نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم زیستی، گروه علوم جانوری، تهران، ایران
2 دانشگاه آزاد اسلامی تهران، واحد علوم تحقیقات، ، تهران، ایران
3 دانشجوی کارشناسی ارشد زیست شناسی سلولی تکوینی، دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم زیستی، گروه علوم جانوری، تهران، ایران
چکیده
هدف: در این مطالعه تجربی اثر عصاره هیدروالکلی هسته انگور بر سندرم تخمدان پلی کیستیک در رت ماده نژاد ویستار مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روشها: در این مطالعه تجربی ۳۰ سر موش صحرایی به ۶ گروه شامل کنترل، پلی کیستیک و 4 گروه تجربی تقسیم شدند. چهار گروه تجربی با تزریق درون صفاقی عصاره هسته انگور (دوزهای 50، 75، 100، 200 میلیگرم بر کیلوگرم بهمدت 10 روز) تیمار شدند. تخمدان پلی کیستیک با روش تزریق زیر پوستی 2 میلیگرم هورمون استرادیول والرات در رتهای بالغ القا شد. تخمدانهای کلیه گروهها خارج شد، در فیکساتور بوئن تثبیت گردید و برشهای 5 میکرومتری با هماتوکسیلین – ائوزین رنگ آمیزی شدند.
نتایج: نتایج کاهش معنیداری را در تعداد فولیکولهای بدوی، اولیه، پره آنترال، گراآف و جسم زرد درگروه پلی کیستیک در مقایسه با کنترل نشان داد (05/0>P). اندازهگیری ضخامت لایه گرانولوزا و تک , قطر فولیکولهای مختلف و تعداد آنها بهبود زیادی را در گروههای PCOS تیمار شده با عصارة هیدروالکلی هسته انگور نشان داد. دوزهای ۵۰ و ۷۵ میلیگرم بر کیلوگرم بهعنوان دوزهای موثر در نظر گرفته شدند.
نتیجه گیری: بر اساس نتایج این پژوهش میتوان نتیجه گرفت که عصارة هیدروالکلی هسته انگور میتواند در بهبود علائم سندرم تخمدان پلی کیستیک مؤثر واقع شود.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Effect of hydroalcoholic grape seed extract (Vitis vinifera) on polycystic ovarian syndrome in female Wistar rat
نویسندگان [English]
- H M 1
- K P 2
- Z S 3
چکیده [English]
Aim: In this experimental study effect of grape seed extract on polycystic ovarian syndrome (PCOS) in female Wistar rats, were assessed. Material and Methods: In this experimental study 30 rats were divided into 6 groups including control, the PCOS and four experimental groups. Four experimental groups were treated with intrapritoneal injection of grape seed extract (doses 50, 75, 100, 200 mg/kg for 10 days). Polycystic ovary was induced by subcutaneous injection of 2 mg estradiol valerate in adult rats. Ovaries of all groups were removed, fixed in Bouin’s fixative and 5 µm sections were stained using Hematoxylin–Eosin. Results: Results showed a significant decrease in the number of primordial, primary, preantral, Graafian follicles and corpus luteum in PCOS group with comparison with control (p < 0.05). Measuring granulosa layer and theca thickness, various follicles diameters and their numbers showed much improvement in treated PCOS groups with hydroalcoholic grape seed extract. Fifty and seventy five mg/kg doses were considered as effective doses. Conclusion: According to this study results, it can be concluded that hydroalcoholic grape seed extract can improve the symptoms of polycystic ovarian syndrome.
