نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 دانشجوی کارشناسی ارشد زیست شناسی سلولی- مولکولی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران
2 پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، دپارتمان سلولهای بنیادی و پزشکی ترمیمی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران
3 کارشناس ارشد ژنتیک، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران
چکیده
هدف: با تلفیق سیستم االقایی تتراسیکلین (Tet-inducible system) و ناقلین لنتی ویروسی، القا بیان ژن گزارشگر Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) در سلولهای پرندگان مورد بررسی قرار گرفت. مواد و روش‌ها: ژن EGFP تحت کنترل سیستم Tet-ON قرار گرفت و بیان آن در سلولهای کبدی جوجه رده LMH بررسی شد. ابتدا باکتریهای مستعد با ناقل لنتی ویروسی القایی حامل EGFP بههمراه یک ناقل دوم که فعال کننده Tet (Tet-transactivator) بهنام rtTA-M2 را حمل میکرد ترانسفورم شده و ذخیره ماکسی پرپ خالصی از هریک از ایندو DNA پلاسمیدی فراهم شدند. سپس با روش رسوب DNA-فسفات کلسیم سلولهای LMH با ذخیره هردو پلاسمید ترانسفکت شد. در مرحله بعد، غلظتهای سریالی از آنالوگ Tet یعنی داکسی سیکلین را به محیط کشت سلول اضافه نمودیم بهطوریکه با افزایش غلظت DOX، بیان EGFP بیشتر القا گردید. نتایج: افزایش غلظت داکسی سایکلین افزایش بیان را به دنبال داشت. در 24 ساعت اول بعد از ترانسفکشن بیان بهترتیب برای غلظتهای 0 ، 01/0 ، 1/0 و 1 میکروگرم بر میلیلیتر داکسی سایکلین 4/0، 2/6 ، 3/10و 16 درصد و در 24 ساعت دوم بهترتیب 4/6 ، 26 ، 3/28 و7/29بود.با این .جود، افزایش بیش از حد غلظت داکسی سایکلین باعث مرگ سلولها گردید. نتیجه گیری: تلفیق سیستمهای القایی Tet با منشا باکتریایی و لنتی ویروسهای نوترکیب مرتبط با انتقال ژن به سلولهای انسانی میتواند باعث القا ژن در سلولهای پرندگان شود. غلظت القا کننده بر میزان القا بیان ترانسژن تاثیر مستقیم میگذارد.
تازه های تحقیق
-
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Inducible Gene Expression of GFP Reporter Gene in LMH Cell Line Using Inducible Lentivirus Vectors
نویسندگان [English]
- A R 1
- M G 2
- E S 3
چکیده [English]
Aim: By combining Tet-inducible system and lentivirus vectors, we investigated the induction of Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) reporter gene in poultry cells. Material and Methods: the EGFP gene was placed under Tet-ON system and its induction was studied in liver cell line LMH. First, we transformed competent bacteria separately with an inducible lentivirus vector carrying EGFP and a second vector carrying Tet transactivator rtTA-M2 and prepared a purified maxi-prep stock of either plasmid DNA. Then, we used DNA-calcium phosphate co-precipitation method to co-transfect LMH cells with both plasmid stocks. In the next step, we added different concentrations of Tet analog doxycycline (DOX) to cell growth medium. Results: Increase of DOX concentration caused elevation of gene expression Within the first 24 hours after post-transfection, the expression of EGFP for 0, 0.01, 0.1 and 1 µg/ml of DOX was 0.4, 6.2, 10.3 and 16% respectively, and in the next 24 hours the expression changed to 6.4, 26, 28.3 and 29.7% respectively. However, treatment with the overdose of DOX caused the cell death. Conclusions: Combination of Tet-inducible system originating from bacteria and recombinant lentivirus vectors designed for gene transfer to human cells can jointly promote transgene expression in poultry cells. The concentration of the inducer can directly influence the level of transgene induction.
