مقدمه

عوامل متفاوتی در ناباروری مردان نقش دارند که از جمله شایعترین این عوامل، بیماری واریکوسل می باشد. واریکوسل به اتساع و پیچش غیرطبیعی وریدهای اسپرماتیک اطلاق می‏شود (1). شیوع واریکوسل در جمعیت عمومی مردان حدود 15 تا 20درصد بوده درحالی که در زوج های نابارور که دلیل ناباروری آن‏ها فاکتورهای مردانه است حدود 25 تا 40 درصد (2) و در مردان با ناباروری ثانویه به حدود 70 تا 80 درصد می‏رسد. این امر نشان دهنده این است که مردانی که در ابتدا بارور بودند ممکن است با واسطه واریکوسل نابارور شوند (3).

در بیماران واریکوسل عملکرد بیضه بطور پیشرونده آسیب می‏بیند ولی مکانیسم‏های دقیق عملکرد غیرطبیعی بیضه در این بیماران کاملا شناخته شده نیستند. با این وجود افزایش دمای بیضه، گرفتگی وریدها و هیپوکسی بیضه از عوامل ممکن در ایجاد واریکوسل می باشند (4). مطالعات نشان دادند که دمای بیضه افراد نابارور واریکوسل در مقایسه با افراد بارور به میزان قابل توجهی افزایش می یابد ولی در مقایسه افراد بارور با سایر افراد نابارور تفاوت قابل توجهی ای در دمای بیضه مشاهده نشده است (5و6).

مطالعات متعدد نشان دادند که در بیماران واریکوسل کیفیت پارامترهای اسپرمی (تعداد، تحرک و مورفولوژی) نسبت به افراد بارور کاهش می یابد (7و8). رابطه ی بین واریکوسل و اختلال در روند اسپرماتوژنز به خوبی شناخته شده است. از آنجائیکه روند اسپرماتوژنز به افزایش دما حساس است، در نتیجه در افراد واریکوسل عملکرد آن دچار اختلال خواهد شد و مختل شدن اسپرماتوژنز سبب آسیب به رده‏های سلول‏های اسپرماتید شده و DNA اسپرم، مستعد آسیب می گردد (9). در نتیجه بررسی آسیب DNA اسپرم علاوه بر پارامترهای اسپرمی ضروری به نظر می رسد. در دهه گذشته مطالعات فراوانی درباره نقش DNA هسته در ناباروری مردان صورت پذیرفت. مطالعات متعدد نشان دادند که اسپرم افراد نابارور دارای آسیب DNA بیشتری نسبت به افراد بارور می باشد. آسیب DNA امکان دارد اثر منفی برروی پتانسیل باروری این بیماران داشته باشد. بعلاوه سطح بالای آسیب DNA ممکن است با کیفیت پایین پارامترهای اسپرمی رابطه داشته باشد (10و11).

روش‏های متعددی برای تشخیص میزان آسیب DNA اسپرم وجود دارد که از جمله آن‏ها می‏توان به آکریدین اورنج،SCSA(Sperm Chromatin Structure Assay)،SCD (Sperm Chromatin Dispersion) و            TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) اشاره کرد. در این میان TUNEL روشی بسیار حساس و دقیق است که جهت تشخیص شکستگی های تک رشته و یا دو رشته DNA استفاده می شود (12). ارزیابی میزان آسیب DNA اسپرم به وسیله رنگ آمیزی TUNEL نشان می دهد که افراد نابارور نسبت به افراد بارور دارای تعداد بیشتری اسپرم با آسیب DNA می‏باشند (13).

بنابراین در این مطالعه سعی بر آن است که علاوه بر مقایسه پارامترهای اسپرمی، سلامت DNA اسپرم نیز بین افراد بارور و نابارور واریکوسل مورد ارزیابی قرار گیرد.

