نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه پیام نور تفت، یزد ، ایران
2 دانشگاه علوم پزشکی شهید صدوقی یزد، مرکز تحقیقاتی و درمانی ناباروری، گروه بیولوژی و علوم تشریحی، یزد، ایران
3 دانشجوی دکتری زیست شناسی ژنتیک مولکولی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک، تهران، ایران
چکیده
هدف: هدف از این مطالعه بررسی اثرات مخرب دوزهای مختلف نانوذرات نقره بر پتانسیل باروری، ساختار کروماتین و DNA اسپرم اپیدیدیمی موش بود.
مواد و روشها: تعداد 24 موش نر سوری در چهار گروه 6 تایی شامل یک گروه کنترل و سه گروه مطالعه جهت تجویز دهانی نانوذرات نقره با دوزهای مختلف 50، 100 و 200 میکرو لیتر بر کیلوگرم در روز بهمدت 5 هفته در نظر گرفته شدند. سپس اسپرم های اپیدیدیمی برای آنالیز پارامترهای اسپرم به روشهای معمول میکروسکوپی و بر اساس معیارهای قانون WHO آسپیره شدند. تراکم کروماتین، شدت ناهنجاری و میزان پروتامین کروماتین اسپرم با سه روش سیتوشیمی مختلف بهترتیب شامل انیلین بلو، تولوئیدن بلو و کرومومایسین A3 ارزیابی گردیدند.
نتایج: نتایج نشان داد که سومین گروه (گروه دریافت کننده بالاترین دوز نانوذرات نقره) در مقایسه با گروه کنترل و سایر گروه های مورد بررسی دارای کمترین تعداد، کمترین درصد اسپرمهای با حرکت سریع و کمترین درصد اسپرم های با مورفولوژی نرمال بودند. گروه های II و III، اختلاف معنیداری را با سایر گروهها در میزان تراکم کروماتین و نقص پروتامین اسپرم نشان دادند.
نتیجه گیری: در این مطالعه، تاثیرات منفی نانو ذرات نقره بر پارامترها، ساختار کروماتین و DNAاسپرم موش، مشاهده گردید. تصور می‌شود که اثر منفی نانوذرات نقره بر کیفیت اسپرم قابل ملاحظه بوده و وابسته به دوز مصرفی میباشند.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Effects of Different Doses of Silver Nanoparticles on Sperm Parameters, Chromatin Structure and DNA Integrity in Mice
نویسندگان [English]
- M Y 1
- A T 2
- S R 1
- SA R 3
چکیده [English]
Aim: The aim of this study was to evaluate the negative effects of different doses of silvernanoparticles on fertility potential, chromatin structureand DNA integrity of epididymal sperm in mice.
Material and Methods: Twenty four male mice were divided into 4 groups (n=6) including one control and three experimental groups for orally administration of silver nanoparticles with three different doses (50, 100 and 200 μl/kg/day) for 5 weeks. Then, cauda epididymal spermatozoa were aspirated for analysis of sperm parameters using general microscopy methods and according to WHO criteria. Chromatin condensation, intensity of sperm chromatin abnormalities and protamine deficiency were assessed by three different cytochemical tests including aniline blue (AB), toluidine blue (TB) and chromomycin A3 (CMA3) tests respectively.
Results: Results showed that third group (treated with the highest silvernanoparticles dose), had the lowest sperm number, the lowest of sperm fast motility percentage and the lowest sperm percentage having normal morphology significantly in comparison with control and others groups. The II and III groups significantly showed differences in sperm chromatin condensation and deficiency comparing to other groups.
Conclusion: In this study the negative effect of silver nanoparticles on mice sperm parameters, sperm chromatin structure and DNA integrity were observed. It is believed that the negative effects of silver nanoparticles on sperm quality are significant and depend on used doses.