کلیدواژه‌ها [English]
- Tet-inducible system
- Expression induction
- Lentivirus
مقدمه
رده سلولهایLMH در سال 1997 در پی تیمار سلولها با دیاتیل نیتروزآمین تثبیت گردید (1). این رده سلولی از سلولهای سرطانی کبد جوجه نژاد لگهورن جدا شدهاند. LMH-2A رده دیگری از سلولهای کبدی جوجه میباشند و دارای ژن گیرنده استروژن است که با تکنیک ترانسفکت در این رده سلولی تثبیت شده است. سلولهای کبدی جوجه مدلهای بسیار خوبی برای مطالعه متابولیسم در کبد هم میباشد. همچنین سلولهای اولیه کشت شده کبد جوجه از قابلیت سنتز و ترشح پروتئینهای پلاسما برخوردارند (2).
برای تنظیم بیان یک ژن که عموما تحت کنترل یک پروموتر القا شونده یا مهار شونده قرار میگیرد میتوان تاثیر میزان بیان آن ژن را بر روی عملکرد سلول مطالعه کرد و یا میزان بیان آن را به مقدار دلخواه افزایش داده و اثر آن را بر روی سلول مطالعه کرد. همچنین با تلفیق سیستمهای القایی با پروموترهای اختصاصی میتوان زمان و مکان بیان یک ژن را کنترل کرد. سیستمهای القائی Tet در سال 1992 توسعه پیدا کرد (3). این سیستم بهطور گسترده برای تنظیم بیان یک ژن در لاینهای مختلف سلولی و همینطور تعدادی از ارگانها در شرایط آزمایشگاهی استفاده میشود (4-7). سیستمهای وابسته به Tet از جمله بهترین و پرکاربردترین سیستمهای بیان کنترلی ژن میباشند چرا که القا کنندهها و یا مهار کنندههای سیستم که میتواند Doxycycline و یا Tetracyclin باشد هیچ اثر سمی بر روی سلولها ندارد (8) .سیستمهای وابسته به تتراسایکلین به دو نوع روشن (Tet-On) و خاموش (Tet-Off) تقسیم میشوند (3 و 9). در این سیستمها پروموتر به گونهای طراحی شده است که افزودن عامل ضد باکتریایی Doxycycline و یا Tetracyclin به محیط سلولها باعث القا و یا مهار بیان ژن هدف میشد. در این سیستمها از پروتئین مهار کننده تتراسایکلین (TetR) در باکتری Ecoli استفاده میشود که با پروتئین فعالسازی رونویسی VP16 هرپس ویروس ترکیب شده و پروتئین تنظیمی TetR/VP16 (tTA ) را ایجاد میکند (10). علاوه بر tTA پروتئینهای تنظیمی دیگری مانندrtTA که نوع جهش یافتهای از tTA بوده و همچنین rtTA-M2 و tTS را میتوان نام برد (11) که پروتئین تنظیم کننده آخر در واقع یک پروتئین خاموش کننده میباشد. برای بیان کنترل شدهی ژن هدف، ژن مزبور در پایین دست یک پروموتر هیبرید قرار میگیرد بهطوری که این پروموتر از جایگاه اتصال برای TetR بهنام تتراسیکلین اپران برخوردار است و بلافاصله بعد از آن توالی Minimal CMV قرار میگیرد. در سیستم Tet off افزودن Dox به محیط سلولها باعث اتصال به پروتئین ترکیبی TetR/VP16 شده و در نتیجه تغییر شکل و توقف رونویسی و بیان ژن هدف میگردد، این در حالی است که سیستم Tet on که نوع جهش یافته سیستم Tet off میباشد، دقیقا عکس این سیستم عمل میکند و وجود Dox در محیط باعث القا بیان ژن هدف میشود (12).
شکلهای دیگری از سیستمهای تنظیمی بیان ژن پروتئین با نام tTS که یک پروتئین خاموش کننده میباشد، به اینصورت است که در حالت عدم حضور Dox در محیط به tetO متصل شده و مانع رونویسی از ژن هدف میشود اما با اضافه شدن Dox به محیط این آنتی بیوتیک با اتصال به tTS باعث ایجاد تغییراتی در ساختار tTS شده و آنرا از tetO جدا میکند. در این لحظه پروتئین تنظیمی rtTA به tetO متصل شده و رونویسی انجام میگیرد. استفاده از tTS باعث بهبود در عملکرد کنترلی سیستمهای القایی شده است (13). در مطالعه جاری بهمنظور کنترل بیان ژن گزارشگر Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) در سلولهای رده LMH از ناقل القایی TIGHT PNL-TRE- استفاده گردید.