کلیدواژه‌ها [English]
- Estradiol valerate
- Corpus loteum
- Polycystic ovarian syndrome
- Hydroalcoholic Grape seed extract
مقدمه
سندرم تخمدان پلی کیستیک(polycystic ovarian syndrome, PCOS) شایعترین اختلال غدد درون ریز جنسی در زنان است که ۵ تا۱۰ درصد از زنان را شامل میشود. ناباروری بهعلت اختلال بلوغ فولیکول و تخمکگذاری و تخمدانهای پر از کیست و هیپرآندروژنیسم همراه با ناهنجاریهای متابولیک شامل چاقی، هیپرانسولینما، افزایش خطر ابتلا به دیابت نوع۲ و بیماریهای قلبی و عروقی است (۱).PCOS اغلب با اختلالات فیزیولوژیکی شامل افسردگی و بیماریهای روحی دیگر و اختلالات متابولیکی عمدتا مقاومت به انسولین و هیپر انسولینما، که بهعنوان یک فاکتور اصلی مسئول تغییر در تولید آندروژن و متابولیسم تشخیص داده شده است همراه است. اغلب زنان مبتلا به PCOS اضافه وزن یاچاقی دارند (۲). از علائم دیگر سندرم PCOS هیپراندروژنیسم، ترشح زیاد هورمون زرده ای LH) Luteinizing Hormone- (، کمبود هورمون محرک فولیکولی Stimulating Hormone-FSH) Follicle (، اختلال قاعدگی، پرمویی، ناباروری، عدم تخمکگذاری و افزایش فشار خون میباشد. اختلال بلوغ تخمک و عدم شایستگی رشد و نمو جنینی در زنان مبتلا به PCOS با غدد درون ریز غیر طبیعی، اختلال متابولیک و تغییردر میکرومحیطهای داخل فولیکول در طی فولیکولوژنز و بلوغ فولیکول مرتبط است (۳). علت PCOS همچنان نامعلوم است، اما غیر طبیعی بودن ذاتی سنتز و ترشح آندروژنها (تستوسترون و آندرستون دیون) احتمالا علت این سندرم باشد. شواهد روشنی از ترشح زیاد آندروژن توسط سلول تکای تخمدان و اختلال در تولید آندروژن غده آدرنال وجود دارد، علاوه بر این سنتز آندروژنها (تستوسترون و آندرستون دیون) بهخصوص در بافت چربی در پاتوفیزیولوژی درگیر است (۲). درگیری سیستم عصبی سمپاتیک در پاتولوژی بهوسیله فیبرهای عصبی کاتکول آمینرژیک در PCOS است. افزایش فعالیت عصب سمپاتیک تخمدان در ایجاد PCOS از طریق تحریک ترشح آندروژن عمل میکند. فاکتور رشد عصبی(NGF) یک مارکر قوی برای فعالیت عصب سمپاتیک است و اخیرا در زنان PCOS افزایش تولید NGF تخمدانی نشان داده شده است (۲). ویژگیهای بیوشمیایی کمتر رایج PCOS شامل هیپرپرولاکتینمی و اختلال در ترشح هورمون رشد است (۴). انگور یکی از میوههایی است که بهطور گسترده در سراسر جهان مصرف و اهمیت قابل توجهی در صنایع دارویی و غذایی داشته است. انگور سرشار از پلی فنول است و60 تا70 درصد پلی فنول انگور در هسته آن موجود است. هسته انگور دارای خواص آنتی اکسیدانتی قابل توجهی است. ترکیبات فنولیک موجود در دانه انگور فلاونوئیدها هستند ازجمله اسید گالیک، مونومر فلاون ۳- اول و الیگومرهای دیگر و پلیمرهای مشتق از آن (پروسیانیدین). سه فلاون جدید اکسیداتیو به نامهای وینیفرونهای (Viniferones) A,B,C از هسته انگور جدا شده است. پلی فنول عصاره هسته انگور، پروآنتوسیانیدین (Proanthocyanidin) در فرانسه برای چندین دهه در درمان اختلالات وریدی و مویرگی (مثل رتینوپاتی، نارسایی سیاهرگی وشکنندگی عروق) بهکار میرفته است (۵). مطالعات اخیر نشان داده که پروسیانیدین (procyanidins) در هسته انگور دارای اثرات ضدالتهاب، ضد درد مفاصل، ضد آلرژی (۶)، ضدآنژیوژنز (۷)، ضد باکتری (۸)، مهار تکثیر سلولی (۹)، القا آپوپتوزیس (۱۰)، ضد تومور (۱۱)، ضد دیابت (۱۲) و جلوگیری از بیماریهای قلبی و پیری پوست میباشد. مطالعات دیگر نشان داده که پروآنتوسیانیدین هسته انگور از بدن در برابر آفتاب محافظت میکند، دید و گردش خون را بهبود میبخشد. (۵). این مطالعه با هدف تعیین اثر عصاره هیدروالکلی هسته انگور (Grape seed extract, GSE) بر روی سندرم تخمدان پلی کیستیک در رت انجام گرفت.
