مقدمه

فولیکول مو یک ساختار خیره کننده و سهل‌الوصولی برای مطالعه جنبه­های مختلف زیست شناسی جانوری است. به ویژه، ماهیت چرخه­ای رشد مو سبب می‌شود که فولیکول مو در جانوران بالغ به یک ساختار جالب توجه از نظر فعالیت‌های تکوینی تبدیل گردد و به این دلیل این ساختار به طور روز افزونی مورد توجه محققین قرار می­گیرد (1، 2، 3 و 4). یکی از جنبه­های جالب توجه و همچنین بحث برانگیز در زیست­شناسی مو به موقعیت دقیق محل قرارگیری سلول‌های بنیادی اپیدرمی در فولیکول مو مربوط می­شود. عقیده بر این است که فولیکول مو شبیه تمام سیستم­های تجدید پذیر واجد یک خزانه­ای از سلول‌های بنیادی است که نقش اصلی در رشد، ترمیم و تمایز فولیکول مو بر عهده دارد (5، 6 و 7). بر طبق تعریف رایج، سلول‌های بنیادی، سلول‌هایی ابتدایی و با عمر درازی هستند که نرخ فعالیت میتوزی در آن‌ها پایین است. در بیشتر مدل‌ها، این سلول‌ها در پاسخ به نیازهای بافت و تحت تاثیر عوامل تحریکی مختلف فعال می­گردند و وارد فاز تکثیری شده و تعدادی سلول‌های تقسیم شونده موقتی (transient amplifying) یا TA را به وجود می­آورند. سلول‌های اخیر از این قابلیت برخوردارند که با سرعت زیاد تقسیم شده و تعدادی زیادی سلول‌های دختر به وجود می­آورند، لیکن این سلول‌ها از ظرفیت محدودی برای تقسیم برخوردارند و در نتیجه پس از چند دور تقسیم میتوز به سرنوشت نهایی خود تمایز پیدا می­کنند (8 و 9).

با وجود اجماع عمومی درباره وجود سلول‌های بنیادی اپیدرمی در فولیکول مو، نظرات مختلفی پیرامون محل و موقعیت قرارگیری آن‌ها در فولیکول مو وجود دارد. بسیاری از محققین معتقدند که سلول‌های بنیادی اپیدرمی در پایین‌ترین ناحیه بولب از فولیکول (بخش قاعده­ای فولیکول) قرار دارند، جایی که در آنجا سلول‌های تقسیم شونده رشته مو و سایر محصولات تمایزیافته را در طی فاز رشد چرخه فولیکول به وجود می­آورند (10). از طرف دیگر، محققین دیگری اخیرا فرضیه بالژ را پیشنهاد کرده­اند که بر مبنای آن سلول‌های بنیادی در بخش بالایی غلاف ریشه خارجی (outer root sheath) یا ORS فولیکول مو مستقر هستند، یعنی در ناحیه نزدیک به نقطه اتصال عضله راست کننده مو (11، 12، 13 و 14). بعضی پیشنهاد کرده­اند که در فولیکول موهای سر انسان، این سلول‌های بنیادی در ناحیه بالژ قرار دارند (15 و 16)، در حالی که دیگران خزانه آن‌ها را در زیر سطح میانی فولیکول و بالای بولب در نظر گرفته­اند (17).

شواهد چندی وجود دارد که نظریه بالژ را تایید می‌کند. به طور مثال، ثابت شده که اگر یک سوم تحتانی فولیکول قطع گردد، باقیمانده فولیکول می­تواند ترمیم گردد و یک موی جدیدی را به وجود آورد. در اینجا سلول‌های جدید اپیدرمی موجود در بولب قاعدتا بایستی از سطح بالای محل قطع شدگی منشا گرفته باشند (18 و 19) و چون ناحیه بالژ در بالای فولیکول قرار دارد منطقی است که نتیجه بگیریم این سلول‌ها از ناحیه بالژ سرچشمه گرفته­اند. علاوه بر این، نشان داده شده که سلول‌های حاصل از بخش‌های میانی و بالایی فولیکول در محیط کشت از توانایی تکثیری بیشتری در مقایسه با سلول‌های بولب برخوردار هستند (12) و همچنین بسیاری از نشانگرهای مربوط به سلول‌های بنیادی را بیان می‌کنند (20، 21 و 22).

بر طبق نظریه قرارگیری سلول‌های بنیادی در بالژ یا نظریه فعال شدن بالژ، سلول‌های زاینده اپیدرمی (GE) موجود قاعده فولیکول یا بولب (bulb) سلول‌های TA هستند که ظرفیت تکثیری محدود آن‌ها در انتهای هر فاز رشد به اتمام می­رسد و همین امر است که منجر به توقف رشد مو و ورود فولیکول به مرحله انتقالی (catagen) می‌گردد  (9). اگر این نظریه درست باشد، به یکی از جالب­ترین و پر مناقشه ترین سؤالات در زمینۀ زیست­شناسی فولیکول مو، یعنی" چه عاملی طول فاز رشد هر چرخه را معین می‌کند؟" جواب می­دهد.

شواهد مربوط به پتانسیل تکثیری سلول‌های اپیدرمی واقع در بالژ و بولب (23، 24 و 25) و همچنین سایر مشخصات مرتبط با طبیعت بنیادی بودن و نبودن آن‌ها (26، 27، 28 و 29) عمدتا از کشت این سلول‌ها در محیط کشت حاصل شده است، ولی تاکنون این پتانسیل به طور مستقیم و در in vivo مورد سنجش و ارزیابی قرار نگرفته است. از این‌رو ما در این تحقیق بر آن شدیم که پتانسیل سلول‌های اپیدرمی را که بعد از کندن مو در انتهای بولب فولیکول باقی می­مانند مورد سنجش قرار دهیم. همان طور که برای همگان مشهود است، موقعی که یک موی در حال رشد از فولیکولش کنده می­شود، سبب شروع تولید یک موی جدید می‌گردد. این موضوع این سوال را در ذهن متبادر می‌کند که سلول‌های موجود در این موی جدید از کجا می­آیند؟ در این راستا نشان داده شده که موقعی که یک موی در حال رشد کنده می­شود، اصولا دو جمعیت از سلول‌های اپیدرمی در فولیکول باقی می­مانند: یکی جمعیت کوچکی از سلول‌های زاینده‏ی بولب هستند که به شکل یک ساختار حلقه­مانند در پایین‌ترین بخش فولیکول (بولب) باقی می­مانند (30) و دیگری اجتماعی از سلول‌های ORS هستند که در ناحیۀ بالژ بر جا می­مانند (31(. کندن مو سبب خارج کردن اکثر سلول‌های ORS مستقر در بین این دو جمعیت شده و در این محل یک فضای خالی بر جای می­گذارد. هدف ما از این تحقیق این بوده است که مشخص کنیم کدامیک از این دو جمعیت سلول‌های اپیدرمی باقیمانده (بولب و بالژ) در ترمیم و تشکیل موی جدید دخالت دارند تا بر اساس آن قابلیت تکثیری و نقش سلول‌های بولب را روشن‌تر نماییم.  