مواد و روش‌ها
آماده سازه ناقل های ویروسی: ناقلین مورد استفاده در این بررسی شامل یک سیستم القایی Tet-on با القا پذیری بهوسیله داکسی سایکلین بهنام PNL-TRE-TIGHT و یک ناقل تولید کننده پروتئین ترکیبی (پروتئین تنظیمی) rtTA-M2 بهنام PNL-rtTA-M2 بودند (شکل 1). تمامی ناقلین مطابق روش استاندارد به سویه Top10 از باکتری Ecoli ترانسفورم شدند و برای انتخاب باکتریهای ناقل پلاسمید هدف، باکتریها در محیط کشت حاوی آنتی بیوتیک مورد نظر کشت داده شدند. سپس یک تک کلون از باکتری رشد کرده برداشته شد و در ابتدا در 2 میلیلیتر بهمدت 8 ساعت در انکوباتور شیکر کشت داده شد. سپس یک میلیلیتر از آن برای تهیه مینی پرپ استفاده شد و پس از تهیه مینی پرپ و تست آنزیمی برای اطمینان از صحت کلونیها، بقیه محیط کشت به 200 میلیلیتر محیط تلقیح شده و بهمدت 16 ساعت در انکوباتور شیکر کشت داده شد. با استفاده از کیت QIAGEN (شرکت QIAGEN، آلمان) ماکسی پرپ پلاسمیدها تهیه شد.
شکل 1: شمایی خطی از ناقل لنتی ویروسی Tet-ON و ناقل تولید کننده پروتئین ترکیبی rtTA-M2
کشت سلولهای LMH: سلولهای رده LMH بهصورت کشت شده در فلاسک T25 خریداری گردید. سلولها در انکوباتور قرار داده شد و بعد از پر شدن فلاسک سلول، برای تهیه ذخیره سلولی و آماده کردن سلول برای مرحله ترانسفکشن به پلیت 24 خانه و فلاسکهای T25 دیگر پاساژ داده شدند. بهدلیل چسبندگی پایین سلولهای رده LMH، کف فلاسکها و پلیتهای مورد استفاده با ژلاتین 1/0 درصد پوشانده شد. کشت سلولهایLMH در محیط Waymouth MB 752/1 (از شرکتGIBCO) با FBS 10 درصد و 100 میگروگرم بر میلیلیتر پنیسیلین و 100 میگروگرم بر میلیلیتر استرپتومایسین انجام شد. برای آماده کردن سلول برای مرحله ترانسفکشن، سلولها در پلیت های 24 خانه کشت داده شدند. تعداد 100 هزار سلول در هر خانه از پلیتهای 24 خانه کشت داده شد و سلولها در انکوباتور CO2 در 37 درجه سانتیگراد بهمدت 24 ساعت انکوبه شدند.
ترنسفکشن سلول های LMH: بعد از اینکه سلولها 50 تا 60 درصد پلیت را پرکردند مرحله ترانسفکشن سلولها انجام گرفت. ترانسفکشن سلولها با پلاسمیدهای ویروسی با روش رسوب DNA- فسفات-کلسیم و بهکمک محلول HEPES انجام شد. در این مرحله سازه PNL-TRE-TIGHT بههمراه ناقل PNL-rtTA-M2 که تولید کننده پروتئین ترکیبی rtTA میباشد ترانسفکت همزمان شد. برای عمل ترنسفکشن بعد از ترکیب 5/0 میکروگرم DNA ناقل اول و 5/0 میکروگرم ناقل دوم با آب و CaCl2 این ترکیب بهصورت قطره قطره بهترکیب 2X HEPES که در حال ورتکس شدن بود اضافه شد. سپس بهمدت 20 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد و بعد از افزودن آن به محیط سلولهایی که 24 ساعت قبل آماده شده بود سلولها برای مدت 7 تا 8 ساعت در انکوباتور CO2 انکوبه شد. برای القای بیان ژن گزارشگر ابتدا استوکهای Doxycyclin با مقادیر 01/0، 1/0 و 1 میکروگرم تهیه شد. بعد از حدود 7 ساعت محیط سلولها تعویض شد و حدود 10 میکرولیتر از استوکهای تهیه شده به محیطهای کشت سلولی اضافه شد. میزان بیان ژن گزارشگر EGFP هم در حضور و هم در غیاب DOX، 24 و 48 ساعت بعد از افزودن داکسیسایکلین در زیر میکروسکوپ فلوئورسنت مورد بررسی قرار گرفت.