مواد و روش‌ها

این مطالعه بر روی 55 بیمار مبتلا به واریکوسل با درجهП( حالتی که اتساع ورید ها در بیماران قابل لمس باشد) یا درجه ш( حالت شدید بیماری که اتساع وریدها قابل رویت است) مراجعه کننده به مرکز باروری و ناباروری اصفهان و 25 فرد بارور به عنوان گروه کنترل انجام شد. پس از تشخیص نوع واریکوسل توسط جراح مربوطه،پرسشنامه‏ای حاوی اطلاعات شخصی افراد، نوع ناباروری و مدت زمان ناباروری و همچنین رضایت نامه شرکت در طرح از مراجعه کنندگان تهیه شد. میانگین سن افراد واریکوسل مورد مطالعه83/4± 11/30 و میانگین سن افراد بارور5/5 ±09/36 و میانگین سن همسران آن‏ها به ترتیب 60/4± 54/25 و 56/5± 40/30 بود. میانگین طول مدت ناباروری بیماران واریکوسل نیز 50/2± 21/3 سال بود. بررسی پارامترهای اسپرمی و سلامت DNAاسپرم بر روی نمونهمایع منی بیماران انجام شد.

جمع آوری مایع منی: نمونه مایع منی بیماران بعد از 4-3 روز جلوگیری از مقاربت جمع آوری شد. قسمتی از نمونه مایع منی جهت بررسی پارامترهای اسپرمی (تعداد، تحرک و مورفولوژی) با استفاده از میکروسکوپ نوری بر اساس معیار سازمان جهانی بهداشت(WHO) (14)و باقیمانده نمونه جهت ارزیابی درصد شکستگیDNA با استفاده از رنگ آمیزیTUNELمورد استفاده قرار گرفت.

ارزیابی اسپرم: شمارش اسپرم‏ها بر حسب میلیون در لیتر با استفاده از دستگاه شمارش اسپرمMackler Counting) Chamber) انجام گرفت. بررسی میزان تحرک اسپرم توسط مشاهده‏ی مستقیم در زیر میکروسکوپ بر اساس معیار WHO شامل 3 نوع حرکت پیشرونده، حرکت غیرپیشرونده و اسپرم‏های غیرمتحرک بود که بصورت مجموع درصد پیشرونده و غیر پیشرونده در این مطالعه گزارش شد.

ارزیابی مورفولوژی اسپرم: در این مطالعه جهت ارزیابی مورفولوژی اسپرم از معیار Strict criteria و رنگ آمیزی پاپانیکولائو استفاده شد. بر اساس این معیار، هر یک از ناهنجاری های سر، گردن و دم اسپرم تعیین گردید. در این معیار اسپرم‏هایی طبیعی در نظر گرفته می‏شد که شکل سر بیضی با یک محیط صاف بوده و آکروزوم حدود 40 تا 70 درصد سر اسپرم را در بر گرفته باشد و همچنین ناحیه گردن و دم اسپرم نیز طبیعی باشد. درصد انواع ناهنجاری سر اسپرم شامل سر کروی، کشیده، گلابی شکل، بدون شکل، دوتایی، سوزنی، ماکروسفال و میکروسفال است و ناهنجاری های ناحیه گردن و دم اسپرم نیز مورد بررسی قرار گرفت (شکل1).