مواد و روشها
روش تهیه عصاره هیدروالکلی هسته انگور: انگور قرمز از باغهای شهر فراهان تهیه و پس از شستن و خشک کردن، هستهها از میوه جدا و آسیاب شدند. مقدار 75 گرم پودر هسته انگور به 200 میلیلیتر اتانول70 درصد اضافه و بهمدت 24 ساعت در دمای 40 درجه سانتیگراد در انکوباتور نگهداری شد. روزانه بهمدت سه ساعت بر روی دستگاه روتاتور با200 دور در دقیقه چرخانده بعد با کاغذ صافی واتمن شماره 1 فیلتر و سپس حلال (اتانول) محلول فیلتر شده، با دستگاه تبخیر کننده چرخان (Hoilph آلمان) تبخیر شد (۱۳) و عصاره خشک بهدست آمد. نمونهها بهمدت ۲ماه در یخچال تا زمان انجام آزمایش نگهداری شد.
تعیین LD50(Lethal dose 50) (دوز کشنده۵۰ درصد) بهروش درون صفاقی: دوز کشنده۵۰ درصد دوزی است که سبب مرگ نیمی از حیوانات مورد آزمایش میگردد و مقدار آن بر حسب وزن ماده مورد تحقیق در واحد وزن حیوان مورد آزمایش محاسبه میشود. دوز کشنده۵۰ درصد درون صفاقی در گروههای 6 تایی، دوز۱۵۰۰ میلیگرم بر کیلوگرم وزن موشهای ماده نژاد ویستار بهدست آمد. وضعیت حیوانات بلافاصله پس از تجویز عصاره تا 4 ساعت پیوسته و بعد ا ز 72 ساعت هر چهار ساعت یک بار و سرانجام بهمدت 14 روز روزانه تحت مراقبت قرار گرفتند (۱۴).
روش بررسی
در این تحقیق تجربی از ۳۰ سر رت ماده نژاد ویستار با وزن تقریبی 20±170 گرم استفاده شد که در قفسهای مخصوص و تحت شرایط محیطی و درجه حرارت مطلوب تقریبا 22 درجه سانتیگراد و سیکل روشنایی و تاریکی 12 ساعته و با مصرف آزاد آب و غذا نگهداری شدند. انجام آزمایشات بر اساس مصوبات کمیته اخلاق زیستی گروه علوم جانوری در دانشکده علوم زیستی صورت پذیرفت. یک استراتژی مهم برای درک بهتر علت PCOS استفاده از مدلهای حیوانی است (۱۵). روش القای PCOS انتخاب شده در این تحقیق از طریق تزریق زیر پوستی استرادیول والرات (EV) بود. به تمامی رتها در مرحله استروس سیکل تولیدمثلی، دوز 2 میلیگرم استرادیول والرات که در۰/۲ میلیلیتر روغن کنجد بهعنوان حلال حل شده بود، بهصورت زیر پوستی و یک بارتزریق در ناحیه کشاله ران در سطح شکمی تزریق شد (۱). برای تعیین دوز مناسب عصاره هسته انگور، از غلظتهای مختلف استفاده شد. موشها به ۶ گروه 5 تایی که شامل گروههای کنترل،PCOS و 4 گروه تجربی تقسیم شدند. گروههای تجربی روزانه بهمدت 10 روزمتوالی دوزهای مختلف عصاره 50، 75، 100 و 200 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن خود عصاره هیدروالکلی هسته انگور محلول در سالین نرمال بهصورت درون صفاقی دریافت کردند. به موشهای گروه کنترل نیز به همان اندازه سالین تزریق شد. 5 روز بعد از اتمام تزریقها موشها بهوسیله دی اتیل اتر بیهوش شده و خون بهصورت مستقیم از قلب آنها گرفته شد. جهت مطالعه بیوشیمیایی مقدار 3 تا 5 میلی لیترخون استفاده شد و پس از یک ساعت قرار گرفتن در دمای اتاق بهمدت 10 دقیقه با سرعت 3000 دور در دقیقه سانتریفیوژ گردید و پس از جدا کردن سرم تا زمان انجام آزمایش در دمای20- درجه سانتیگراد نگهداری شد. تخمدانها بعد از خارج شدن از بدن موش و حذف چربیهای اضافی با اسکالپل در محلول بوئن الکلی فیکس شدند. پس از قالب گیری، بهصورت سریالی و با ضخامت 5 میکرومتر برش داده و با هماتوکسیلین می یر (Mayer) و ائوزین رنگ آمیزی شدند.