تصویر برداری با میکروسکوپ فلوروسنس و محاسبه میزان بیان و شدت بیان EGFP: حدود24 ساعت و 48 ساعت پس از افزودنDOX به محیط کشت، سلولها برای بررسی میزان بیان و عکسبرداری سلولها در زیر میکروسکوپ فلوروسنس بررسی شد و از بخشهای مختلف هر چاهک عکس گرفته شد تا در محاسبات و آنالیز میزان بیان EGFP استفاده گردد. تمام تصاویر با بزرگنمایی 10 برابر و از بخشهای مختلف چاهکهای در نظر گرفته شده برای هر غلظت تهیه شد. تصاویر گرفته شده برای شمارش سلولها با استفاده از نرم افزارGrid cell counter و برآورد درصد سلولهای بیان کننده ژن EGFP، مورد استفاده قرارگرفت. برای محاسبه درصد بیان ژن گزارشگر EGFP از فرمول زیر استفاده شد:
EGFP = میانگین تعداد سلولهای بیان کنندهEGFP در 5 تا 7 میدان میکروسکوپی
CV= میانگین تعداد سلولهای موجود در 5 تا 7 میدان میکروسکوپی
برای آنالیز شدت بیان از دو ابزار 3D surface plot و ROI manager در نرم افزار Image J استفاده شد. قبل از آنالیز هر تصویر، ابتدا با استفاده از ابزار Subtract background از منوی Process روی تصویر ویرایش بهعمل آمد تا میزان Background به حداقل رسد و تصاویر یکنواختتر حاصل شود. سپس تصاویر با استفاده از ابزار Interactive 3D surface plat آنالیز شد و میزان EGFP intensity محاسبه گردید. این ابزار با اندازه گیری ارزش پیکسلی در تمام نقاط تصویر، نقاط بیان کننده ژن و شدت بیان را میسنجد به طوریکه بهرنگ سیاه ارزش پیکسلی صفر و بهرنگ سفید بیشترین ارزش پیکسلی یعنی 255 اختصاص میدهد. به این ترتیب با توجه به تعداد نقاط بیان کننده و شدت بیان در نقاط بیان کننده، تصاویر بهوسیله نرم افزار آنالیز شده و خروجی بهصورت سه بعدی به نمایش گذاشته میشود. بنابراین با توجه به شدت بیان EGFP در هر سلول، رنگ فلورسنت از حالت سبز تیره تا سبز روشن متمایل به سفید متغیر بوده که این امر ارزش پیکسلی را برای هر نقطه بیان کننده ژن EGFP متفاوت میکند.
برای دریافت خروجی عددی از تصاویر تعریف شده برای نرم افزار Image J از ابزار ROI manager استفاده شد. برای اینکار تصویر تمام سلولهای EGFP+ با استفاده از ابزار Point انتخاب و به پنجره ROI manager اضافه شد. سپس با گزینه Measure در پنجره ROI manager میزان شدت بیان EGFP در سلولهای EGFP+ بهدست آمد. میانگینهای Intensity جمع آوری شد و دادهها با استفاده از نرم افزار SAS آنالیز شد. مقایسه میانگین دادههای Intensity با استفاده از آزمون مقایسه میانگینها در نرم افزار SAS آنالیز شد
نتایج
القاپذیری سیستم بیانی در حضور آنتی بیوتیک
در مقاطع زمانی 24 و 48 ساعت از سلولهای ترانسفکت شده در زیر میکروسکوپ فلورسنس عکسبرداری بهعمل آمد. مشاهده چشمی این تصاویر نشان میدهد که با افزایش غلظت و زمان حضور DOX در محیط کشت سلول درصد سلولهای EGFP+ بیشتر میشود شکل (2). شمایی از روند افزایشی درصد سلولهای بیان کننده EGFP و تاثیر پارامتر زمان القا و غلظت القاگر را در سلولهای LMH نشان میدهد
شکل 2: تصویر میکروسکوپی سلولهای بیان کننده EGFP. مشاهده چشمی این تصاویر نشان میدهد که تعداد سلولهای EGFP+ با افزایش غلظت داکسی سایکلین و افزایش زمان القا بیان ژن در رده سلولی LMH رو به فزونی میرود. تمام تصاویر با بزرگنمایی 10 برابر از سلولها تهیه شد.