در این تحقیق ما بررسی‌های خود را روی فولیکول‌های ویبریسا (موهای پشت لب بعضی از پستانداران از جمله جوندگان) موش صحرایی (رت) انجام دادیم و دلیل آن این است که اولا بر خلاف چرخه‏ی رشد بسیاری از انواع فولیکول که تحت تاثیر عوامل هورمونی یا محیطی قرار می­گیرد (4، 32 و 33)، فولیکول ویبریسا جوندگان واجد چرخه­ای است که با یک دقت زیاد توسط عوامل درونی کنترل می‌گردد. با توجه به این ویژگی محققین قادرند مراحل رشد فولیکول را پیش­بینی کنند و طول رشتۀ موی آن‌را با دقت میلی­متر تخمین بزنند (34). ثانیا اینکه این فولیکول‌ها در یک نظم کاملا مشخص و شناخته شده بر روی پوست لب پشتی قرار می­گیرند. به واسطه این نظم هر فولیکول با دارای آدرس مشخصی بوده و با این آدرس کاملا از فولیکول‌های مجاور متمایز می­گردد (35). 

مواد و روش‌ها

الف) حیوانات و روش خارج نمودن مو از فولیکول: موش‌های صحرایی یا رت نژاد PVG (Inbred Piebald Virol Glaxo rat) با رعایت کامل موازین اخلاقی از هر دو جنس نر و ماده (صرفا جهت تصادفی بودن انتخاب‌ها) برای این کار فراهم شدند. برای اطمینان از یکنواختی آزمایش، فقط فولیکول‌هایی که در میانه‏ی فاز رشد یا آناژن (anagen) بودند استفاده شدند. این فولیکول‌ها به این طریق معین شدند که در آن‌ها طول موی در حال رشد یک سوم تا دو سوم طول موی فاز رشد قبلی (club) بود. در کل، 82 فولیکول آناژن از 17 موش صحرایی برای تحقیق روی جنبه­های مختلف ترمیم مو متعاقب کندن مو مورد استفاده قرار گرفتند. قبل از کندن رشته مو، حیوانات با استفاده از فلوتن (شرکت دامپزشکی مالینکرات- انگلستان) بی هوش شدند و موقعیت فولیکول‌های میانه آناژن روی لب فوقانی حیوان با توجه به نام‌گذاری اولیور مشخص گردید (35). به منظور تسهیل کندن رشته­های مو و به حداکثر رساندن مقدار بافت خارج شده، ابتدا با کمک پنس‌های ظریف موهای فاز رشد قبلی یا کلاب (club fiber)، از فولیکول‌های انتخابی جدا گردید. سپس رشته موی در حال رشد با دقت از نزدیک به سطح پوست گرفته شده و به آرامی بیرون کشیده شد تا اینکه رشته‏ی مو از فولیکول خارج گردید. انتهای نزدیک یا پروکزیمال موی خارج شده فورا زیر استرئومیکروسکوپ مورد مشاهده قرار گرفت تا اینکه اطمینان حاصل شود که حداکثر مقدار ماتریکس خارج شده باشد و این عمل در تمام فولیکول‌ها یکسان انجام شده باشد. انتهای پروکزیمال رشته­ موهایی که به درستی کنده شده بودند معمولا به صورت فنجانی با لبه­های صاف دیده می‌شد (شکل 1). فولیکول‌هایی که رشته موی کنده شده‏ی آن‌ها چنین ساختاری را نمایان نمی‌کرد از تحقیق کنار گذاشته می­شدند. معمولا در هر موش صحرایی تعداد 4 تا 5 فولیکول که متعاقب کنده شدن رشته موی آن‌ها کاملا شرایط مورد نظر را دارا بودند برای ادامه‏ی کار استفاده می­شدند.

برای بررسی وقایعی که متعاقب یک‌بار کندن مو در فولیکول رخ می‌دهد، حیوانات مذکور 6، 12، 24 و 48 ساعت و همچنین 4 و 7 روز پس از عمل کندن کشته شدند و فولیکول‌های تجربی به طریق مرسوم از پوست لب فوقانی آن‌ها جدا گردید (36). این فولیکول‌ها سپس یا برای کارهای بافت­شناسی تثبیت شدند و یا اینکه برای کارهای ایمنوهیستوشیمی و نشان‌دار کردن با BrdU به سرعت فریز گردیدند.

برای تعیین اندازه­گیری قابلیت فولیکول‌ها در ایجاد موی جدید، قبل از کندن، طول موی کلاب و موی در حال رشد اندازه­گیری شد. سپس در فواصل معین زمانی، فولیکول‌های مورد آزمایش مشاهده تا اینکه موی در حال ترمیم از سطح پوست خارج گردید. از این به بعد طول این مو در فواصل زمانی 1 تا 3 روز به طور مرتب اندازه گیری شد. موقعی که طول این موی در حال ترمیم به یک سوم تا یک دوم طول موی کلاب رسید، این مو مجددا به طریق فوق‌الذکر کنده شد. فرایند کندن و اندازه گرفتن تا 5 بار متوالی انجام گرفت و در این مورد زمان آزمایش حدود 110 روز طول کشید. در هر مرحله از آزمایش فولیکول‌هایی که شرایط آزمایش به درستی در مورد آن‌ها انجام نمی­شد از ادامه‏ی تحقیق کنار گذاشته می‌شدند. داده­های بدست آمده از این اندازه­گیری های متوالی وارد نرم افزار SPSS 16 گردید و با استفاده از آزمون یک-طرفه‏ی ANOVA مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و با استفاده از همین نرم افزار نمودار رشد مو در فولیکول‏های تیمار تهیه گردید. طول کلی موی تولید شده به وسیله هر فولیکول به وسیله جمع زدن طول موی اولیه و مجموع طول موهای ترمیم شده مشخص گردید. این طول سپس با طول موی کلاب مقایسه شد. حیواناتی که موی فولیکول‌های آن‌ها برای چندین بار متوالی کنده شده بود، 6 یا 24 ساعت پس از آخرین کندن کشته شدند و فولیکول‌های مورد آزمایش آن‌ها جدا و برای کارهای بافت شناسی و ایمنوهیستوشیمی آماده گردیدند. در یک مورد، بعد از سومین بار کندن مو، به فولیکول‌ها اجازه داده شد تا رشد کنند و به طول انتهایی خود برسند و در همین حین طول موی ترمیمی آن‌ها به طور مرتب اندازه گیری می­شد. در این زمان این مو برای بار چهارم کنده شد و سپس حیوان کشته شده و فولیکول‌های مورد آزمایش آن برای کارهای بافت شناسی تثبیت گردیدند.

ب) بافت شناسی: فولیکول‌های جدا شده در فرمالین نمکی 4 درصد تثبیت و از میان یک سری اتانول با غلظت بالارونده عبور داده شد تا آبگیری شوند و با زایلول شفاف و نهایتا در پارافین قالب گیری شدند. برش‌هایی طولی با ضخامت 7 میکرون از فولیکول‌ها تهیه گردید و با ترکیبی از هماتوکسیلین وایگرت، آبی آلسین و کورتیس پونسا S ( تماما فراهم شده از سیگما، انگلستان) رنگ آمیزی شدند.