آنالیز آماری: برای تجزیه و تحلیل آماری دادهها، از آنالیز واریانس یکطرفه و نرم افزارSPSS استفاده شد.value - p کمتر از 05/0 معنیدار تلقی شد و نمودارهای مربوطه از طریق برنامهEXCEL رسم گردید.
نتایج
در تخمدانهای رتهای بالغ تیمار شده با EV ، فولیکولهای بزرگ کیستیک با لایه گرانولوزای باریک در حد یک یا دو لایه سلولی و تعداد کمی فولیکولهای کوچک که از مشخصههای PCOS است، مشاهده شد. در این گروه جسم زرد مشاهده نشد. در گروه کنترل برخلاف گروه تیمار، تخمدانها فاقد کیست و مملو از جسم زرد بودند که نشاندهنده تخمکگذاری طبیعی در این گروه است. همچنین میزان فولیکولهای کوچک به مراتب بیشتر بود. بنابراین بر پایه مشاهدات ما، تیمار باEV پس از 60 روز، منجر به ایجاد کیست و توقف رشد فولیکولی و عدم تخمکگذاری طبیعی در این گروه شده است. پس از تیمار تخمدانهای پلی کیستیک با عصاره هیدروالکلی هسته انگور، بررسیهای مورفولوژیکی تعدادی جسم زرد را در اکثر آنها نشان داد که نشانه انجام و آغاز تخمکگذاری در آنهاست. افزایش مشخصی در فولیکولهای کوچک بین گروه تیمار و PCOS مشاهده گردید.
بهمنظور تعیین اثر عصاره هیدروالکلی هسته انگور بر روی تکوین فولیکولی، فولیکولها بر اساس مورفولوژی به 6 گروه: فولیکولهای بدوی (PRI)، فولیکولهای اولیه(PF) ، فولیکولهای پره آنترال(PA) ، فولیکولهای آنترال(A) ، فولیکولهای کیستیک(C) ، و اجسام زرد(CL) دسته بندی شدند.
شکلهای ۱تا ۶ نشاندهنده تخمدان کنترل، PCOS و گروههای تیمار شده با دوزهای مختلف 50، 75، 100 و 200 میلیگرم بر کیلوگرم عصاره هیدروالکلی هسته انگور است. . در بررسی مورفولوژی تخمدان های گروه کنترل هیچ فولیکول کیستی مشاهده نشد و تخمدان ها مملو از اجسام زرد و فولیکول های مختلف از جمله آنترال بودند که نشان دهنده تخمک گذاری طبیعی در این گروه است( شکل۱). در تخمدانهای گروه PCOS فولیکول های کیستیک متعدد با لایه گرانولوزای باریک در حد یک یا دو لایه سلولی که از مشخصات تخمدان های پلی کیستیک است و تعداد کمی فولیکول های کوچک مشاهده شد (شکل۲). پس از تیمار تخمدان های PCOS با عصاره هسته انگور٬ بررسی های مورفولوژیکی نشان داد که تعداد کیست ها و اندازه آن ها کاهش یافته است و اجسام زرد ظهور پیدا کرده اند و میزان فولیکول های کوچک در گرو های تیماری بیشتر از گروه کنترل است. در تخمدان های PCOS تیمار شده با دوز 50 میلیگرم بر کیلوگرم عصاره هسته انگور فولیکول های مختلف از جمله آنترال و اجسام زرد (تعداد اندک) مشاهده شد (شکل۳).
در گروه تیمار شده با دوز ۷۵ میلیگرم بر کیلوگرم عصاره تشکیل اجسام زرد و فولیکول های مختلف از جمله اولیه و پره آنترال مشاهده شد (شکل۴). تخمدان های تیمار شده با دوز ۱۰۰ میلیگرم بر کیلوگرم عصاره هسته انگور فولیکول های مختلف از جمله آنترال و جسم زرد را نشان دادند (شکل۵). در بررسی مقطع تخمدان گروهPCOS تیمار شده با دوز 200 میلیگرم بر کیلوگرم عصاره فولیکولهای آنترال٬ پرآنترال و گراف مشاهده گردید (شکل۶).