تاثیر دو پارامتر زمان القا و غلظت DOX بر افزایش تعداد سلولهای القا شده
شمارش میدانی سلولها در زیر میکروسکوپ فلورسنس نشان داد که به موازات افزایش غلظت داکسی سایکلین و افزایش زمان القا، تعداد سلولهای بیان کننده ترانسژن EGFP نیز افزایش مییابد (شکل 3). بر طبق این نمودار درصد سلولهای مثبت در 24 ساعت اول با یک مقدار نسبتا ثابت در حال افزایش بوده ولی در 24 ساعت دوم افزایش سریعی در این میزان ایجاد شده است. در نمونههای 24 ساعته، درصد سلولهای مثبت به EGFP بهموازات افزایش غلظت داکسی سایکلین افزایش پیدا کرده است. ولی در 48 ساعت بهتدریج آهنگ افزایش کند میشود، بهطوری که از غلظت 1/0 تا 1 تغییر چندان محسوسی بهچشم نمیخورد. بیان ژن گزارشگر در سلولهای کنترل 24 ساعت بعد از ترانسفکشن حدود 4/0 درصد و بهترتیب برای 01/0، 1/0 و 1 میکروگرم بر میکرولیتر داکسی سایکلین حدود 2/6 ، 34/10 ، 16 درصد محاسبه شد. سلولها برای 24 ساعت دیگر در انکوباتور ذخیره شد تا میزان بیان ژن بعد از 48 ساعت بررسی شود. نتایج حاصله در 48 ساعت بعد ترانسفکشن نشان داد که بیان ژن با افزایش مقدار داکسی سایکلین و مدت زمان بیشتر بالا میرود، بهطوریکه بیان در 24 ساعت دوم برای گروه شاهد به 4/6 درصد رسید و برای گروههای آزمایشی 01/0 ، 1/0 و 1 میکروگرم بر میکرولیتر داکسی سایکلین بهترتیب به 26 ، 3/28 و 7/29 افزایش یافت.
شکل 3: افزایش درصد سلولهای بیان کننده ژن گزارشگر EGFP با افزایش غلظت داکسی سایکلین و افزایش زمان حضور القاگر داکسی سایکلین در محیط کشت سلولی. برای محاسبه درصد سلولهای بیان کننده ژن EGFP، تعداد سلولهای بیان کننده EGFP در تعداد مشخصی از میادین میکروسکوپی (5 تا 7 میدان ) بهکمک نرم افزار Grid cell counter شمارش و میانگین گرفته شد. عدد حاصله بر میانگین تعداد کل سلولهای موجود در همان میادین میکروسکوپی تقسیم و سپس در 100 ضرب شد. بررسیها بهصورت جداگانه برای 24 و 48 ساعت بررسی شد.
تناسب مستقیم بین میزان بیان با میزان پیکسلهای فلورسنت
تصاویر میکروسکوپی سلولها با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت بعد از ترانسفکشن و القای ژن EGFP و انکوباسیون برای مدت 24 و 48 ساعت پس از القا با القاگر بیان جمع آوری شد. تصاویر حاصله بعد از ویرایش با ابزار Subtract background با ابزارInteractive 3D surface plat آنالیز شد. نتایج این آنالیز که در شکل (4) منعکس شده است، نشان دهنده افزایش در درصد بیان EGFP و افزایش شدت بیان ژن EGFP و افزایش تعداد سلولهای بیان کننده ژن گزارشگر EGFP بهموازات افزایش زمان القا و دوز داکسی سایکلین میباشد.
برای سنجش کمی تغییرات بیانی، تصاویر سلولی با ابزار Subtract background و ابزار Interactive 3D surface plot آنالیز شد و دادههای بهدست آمده با استفاده از نرم افرار SAS با روش مقایسه میانگینها آنالیز شد. نتایج بهدست آمده تفاوت معنیدار میانگینهای شدت بیان را در دوزهای مختلف داکسی سایکلین و مدت زمان القا بیان ژن در سطح 001/0 نشان میدهد. (001/0p<) (شکل 5).