شکل1: مورفولوژی اسپرم با استفاده از رنگ آمیزی پاپانیکولائو

ارزیابی آسیب DNA اسپرم : در این مطالعه جهت بررسی میزان شکستگی DNA از روش TUNEL استفاده گردید (کیت TUNEL از شرکت پرومگا آمریکا تهیه شد). این روش به بررسی میزان شکستگیDNA  در سلول‏های آپوپتیکمی‏پردازد و از جمله تکنیک‏های بسیار حساس و اختصاصی در شناسایی اسپرم‏های غیر طبیعی از اسپرم‏های سالم می باشد. در این روش ابتدا اسپرم‏ها را با استفاده از محلول PBS شستشو داده، سپس بر روی لام اسمیر تهیه شد و بر طبق دستورالعمل TUNEL رنگ آمیزی انجام گردید. بر اساس این تکنیک، رنگ فلئورسنت fluorescein-12-dUTP با استفاده از آنزیم TerminalDeoxynucleotidyle transferase (TdT) به انتهای-OH ´3DNA (قطعات شکسته DNA) اتصال می یابد.fluorescein-12-dUTP،DNA را نشان دار نموده امکان مشاهده مستقیم آن را فراهم می‏نماید. میزان fluorescein-12-dUTP به‏وسیله میکروسکوپ فلئورسنس اندازه‌گیری شد. رنگ فلئورسنت مشاهده شده در هر اسپرم، نشانگر شکستگی در رشته یا رشته‏های DNA است. بر‌اساس حضور یا عدم حضور رنگ‌ سبز فلئورسنت در ناحیه سر اسپرم، اسپرم‏ها به عنوان TUNEL مثبت (اسپرم‏های دارای شکستگی DNA) یا منفی (اسپرم های دارایDNA  سالم) در نظر گرفته می‌شوند(12و 15).

شکل2: تصویری از DNA اسپرم با استفاده از رنگ آمیزیTUNEL  (A: گروه واریکوسل و B: گروه بارور) در قسمت A پیکان شماره 1 نشان‏دهنده اسپرم‏های با DNA سالم و پیکان شماره2 نشان‏دهنده اسپر‏م‏های دارای شکستگی DNA می باشد.

روش بررسی آماری:اطلاعات بدست آمده در محیط نرم افزارSPSS 11.5 وارد شد و با استفاده از آنالیزهای آماری Descriptive analysis،CorrelationCoefficientو independent Paired t-testمورد ارزیابی قرار گرفتو در صورتی که05/0P-Value ≤ بود، از لحاظ آماری معنی دار محسوب شد.

نتایج

نتایج حاصل از ارزیابی پارامترهای اسپرمی در افراد واریکوسل و مقایسهآن‏ها با پارامترهای اسپرمی افراد بارور در جدول 1 نشان داده شده است.همانطور که مشاهده می شود، تفاوت بین میانگین پارامترهای اسپرمی بین افراد بارور و نابارور واریکوسل معنی دارمی باشد. میانگین تعداد اسپرم در افراد بارور 92/16±84/106 و در افراد واریکوسل 49/7±85/44، میانگین درصد تحرک اسپرم در افراد بارور 1/2±8/57 و در افراد واریکوسل 71/1 ±87/49 و میانگین درصد مورفورلوژی غیرطبیعی در افراد بارور 6/0±72/94 و در افراد واریکوسل 22/0±27/97 می باشد.

در شکل 3 مقایسه درصد شکستگی DNA اسپرم در افراد بارور و واریکوسل نشان داد که شکستگی DNA اسپرم در افراد واریکوسل (43/1±34/14) نسبت به افراد بارور (36/1±2/9) بطور معنی‏دار (05/0>p) افزایش نشان داد.

رابطه‏ی بین پارامترهای اسپرم و درصد شکستگی DNA اسپرم در جدول 2 مشخص شده است. از لحاظ آماری بین درصد اسپرم‏های دارای شکستگی DNA با تعداد اسپرم و درصد اسپرم‏های با مورفولوژی غیرطبیعی در افراد نابارور واریکوسل رابطه‏ی معنی‏دارمعکوسی وجود داشت. در حالی که این روابط در افراد بارور معنی‏دار نبود.

همچنین در این مطالعه بیماران نابارور واریکوسل از لحاظ درصد شکستگی DNA به 2 گروه کمتر و بیشتر از 15 درصد تقسیم شدند که این تقسیم بندی طبق مطالعه‏ی گریکو و همکاران (18)، نتایج نشان داد که 8/61 درصد افراد واریکوسل دارای آسیب DNA کمتر از 15 درصد بودند در حالی که آسیب DNA در 84 درصد افراد بارور کمتر از 15 درصد بود.