شکل۱: مقطع تخمدان گروه کنترل که اجسام زرد متعدد را نشان میدهد (بزرگنمایی میکروسکوپی ×۱۰۰). رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین٬ CL: جسم زرد A: فولیکول آنترال
شکل ۲: مقطع تخمدان PCOS که کیستهای متعدد درگروه PCOS را نشان میدهد (بزرگنمایی میکروسکوپی ×100) . رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین٬CF : فولیکول کیستیک
شکل ۳: مقطع تخمدان گروه PCOS تیمار شده با دوز ۵۰ میلیگرم بر کیلوگرم عصاره هیدروالکلی هسته انگور که تشکیل جسم زرد و فولیکولهای آنترال را نشان میدهد ( بزرگنمایی میکروسکوپی ×100). رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین٬ CL: جسم زرد A: فولیکول آنترال
شکل۴: مقطع تخمدان گروه PCOS تیمارشده با دوز ۷۵ میلیگرم بر کیلوگرم عصاره هیدروالکلی هسته انگور که تشکیل اجسام زرد و فولیکولهایاولیه و پره آنترال را نشان میدهد) بزرگنمایی میکروسکوپی × ۱۰۰(. رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین٬ CL: جسم زرد، PA: فولیکول پره آنترال، PF: فولیکول اولیه
شکل ۵: مقطع تخمدان گروه PCOS تیمارشده با دوز ۱۰۰ میلیگرم بر کیلوگرم عصاره هیدروالکلی هسته انگور که تشکیل جسم زرد و فولیکول آنترال را نشان میدهد (بزرگنمایی میکروسکوپی ×۱۰0). رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین٬ CL: جسم زرد، A: فولیکول آنترال
شکل۶: مقطع تخمدان گروه PCOS تیمارشده با دوز ۲۰۰ میلیگرم بر کیلوگرم عصارههیدروالکلی هسته انگور که تشکیل فولیکول گراف، آنترال و پره آنترال را نشان میدهد (بزرگنمایی میکروسکوپی × 10۰). رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین٬ G: فولیکول گراآف، A: فولیکول آنترال،PA : فولیکول پره آنترال
بررسی آماری تعداد فولیکولهای بدوی اختلاف معنیدار (001/0>p)، تعداد فولیکول اولیه اختلاف معنیدار (002/0>p)، تعداد فولیکولهای پره آنترال، آنترال، گراف، جسم زرد و کیست اختلاف معنیداری (001/0>p) را در گروه PCOS با مقایسه گروه کنترل نشان داد (نمودار۱).
با مقایسه تخمدانهای گروه پلی کیستیک تیمار شده با عصاره هیدروالکلی هسته انگور با دوز۵۰ میلیگرم بر کیلوگرم با PCOS اختلاف معنیدار (008/0>p) در فولیکول بدوی، اختلاف معنیدار (001/0>p) در فولیکول گراآف و کیستیک و جسم زرد مشاهده گردید، در حالیکه در تعداد فولیکولهای آنترال و پره آنترال بین این دو گروه اختلاف معنیداری مشاهده نشد (نمودار۲).
با مقایسه تخمدانهای گروه PCOS تیمار شده با دوز ۷۵ میلیگرم بر کیلوگرم عصاره هسته انگور و گروه PCOS اختلاف معنیدار (021/0>p) درتعداد فولیکول بدوی، (018/0>p) در تعداد پره آنترال، (004/0>p) در تعداد گراف،(007/0>p) در تعداد جسم زرد و (001/0>p) در تعداد فولیکول کیستیک مشاهده گردید واختلاف معنیداری در تعداد فولیکول آنترال در این دو گروه مشاهده نگردید (نمودار۳).
نمودار۱: مقایسه نتایج حاصل از مورفومتری گروههای مختلف فولیکولی در رتهای تیمار شده با استرادیول والرات (پلی کیستیک) در مقایسه با کنترل(۵ =n) (میانگین ± انحراف معیار). 001/0>p***٬ 01/0>p**٬ 05/0>p*.
نمودار 2: مقایسه نتایج حاصل از مورفومتری گروههای مختلف فولیکولی در تخمدان پلی کیستیک رتهای تیمار شده با دوز ۵۰ میلیگرم بر کیلوگرم عصاره هیدروالکلی هسته انگور در مقایسه با تخمدان پلی کیستیک تیمار نشده (۵ =n) (میانگین ± انحراف معیار). 001/0>p***٬ 01/0>p**٬ 05/0>p*.