کلیدواژه‌ها [English]
- Silver nanoparticles
- Sperm parameters
- Chromatin
- DNA
- Mice
مقدمه
نانوذرات شامل ذرات جامد کلوئیدی با اندازههایی در محدوده 10 تا 100 نانومتر بوده که از دهها یا هزاران اتم تشکیل شده و بهعنوان یکی از پرکاربردترین مواد در دانش فناوری نانو بهشمار میروند (1). رفتار آنها عمدتا ناشی از اندازه بسیار کوچک آنها بوده و خواص فیزیکوشیمیایی همچون حلالیت، نفوذپذیری، میزان عبور نور، هدایت الکتریکی و توان مغناطیسی کنترل نشده ای در مقایسه با مواد مشابه خود ولی در مقیاس میکرونی دارند (2 و 3). شناسایی مولکولهای زیستی، انتقال هدفمند داروها، واکسنها و ژنها، درمان بیماریهایی نظیر سرطان، دیابت، ایدز، ترمیم آسیبهای عصبی و نخایی، ترمیم زخمها، افزایش عمر سلولهای مغزی و تولید مواد ضد میکروبی تنها بخش کوچکی از کاربردهای این مواد میباشند (4). خصوصیات مهم و ویژه نانوذرات نقره از قبیل تاثیر سریع، پایداری زیاد، قابلیت اضافه شدن به الیاف و پلیمرها و خاصیت ضد باکتری بالا باعث شده است که در اکثر صنایع از جمله صنایع غذایی مورد استفاده قرار گیرد. نقره در ابعاد نانو بر متابولیسم، تنفس و تولید مثل میکروارگانیسم‌ها اثر گذاشته بهطوریکه این مواد تاکنون بیش از 650 نوع باکتری شناخته شده را از بین برده اند (5، 6 و7). نانو ذرات نقره بهدو صورت پودر (کامپوزیت) و مایع (کلوئید) تولید می‌شود. در فناوری نانونقره، یونهای نقره بهصورت کلوئیدی در محلولی بهحالت سوسپانسیون قرار دارند که دارای خاصیت ضد باکتری، ضدقارچ و ضد ویروس میباشند (8 و 9).
علیرغم استفاده فراوان از نانوذرات و تلاشهای زیادی که بهمنظور نشان دادن ویژگیهای مطلوب نانو نقره در پزشکی صورت گرفته، هنوز اثرات بیولوژیکی این ذرات بر سلولها و اندامها بهطور کامل مشخص نمیباشد. تحقیقات بر روی حیوانات نشان میدهند که پس از استنشاق، بلع یا تزریق نانو ذرات نقره، این مواد میتوانند در پوست یا ریه رسوب کرده و سپس به جایگاههای ثانویه نظیر کبد، طحال، کلیهها، ماهیچهها، مغز، تخمدانها و بیضهها جابهجا شوند. بدیهی است که در این اعضا اثرات سمی مختلفی مشاهده گردیده است (10- 14).
در پژوهش دیگری که در زمینه اثرات مخرب نانوذرات نقره بر سیستم تناسلی مذکر صورت پذیرفته نشان داده شده است که این نانو ذرات قادرند بر سلولهای جنسی نر اثرات منفی گذاشته و قابلیت باروری اسپرم را بهطور معنیداری کاهش دهند (15 -20).
ناباروری مشکل عمده ای است که در 15 درصد از زوجها مشاهده شده و مطالعات آماری نشان داده اند که حدود 50 درصد از این موارد مربوط به فاکتور مردانه میباشد (21). رویکرد جدید ارزیابی ناباروری مردان بررسی عملکرد اسپرم و خصوصا ارزیابی کروماتین هسته اسپرم میباشد. از آنجائیکه گامتهای مرد حامل نیمی از ژنوم جنینی میباشند، هر گونه ناهنجاری در ساختار کروماتین اسپرم بر جنین تاثیر نامطلوب میگذارد. علاوه بر این، تراکم کروماتین اسپرم دارای نقش کلیدی در باروری مردان و نتایج اولیه باروری میباشد (22).
با توجه به کاربرد گسترده نانوذرات نقره در شاخههای مختلف پزشکی، صنایع غذایی و لوازم آرایشی بهنظر میرسد که بررسی اثرات منفی این مواد بر بافتهای مختلف، بهویژه ارگانهای تولیدمثلی و سلولهای اسپرمی حائز اهمیت میباشد. لذا هدف از این تحقیق بررسی اثرات مخرب دوزهای مختلف نانوذرات نقره بر پتانسیل باروری، ساختار کروماتین و DNA اسپرم اپیدیدیمی در حیوان آزمایشگاهی موش میباشد.
مواد و روشها
نانو ذرات نقره به ابعاد 40 نانومتر بهصورت محلول با غلظت 4-10× 43/1 مولار و وزن 79/0 میلیگرم بر لیتر10 سنتز شده از پژوهشکده علوم پایه نانوفناوری دانشگاه پیام نور استان یزد تهیه گردید.
بهمنظور انجام این مطالعه تجربی، 24 سرموش نر بالغ از نژاد سوری به 4 گروه 6 تایی شامل گروه کنترل و 3 گروه تجربی تقسیم شده و در شرایط کنترل شده درجه حرارت 20 تا 25 درجه سانتیگراد، رطوبت حدود 55 تا 60 درصد با دوره نوری 12ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی با دسترسی آسان به آب و غذای کامل طبق ضوابط قانون نگهداری از حیوانات آزمایشگاهی نگهداری شدند. موشهای گروه مطالعه بهمدت 35 روز (بیش از یک دوره اسپرماتوژنز) روزانه مورد تجویز دهانی نانوذرات نقره از طریق گاواژ قرار گرفتند. گروه مورد مطالعه اول، دوم و سوم هر روز بهترتیب دوز 50، 100 و 200 میکرولیتر بر کیلوگرم نانوذرات نقره محلول و گروه کنترل تنها سرم فیزیولوژی بهصورت دهانی دریافت مینمودند.