جدول 1: مقایسه‏ی پارامترهای اسپرمی بیماران واریکوسل با افراد بارور. (میانگین± انحراف معیار) (05/0>p) *نسبت به گروه بارور

شکل 3: مقایسه ی آسیب DNA اسپرم بین بیماران واریکوسل و افراد بارور(میانگین± انحراف معیار ) (05/0>p) *

جدول2: ارتباط بین پارامترهای اسپرم و درصد شکستگی DNA اسپرم. (میانگین± انحراف معیار) (05/0>p) *

بحث

افزایش دمای بیضه در مردان مبتلا به واریکوسل، اسپرماتوژنز غیرطبیعی را به همراه دارد و به دنبال آن اختلال در فرایند اسپرماتوژنز می تواند منجر به ساخت اسپرم‏هایی شود که علاوه بر نقص در پارامترهای اسپرمی سطوح متفاوتی از میزان نقص در ساختار کروماتین را نشان می دهند (9). بنابراین هدف از این مطالعه مقایسه تعداد، تحرک و مورفولوژی اسپرم و همچنین مقایسه سلامت DNA اسپرم در بیماران نابارور واریکوسل با افراد بارور بود.

 نتایج این مطالعه نشان داد که در بیماران واریکوسل تعداد اسپرم و تحرک به طور معنی داری نسبت به افراد بارور پایین تر بود که با مطالعه اسمیت و همکاران (13) و همچنین ملا و همکاران (16) مطابقت دارد. نصر و همکاران (7) نشان دادند که افراد واریکوسلی که دارای پارامترهای اسپرمی غیرطبیعی بودند، با انجام عمل واریکوسلکتومی و احتمالا حذف شدن استرس گرمایی پس از 6 ماه از عمل با بهبودی پارامترهای اسپرمی مواجه شده اند. بنابراین نقص در روند اسپرماتوژنز در افراد واریکوسل که احتمالا به دلیل افزایش دمای بیضه می‏باشد، منجر به غیر طبیعی شدن پارامترهای اسپرمی می‏گردد.

یکی از علل ناباروری مردان علاوه بر کاهش کیفیت پارامترهای اسپرمی، آسیب DNA هم می تواند باشد. فاکتورهای مختلفی در بیماران واریکوسل سبب ایجاد آسیب DNA می‏گردند که از جمله آن‏ها می‏توان به استرس گرمایی، عدم جایگزینی پروتامین به جای هیستون، استرس اکسیداتیو و آپوپتوزیس اشاره نمود (17).

مطالعات اخیر نقش استرس های اکسیداتیو را در ایجاد ناباروری مردان مطرح کرده و نشان دادند که بیماران واریکوسل دارای سطح بالای رادیکال های آزاد اکسیژن(ROS) در پلاسمای مایع منی می باشند (18و19). تعداد زیادی از مطالعات نیز گزارش کردند که علاوه بر بالاتر بودن سطح ROS در این بیماران، میزان آنتی اکسیدانت در مایع منی این بیماران نسبت به افراد بارور کاهش می‏یابد (20). در نتیجه احتمالا عملکرد غیرطبیعی اسپرم در این بیماران با استرس اکسیداتیو ارتباط دارد. به علاوه استرس اکسیداتیو بر سلامتی ژنوم اسپرم تاثیر داشته و سبب ایجاد شکستگی در تک رشته و یا دو رشته DNA خواهد شد (21).

یکی دیگر از دلایل آسیب DNA در بیماران واریکوسل آپوپتوزیس است. آپوپتوزیس بطور طبیعی حدود 75 درصد اسپرماتوگونی ها را، در لوله های منی ساز حذف می‏کند (22). با توجه به مطالعه ساکاس و همکاران (23) مشخص گردید که درصدی از اسپرم‏های غیر طبیعی از فرآیند آپوپتوزیس در بیضه فرار کرده و در مایع منی مشاهده می شوند که تحت عنوان فرار از آپوپتوزیس نامگذاری می شوند. برخی مطالعات نشان داده‏اند که اختلال روند اسپرماتوژنز در ناباروران واریکوسل، افزایش درصد اسپرم‏های آپوپتیک که باید در بیضه حذف می‏شدند را به همراه داشته است و این اسپرم ها بیشتر مستعد آسیب DNA هستند (24).