نمودار ۳: مقایسه نتایج حاصل از مورفومتری گروههای مختلف فولیکولی در تخمدان پلی کیستیک رتهای تیمار شده با دوز ۷۵ میلیگرم بر کیلوگرم عصاره هیدروالکلی هسته انگور در مقایسه با تخمدانپلی کیستیک تیمار نشده (۵ =n)(میانگین ± انحراف معیار).001/0>p***٬ 01/0>p**٬ 05/0>p*.
با مقایسه تخمدانهای گروه پلی کیستیک تیمار شده با دوز ۱۰۰ میلیگرم بر کیلوگرم عصاره هسته انگور وPCOS اختلاف معنیدار(01/0>p) در تعداد فولیکول بدوی، (009/0>p) در تعداد فولیکول اولیه، (015/0>p) درتعداد پره آنترال، (007/0>p) در تعداد جسم زرد و (001/0>p) در تعداد کیست مشاهده گردید و در تعداد فولیکول آنترال و گراف اختلاف معنیداری مشاهده نگردید (نمودار۴).
با مقایسه تخمدانهای گروه PCOS تیمار شده با دوز ۲۰۰ میلیگرم بر کیلوگرم عصاره هیدروالکلی هسته انگور با PCOS اختلاف معنیدار (01/0>p) در تعداد فولیکول کیستیک، (001/0>p) در تعداد جسم زرد و (029/0>p) در تعداد گراف مشاهده گردید. در حالیکه در تعداد فولیکولهای پریموردیال، اولیه، پره آنترال و آنترال اختلاف معنیداری مشاهده نگردید (نمودار۵).
نمودار ۴: مقایسه نتایج حاصل از مورفومتری گروههای مختلف فولیکولی در تخمدان پلی کیستیک رتهای تیمار شده با دوز ۱۰۰ میلیگرم بر کیلوگرم عصاره هیدروالکلی هسته انگور در مقایسه با تخمدان پلی کیستیک تیمار نشده (۵ =n) (میانگین ± انحراف معیار).001/0>p***٬ 01/0>p**٬ 05/0>p*.
نمودار۵: مقایسه نتایج حاصل از مورفومتریگروههای مختلف فولیکولی در تخمدان پلی کیستیک رتهای تیمار شده با دوز ۲۰۰ میلیگرم بر کیلوگرم عصاره هیدروالکلی هسته انگور در مقایسه با تخمدان پلی کیستیک تیمار نشده (۵ =n) (میانگین ± انحراف معیار). 001/0>p***٬ 01/0>p**٬ 05/0>p*.
اندازهگیری ضخامت لایه گرانولوزا گروههای PCOS تیمارشده با عصاره هیدروالکلی هسته انگور در مقایسه باPCOS افزایش معنیداری (05/0>p) را نشان داد (نمودار۶).
اندازهگیری قطرلایه تک فولیکول آنترال در گروههای PCOS تیمار شده با عصاره هیدروالکلی هسته انگور در مقایسه با PCOS کاهش معنیداری (05/0>p) را در دوز های۵۰ و ۷۵ میلیگرم بر کیلوگرم عصاره هیدروالکلی هسته انگور در مقایسه با گروه PCOS نشان داد (نمودار۷).
اندازه گیری قطر فولیکولهای آنترال در گروه PCOS نسبت به کنترل افزایش معنیداری (001/0>p) را نشان داد که بهعلت وجود کیستهای بزرگ و پر از مایع است. کاهش معنیداری در اندازه قطر فولیکولی بین گروه تیمار با دوز ۵۰ (01/0>p) و دوز ۷۵ (05/0>p) عصاره هسته انگور و پلی کیستیک مشاهده شد (نمودار۸).
نمودار ۶: مقایسه قطر لایه گرانولوزا درگروههای پلی کیستیک تیمارشده با عصاره هیدروالکلی هسته انگوربا پلیکیستیک تیمار نشده (05/0>p) *
نمودار 7: مقایسه قطر لایه تک درگروههای پلی کیستیک تیمارشده با عصاره هیدروالکلی هسته انگور با پلی کیستیک تیمار نشده (05/0>p*
نمودار 8: مقایسه قطر فولیکول آنترال در گروههای مختلف. a: معنیداری گروه پلی کیستیک با کنترل را نشان میدهد (001/0>p).
**: کاهش معنیدار قطر فولیکول دوز ۵۰ را نسبت به گروه پلی کیستیک نشان میدهد 01/0>p).
*: کاهش معنیدار قطر فولیکول دوز ۷۵ را نسبت به گروه پلی کیستیک نشان میدهد (05/0>p).
