم بر گرم وزن خشک گزارش شد که 19/1 برابر میزان نمونههای شاهد در همان زمان بود. میزان تجمع سیلیمارین پس از گذشت 96 ساعت به 19/1 میلیگرم بر گرم وزن خشک گزارش شد که 1/3 برابر نمونه شاهد در همان زمان بود (37/0 میلیگرم بر گرم ون خشک) و 120 ساعت پس از تیمار کاهش پیدا کرد (8/0 میلیگرم بر گرم وزن خشک) و 9/1 برابر نمونههای شاهد گزارش شد (4/0 میلیگرم بر گرم وزن خشک).
|
B |
شکل 2: تغییرات وزن خشک (A) و تولید سیلیمارین (B) در ریشههای تیمار شده با غلظت 10 میلیگرم در لیتر کیتوزان با وزن مولکولی کم و شاهد در زمانهای مختلف (12، 24، 48، 72، 96 و 120 ساعت) در ریشههای مویین گیاه خارمریم (SE ±)
تغییرات فلاونولیگنانها در ریشههای مویین گیاه خارمریم شاهد و تیمار شده با کیتوزان در زمانهای مختلف
بیشترین میزان تاکسی فولین، سیلی کریستین، سیلی دیانین، سیلی بین و ایزوسیلیبین در محیط تیمار شده با 10 میلیگرم در لیتر کیتوزان و 96 ساعت پس از تیمار حاصل آمد که بهترتیب 95/3، 58/3، 02/3، 11/7 و 13/7 برابر بیشتر از ریشههای تیمار نشده بودند.
جدول 2: تغییرات فلاونولیگنانها در ریشههای مویین گیاه خارمریم تیمار شده با غلظتهای مختلف کیتوزان با وزن مولکولی کم (0، 5، 10، 20 و 30 میلیگرم در لیتر) 96 ساعت پس از اعمال تیمار (SE ±Mean )
|
غلظت کیتوزان (mg/ 50ml culture) |
فلاونولیگنان( mg g-1DW) |
|||||
|
تاکسی فولین |
سیلی کریستین |
سیلی دیانین |
سیلی بین |
ایزوسیلی بین |
||
|
|
0 |
002/0±044/0 |
006/0±154/0 |
01/0±13/0 |
004/0±018/0 |
007/0±020/0 |
|
|
5 |
003/0±15/0 |
09/0±27/0 |
01/0±30/0 |
004/0±053/0 |
002/0±032/0 |
|
10 |
4/0±41/0 |
05/0±48/0 |
02/0±34/0 |
007/0±1/0 |
004/0±092/0 |
|
|
20 |
01/0±077/0 |
06/0±27/0 |
03/0±13/0 |
006/0±031/0 |
006/0±021/0 |
|
|
30 |
008/0±072/0 |
05/0±26/0 |
05/0±18/0 |
007/0±041/0 |
005/0±027/0 |
|
اثر کیتوزان (10 میلیگرم در لیتر) بر تغییرات فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدانت و میزان پراکسید هیدروژن
میزان تخریب اکسیداتیو القا شونده توسط کیتوزان بهوسیله اندازهگیری فعالیت گایاکول پراکسیداز و آسکوربات پرکسیداز و پراکسید هیدروژن، بررسی شد. گایاکول پراکسیداز بهوسیله کیتوزان فعال شد و 120 ساعت پس از تیمار به بیشترین میزان خود رسید ∆OD g-1 FW min-1) 86/21( که 2/2 برابر بیشتر از کنترل (∆OD g-1 FW min-1 86/9) بود (شکل 3).
روند افزایشی آنزیم آسکوربات پراکسیداز در شکل 4 نشان داده شده است. فعالیت آنزیم پس از گذشت 12 ساعت به ∆OD g-1 FW 52/3 رسید و این روند افزایشی تا 96 ساعت پس از اعمال ادامه پیدا کرد (∆ODg-1 FW 14/5) و 120 ساعت پس از اعمال تیمار مجدداً کاهش پیدا کرد (∆ODg-1 FW 97 /3).
فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز 96 ساعت پس از افزودن 10 میلیگرم بر لیتر کیتوزان، اندازه گیری شد، تا تعیین شود چگونه کیتوزان انباشتگی سیلیمارین را در کشت ریشههای مویین، تحریک مینماید. بیشینه ∆OD g-1 FW min-1 54/7، 96 ساعت پس از تحریک برای فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز ثبت شد که 86/2 برابر آن در ریشههای تیمار نشده بود (∆OD g_1 FW min-1 63/2) (شکل 4).
شکل 5 تغییرات محتوای پراکسیدهیدروژن را در ریشههای تیمار شده با غلظت 10 میلیگرم در لیتر کیتوزان پس از تیمارهای زمانی مختلف را نشان میدهد. میزان پراکسید هیدروژن 12 ساعت پس از اعمال تیمار µmol g-1 DW 8/9 گزارش شد. 24 و 48 ساعت پس از اعمال تیمار میزان پراکسید هیدروژن کاهش پیدا کرده و پس از آن مجددا افزایش پیدا کرد و 96 ساعت پس از اعمال تیمار به µmol g-1 DW 81/10 رسید و پس از آن مجددا کاهش پیدا کرد (µmol g-1 DW 12/9) (شکل 5).
شکل 3: فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز در ریشههای تیمار شده با غلظت 10 میلیگرم در لیتر کیتوزان با وزن مولکولی کم در ریشههای شاهد و تیمار شده در زمانهای مختلف پس از اعمال تیمار (SE ±)
شکل4: تغییرات فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در ریشههای تیمار شده با غلظت 10 میلیگرم در لیتر کیتوزان (وزن مولکولی کم) در ریشههای شاهد و تیمار شده در زمانهای مختلف پس از اعمال تیمار (SE ±)
شکل 5: تغییرات میزان پراکسید هیدروژن در ریشههای تیمار شده با غلظت 10 میلیگرم در لیتر کیتوزان (وزن مولکولی کم) در ریشههای شاهد و تیمار شده در زمانهای مختلف پس از اعمال تیمار (SE ±)
بحث
کیتوزان فرم داستیله کیتین است که از دیواره سلولی قارچ، اسکلت خارجی سخت پوستان، کوتیکول حشرات و برخی جلبکها بهدست میآید. این ترکیب زیستی قابل تجزیه بوده و کاملا غیر سمی است. گزارش شده است که کیتوزان و مشتقات آن توانایی القای پاسخهای دفاعی در گیاهان را دارد. همچنین Uthairatanakij و همکاران (30)، نشان دادند که کیتوزان باعث افزایش بازدهی محصول میشود. غلظت کیتوزان و درجه داستیلاسیون کیتوزان اثرات متغیری روی گیاه خواهد داشت.
در این تحقیق کیتوزان با وزن مولکولی کم باعث افزایش وزن خشک ریشههای مویین خار مریم شد.بررسی اثر کیتوزان با وزن مولکولی کم بر تولید سیلیمارین نشان داد که این ماده زیستی سبب افزایش تولید این متابولیت ثانویه در گیاه خار مریم شد، بهطوریکه میزان تجمع سیلیمارین پس از گذشت 96 ساعت به 19/1 میلیگرم بر گرم وزن خشک رسید که 2/3 برابر نمونه شاهد بود.
Vasconsuelo و همکاران (14) نشان دادند که ساز و کارهای سیگنالینک اعمال شده توسط کیتوزان، سبب افزایش آنتراکوئینون ها در گیاه Rubia tinctorum L. شد. این محققان نشان دادند که اثر این الیسیتور ممکن است از طریق فعال سازی آبشار PLC/PKC باشد. گفته میشود علاوه بر MAP کینازها یا پروتئین کینازهای فعال کننده میتوژنها، PKC نیز در فعالیت ناشی از کیتوزان در سلول دخیل است.