ج) نشان‌دار کردن با BrdU و ایمنوهیستوشیمی: فولیکول‌ها متعاقب جدا شدن از حیوان، فورا در محیط کشت حداقل یا MEM (Minimum Essential Medium) که حاوی 10 میکرو مول بر لیتر ماده‏ی نشان‌دار برمودزکسی یوریدین یا BrdU (سیگما، انگلستان) بود قرار داده شده و محیط مذکور برای مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد قرار گرفتند. BrdU نوکلئوتیدی است که در جریان همانند­سازی DNA در فاز سنتز بجای نوکلئوتید تیمین در رشته‏ی DNAی در حال ساخت وارد می‌گردد. برای برداشتن و خارج کردن BrdU آمیخته نشده، نمونه­ها سه بار با بافر PBS (phosphate buffer solution) شستشو شده و سپس در همان بافر به مدت 20 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی گراد قرار گرفتند. فولیکول‌های نشان‌دار شده سپس به قالب‌های آلومینیومی حاوی مایع tissue-tek (شرکت مایلز ساینتیفیک، انگلستان) منتقل شدند. این قالب‌ها سپس به سرعت با شناور کردن آن‌ها در نیتروژن مایع فریز شدند. فولیکول‌های فریز شده با استفاده از کرایوستات (برایت، انگلستان) در دمای 20- درجه سانتی گراد به طور طولی و با ضخامت 6 میکرون برش داده شدند. برش‌ها سپس به روی لام‏های پوشیده شده با پلی L-لیزین منتقل شده و به آن‌ها اجازه داده شد تا در دمای اتاق خشک شوند. این برش‌ها سپس با اتانول 70 درصد (در بافر گلیسین، 50 میلی مول بر لیتر، با pH برابر با 2) فیکس شدند.  سپس برش‌ها سه بار با PBS شسته شده و سپس برای مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد با محلول آنتی-BrdU (شرکت بورینگر منهیم بیومدیکا، انگلستان) انکوبه شدند. این نمونه­­ها بعدا سه بار با بافر PBS شسته شده و مجددا برای مدت یک ساعت در محلول rabbit anti-mouse lg-fluorescein (شرکت داکوA/S، دانمارک) که به نسبت 1 به 40 با PBS حاوی 70 میکرو مول بر میلی­لیتر آبی ایوان (مرک، آلمان) رقیق شده بود انکوبه شدند. دلیل استفاده از آبی ایوان ایجاد تضاد در زمینه بود. اسلایدهای حاوی برش بعدا با PBS به صورت فوق‌الذکر شسته و با محلول سیتوفلور (آگار اید، انگلستان) پوشانده شدند. برش‌های نشان‌دار شده در زیر میکروسکوپ فلورسنس زایز اکسیورت 135 (کارل زایس، آلمان) که به دوربین عکاسی مجهز بود مشاهده و تصویرهای لازم تهیه شد.

د) قطع و جدا نمودن بخش بالایی فولیکول‌های کنده شده در in vivo: برای این کار رت­ها با فلوتن بیهوش شدند و ردیف عقبی فولیکول‌های ویبریسا ]ردیف A بر اساس نام‌گذاری اولیور، 1966(35)[ پس از بریدن پوست در معرض دید قرار گرفتند. سه چهارم بالایی فولیکول‌های مورد نظر از بافت‌های همبند اطراف پاک‌سازی شد و سپس موهای کلاب و در حال رشد از فولیکول‌های انتخاب شده کنده و سپس با کمک قیچی­های ظریف فولیکول‌ها درست از  بالای ناحیه بولب به دو قسمت تقسیم شدند. این کار باعث شد که ناحیه بولب کاملا از ناحیه‏ی فوقانی فولیکول جدا گردد. بعد از این کار، پوست لب بالای حیوان به موقعیت اولیه برگردانده شد و محل بریدگی به دقت بخیه زده شد. لازم به ذکر است این عمل هیچ مزاحمتی برای غذا خوردن حیوان ایجاد نمی‌کرد به طوری که پس از به هوش آمدن حیوان عمل شده قادر بود به طور طبیعی تغذیه کند. به طور کلی 16 فولیکول در 5 رت (شامل 3 نر و 2 ماده) به این طریق قطع گردید. بیست روز پس از عمل قطع کردن، حیوانات کشته می­شدند و بعد از بریدن پوست لب بالایی و نمایان کردن محل مورد نظر، نیمه­های فولیکول‌های قطع شده جدا و در محلول فرمالین نمکی فیکس می­شدند. سپس این نیمه فولیکول‌ها از بافت‌های اطراف پاک می‌شد و برای مطالعات بافت شناسی به شیوه­ای که در بالا ذکر شد آماده می­شدند.

نتایج

موقعی که رشتۀ موی از یک فولیکول در حال رشد کنده می­شود (شکل A1)، این عمل کندن نه تنها رشتۀ مو را خارج می‌کند بلکه غلاف خارجی ریشه و بیشتر بخش اپیدرمی (ماتریکس) بولب را نیز بر می‌دارد (شکل B1). لیکن متعاقب این کار به طور پیوسته یک جمعیت کوچکی از سلول‌های اپیدرمی ماتریکس در پایین‌ترین ناحیۀ فولیکول بر جای می­ماند (شکل C1). در بالای بخش بولب فولیکول، یک لایه‏ی ناقصی از سلول‌های قاعده­ای (بازال) غلاف خارجی ریشۀ به صورت چسبیده به دیوارۀ فولیکول باقی می­ماند ولی فضایی که قبلا با رشته‏ی مو پر شده بود مملو از خون و بقایای سلولی می‌گردد. همچنین به طرف بالای فولیکول، در بخشی که به بالژ شناخته می­شود یک غلاف خارجی نسبتا ضخیم بر جای می­ماند (شکل C1).

شکل 1: اثر کندن رشته مو  بر فولیکول‌های آناژن. A) برش طولی از یک فولیکول ویبریسای رت در مرحله میانی آناژن. B) یک رشته موی کنده شده از فولیکول مرحله آناژن. C) یک برش طولی از فولیکول ویبریسا درست بعد از کنده شدن رشته مو. دو جمعیت از سلول‌های اپیدرمی در فولیکول باقی مانده، شامل: سلول‌های زاینده بولب (فلش) در قاعده فولیکول و سلول‌های غلاف خارجی ریشه (o) در بالای فولیکول. رنگ آمیزی در A و C: آبی آلسین، هماتوکسیلین وایگرت، کورتیس پونسا S، خط نشانه در A برابر با 400 میکرومتر، در B برابر با 200 میکرومتر و در C برابر 300 میکرومتر.

ترمیم و تجدید رشد مو در ناحیۀ بولب فولیکول متعاقب کنده شدن رشتۀ مو

عمل کندن رشتۀ مو ظاهرا آسیبی به پاپیلای درمی (dermal papilla) فولیکول وارد نمی‌کند چرا که این ساختار متعاقب کندن همان مورفولوژی و ویژگی‌های مرحلۀ آناژن را حفظ می‌کند به طوری که به صورت گلابی شکل باقی مانده و دارای یک ناحیۀ راسی مشخص می­باشد. این پاپیلا همان طور که در بالا ذکر شد در قسمت قاعده­ای به وسیلۀ حلقه­ای از سلول‌های اپیدرمی ماتریکس احاطه می‌گردد. سلول‌های پاپیلا در این ساختار به خوبی پراکنده شده و فضای بین سلولی آن‌ها غنی از مواد گلیکوزآمینوگلیکان می­باشد (با توجه به رنگ گرفتن شدید آن‌ها با رنگ آبی آلسین) و مویرگ‌های خونی به خوبی در آن منشعب شده­اند (شکل A2 را با B2  مقایسه کنید).