پس از این مدت، موشها اندازه گیری وزنی شده و سپس توسط اتر بیهوش گردیدند. جهت بررسی پارامترهای اسپرمی، ناحیه شکم موشها برش داده شد و دم اپیدیدیم که در قطب تحتانی هر بیضه قابل مشاهده میباشد، توسط قیچی استریل بریده شده و در محیط کشت serum-free medium for Chinese Hamster ovary cellsیا HamsF10 قرار گرفت. سپس با فشردن و تکان دادن آرام، سلولهای اسپرم بهصورت شناور وارد محیط کشت شدند. قطعات اضافی اپیدیدیم از داخل ظرف برداشته شده و این محیط کشت حاوی سوسپانسیون اسپرم بهمدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد با فشار CO2 5 درصد انکوبه گردید. بعد از انکوباسیون، مقدار 10 میکرولیترسوسپانسیون حاوی اسپرم توسط سمپلر برداشته شده و مورد آنالیز قرار گرفتند (23).
الف) پارامترهای اسپرم: مطالعه مورفولوژی اسپرمها با استفاده از دستورالعمل استاندارد رنگ آمیزی پاپانیکولا انجام شد (24). این نوع رنگ آمیزی یکی از روشهای معمول برای بررسی مورفولوژی اسپرم میباشد که در آن نواحی آکروزوم و بخش سر و قطعه میانی اسپرم رنگ آمیزی میگردد، بهطوریکه ناحیه سر آبی و بخش قطعه میانی قرمز یا صورتی رنگ می‌شود. پس از رنگ آمیزی اسپرم، اشکال طبیعی و غیرطبیعی اسپرم، در زیر میکروسکوپ با بزرگنمایی ×100 مورد بررسی قرار گرفتند. اشکال غیرطبیعی اسپرم شامل اسپرمهایی با دو سر بزرگ، سر کوچک، سر گرد، بدون آکروزوم، سر سنجاقی، دم بلند یا کوتاه، بدون دم و یا دم پیچ خورده و قطره سیتوپلاسمی میباشند.
مطالعه حرکت (motility) اسپرمها بر اساس معیارهای (WHO) World Health Organization انجام گردید. برای بررسی تحرک اسپرمها، مقدار 10 میکرولیتر از هر نمونه را در مرکز Makler chamber قرار داده و پس از گذاشتن درپوش توسط میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی ×40 مشاهده و شمارش گردید. در این بررسی، تعداد 200 سلول مورد شمارش قرار گرفته و از این تعداد درصد تحرک اسپرم بر اساس دستورالعمل سازمان بهداشت جهانی (WHO) مشخص شد (25 و 26). در این بررسی، اسپرمها را به گروههای متحرک با حرکت پیش رونده سریع (نوع a)، متحرک با حرکت پیش رونده آهسته (نوع b)، اسپرمهای متحرک به فرم درجا (نوع c) و بدون تحرک (نوع d) گروهبندی شدند.
مطالعه قابلیت حیات (Viability) اسپرم بهروش سیتوپلاسمی و با استفاده از رنگ آمیزی ائوزین و توسط میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی ×40 انجام گردید (26 و 27). اسپرمهای زنده بهدلیل سالم بودن غشا سیتوپلاسمی رنگ ائوزین وارد شده بهداخل سلول را مجددا خارج میکنند و بنابراین در زیر میکروسکوپ بدون رنگ قابل مشاهده هستند. در حالیکه که اسپرمهای مرده بهدلیل غشا آسیب دیده رنگ وارد شده بهداخل سلول را حفظ نموده لذا بعد از شستشو همچنان بهصورت رنگی مشاهده میشوند.
ب) مطالعه ساختار کروماتین و DNA اسپرم:
1- رنگ آمیزی آنیلین بلو Aniline Blue جهت مطالعه میزان تراکم کروماتین اسپرم استفاده گردید (23، 28 و29). رنگ آنیلین بلو اسیدی، بهطور خاص وجود هیستونهای اضافی را در ساختار کروماتین اسپرم نشان میدهد. طی جابهجایی هیستونها با پروتامین و تراکم کروماتین در مرحله اسپرمیوژنز، اسپرمهای طبیعی رنگ آنیلین بلو را به خود نگرفته، ولی اسپرمهایی که تراکم ناقص دارند یا بلوغ کافی را طی نکرده اند، این رنگ را بهخود میگیرند.