همچنین Putalun و همکاران (16)، نشان دادند که، کیتوزان باعث تولید آرتمیزین در ریشههای مویین گیاه Artemisia annua. میشود، بهطوریکه میزان تولید این متابولیت ثانویه، پس از گذشت 6 روز و 150 میلیگرم در لیتر کیتوزان، 6 برابر افزایش پیدا کرد. همچنین در این تحقیق نشان داده شد که کیتوزان باعث افزایش رشد ریشههای مویین تیمار شده توسط کیتوزان میشود که با یافتههای ما کاملا مطابقت دارد.
بررسی روند تغییرات H2O2 در ریشههای تیمار شده با کیتوزان با وزن مولکولی کم افزایش 96 ساعت پس از اعمال تیمار نشان داد. با تجمع افزایش H2O2، میزان فعالیت آنزیمهای ضد اکسنده افزایش یافت بهطوریکه بیشترین فعالیت آنزیم POD، 96 ساعت پس از اعمال تیمار و فعالیت آنزیم APX نیز 96 ساعت پس از اعمال تیمار به بالاترین مقدار رسید که مشابه با نتایج Flcon-Rodriguez و همکاران (17) در مطالعه روی گیاه Nicotiana tabacum، تیمار شده با کیتوزان بود. همچنین Flocco و همکاران (31)، نشان دادند که کیتوزان باعث افزایش فعالیت آنزیم پراکسیداز در ریشههای مویین گیاه Armoracia lapathifolia میشود.
درک مسیرهای پیام رسانی یکی از قدمهای لازم در جهت توجیه اثرات الیسیتورها میباشد. الیسیتورها ابتدا توسط گیرندههای گیاهی فعال میشوند و سپس خود سبب فعالسازی فاکتورهای مربوطه میشوند. مانند کانالهای یونی، پروتئینهای متصل شونده به GTP و پروتئین کینازها. فعال شدن فاکتورهای مربوطه باعث فرستادن پیام محرک بهداخل سلول و بهراه افتادن واکنش های فرودست میشود. مانند فسفوریلاسیون و دفسفوریلاسیون برگشت پذیر پروتئینهای غشای سلولی و پروتئینهای سیتوزولی، افزایش کلسیم درون سلولی، دپلاریزه شدن غشای سلولی، خروج یونهای پتاسیم و کلر و ورود یونهای هیدروژن، قلیایی شدن محیط خارج سلول و اسیدی شدن سیتوپلاسم، فعال شدن پروتئین های MAPکیناز، NADPH اکسیداز و تولید گونههای فعال اکسیژن (ROS)، بیان اولیه ژنهای دفاعی، تولید اتیلن و جاسمونات، بیان نهایی ژنهای دفاعی و در پایان تولید متابولیتهای ثانویه. مسیر پیام رسانی محرکها، شبکهای پیچیده با واکنشهای متوالی جهت بهراه اندازی سیستم دفاعی موثر و کارآمد میباشد.
Sanchez- Sampedro و همکاران (32)، با مطالعه روی کشت سلولی و تولید سیلیمارین دریافتند که حذف یون کلسیم از محیط کشت میتواند به افزایش تولید سیلیمارین در سوسپانسیون سلولی کمک کند.
نتیجه گیری
نتایج بهدست آمده مبین این مسئله است که استفاده از کیتوزان با وزن مولکولی کم باعث افزایش تجمع و تولید سیلیمارین میشود که از نقطه نظر صنعتی قابل توجه است. نتایج نشان داد که در حضور کیتوزان با وزن مولکولی کم میزان فعالیت آنزیمهای دفاعی افزایش یافت. با توجه به اینکه شناسایی حد واسطهای بین الیسیتور و تولید متابولیتهای ثانویه و وقایع درون سلولی در این مرحله از تحریک و کاربرد نتایج در مطالعات مهندسی متابولیت بهمنظور افزایش تولید متابولیتهای ثانویه با ارزش گیاهان دارویی بسیار موثر میباشد، توصیه میشود با مطالعات دقیق تر عواملی حاضر در مسیر سیگنالی موثر در افزایش بیوسنتز این متابولیتها شناسایی شوند.
تشکر و قدردانی
بدین‌وسیله از پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران که حمایت مالی این طرح پژوهشی (شماره 88024- 05- 05- 12) را بهعهده داشت، قدردانی میشود.
)