شکل 4: آنالیز پیکسلی تصاویر سلولها بعد از ترانسفکشن و القا ژن EGFP. تصاویر سلولی پس از القا بیان با دوزهای مختلف داکسی سایکلین بهمدت 24 ساعت و 48 ساعت جمع آوری شد. این تصاویر بعد از ویرایش با ابزار subtract background نرم افزار ImageJ در نهایت با ابزارInteractive 3D surface plat همان نرم افزار آنالیز شد. (ستون مدرج در کنار هر تصویر بیانگر میانگینintensityPixel برای هر نقطه نورانی میباشد). برای آنالیز، تعداد مشخصی از میدانهای میکروسکوپی (5 تا 7 میدان ) برای هر غظت 24 و 48 ساعت بعد از القا بیان به نرم افزار Image J وارد شده تا میزان ارزش پیکسلی موجود در هر نقطه از تصویر را اندازهگیری و بهصورت سه بعدی و به شکل تصاویر بالا به نمایش بگذارد.
|
DOX (µL/mL) |
|
0 |
|
0.01 |
|
0.1 |
|
1 |
|
*** |
|
* |
|
# |
|
** # x |
|
** # x |
|
# |
|
# |
شکل 5: شدت بیان EGFP بعد از ترانسفکشن و القا بیان ژن گزارشگر در دوزهای مختلف داکسی سایکلین. برای بهدست آوردن شدت بیان، از ابزار Subtract background و ابزار ROI manager استفاده شد. سپس دادههای و اعداد خام که نشانگر شدت بیان (Pixel Intensity) بهصورت کمی بود به نرم افزار SAS وارد شد و میانگین شدت بیان تمام نقاط انتخاب شده اندازه گیری و مقایسه میانگین ها برای تمام تصاویر برای غلظتها مختلف انجام شد. علایم نمودار تفاوت معنیدار بین گروهها را بهشرح زیر نشان میدهد: علامت (*) تفاوت بین دو مقطع زمانی 24 و 48 ساعت برای هر غلظت معین DOX، علامت (#) تفاوت بین هر غلظت از DOX با معادل زمانی خود در کنترل بدون DOX، علامت (X) تفاوت بین هر یک از دو غلظت DOX معادل 0.1 µL/mL و 1 µL/mL باغلظت 0.01µL/mL.
بحث
تنظیم بیان ژن یکی از بخشهای مهم در تحقیقات سلولی و ژن درمانی میباشد، بهطوریکه کنترل بیان ژن و تولید سطح مشخصی از پروتئین هدف در سلول و یا بافت هدف و یا متوقف کردن بیان ژن در سلول و القا بیان آن در زمان خاص تاثیر زیادی در مطالعات بیولوژیکی و تکوینی دارد. با ترکیب این سیستمها با پروموتر های اختصاصی میتوان زمان و مکان ژن هدف را بهطور همزمان کنترل نمود.
در این مطالعه، کاربرد سیستم القایی تتراسیکلین (Tet-ON) بر روی سلولهای پرندگان رده LMH مطالعه شد و نشان داد که چنین سیستم پروکریوتی علاوه بر عملکرد در سلولهای پستانداران، میتواند در سلولهای طیور نیز بهخوبی کار کند. القاگر بیان در این سیستمها داکسی سایکلین (DOX) بود که آنالوگ تتراسیکلین با سمیت کمتر بوده و در غلظتهای مختلف باعث ایجاد سطوح بیانی مختلف برای ژن هدف میشود (14).
نتایج حاصل شده در این بخش نشان داد که سلولهای ترانسفکت شده LMH با ناقلین القایی بعد از افزودن DOX شروع به بیان کردند و افزایش غلظت داکسی سایکلین افزایش بیان را بهدنبال داشت. بهطوریکه با افزایش سریالی غلظت DOX القا بیان ژن هم در 24 ساعت اول بعد از ترانسفکشن و هم در 24 ساعت دوم بهصورت خطی افزایش پیدا کرد. این نتایج با گزارشات اولیه بر روی سیستم بیانی Tet و القا آن بهوسیله DOX همخوانی دارد (3). در این پژوهش، بهجای اکتیواتور اولیه (rtTA)، از نسخه جهش یافته آن بهنام rtTA-M2 استفاده شد که از نظر القای بیان و خاموش سازی نشت بیان بر نسخه اولیه برتری آشکار دارد (11).