شش ساعت بعد از کندن، تغییرات مورفولوژیکی اندکی در فولیکول مشاهده می­شود (شکل C2) و 12 ساعت پس از این کار نیز این تغییرات قابل توجه نمی­باشد (شکل D2)، لیکن پس از 24 ساعت بخش اپیدرمی بولب یک حجیم شدگی و گسترش بارزی را به نمایش می‌گذارد (شکل E2). در این زمان سلول‌های اپیدرمی باقیمانده هنوز به صورت سلول‌های با رنگ تیره­­تر مشخص هستند در حالی که یک جمعیت جدیدی از سلول‌های روشن­تر در بالای آن‌ها قابل روئیت می­باشد. در ساعت 48 این ناحیۀ جدیدا رشد کرده گسترده شده و به طرف بالا پیشروی کرده است و در همین حال نشانه­­ای از تمایز در سلول‌های بالایی و بیرونی ماتریکس جدید مشاهده می­گردد (شکل F2). این گروه از سلول‌های تمایز یافته بعدا به طرف بالا حرکت کرده و چهار روز پس از کندن در بالای بولب مشاهده می­شوند. در این زمان سلول‌های پاپیلای درمی متراکم شده و یک کاهش مشخص در مواد خارج سلولی آن دیده می‌شود، در حالی که ماتریکس اپیدرمی با اپیدرم بالای فولیکول پیوسته شده است. در روز هفتم رشد فیبر مو از سر گرفته شده (تصویر نشان داده نشده) و در روز نهم فولیکول از نظر مورفولوژی کاملا به یک فولیکول میانۀ آناژن شباهت پیدا کرده است به طوری که دارای یک پاپیلای درمی گلابی شکل و سلول‌های اپیدرمی در مراحل مختلف تکثیر و تمایز می­باشد (شکل H2). در این زمان، در تعدادی از فولیکول‌ها رشتۀ موی جدید از سطح پوست خارج شده است.

شکل 2: بافت­شناسی ناحیه‏ی قاعده­ای یا بولب فولیکول قبل (A) و در مراحل مختلف (B-H) بعد از برداشته شدن رشته مو. A) بولب فولیکول در میانه آناژن دارای یک پاپیلای درمی گلابی شکل است که به وسیله ماتریکس اپیدرمی احاطه می­شود. B) بولب فولیکول درست بعد از کندن مو. C) در ساعت 6: سلول‌های GE یک واکنش بازوفیلی شدیدی از خود نشان می‌دهند و در پاپیلای درمی سلول‌ها فشرده­تر شده­اند. D) در ساعت 12: سلول‌های GE فعالانه درگیر فعالیت میتوزی هستند. E) در ساعت 24: یک گسترشی در بخش GE مشهود است. سلول‌های GE اولیه هنوز در قاعده بولب به صورت ناحیۀ تیره­تر دیده می­شوند، در حالی که یک جمعیت جدیدی از سلول‌های روشن­تر درست در بالای آن‌ها (فلش) ایجاد شده است.F) در ساعت 48: ماتریکس اپیدرمی جدید به سمت بالا گسترش پیدا کرده و تقریبا پاپیلای درمی را احاطه کرده است. سلول‌های بالایی در حال فرایند تمایز هستند (فلش). G) در روز چهارم، در اطراف پاپیلای درمی یک ماتریکس جدید شکل گرفته است. سلول‌های اپیدرمی تمایز یافته اکنون در بالای بولب قابل تشخیص می­باشند (فلش). H) در روز نهم: بولب به ظاهر آناژن طبیعی برگشته است. رنگ آمیزی در تمام موارد، آبی آلسین، هماتوکسیلین وایگرت، کورتیس پونسا S، خط نشانه در  A-E  برابر 200 میکرومتر، در F برابر با 100 و در G-H برابر با 200 میکرومتر.

توزیع BrdU در فولیکول متعاقب یک‌بار کندن مو

شش ساعت پس از کندن، ماده نشان‌دار BrdU به شدت در سلول‌های اپیدرمی ماتریکس که در قاعده فولیکول باقی مانده­اند دیده می‌شود (شکل‌های A3 و B3). در این مرحله توزیع ماده نشان‌دار فقط به همین سلول‌ها محدود می­شود و نشانه چندانی از وجود این ماده در سلول‌های اپیدرمی میانی و بالایی فولیکول (ناحیه بالژ) دیده نمی­شود (شکل C, D3). در ساعت 12 (شکل A4( مادۀ نشان‌دار هنوز به شدت در ناحیه قاعده­ای دیده می‏شود (شکل B4) اما در این زمان مشاهده می‌شود که تعدادی از سلول‌های ORS بالای بولب نیز نشان‌دار شده­اند (شکل C4) ولی نواحی بالایی فولیکول هنوز فاقد ماده نشان‌دار می­باشند (شکل‌های D4 و E4). در ساعت 24 (شکل A5) سلول‌های اپیدرمی بولب باز هم ماده نشان‌دار را بیان می‌کنند (شکل B5) و اکنون علائم نشان‌دار شدن در نیمه فوقانی فولیکول مشاهده می‌شود (شکل­های C5 و D5). در ساعت 48 فضای داخلی فولیکول با یک تودۀ متراکمی از سلول‌های ORS پر شده است (شکل A6(. در این زمان ماده نشان‌دار باز هم به صورت پیوسته در ناحیه بولب قابل مشاهده است (شکل B6) ولی همزمان تعداد محدودی تقسیم سلولی در لایه بازال سلول‌های اپیدرمی ORS دیده می‌شود (شکل‌های B,C,D6).

به طور کلی این مشاهدات نشان داد که متعاقب کنده شدن مو از فولیکول تقسیم سلول‌های به طور غالب در ناحیه ماتریکس بولب دیده می­شود و این گروه از سلول‌ها به طور پیوسته تکثیر می‌شوند ولی با گذشت زمان تقسیم سلولی به نواحی بالاتر فولیکول نیز گسترش می­یابد ولی در ساعت 48 سلول‌های ناحیۀ بالژ نیز نشان‌دار می­گردند (شکل‌های D6 و E6).

مورفولوژی فولیکول مو و توزیع BrdU متعاقب خارج کردن متوالی رشتۀ مو

بافت شناسی و توزیع BrdU در زمان‌های مختلف بعد از کندن متوالی دقیقا مشابه فولیکول‌هایی بود که این کار فقط یک‌بار در مورد آن‌ها انجام شد (مشاهدات ارائه نشده)، بدین ترتیب که ماده نشان‌دار از همان ابتدا در سلول‌های برجای مانده ماتریکس دیده می­شد ولی متعاقبا به نواحی بالایی فولیکول نیز گسترش پیدا می‌کرد (شکل 7). موضوع جالب توجه اینکه BrdU هیچ گاه در سلول‌های پاپیلای درمی مشاهده نشد. گاهی ماده نشان‌دار به طور خیلی نادر (یک یا دو سلول) در داخل این ساختار مشاهده می‌شد ولی سلول‌های نشان‌دار شده سلول‌های پایپلای درمی نبودند بلکه آن‌ها سلول‌های موجود در دیواره رگ‌های خونی تغذیه کننده پاپیلا بودند که ماده نشان‌دار را به خود گرفته بودند (شکل B4). در این مطالعات هیچ گونه تفاوت مشهودی از نظر نتایج بدست آمده در دو جنس نر و ماده مشاهده نشد.