2- رنگ آمیزی تولوئیدن بلو Toluidine Blue جهت تخمین شدت ناهنجاری کروماتین اسپرم استفاده گردید (23، 28 و30). تولوئیدن بلو، یک رنگ متاکروماتیک بوده که برای تعیین کیفیت و کمیت تراکم کروماتین هسته و میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم، از طریق پیوند با گروههای فسفات رشتههای DNA آسیب دیده استفاده می‌شود. در این تست، هرچه میزان تراکم کروماتین کمتر باشد، رنگ پذیری DNA توسط تولوئیدن بلو افزایش مییابد. بنابراین طیفی از رنگ بین آبی روشن (اسپرم با کروماتین نرمال)، آبی تیره (اسپرم با کروماتین کمی ناهنجار)، بنفش (اسپرم با کروماتین ناهنجار) و بالاخره ارغوانی (اسپرم با کروماتین بسیار ناهنجار) قابل تشخیص میباشد.
3- رنگ آمیزی کرومومایسین A3 برای بررسی بلوغ هسته اسپرم و نقص کروماتین اسپرم (CMA3) استفاده گردید (23، 28 و30). کرومومایسین یک فلوروکروم بوده که با مولکول پروتامین برای اتصال به شیار کوچک DNA دو رشته ای رقابت میکند. طی روند اسپرماتوژنز قسمت عمده هیستونها با پروتامین جابهجا شده تا کروماتین اسپرم متراکم شود. اسپرمهایی با نقصان پروتامین توسط CMA3 رنگ میگیرند و ضمن بررسی با میکروسکوپ فلورسنت به رنگ زرد درخشان دیده میشوند. این اسپرمها در واقع اسپرمهایی با کروماتین نابالغ محسوب میگردند. بنابراین رنگ آمیزی کرومومایسین یک روش حساس و مفید برای بررسی وضعیت تراکم کروماتین و بررسی محتوای پروتامین بهطور غیر مستقیم میباشد.
آنالیز آماری: برای انجام محاسبات آماری از نرم افزار آماری SPSS 17 استفاده شد. میانگین تمام پارامترها بهصورت Mean±SD و سطح معنیدار 05/0p< نشان داده شد. مقایسه میانگین غلظت کیفیت پارامترهای اسپرمی در بین تمام گروهها با استفاده از تست ANOVA و بین دو گروه با آزمون Tukey مورد ارزیابی قرار گرفت.
نتایج
در بررسی وزن موشها قبل و بعد از تیمار با نانوذرات نقره، تفاوت معنیداری در بین گروهها مشاهده نگردید. مقایسه میانگین تعداد اسپرمها بین گروههای مختلف، تفاوت معنیداری را نشان داد (05/0p<). بهطوریکه حیوانات گروه مطالعه سوم، که بیشترین دوز مصرفی نانوذرات نقره را دریافت کرده بوند، کمترین میانگین تعداد اسپرم در مقایسه با گروه کنترل و حتی در مقایسه با گروههای مورد مطالعه اول و گروه دوم را دارا بودند (جدول1).
جدول 1: مقایسه میانگین پارامترهای اسپرم در گروههای مختلف
|
پارامترهای اسپرم |
گروه کنترل (n=6) |
گروه مطالعهa (n=6) |
گروه مطالعه b (n=6) |
گروه مطالعه c (n=6) |
p- value abc |
p-valueab |
p-valueac |
p-valuebc |
|
تعداد اسپرم (/ml106 ×) |
27±3.5 |
23.66±8 |
21.00±3.6 |
17.00±3.5 |
*0.004 |
0.897 |
*0.008 |
0.053 |
|
اسپرمهای زنده (%) |
64.6±3.7 |
61.1±4.8 |
51.8±7.5 |
52.4±8.32 |
*0.029 |
0.027 |
0.661 |
0.219 |
|
حرکت پیشرونده سریع (%) |
35.83±4.49 |
49±8.14 |
37.6±4.33 |
18.16±5.45 |
*0.000 |
*0.005 |
*0.000 |
*0.000 |
|
حرکت پیشرونده آهسته (%) |
33.5±2.34 |
22.33±5.64 |
15.6±2.51 |
22.33±5.68 |
*0.000 |
*0.019 |
1.000 |
*0.019 |
|
متحرک به فرم درجا (%) |
19.16±4.7 |
16.83±3.54 |
28.2±3.11 |
44±5.83 |
*0.000 |
*0.001 |
*0.000 |
*0.000 |
|
اسپرمهای بی حرکت (%) |
11.5±2.88 |
11.66±3.38 |
18.4±5.22 |
17±3.28 |
*0.009 |
*0.007 |
*0.022 |
0.541 |
|
اسپرمهای با مورفولوژی طبیعی (%) |