تغییر ملایم گروههای آزمایشی تیمار شده با غلظتهایی 01/0، 1/0، 1 داکسیسایکلین در 48 ساعت دوم میتواند بهدلیل قابلیت ترانسفکشن 30 درصدی سلولهای LMH باشد که باعث شد که در بیان القایی ژن EGFP در 24 ساعت دوم یک روند روبه رشد کم و بیان حدود 30 درصد مشاهده شود.
بیان 4/0 درصد و 4/6 درصد در سلولهای شاهد، بهدلیل Background و نشت بیان ژن در زمان خاموشی سیستم و عدم حضور القاگر در محیط میباشد. برای حذف این بیان پایه در سازههای القایی سیستم های جدیدتر با بیان پایهای و یا نشتی کمتر در بیان ژن ایجاد شده است. از جمله سیستمهای جدید میتوان به پروموتر هیبرید TRE3G (شرکت ClonTech) اشاره کرد که دارای نشتی بیان بسیار پایین به سیستمهای قبلی میباشد. بیان پایهای و یا نشتی موجود در سازه القایی لنتی ویروسی و وجود یک فعالیت پایه در Minimal CMV Promoter میتواند بهخاطر توالیهای خاص و توالیهای مسئول سیگنال دهی و افزایش نسخه برداری از ناحیهLTR در ژنوم ویروسی باشد (15).
تحمل سلولهای پستاندار در برابر تیمار با DOX نسبتا بالاست ولی بینهایت نیست. با این وجود در مورد سلولهای LMH، با افزایش غلظت DOX و گذشت زمان بیشتر از مرحله تیمار سلولها با DOX، سلولها شروع به از بین رفتن نمودند و درصد تلفات سلول رو به افزایش گذاشت. بنابراین نتایج ما نشان دا که سلولهای LMH قادر نیستند غلظتهایی از DOX که برای سلولهای پستاندار قابل تحمل بود را تحمل نمایند. در مجموع، سازههای القایی بههمراه DOX باعث میشوند که سیستمهای نسخه برداری درون سلول بیشتر بهسمت مکانیسم بیان القایی هدایت شده و سلول از یک وضعیت بیان نرمال در یک شرایط غیر طبیعی قرار گیرد و سیستمهای القایی همانند یک تله برای ماشین نسخه برداری سلول عمل میکند و این امر باعث مرگ سلول میشود.
آزمایشگاه ما یک مطالعه سیستماتیک را بر روی میزان نشت و القای بیان در سیستم Tet آغاز کرده است که طی آن پروموترهای القا شونده متنوعی بهکار برده شده است. این پروموترها شامل پروموتری قدرتمند از آدنوویروسها میباشد (16). پروموتری که در آن نمان و فواصل عناصر پاسخگو به Tet تغییر یافته است (17) و پروموتری که متحمل تغییر در توالیهای تکراری TetO شده است (8). نتایج مقدماتی این مطالعه نشان میدهد که میزان نشت بیان ناخواسته را میتوان به حداقل میزان ممکن رساند ولی میزان القا نیز ممکن است همزمان کاهش پیدا کند. بنابراین بسته به اینکه چه ترانسژنی و برای چه منظوری القا میشود، یکی از این سیستمها را میتوان مورد استفاده قرار داد، ولی امکان مهار صددرصدی نشت بیان ممکن است هیچوقت حاصل نشود. بدین جهت باید در بهکارگیری این سیستمها برای ژنهایی که محصولات سمی را کد میکنند با احتیاط عمل کرد.
نتیجه گیری
مطالعه حاضر نوعی امکان سنجی برای کاربرد سیستم القایی Tet در رده سلولی LMH بهعنوان نماینده سلولهای مربوط به طیور محسوب میشود. این مطالعه نشان داد که سیستم القایی مزبور برای القای بیان ترانسژنها در سلولهای فوق بهخوبی عمل میکند و القا نیز بهطور مطلوب صورت میگیرد بهشرط آنکه غلظتهای بالای DOX مورد نیاز نباشد.
تشکر و قدردانی
کلیه مراحل این تحقیق در پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری انجام گرفت. از مسئولین پژوهشکده پزشکی پژوهشگاه تقدیر میشود.
)