شکل 3: بافت­شناسی (A) و توزیع BrdU نشان‌دار (B-D) در فولیکول‌ها 6 ساعت بعد از کندن رشته مو. A) سلول‌های زاینده اپیدرمی باقیمانده (فلش) در اطراف قاعده پاپیلای درمی (p) دیده می­شوند. در طول بیشتر فولیکول، لوله توخالی (s) محل موی قبلی با خون و تفاله­های سلولی پر شده است. سلول‌های ORS (o) در بخش بالایی فولیکول حفظ شده­اند. رنگ آمیزی: آبی آلسین، هماتوکسیلین وایگرت، کورتیس پونسا S، خط نشانه برابر با 400 میکرومتر. B) سلول‌های زاینده در اطراف پاپیلا (p) به شدت با آنتی­بادی anti-BrdU (فلش) نشان‌دار شده‌اند. در بالای این بخش و در بالای بولب عملا هیچ ماده نشان‌داری دیده نمی­شود. همچنین در قسمت‌های میانی (C) و بالایی (D) فولیکول هیچ نشانه­ای از تقسیم سلولی دیده نمی­شود. خط نشانه B-D برابر با 50 میکرومتر.

شکل 4: بافت­شناسی (A) و توزیع BrdU نشان‌دار (B-D) در فولیکول‌ها 12 ساعت بعد از کندن رشته مو. A) در برش طولی، مورفولوژی فولیکول بسیار مشابه آن چیزی است که در ساعت 6 (شکل A3) مشاهده می­شد. رنگ آمیزی: آبی آلسین، هماتوکسیلین وایگرت، کورتیس پونسا S، خط نشانه برابر با 400 میکرومتر. B) سلول‌های GE در سرتاسر بولب اکنون با آنتی-BrdU نشان‌دار شده­اند. نشان‌دار شدن یک سلول واحد در پاپیلای درمی در محل قرارگیری مویرگ‌های خونی (فلش) دیده می­شود. C) سلول‌های در حال تقسیم در یک چهارم پایینی فولیکول دیده می­شوند، هر چند که تعداد آن‌ها به طرف بالا کاهش پیدا می‌کند. (D و E) یک‌بار دیگر، تقسیم سلولی (یا تعداد بسیار محدودی) در بخش میانی و بخش بالایی فولیکول دیده نمی­شود. خط نشانه B-E برابر با 50 میکرومتر.

شکل 5: بافت­شناسی (A) و توزیع BrdU نشان‌دار (B-D) در فولیکول‌ها 24 ساعت بعد از کندن رشته مو. A) علاوه بر ترمیم ماتریکس، در بالای بولب سلول‌های اپیدرمی اکنون حفره داخلی را پر کرده­اند (فلش). رنگ آمیزی: آبی آلسین، هماتوکسیلین وایگرت، کورتیس پونسا S، خط نشانه برابر با 400 میکرومتر. B) تقسیم سلولی به شدت در تمام سلول‌های اپیدرمی موجود در بولب دیده می­شود. (p) پاپیلای درمی. C) ماده نشان‌دار BrdU اکنون در ناحیه پایینی و میانی فولیکول دیده می­شود. D) برای اولین بار، ماده نشان‌دار BrdU در این بخش بالایی از فولیکول دیده می­شود، هر چند که تراکم آن‌ها اندک بوده و توزیع آن‌ها به جوانب محدود می­شود. خط نشانه B-D برابر 50 میکرومتر.

شکل 6:  بافت­شناسی (A) و توزیع BrdU نشان‌دار (B-D) در فولیکول‌ها 48 ساعت بعد از کندن رشته مو. A) ماتریکس کاملا ترمیم یافته است. رنگ آمیزی: آبی آلسین، هماتوکسیلین وایگرت، کورتیس پونسا S، خط نشانه برابر با 400 میکرومتر. B) مادۀ آنتی-BrdU هنوز هم سلول‌های در حال تقسیم ناحیه پایینی بولب را رنگ کرده است. C) سلول‌های در حال تقسیمی که در این ناحیه از فولیکول دیده می­شوند هنوز نیز ظاهرا به لایه قاعده­ای ORS محدود می­شوند. D) ماده نشان‌دار اکنون در بیشتر طول فولیکول مشاهده می­شود، هر چند که در سطوح بالایی تراکم پایینی را نشان می‌دهد. خط نشانه B-D برابر با 100 میکرومتر.

شکل 7: دیاگرام شماتیکی که طرح کلی تقسیم سلولی مشاهده شده در فولیکول‌ها را متعاقب کنده شدن رشته مو خلاصه کرده است. در ابتدا، ماده نشان‌دار BrdU به سلول‌های زاینده اپیدرمی بر جای مانده در بولب  محدود می­شود و تقریبا هیچ نشانه­ای از این ماده در سایر بخش‌های فولیکول دیده نمی­شود. ماده نشان‌دار سپس به طرف بالا گسترش یافت و یک سوم پایینی فولیکول را در بر گرفت و تا ساعت 24 تقسیم سلولی در سرتاسر نیمه پایینی فولیکول قابل تشخیص بود. در ساعت 48، BrdU در سه چهارم طول فولیکول مشاهده می­شد. در تمام طول مدت بعد از کنده شدن رشته مو، ماده نشان‌دار به طور پیوسته در بخش پایینی GE دیده می­شد.

اندازه­گیری رشد  موهای ترمیم شده

موهای جدید در فاصله زمانی بین 8 تا 10 روز بعد از کندن در سطح پوست ظاهر شدند (نمودار 1). این زمان برای بار اول یا دفعات دوم و سوم تغییر نمی­کرد ولی در مورد فولیکول‌هایی که عمل کندن برای 4 یا 5 بار در آن‌ها تکرار شده بود زمان خروج موی جدید از سطح پوست قدری افزایش یافت و به 9 تا 11 روز تغییر کرد. با توجه به تعداد زیاد موارد اندازه­گیری مشخص شد که موهای ترمیمی با نرخی حدود 9/0 تا 1 میلی متر در روز رشد می‌کنند و این نرخ در دفعات بعدی نیز تغییر چندانی نشان نمی­داد. در 2 مورد فولیکول‌ها یک کاهش جزئی در نرخ رشد مو بعد از چهارمین و پنجمین بار کنده شدن نشان دادند، اما در هیچ‌کدام از فولیکول‌های مورد آزمایش رشد مو متوقف نشد. موهای جدید تا موقعی که به میانه مرحله رشد می­رسیدند طول آن‌ها اندازه­گیری می­شد و در این زمان مجددا کنده می­شدند. موقعی که طول موهای ترمیمی با یکدیگر جمع شد و به طول موی در حال رشد اولیه اضافه شد مشخص شد که در تمام فولیکول‌ها این طول بیشتر از طول موی کلاب آن‌ها است (265-32 درصد) و هر چه دفعات کنده شدن بیشتر می‌شد این افزایش بیشتر و مشخص­تر بود (جدول 1). 