70.83±5.47 |
69.17±3.6 |
64.67±3.8 |
64.17±5.6 |
0.192 |
0.262 |
*0.027 |
0.973 |
گروه دریافت کننده دوز 50 میکرولیترنانو ذرات نقره = a
گروه دریافت کننده دوز 100 میکرولیتر نانو ذرات نقره = b
گروه دریافت کننده دوز 200 میکرولیتر نانو ذرات نقره =c
مقایسه میانگین درصد حرکت پیش رونده سریع اسپرمها بین گروههای مختلف تفاوت معنیداری را بین گروهها نشان داد. میانگین درصد اسپرمهایی با حرکت پیش رونده سریع در گروه مورد مطالعه 3 بهطور معنیداری کمتر از سایر گروهها بود. از طرفی درصد حرکت پیش رونده سریع در گروه مورد مطالعه 1 در مقایسه با سایر گروهها و حتی گروه کنترل بهطور معنیداری بیشتر بوده، ولی تفاوت معنیداری بین گروه کنترل و گروه 2 مشاهده نشد. مقایسه میانگین درصد حرکت پیشرونده آهسته اسپرمها نیز، تفاوت معنیداری را بین گروهها نشان داد. میانگین درصد حرکت پیشرونده آهسته در گروه کنترل در مقایسه با سایر گروهها بهطور معنیداری بیشتر بوده است. تفاوت معنیداری بین گروههای مورد مطالعه 3 و 2 مشاهده نشد. همچنین درصد اسپرمهای با حرکت آهسته در گروه مورد مطالعه 3 و 1 بهطور معنیداری بیشتر از گروه 2 بوده است. مقایسه میانگین درصد حرکت اسپرمها بهفرم غیرطبیعی درجا نیز، تفاوت معنیداری را بین گروهها نشان داد. میانگین درصد حرکت غیرطبیعی بهفرم درجا در گروه 3 در مقایسه با سایر گروهها بهطور معنیداری بیشتر بوده است. درحالی که گروه کنترل بهطور معنیدارای کمترین میانگین درصد اسپرمهای متحرک بهفرم درجا در مقایسه با گروه 2 و گروه 3 داشت. تفاوت معنیداری بین گروه کنترل و گروه 1 مورد مطالعه مشاهده نشد. اختلاف معنیداری از لحاظ درصد اسپرمهای بیتحرک بین گروهها مشاهده شد. گروه مورد مطالعه 2 و 3 بهطور معنیداری دارای بیشترین درصد اسپرمهای بی حرکت در مقایسه با گروههای کنترل و گروه مورد مطالعه 1 بودند. تفاوت معنیداری بین گروههای مورد مطالعه 2 و 3 دیده نشد (جدول1). مقایسه مورفولوژی اسپرمها بین گروههای مختلف نشان داد که درصد اسپرمهای غیرطبیعی در گروههای مورد مطالعه، بهویژه گروههای دریافت کننده دوزهای بالاتر نانوذرات نقره بیشتر بوده، هر چند که این اختلاف چندان معنیدار نبوده است (جدول1). مقایسه آنالیز میانگین درصد قابلیت حیات اسپرمها، تفاوت معنیداری را بین گروههای مختلف نشان داد. در این میان گروه مورد مطالعه دوم و سوم کمترین درصد اسپرمهای زنده را در مقایسه با گروه کنترل داشتند. البته تفاوت معنیداری بین درصد اسپرمهای زنده در گروه کنترل و گروه اول مشاهده نگردید (جدول1).
جدول 2 و شکلهای 1 و 2 نشان دهنده تغییرات ساختار کروماتین در گروههای مختلف میباشد. آنالیز دادههای رنگآمیزی آنیلین بلو نشان داد که تفاوت معنیداری بین گروههای دریافت کننده دوزهای متوسط و بالای نانوذرات نقره وجود داشته و بیشترین درصد اسپرمهای نابالغ مربوط به گروهی که 200 میکرولیتر نانوذره نقره را دریافت کرده بودند، میباشد. در رنگ آمیزی تولوئیدین بلو، فقط گروههای دریافت کننده دوزهای 100 و 200 میکرولیتر نانوذره نقره تفاوت معنیداری را با سایر گروهها نشان دادند (001/0 p≤) ولی در گروه50 میکرولیترتفاوت معنیداری مشاهده نشد. مقایسه دادههای مربوط به رنگ آمیزی کرومومایسین A3 نشان داد که در بین گروههای مختلف دریافت کننده دوز و همچنین بین این گروهها و گروه کنترل کرده بودند، تفاوت بهصورت معنیدار بود.