مقایسه دوزهای 50، 75، 100 و 200 میلیگرم بر کیلوگرم عصاره هیدروالکلی هسته انگور که در این تحقیق به رتهای مبتلا به سندرم تخمدان پلی کیستیک بهصورت درون صفاقی بهمدت ۱۰ روز تزریق شد نشان میدهد که در اکثر موارد تعداد فولیکولهای کوچک و همچنین تعداد فولیکولهای آنترال و گراف افزایش یافته است، بهعلاوه جسم زرد در هر۴ دوز افزایش چشمگیری را نشان داد که بیانگر بهبود چشمگیر در وضعیت تخمدانهای پلی کیستیک است. با این حال، بین دوزهای مورد مطالعه در دوز۲۰۰ میلیگرم بر کیلوگرم عصاره هیدروالکلی هسته انگور تورم شدید شکمی، تجمع مایع در حفره صفاق و تغییر حالت شدید ظاهری در اندامهای بدن مشاهده گردید. با توجه به نتایج این تحقیق دوزهای پایین ۵۰ و ۷۵ میلیگرم بر کیلوگرم عصاره هیدروالکلی هسته انگور بهعنوان دوزهای موثر در نظر گرفته شدند.
بحث
در این تحقیق تجربی سندرم تخمدان پلی کیستیک با استفاده از تزریق زیر پوستی استرادیول والرات القا شد و اثر دوزهای مختلف عصاره هسته انگور بر میزان رشد و نمو فولیکولی و بهبود علائم این بیماری بر اساس مشاهدات مورفولوژیکی، مورفومتری و هورمونی بررسی گردید. مدل رت برای القا تجربی تخمدان پلی کیستیک(PCO) بهوسیله یکبار تزریق استرادیول والرات ایجاد میشود که مشابهPCOS انسان است. در این مدل کیستها بعد از 8 تا 9 هفته بعد از یک بار تزریق EV ظاهر میشوند. رتهای ماده عدم تخمک گذاری منظم، فاز اسمیر واژینال شاخی پایدار (PVC) و تخمدان پلی کیستیک را بعد از ۸ هفته از تیمار با EV نشان دادند. (۱۶). در این تحقیق نیز کیستها 8 تا 9 هفته بعد از یک بار تزریق EV ظاهر شدند که همسو با نتایج مطالعه فوق میباشد.
چرخه رتهای بالغ ماده با یک بار تزریق استرادیول والرات دچار اختلال سیکل عدم تخمک گذاری و تخمدان پلی کیستیک شدند که شامل افزایش تعداد فولیکولهای آترتیک و کیستیک با لایه سلولی گرانولوزای نازک و لایه تکای ضخیم غیرطبیعی میباشد (۱). در این تحقیق القا با استفاده از EV صورت گرفت و افزایش فولیکولهای آترتیک و کیستیک با لایه سلولی گرانولوزای نازک و تکای ضخیم همسو با مطالعه فوق مشاهده گردید.
غلظت هورمون LH پایه پلاسما در حیوانات PCOS در ۲ تا ۸ هفته بعد از تیمار باEV در محدوده کمتر از نرمال است در حالیکه بعد از ۲۲ هفته LH پلاسما بالاتر از محدوده نرمال است (۱۷). در این تحقیق نیز LH پلاسما در رتهای تیمار شده باEV افزایشی مشابه با تحقیقات فوق داشته است.
در شرایط پاتولوژیک مثل PCOS معمولا تخمدانها بزرگ و با هیپرپلازی سلولهای تک بینابینی (Ti)همراه هستند که با اختلال عملکرد تخمدان مرتبط است. سلولهای Ti نقش مهمی در تنظیم عملکرد تخمدان بازی میکنند. آنتی اکسیدانتها، رشد سلولهای Ti را مهار میکنند. رزواترول یک پلی فنول طبیعی است که در غلظت بالا در انگور، انواع توت، آجیل و شراب قرمز وجود دارد و دارای خواص بالقوه مفید ضد سرطان، ضدالتهاب، آنتی اکسیدانت و محافظت از قلب است. نشان داده شده که رزواترول تکثیر سلولی را مهار میکند و آپوپتوزیس سلولهای Ti تخمدان را از طریق محدود کردن سنتز DNA و زنده ماندن سلولها، افزایش فعالیت کاسپاز ۳/۷ و قطعه قطعه شدن DNA و القای تغییرات مورفولوژیکی هسته ای و سایتواسکلتونی موجب میشود (۱۸). در این تحقیق تیمار با عصاره هسته انگور باعث کاهش قطر تک در گروههای PCOS شده است که احتمالا رزواترول موجود در عصاره هسته انگور رشد سلولهای Ti را مهار کرده است که همسو با نتایج مطالعه فوق میباشد.