نمودار 1: منحنی رشد مو (بر مبنای میلی­متر متعاقب 5 بار کنده شدن متوالی. موی اولیه و موهای ترمیم شده همیشه در مرحله میانی آناژن کنده می­شدند و موهای جدید معمولا 9 تا 12روز پس از کنده شدن از سطح پوست خارج می­شدند. نرخ متوسط رشد موها به طور پیوسته حدود 1 میلی­متر در روز بود. حروف P1-P6 دفعات تکرار کندن مو(plucking) را نشان می‌دهد

جدول 1: طول موهای تولید شده بعد از یک‌بار یا چندین بار متوالی کنده شدن. با توجه به اینکه فولیکول‌های با اندازۀ مختلف در این آزمایش مورد استفاده قرار گرفتند فاصله پایین‌ترین عدد با بزرگ‌ترین عدد بسیار زیاد است.

شکل 8: میکروگراف قطعه‏ی پایینی فولیکول (بولب) که 20 روز قبل عمل کنده شدن رشته‏ی مو و قطع از بخش بالایی در آن انجام شده بود. A) مشاهده می­شود که یک موی پیگماندار از بالای فولیکول به بیرون رشد کرده است. B) برش طولی این قطعه که مشاهده می­شود یک ماتریکس اپیدرمی جدید در اطراف پاپیلای درمی به وجود آمده است. رنگ آمیزی در B: آبی آلسین، هماتوکسیلین وایگرت، کورتیس پونسا S، خط نشانه در A برابر با 500  میکرومتر و در B برابر با 600 میکرومتر.

ترمیم مو در قطعه­های فولیکول در in vivo

از میان 16 نیمه یا قطعه بولب فولیکول، مشاهده شد که در 11 مورد (6 مورد متعلق به جنس نر و 5 مورد متعلق به جنس ماده) موی جدیدی در آن‌ها ایجاد شده و از بالای بولب خارج گشته است. طول این موها بین 1 تا 3 میلی­متر در تغییر بود (شکل A8). این موها به شدت تاخورده و در هم تابیده بودند و به وسیله بافت همبند کاملا احاطه شده بودند. از نظر بافت شناسی این قطعه­ها دارای یک ماتریکس اپیدرمی بودند که به طور واضح ترمیم شده بود و هنوز ویژگی‌های مرحله آناژن را نشان می‌داد. پاپیلای درمی موجود در این در این قطعه­ها نیز مورفولوژی گلابی شکل خود را حفظ کرده بود (شکل B8).

بحث

فولیکول مو در بالغین به دلیل فرآیند ترمیم سلولی و فیزیولوژیکی چرخه­ای خود یک جایگاه غیرمعمولی را در تکوین پستانداران اشغال می‌کند. احتمالا مهم‌ترین سوال در زیست شناسی فولیکول مو این است که چه عاملی زمان­بندی این فعالیت چرخه­ای را کنترل می‌کند (37 و 38). در پژوهش حاضر ما فعالیت سلولی را متعاقب کندن یک‌بار و چند بار متوالی مو از فولیکول دنبال کردیم و شاهدی قوی بر این موضوع یافتیم که سلول‌های زاینده اپیدرمی موجود در قاعده فولیکول قادرند که بیشتر از آن چیزی که برای معمولا در هر چرخه تقسیم می­شوند تقسیم گردند. این یافته این عقیده را که فاز رشد چرخه مو به وسیله پتانسیل تکثیری محدود این سلول‌ها کنترل می­شود به چالش می‌کشد (31و 39).

در گذشته از کندن مو برای مطالعه جنبه­های مختلفی از رفتار فولیکول استفاده شده است (34)، لیکن در این مطالعات به غیر از توصیف عواقب آنی متعاقب این عمل اطلاعات دیگری در رابطه با وقایع سلولی داخل فولیکول ارائه نشده است (30). استاندارد کردن و یکنواخت کردن آزمایش در این پژوهش بسیار اهمیت داشت چرا که نشان داده شده که کندن ویبریسا در مراحل مختلف چرخه رشد می­تواند روی زمان­بندی فاز رشد بعدی تاثیر بگذارد (40). در ابتدا ما نشان دادیم که سلول‌هایی که در طی کنده شدن از فولیکول خارج می­شوند با تقسیم مداوم سلول‌های زاینده‏ی اپیدرمی باقیمانده در قاعده فولیکول جایگزین می­شوند. این موضوع با توجه به نشان‌دار شدن پیوستۀ این سلول‌ها با BrdU کاملا آشکار شد ضمن اینکه مطالعات بافت شناسی نیز رشد پیوستۀ بخش اپیدرمی باقیمانده و ایجاد موی جدید در فولیکول را نشان داد. قبلا پیشنهاد شده که بعد از کنده شدن یک توقفی در فعالیت میتوزی سلول‌های زاینده‏ی اپیدرمی باقیمانده رخ می‌دهد (40) ولی در اینجا ما چنین توقفی را مشاهده نکردیم. این فرضیه که ماتریکس اپیدرمی ترمیم شده‏ی جدید از سلول‌های غلاف ریشه بالای فولیکول (یا ناحیه بالژ) منشا می­گیرند نمی­تواند صحت داشته باشد زیرا مطالعات نشانه گذاری با BrdU نشان داد که متعاقب کندن مو، قبل از اینکه تقسیم سلولی در بخش بالایی فولیکول شروع شود فرآیند ترمیم در بخش پایینی پیشرفت زیادی پیدا کرده است. کندن رشته مو در فولیکول‌های انسان و همچنین ویبریسا یک لایه نازکی از سلول‌های غلاف خارجی ریشه را در طول دیواره فولیکول برجای می‌گذارد (24 و 41) و نشان داده شده که سلول‌های واقع در بین بولب و بالژ دارای توانایی تکثیری قابل ملاحظه­ای هستند (15 و 17). اما در اینجا نشان داده شد که هنگامی که سلول‌های ORS بالای بولب شروع به تقسیم می‌کنند (با توجه به نشانه گذاری با BrdU) سلول‌های حاصل از تقسیم ابتدا فضای خالی برجای مانده از رشته مو را پر می‌کنند و به نظر می‌رسد که سهمی در تشکیل ماتریکس ندارند. علاوه بر شواهد ایمنوهیستوشیمی و بافت شناسی آزمایش کندن مو و سپس جدا کردن نیمه پایینی فولیکول از بخش بالایی در in vivo بدون هیچ گونه شبهه­ای آشکار کرد که سلول‌های GE باقیمانده در قاعده فولیکول قادر به بازسازی ماتریکس و تولید یک موی جدید هستند. قابلیت ناحیه بولب فولیکول (بدون کندن مو) برای رشد در in vivo خیلی قبل به وسیله سایر محققین نشان داده شده است (42) ولی ما در اینجا برای اولین بار نشان دادیم که بولب فولیکول بعد از کنده شد مو نیز می‌تواند در داخل بدن خود را ترمیم و یک موی جدید ایجاد نماید. این آزمایش نشان داد که هم ماتریکس و هم موی جدید از همان گروه از سلول‌ها منشا می‌گیرند که متعاقب کندن در انتهایی‌ترین نقطه فولیکول بافی می­مانند و در این ساختارهای جدید سلول‌های بالایی فولیکول نقش ندارند.