جدول 2: مقایسه میانگین اسپرمهایی با کروماتین نابالغ در گروههای مختلف
|
رنگ آمیزی کروماتین |
گروه کنترل (n=6) |
گروه مطالعه a (n=6) |
گروه مطالعه b (n=6) |
گروه مطالعه c (n=6) |
p- value abc |
p-value ab |
p-value ac |
p-value bc |
|
تولوئیدن بلو |
10.7±1.3 |
10±1.1 |
15.9±1.3 |
20±3.5 |
0.264 |
0.278 |
0.000 |
0.055 |
|
آنیلین بلو |
8.5±1.1 |
9±0.7 |
11.4±1.2 |
14.5±2.1 |
0.062 |
0.076 |
0.021 |
0.042 |
|
کرومومایسین A3 |
25±6.4 |
28.2±3.5 |
46.5±2.1 |
68.5±5.7 |
0.021 |
0.035 |
0.000 |
0.001 |
گروه دریافت کننده دوز 50 میکرولیترنانو ذرات نقره = a
گروه دریافت کننده دوز 100 میکرولیتر نانو ذرات نقره = b
گروه دریافت کننده دوز 200 میکرولیتر نانو ذرات نقره =c
شکل1: رنگ آمیزی کرومومایسین A3 اسپرم. گروه تحت تیمار با نانو ذرات نقره دارای درصد بیشتری از اسپرم با رنگ زرد درخشان بههمراه نقص پروتامین میباشند (بزرگنمایی ×100 ).
شکل 2: رنگ آمیزی آنیلین بلو اسپرم. گروه تحت تیمار با نانوذرات نقره دارای درصد بالایی از اسپرمهای بنفش رنگ با هیستون اضافی میباشند (بزرگنمایی ×100).
بحث
اگرچه نانوذرات نقره بهصورت گسترده در محصولات مصرفی بهکار میرود، اطلاعات سم شناسی کافی در مورد آنها در دسترس نمیباشد. یکی از مسیرهای ورود نانوذرات، دهانی یا خوراکی است که ممکن است در مورد بسیاری از محصولات مصرفی مثل خمیردندانها, بطریهای قابل بازیافت، پستانک بچه، لوازم آشپزخانه و اسباب بازیها مهم باشد.
در بررسی متون مطالعهای مبنی بر اثر این نانوذرات نقره بر ساختار کروماتین اسپرم مشاهده نگردید و لذا نتایج این مطالعه برای اولین بار گزارش میگردد. دراین پژوهش، ما تلاش کردیم تا اثرات پاتولوژیک نانوذرات نقره 40 نانومتری با دوزهای مختلف را بر پارامترهای اسپرم از جمله تعداد، قابلیت حیاتی، حرکت و مورفولوژی اسپرمها، همچنین بر روی پارامترهای ساختار کروماتین و DNA اسپرم موش سوری بررسی نماییم. سمیت نانو ذره نقره که بهصورت خوراکی در دوزهای 05/0، 1/0 و 2/0 میلیلیتر (50 ، 100 و 200 میکرولیتر) به موشها داده شد، در مقایسه با گروه کنترل مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج مطالعه تاثیرات منفی نانو ذرات نقره بر پارامترها، ساختار کروماتین و DNA اسپرم موش را نشان داد. همچنین بررسی دادهها نشان داد که تغییرات ایجاد شده توسط این نانو ذرات در پارامترها و همچنین ساختار کروماتین اسپرم وابسته به دوز مصرفی میباشد. در راستای یافتههای تحقیق حاضر، در مطالعهای نسبتا مشابه ضمن بررسی اثر نانوذرات نقره بر میزان اکسیداسیون DNA و پارامترهای اسپرمی نشان داده شده است که افزایش اکسیداسیون DNA و تغییر مورفولوژی مجاری اسپرم ساز در گروههای تیمار شده با نانوذرات نقره بهمیزان معنیداری بالاتر از گروه کنترل بوده است. لازم بهذکر است که در این پژوهش تغییری در تعداد اسپرمهایی با مورفولوژی غیرطبیعی بین گروهها مشاهده نشد (31).
همانطور که در بخش مقدمه عنوان گردید، نانوذرات فلزی دارای اثرات مخربی بر سیستمهای بیولوژیکی و بافتهای مختلف بدن میباشند. در پژوهشی که توسط رضایی زارچی و همکاران (12)، بر روی 50 سر موش صحرایی نر بالغ انجام گرفت نشان داده شد که نانوذرات نقره 70 نانومتری در دوز بالا، اثرات پاتولوژیکی (خونریزی، آپوپتوزیس و نکروزیس) بیشتری را در بافت ریه نسبت به مصرف دوزهای پایین ایجاد مینماید. در این مطالعه اثر نانوذرات نقره بر بافت ریه قابل ملاحظه بود و تغییرات حاصله نشانگر آسیبهای سلولی و بافتی بودند. در مطالعهای دیگر، رضایی زارچی و همکاران (11)، اثر نانوذرات نقره بر سلولهای خونی موش را بررسی نمودند. نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که نانوذرات نقره در دوزهای بالا (200 میلیگرم بر کیلوگرم) منجر به مهار فرآیند لختگی توسط پلاکتها در خون و در نتیجه افزایش زمان خونریزی می‌شود. علاوه بر این نتایج آنها نشان داد که تعداد سلولهای خونی از جمله تعداد سلولهای سفید و قرمز، غلطت هموگلوبین، تعداد نوتروفیل و لنفوسیت بهطور معنیداری در مقایسه با گروههای کنترل تغییر کرده است. مقصود احمد و همکاران (32)، در مطالعهای آسیبهای DNA را در سلولهای پستانداران بررسی نمودند. نتایج مطالعه آنها نشان داد که نانوذرات نقره پوشش دار آسیب شدیدتری را نسبت به نانوذرات بدون پوشش ایجاد نموده و ذرات پوشش پلی ساکاریدی بهطور ویژه بهمیزان بیشتر توزیع شده بودند، در حالیکه تراکم ذرات بدون پوشش محدود به سطوح در دسترس و غشای اندامکها میباشد.