بررسی آسیب DNA اسپرم در این مطالعه با استفاده از روش TUNEL نشان داد که بیماران واریکوسل به طور معنی داری واجد درصد بالاتری از اسپرم با آسیب DNA نسبت به افراد بارور بودند. در مطالعه حاضر میزان شکستگی DNA در بیماران واریکوسل 34/14 درصد و در افراد بارور 2/9 درصد گزارش شد. روش TUNEL بعنوان یک روش دقیق جهت بررسی شکستگی‏های تک رشته‏ای و دو رشته ای DNA در بیشتر مقالات گزارش شده است. به علاوه صالح و همکاران (25) با استفاده از روش SCSA آسیب DNA را بررسی کرده و گزارش کردند که افراد نابارور واریکوسل دارای تعداد زیادی اسپرم با آسیب DNA می باشند. با توجه به نتایج این مطالعه می‏توان استنباط کرد که در افراد بارور با وجود طبیعی بودن پارامترهای اسپرمی، درصدی از اسپرم ها نیز با آسیب DNA (2/9 درصد) مواجه هستند ولی به دلیل حضور سدهای طبیعی در دستگاه تولید مثلی زنان، این اسپرم ها حذف می‏گردد. در صورتی که در افراد واریکوسل این درصد بیشتر بوده و حتی در حدود 30 درصد افراد واریکوسل با آسیب DNA بیشتر از 15درصد مواجه هستند. بنابراین می توان احتمال داد که یکی از علل ناباروری این افراد نقص ژنوم می‏تواند باشد. در افراد واریکوسل عملکرد اسپرماتوژنز در اثر دمای بالای بیضه، دچار اختلال شده درنتیجه احتمالا DNA اسپرم، مستعد آسیب  می گردد.مطالعات متعدد نشان دادند که در بیماران واریکوسل با انجام عمل واریکوسلکتومی استرس گرمایی برداشته می شود و پس از عمل احتمالا اسپرماتوژنز به طور صحیح صورت می گیرد و در نتیجه این امر سبب کاهش اسپرم‏های با آسیب DNA خواهد شد (26و27). در راستای این تئوری، آزادی و همکاران (28) گزارش کردند که افراد واریکوسل دارای میزان بالایی اسپرم با آسیب DNA می باشند که پس از عمل واریکوسلکتومی بهبود یافته و درصد اسپرم های دارای آسیب DNA کاهش می‏یابد.

در این مطالعه در بیماران واریکوسل بین تعداد اسپرم و درصد آسیب DNA رابطه معکوس و معنی داری مشاهده شد. این ارتباط می تواند بیانگر درجات متفاوت نقص اسپرماتوژنز باشد. افراد با تعداد کم اسپرم با شدت بالای آسیب اسپرماتوژنز و بنابراین با نقص بیشتر در آسیب DNA مواجه هستند و بالعکس در افراد با تعداد بالای اسپرم با شدت پایین تری از آسیب اسپرماتوژنز و بنابراین با نقص کمتری در آسیب DNA مواجه هستند.در این مطالعه بین درصد آسیب DNA اسپرم و درصد اسپرم‏های دارای مورفولوژی غیرطبیعی رابطه مثبت و معنی داری مشاهده شد. در مطالعه ای که توسط سان و همکاران (29) انجام شد نیز گزارش شد که بین افزایش آسیب DNA و اشکال غیر طبیعی اسپرم و کاهش تعداد اسپرم رابطه وجود دارد، که تاییدی بر نتایج این مطالعه می باشد. آوندانو و همکاران (30) در مطالعه‏ای گزارش نمودند که اسپرم‏های با مورفولوژی طبیعی نیز ممکن است دارای آسیب DNA باشند که این احتمال در اسپرم های طبیعی در افراد نابارور افزایش می‏یابد. لذا این امکان وجود دارد که در بیماران واریکوسل اسپرم‏های به ظاهر طبیعی نیز دارای آسیب DNA باشند. وجود 2/9 درصد آسیب DNA در افراد بارور با پارامترهای طبیعی می‏تواند نشانگری از اسپرم‏ها باشد که مورفولوژی طبیعی دارند ولی با آسیب DNA مواجهه هستند. با توجه به اینکه افراد بارور تعداد بی‏شماری اسپرم دارند، این اسپرم‏ها در طی عبور از سدهای طبیعی حذف، و شانس لقاح با اسپرم‏هایی است که طبیعی هستند.