در فولیکول‌هایی که عمل کنده شدن مو را چندین بار متوالی تجربه کرده بودند درست همان وقایع بافت شناسی و نشان دار شدن BrdU دیده شد که در همتایان یک بار کنده شده آن‌ها مشاهده گردید. در اینجا نیز سلول‌های GE باقیمانده سرچشمه ماتریکس و موی جدید بودند. بر طبق فرضیۀ بالژ (31)، سلول‌های GE به عنوان سلول‌های تقسیم شونده موقتی با پتانسیل تکثیری محدود طبقه بندی می‌شوند. از این‌رو بر طبق این نظریه مدت زمان آناژن و طول موی ایجاد شده به وسیله پتانسیل تکثیری این اجتماع سلولی تعیین می‌گردد. به این ترتیب که برای مثال، اگر موی یک فولیکول در زمانی کنده شود که آن دو سوم طول آناژن خود را سپری کرده در آن صورت انتظار می­رود که سلول‌های GE باقیمانده فقط تا این حد ظرفیت داشته باشند که مویی تولید کنند که حداکثر یک سوم طول موی نهایی باشد. با بهره گرفتن از رشد چرخه­ای دقیق و قابل پیش­بینی فولیکول ویبریسا، ما در اینجا نشان دادیم که مجموع کلی طول موی تولید شده به وسیله این سلول‌ها بسیار بیشتر از آن چیزی است که آن‌ها معمولا در طی هر دوره تولید می‌کنند. ما برای آزمایشات خود چند سپر اطمینان قرار دادیم چرا که پیشنهاد شده که در فولیکول ویبریسا در مراحل انتهایی فاز رشد (آناژن) نسل جدید سلول‌های GE ممکن است از ناحیه بالژ به سمت پایین حرکت کنند و برای شروع چرخۀ بعدی در بولب قرار گیرند (23). برای حذف این احتمال در اینجا همیشه سعی شد که عمل کنده شدن مو در میانه فاز رشد انجام گیرد و اجازه داده نمی­شد که فولیکول‌ها وارد فاز انتقالی (کاتاژن) گردند. به عبارت دیگر، این احتمال وجود نداشت که سلول‌های GE جدید قبل از عمل کندن به بولب وارد شده باشند. به علاوه، این موضوع نیز جالب بود که هنگامی که پس از آخرین بار کندن به فولیکول‌ها اجازه داده می‌شد که تا فاز رشد خود را تکمیل کنند، آن‌ها قادر بودند مویی تولید کنند که از نظر طول، شکل و پهنا با همتایان غیرآزمایشی خود تفاوتی را نشان نمی­دادند. هر چند که در این پژوهش ما حداکثر برای 6 بار عمل کندن را تکرار کردیم ولی هیچ دلیلی وجود ندارد که تصور کنیم این عمل بیش از این قابل انجام نیست و شاید اگر برای تمام طول حیوان این کار را انجام دهیم هم چنان این سلول‌ها قادرند که موی جدیدی تولید کنند. همچنین ممکن است این اشکال رفته شود که تکثیر سلول‌های GE بعد از کندن مو در حقیقت نوعی پاسخ به جراحت وارده است تا پتانسیل طبیعی آن‌ها. اما حتی اگر این هم درست باشد این ثابت می‌کند که این سلول‌ها توانایی­ و قابلیتی دارند که شبیه سلول‌های بنیادی است زیرا طبق تعریف یکی از ویژگی‌های سلول‌های بنیادی این است که آن‌ها قادرند به آسیب و جراحت وارده بر بافت پاسخ داده و از فاز استراحت وارد فاز تکثیر گردند (43). در همین راستا اخیرا نشان داده شده که سلول‌های زاینده اپیدرمی بولب در صورت پیوند شدن به ناحیه پشت موش‌های بدون تیموس می­توانند به تمام انواع سلول‌های پوستی و فولیکولی تمایز پیدا کنند (12، 44 و 45).

به طور خلاصه، ما با اتکا به این نتایج قصد نداریم این احتمال را رد کنیم که سلول‌های GE در فولیکول ویبریسا در طول حیات خود و تحت شرایط طبیعی دچار نوعی تجدید و نوسازی نمی‏شوند، بلکه ما نشان دادیم که حداقل در فولیکول ویبریسا، سلول‌های GE مستقر در ناحیه‏ی بولب فولیکول دارای یک ظرفیت تکثیری زیادی هستند که بسیار بیشتر از آن چیزی است که معمولا در هر چرخه‏ی رشد از خود نشان می‌دهند و بنابراین با توجه به قابلیت تکثیر آن‌ها در in vitro که قبلا نشان داده شد (46) و در in vivo که در این تحقیق آشکار شد و همچنین مطالعه‏ی اخیر که وجود جمعیتی از سلول‌های چند توانه را در ناحیه بولب گزارش کرده (8) به نظر غیرمحتمل می‏آید که این سلول‌ها از نوع سلول‌های تقسیم شونده‏ی موقتی باشند بلکه سلول‌هایی هستند که ویژگی‌های سلول‌های بنیادی را بروز می‌دهند.

نتیجه گیری

با توجه به نتایج نشان داده شده در این تحقیق و تحقیقات قبلی که توسط نویسندگان و دیگران صورت گرفته سلول‌های اپیدرمی واقع در انتهایی ترین ناحیه قاعده فولیکول ویبریسا در رت ویژگی‌هایی را به نمایش می‌گذارند که مشابه سلول‌های بنیادی بوده و با توجه به این ویژگی‌ها آن‌ها در گروه سلول‌های تقسیم شونده موقتی قرار نمی­گیرند و از این‌رو طول فاز رشد فولیکول‌های مذکور توسط قابلیت تکثیری این سلول‌ها تعیین و محدود نمی­گردد.

تشکر و قدردانی

بدین وسیله از زحمات سرکار خانم معصومه نجیب زاده برای انجام آنالیزهای آماری صمیمانه قدردانی می­گردد.

منابع

1. Noveen A, Jiang TX, Ting-Berreth SA, Chuong, CM. Homeobox genes Msx-2 are associated with induction of skin appendages, J. Invest. Dermatol. 1995; 104: 711-719.

2. Stenn KS, Combates NJ, Eilertson KJ, Gordon JS, et al. Hair follicle growth controls. Dermatologic Clinic. 1996; 14: 543-558.

3. Fuchs E. The Tortoise and the Hair: Slow-Cycling Cells in the Stem Cell Race. Cell. 2009; 137(5): 811-819.

4. Krause K, Foitzik K. Biology of hair follicle. Basics.  Seminars in Cutaneous Medicine and Surgery. 2006; 25(1): 2-10.