در مطالعهای نشان دادند که سم زنبور عسل با اثرات آنتی اکسیدانتی و ضد التهابی در رتهای مبتلا به تخمدان پلی کیستیک باعث افزایش تعداد فولیکولهای کوچک و پیدایش اجسام زرد در تخمدان شده است (۱۹).
همسو با مطالعه فوق در این تحقیق نیز عصاره هسته انگور احتمالا بهعلت خاصیت آنتی اکسیدانتی و ضد التهابی باعث افزایش تعداد فولیکولهای تخمدان و تشکیل اجسام زرد در تخمدان پلی کیستیک شده است.
آروماتاز آنزیمی است که آندروژن را به استروژن تبدیل میکند. عصاره هیدروالکلی هسته انگور شامل سطوح بالای دیمرهای پروسیانیدین است که نشان داده شده بهعنوان مهار کننده قوی آروماتاز عمل میکند (۲۰) بسیاری از اجزای عصاره هسته انگور، بهعنوان مثال پروسیانیدینB نشان داده شده که مهار کننده آروماتاز هستند. این مواد شیمیایی در سطوح بالا درهسته انگور یافت شده است. (۲۱). اعتقاد بر این است که یک کاهش نسبی در آروماتاز در زنان مبتلا به PCOS وجود دارد که تولید فولیکول رسیده و تخمکگذاری کارآمد را کاهش میدهد. برای رفع نسبی این نقص مهار کنندههای آروماتاز بهمنظور تحریک تخمکگذاری استفاده می شوند که عمل انتخابی آنها مهار تبدیل آندروژنها به استروژن است و به این ترتیب مقدار استروژن را کاهش می دهند، در نتیجه فیدبک مثبت در هیپوفیز باعث افزایش FSH و تخمکگذاری بهینه میشود (۲۲).
در این تحقیق نیز احتمالا عصاره هیدروالکلی هسته انگور با خاصیت مهارکنندگی آروماتاز باعث تحریک تخمکگذاری در گروههای PCOS تیمار شده با عصاره و افزایش تعداد گروههای مختلف فولیکولی شده است.
جلودار و همکارانش (۲۳) گزارش کردند که عصاره میوه گیاه پنج انگشت در دوز ۳۶۵ میلیگرم بر کیلوگرم در موشهای مبتلا به pcos سبب افزایش فولیکولهای مختلف و تعداد جسم زرد و کاهش در تعداد فولیکولهای کیستی موجود بر روی تخمدان شده است. پژوهشهای داروشناسی نشان داده اند که عصاره گیاه پنج انگشت اثر غیر مستقیم تحریک جسم زرد همراه با اثرات ضد استروژنی را داراست (۲۴).
نتیجه گیری
با توجه به یافتههای این تحقیق میتوان نتیجه گیری کرد که دوزهای پایین (50 و 75 میلیگرم بر کیلوگرم) عصاره هیدروالکلی هسته انگور بهصورت تزریق درون صفاقی میتواند در بهبود علائمPCOS موثر واقع شود و منجر به جهت گیری تخمدان مبتلا به PCOS بهسمت تخمدان طبیعی شود. دوز ۲۰۰ میلیگرم بر کیلوگرم عصاره هیدروالکلی هسته انگور بهصورت تزریق درون صفاقی با اثرات تخریبی (تورم در ناحیه شکم، تجمع مایع در حفره صفاق و تغیرات شدید ظاهری در اندامها) همراه بود. بنابراین یک پاسخ وابسته به دوز مشاهده شد. بهعلاوه با توجه به اثر تخریبی دوزهای بالاتر در مصرف آن جهت درمان باید احتیاط گردد.
تشکر و قدردانی
این مقاله منتج از پایان نامه کارشناسی ارشد میبـاشـد. بدین وسیله از ریاست محترم دانشکده علوم زیستی دانشگاه خوارزمی تشکر بهعمل میآید. از زحمات سرکارخانم لطیفه کریم زاده که در انجام این تحقیق همکاری نمودند تشکر میگردد.
)