نتیجه گیری

مطالعه حاضر نشان می‏دهد که بیماران واریکوسل دارای تعداد اسپرم‏های کمتر، درصد تحرک پایین‏تر، مورفولوژی غیرطبیعی‏تر و آسیب DNA بیشتر نسبت به افراد بارور می باشند که این امر سبب کاهش قدرت باروری این افراد می گردد. با توجه به گزارشات قبلی در بیماران واریکوسل پیشنهاد می شود که، از آنتی اکسیدانت ها جهت کاهش اکسیدانت ها و در نهایت کاهش آسیب DNA استفاده نمایند و در صورتی‏که درصد بالایی از آسیب DNA در نمونه مایع منی آن‏ها مشاهده شده است از عمل واریکوسلکتومی استفاده نموده تا با توجه به مطالعات متعدد که مشخص نموده اند آسیب DNA بعد از عمل کاهش می یابد، بتوان شانس باروری را در این بیماران افزایش داد و اگر پس از عمل باز هم میزان آسیب DNA بالا بود از روش‏های نوین جداسازی اسپرم جهت جدا نمودن جمعیت اسپرمی با آسیب کروماتین پایین تر به منظور به کار گیری در روش‏های کمک باروری استفاده نمود.

تشکر و قدردانی

بدینوسیله از همکاری متخصصین زنان و زایمان، و پرسنل آزمایشگاه نازایی مرکز باروری و ناباروری اصفهان، همچنین از همکاری مسئولین پژوهشکده رویان اصفهان که زمینه اجرای این تحقیق را فراهم آوردند تقدیر و تشکر می‏کنیم. کلیه هزینه های مصرفی و غیر مصرفی این تحقیق از بودجه تحقیقاتی پژوهشکده رویان جهاد دانشگاهی تامین گردیده است.

منابع

1. Zucchi A, Mearini L, Mearini E, Fioretti F, et al. Varicocele and fertility: relationship between testicular volume and seminal parameters before and after treatment, J Androl. 2006; 27(4): 548-51.

2. Naughton CK, Nangia AK, Agarwal A. Pathophysiology of varicocelesin male infertility, Hum Reprod Update. 2001; 7:473-481.

3. Gorelick J, Goldestien M. Loss of fertility in men with varicocele, Fertil, Steril. 1993; 59: 613-616.

4. Ashok Agarwal, Rakesh K. Sharma, Nisarg R. Desai, Sushil Prabakaran,Antonio Tavares, and Edmund Sabanegh.Role of Oxidative Stress inPathogenesis of Varicocele and Infertility, UROLOGY. 2009; 73(3): 461-469.

5. Mieusset R, Biyan L, Mondinat C, et al. Association of scrotal hyperthermia with impaired spermatogenesis in infertile men, Fertil. Steril. 1987; 48: 1006-1011.

6. Zorgniotti AW, MacLeod J. Studies in temperature, human semen quality, and varicocele, Fertil. Steril. 1973; 24(11): 854-863.

7. Nasr-Esfahani MH, Abasi H, Razavi S, Ashrafi S, et al. Varicocelectomy: semen parameters and protamine deficiency,Int J Androl. 2009; 32(2):115-22.

8. Kondo Y, Ishikawa T, Yamaguchi K, Fujisawa M. Predictors of improved seminal characteristics by varicocele repair, Andrologia. 2009; 41(1): 20-3.

9. Comhaire F, Kunnun M. Selective retrography of the internal spermatic vein: a conclusive approach to the diagnosis of varicocele, Andrologia. 1976; 8: 11-24.