5. Messenger AG. The control of hair growth: an overview. J. Invest. Dermatol. (Suppl). 1993; 101(1): 4-9.

6. Blanpain C, Lowry WE, Geoghegan A, Polak L, et al. Self-Renewal, Multipotency, and the Existence of Two Cell Populations within an Epithelial Stem Cell Niche. Cell. 2004; 118: 635–648.

7. Hsu YC, Pasolli HA, Fuchs E. Dynamics between Stem Cells, Niche,and Progeny in the Hair Follicle. Cell. 2011; 144(1): 92-105.

8. Kopan R, Lee J, Lin MH,  Syder AJ, et al. Genetic Mosaic Analysis Indicates That the Bulb Region of Coat Hair Follicles Contains a Resident Population of Several Active Multipotent Epithelial Lineage Progenitors. Developmental Biology. 2002; 242: 44–57.

9. Zhang YV, Cheong J, Ciapurin N, McDermitt DJ, et al. Distinct self-Renewal and differentiation phases in the niche of infrequently dividing hair follicle stem cells. Cell Stem Cell. 2009; 5(3): 267–278.

10. Cotsarelis G, Cheng SZ, Dong G, Sun TT, et al. Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate: Implications on epithelial stem cells. Cell. 1989; 57: 201-209.

11. Sun TT, Cotsarelis G, Lavker RM. Hair follicle stem cells: the bulge activation hypothesis. J. Invest. Dermatol. (suppl). 1991; 96: 77-78.

12. Taylor G, Lehrer MS, Jensen PJ, Sun TT, et al. Involvement of Follicular Stem Cells in Forming Not Only the Follicle but Also the Epidermis. Cell. 2000; 102: 451-461.

13. Christiano AM. Hair Follicle Epithelial Stem Cells Get Their Sox On. Cell stem cell. 2008; 3: 3-4.

14. Tiede S, Kloepper JE, Bodo E, Tiwari S, et al. Hair follicle stem cells: walking the maze. European Journal of Cell Biology. 2007; 86(7): 355-376.

15. Yang JS, Lavker RM, Sun TT. Upper human hair follicle contains a subpopulation of keratinocytes with superior in vitro proliferative potential. J. Invest. Dermatol. 1993; 101: 652-659.

16. Morris RJ, Liu Y, Marles L, Yang Z, et al. Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nat. Biotechnol. 2004; 22(4): 411-417.

17. Rochat A, Kobayashi K, Barrandon Y. Location of stem cells of human hair follicles by colonal analysis. Cell. 1994; 76: 1063-1073.

18. Jahoda CAB, Oliver RF. Changes in hair growth characteristics following the wounding of vibrissa follicles in the hooded rat. J. Embryol. Exp. Morph. 1984; 83: 81-93.

19. Matsuzaki T, Inamatsu M, Yoshizato K. The upper dermal sheath has a potential to regenerate the hair in the rat follicular epidermis. Differentiation.1996; 60: 287-297.

20. Zhang Y, Xiang M, Wang Y, Yan J, et al. Bulge cells of human hair follicles: segregation, cultivation and properties. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2006; 47(1): 50-56.

21. Liu Y, Lyle S, Yang Z, Cotsarelis G. Keratin 15 promoter targets putative epithelial stem cells in the hair follicle bulge. J Invest Dermatol. 2003; 121(5): 963-968.

22. Ohyama M, Terunuma A, Tock CL, Radonovich MF, et al. Characterization and isolation of stem cellenriched human hair follicle bulge cells. J Clin Invest. 2006; 116(1): 249-260.

23. Kobayashi K, Rochat A, Barrandon Y. Segregation of keratinocyte colony-forming cells in the bulge of the rat vibrissa. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993; 90: 7391-7395.

24. Moll I. Proliferate potential of different keratinocytes of plucked human hair follicles. J. Invest. Dermatol. 1995; 105(1): 14-21.

25. Dunnwald M, Tomanek-Chalkley A, Alexandrunas D, Fishbaugh J, et al. Isolating a pure population of epidermal stem cells for use in tissue engineering. Exp Dermatol. 2001; 10(1): 45-54.

26. Amici AW, Yamato M, Okano T, Kobayashi K. The multipotency of adult vibrissa follicle stem cells. Differentiation. 2009; 77(3): 317-323.

27. Kaur P, Li A. Adhesive properties of human basal epidermal cells: an analysis of keratinocyte stem cells, transit amplifying cells, and postmitotic differentiating cells. J Invest Dermatol. 2000; 114(3): 413-420.

28. Strachan LR, Scalapino KJ, Lawrence HJ, Ghadially R. Rapid adhesion to collagen isolates murine keratinocytes with limited long-term repopulating ability in vivo despite high clonogenicity in vitro. Stem Cells. 2008; 26(1): 235-243.

29. Roh C, Tao Q, Photopoulos C, Lyle S. In vitro differences between keratinocyte stem cells and transit-amplifying cells of the human hair follicle. J Invest Dermatol. 2005; 125(6): 1099-1105.
30. Bassukas ID, Hornstein OP. Effects of plucking on the anatomy of the anagen hair bulb: A light microscopic study. Arch. Dermatol. Res. 1989; 281: 188-192.

31. Cotsarelis G, Sun TT, Lavker RM. Label-retaining cells reside in the bulge of the pilosebaceous unit: Implications for follicular stem cells, Hair Cycle, and Skin Carcinogenesis. Cell. 1990; 61: 1329-1337.

32. Ebling FGJ. The hormonal control of hair growth. In Hair and Hair diseases (Orfanos, C. and Happle, R.). Berlin, Springer-Verlag. 1990.

33. Reichrath J, Schilli M, Kerber A, Bahmer FA, et al. Hair follicle expression of 1,25-Dihydroxyvitamin D-3 receptors during the murine hair cycle. Brit. J. Dermatol. 1994; 131: 477-482.

34. Ibrahim L, Wright EA. The growth of rats and mice vibrissa under normal and some abnormal conditions. J. Embryol. Exp. Morph. 1975; 33: 831-844.

35. Oliver RF. Whisker growth after removal of dermal papilla and lengths of follicle in the hooded rat. J. Embryol. Exp. Morphol. 1966; 15: 331-347.

36. Gharzi A, Abbasi M, Jahoda CAB. Study of expression of α-SMA in dermal cells of skin appendages byimmunohistochemistry. Journal of Cell &Tissue. 2011; 1(2): 65-74 [in Persian].

37. Schneider, MR, Schmidt-Ullrich R,  Paus R. The Hair Follicle as a Dynamic Miniorgan. Current Biology. 2009; 19(3): 132-142.

38. Paus R. Control of the hair cycle and hair diseases as cycling disorders. Current Opinion in Dermatology. 1996; 3: 248-258.

39. Ohyama M. Hair follicle bulge: A fascinating reservoir of epithelial stem cells
Journal of Dermatological Science.2007; 46(2): 81-89.

40. Ibrahim L, Wright EA. The effect of single plucking at different times in the hair cycle on the growth of individual mouse vibrissa. Brit. J. Dermatol. 1978; 99: 365-370.

41. Reynolds AJ,  Jahoda CAB. Hair follicle reconstruction in vitro. J. Dermatological Science. 1994; 7: 84-97.

42. Cohen J. The transplantation if individual rat and guinea-pig whisker papillae. J. Embryol. Exp. Morph. 1961; 9: 117-127.