مطالعات متعددی اثر نانوذرات فلزی را بر توانایی باروری و عملکرد اسپرم را مورد بررسی قرار داده اند. در تایید نتایج تحقیق حاضر، Talebi و همکاران (33)، در یک مطالعه اثر نانوذرات اکسید روی با سه غلظت 5 ، 50 و 300 میلی گرم بر کیلوگرم بر اسپرماتوژنز موش را بررسی نمودند. نتایج حاصل از مطالعه آنها نشان داد که نانوذرات اکسید روی موجب آسیب رساندن به بافت بیضه شده و این آسیبها وابسته به دوز مصرفی نانوذرات میباشند. حضور واکوئلهایی در سیتوپلاسم سلولهای سرتولی که نشانگر آسیب مستقیم به این سلولها بوده و همچنین تشکیل سلولهای بسیار بزرگ چند هستهای- که عمدتا از سلولهای اسپرماتوگونی که ارتباطشان را با سلولهای سرتولی از دست دادهاند از نتایج تحقیق مذکور میباشند. همچنین در طی بررسی پارامترهای اسپرم، شامل تعداد، تحرک و درصد اسپرمهای با اشکال غیر طبیعی، در گروههایی که نانوذرات اکسید روی با دوز بالا را مصرف کرده بودند، بهطور معنیداری افزایش یافته بود. میر شکرایی و همکاران (18)، در یک آزمایش in vitroکه بر روی اسپرم 8 راس قوچ نژاد بختیاری انجام دادند، اثر کلوئید نانوذرات نقره را بر پارامترهای اسپرم قوچ مورد بررسی قرار دادند. بر طبق نتایج این آزمایش، کلوئید نانوذرات نقره بر خصوصیات اسپرم بهخصوص پارامترهای تحرک اثرات منفی داشته که این امر میتواند شاهدی بر این ادعا باشد که نانوذرات نقره میتواند میزان باروری اسپرم متاثر سازد.
گروه تحقیقاتی Gromadzka-Ostrowska(17)، اثرات حاد تجویز داخل وریدی یک دوز واحد از نانوذرات نقره را بر روند اسپرماتوژنز و مورفولوژی لولههای منیساز موشهای صحرایی مورد بررسی قرار دادند. نتایج نشان داد که کاهش معنیداری در تعداد اسپرمهای اپیدیدیمی در موشهای صحرایی تحت تیمار صورت گرفته و این اثرات وابسته به دوز و وابسته به زمان میباشند. همچنین تزریق نانوذرات نقره سبب افزایش سطح آسیب به DNA در سلولهای زاینده گردیده که با تست کامت قابل اندازه گیری میباشد. بررسیهای بافت شناسی، تغییرات مورفولوژی لولههای اسپرم ساز بیضههای موشهای صحرایی دریافت کننده 200 نانومتری بهمراتب بیشتر از تغییرات مورفولوژیکی در گروه مصرف کننده نانوذرات نقره 20 نانومتری گزارش گردید. در مطالعه ای دیگر که توسط Baki و همکاران (19) صورت پذیرفت، اثرات نانو ذرات نقره بر تعداد سلولهای اسپرم، تعداد سلولهای لایدیگ و سطح هورمونهای جنسی تستوسترون، هورمون لوتینی ((LH و هورمون محرک فولیکولی ((FSH مورد بررسی قرار گرفت. نتایج آنها نشان داد که تعداد سلولهای لایدیگ در گروههای مورد مطالعه به ویژه گروههای دریافت کننده دوز 200 میلیگرم بر کیلوگرم نانوذرات نقره بهطور معنیداری کاهش یافته بود. از طرفی غلظت هورمون تستوسترون و هورمون LH بهترتیب بهطور معنیداری کم و زیاد شد، هر چند تغییر معنیداری در غلظت FSH مشاهده نشده بود. از طرفی کاهش معنیداری در تعداد، مورفولوژی طبیعی و درصد اسپرمهای متحرک مشاهده گردید که با نتایج حاصل از تحقیق ما قابل مقایسه بودند. گروه تحقیقاتی Miresmaeili (20) نیز در مطالعهای که با هدف ارزیابی نقش نانوذرات نقره بر واکنش آکروزومی و سلولهای اسپرماتوگونی، بر روی موشهای صحرایی که نانوذرات نقره 70 نانومـتری بهصورت خوراکی دریافت کرده بودند، انجام شد، نشان دادند که نانوذرات نقره اثرات منفی بر واکنش آکروزومی اسپرم داشته و همچنین بهطور معنیداری باعث کاهش تعداد سلولهای اسپرماتید و اسپرماتوسیتهای اولیه می‌شود ولی بر تعداد سلولهای سرتولی تاثیر معنیداری ندارد. لارم بهذکر است که با توجه به اثرات بیولوژیکی مشابهی که توسط نانوذرات نقره و نانوذرات روی بر سلولها و بافتهایی نظیر بیضه اعمال می‌شود میتوان نتیجه گرفت که احتمالا مکانیسم عمل این دو نوع نانوذره فلزی مشابه میباشد (19، 33 و 34).
در بیان مکانیسم ایجاد ضایعات DNA و کروماتین اسپرم بهدلیل مصرف نانوذرات نقره میتوان گفت که مطالعات نشان دهنده افزایش رادیکالهای آزاد توسط نانوذرات فلزی همچون نانوذرات نقره میباشند (34). با توجه به اینکه نانوذرات نقره با مکانیسمهای متعددی سبب افزایش سطح رادیکالهای آزاد میگردند، بنابراین انتظار میرود که درصد اسپرمهایی با کروماتین و DNA آسیب دیده و جهش یافته نیز در حیوانات مورد آزمایش افزایش یابد. لازم بهذکر است که این وضعیت میتواند سبب بروز آسیبهای متعددی در نسل های آینده شود (16). گونههای اکسیژن واکنشپذیر (ROS)، واسطههای شیمیایی با نیمه عمر پائینی هستند که در مسیرهای متابولیکی همه سلولهای هوازی از اکسیژن مشتق میشوند. رادیکالهای آزاد بهخاطر داشتن الکترون جفت نشده بسیار واکنشپذیر بوده و قادرند برای جبران کمبود اکسیژن خود، ماکرومولکولهای زیستی نظیر آمینواسیدها یا پروتئینها، قندها، لیپیدها و اسیدهای نوکلئوئیک را مورد حمله قرار داده و با آسیب شدید ساختار و عملکرد سلولی نهایتا سبب مرگ زودرس سلولی میگردند (35). در مطالعه حاضر نیز اگرچه میزان رادیکالهای آزاد مورد اندازه گیری قرار نگرفت ولی با توجه به مطالعات قبلی ما و دیگر محققین میتوان علت اصلی ناهنجاریهای کروماتین و DNA اسپرم را استرس اکسیداتیو دانست.
نتیجه گیری
تحقیق ما نشان داد که موشهای دریافت کننده نانوذرات نقره بهطور چشم گیری دارای اسپرمهایی با کیفیت پائینتر در مقایسه با گروه کنترل بوده و این کاهش وابسته به دوز میباشد. همچنین مطالعه حاضر نشان داد که مسمومیت با نانوذرات نقره سبب تولید اسپرمهایی با کروماتین نابالغ گردیده که این امر بهنوبه خود میتواند سبب کاهش پتانسیل باروری گردد.
لذا، اثر نانوذرات نقره بر روی پارامترهای اسپرمی و کاهش قدرت باروری میتواند بهعنوان یکی از موضوعات اساسی در نظر گرفته شده و بهعنوان یک زنگ خطر برای نسلهای آینده محسوب گردد. اگرچه امروزه با پیشرفت تکنیکهای مختلف، اغلب مردان نابارور میتوانند صاحب فرزند شوند، اما احتمال اینکه اسپرم غیر طبیعی (مثلا اسپرمی که در یک یا چند ژن خاص دچار جهش شده باشد) بهصورت مصنوعی در بارورسازی تخمک شرکت نماید، وجود دارد. بنابراین بررسی و محدودیت استفاده از نانوذرات نقره در زمینههای مختلف از اهمیت خاصی برخوردار بوده و بهعنوان یکی از فاکتورهای اساسی موثر بر توانایی باروری مورد بررسی قرار گیرد. تحقیقات بیشتر، درک مکانیسم دقیق روند تاثیر نانوذرات بر بافتهای مختلف را روشن خواهد ساخت.
تشکر و قدردانی
با تشکر از همکاریهای بی شائبه اساتید و همکاران پژوهشکده علوم پایه و فناوری نانو تکنولوژی دانشگاه پیام نور، مرکز درمانی و تحقیقاتی ناباروری و گروه فیزیولوژی دانشگاه علوم پزشکی شهید صدوقی یزد که در مراحل مختلف این تحقیق همکاری داشتند.
)