مقدمه

به‏علت توانایی سلول­های پستانداران در تولید پروتئین­هایی با کیفیت بالا و با ویژگی­های بیوشیمیایی شبیه به‏شکل طبیعی پروتئین، امروزه تعداد زیادی از پروتئین­های درمانی نوترکیب در سلول­های پستانداران تولید می­شوند. با وجود این­که امروزه تعداد زیادی از رده­های سلولی در دسترس هستند اما نزدیک به 70 درصد از پروتئین­های درمانی نوترکیب در سلول­های تخمدان همستر چینی (CHO)  Chinese Hamster Ovary cell تولید می­شوند. سلول­های CHO دارای ویژگی­هایی هستند که آن­ها را به یک رده مناسب برای تولید پروتئین­های نوترکیب انسانی با کاربرد بالینی تبدیل می­کند. این سلول­ها دارای توانایی کشت به‏صورت سوسپانسیون به جای کشت چسبنده هستند که این‏حالت، کشت سلولی در مقیاس وسیع و استفاده از بیوراکتورها را امکان پذیر می­کند. این سلول­ها دارای این قابلیت می­باشند که به‏منظور ورود آسان DNA خارجی و بیان مقدار زیادی از پروتئین خارجی به آسانی دستخوش اصلاحات ژنتیکی قرارگیرند، این سلول­ها قابلیت تولید پروتئین  به‏صورت گلیکوزیله و انجام اصلاحات پس از ترجمه­ای که برای فعالیت زیستی پروتئین لازم است را دارا می­باشند؛ ایمن بودن محصول، ویژگی کلیدی دیگری است که باید در انتخاب میزبان سلولی در نظر گرفته شود. سلول میزبان نباید به عوامل نابجای بیماری­زا که نهایتا ممکن است به انسان منتقل شود، اجازه رشد و تکثیر دهد. اثبات شده است که سلول­های CHO، میزبان­های ایمن برای تولید مواد دارویی هستند. درمطالعه­ای مشخص شد که ۴۴ ویروس بیماری­زای انسان که از جمله ویروس نقص ایمنی اکتسابی (Human Immunodeficiency Virus) HIV، آنفلونزا، پولیو، هرپس و سرخک قابلیت همانندسازی در این رده سلولی را ندارند (1). سرم مخلوط بسیار پیچیده­ای حاوی تعداد زیادی از ترکیبات شناخته شده شامل فاکتورهای رشد، پروتئین‫های حامل، عناصر ضروری، هورمون­ها و غیره می­باشد که برای تکثیر و تمایز سلول­ها ضروری است. متداول‏ترین سرمی که در محیط کشت سلولی استفاده می­شود سرم جنین گاوی یا (Fetal Bovine Serum) FBS است زیرا غنی­تر بوده و حاوی ایمونوگلوبولین‏های کمتری نسبت به سایر سرم­ها می­باشد. با این وجود استفاده از سرم به‏علت ملاحضات اخلاقی، علمی، ایمنی و اقتصادی معایبی نیز دارد. که از آن جمله می­توان به آسیب به جنین­های گاوی، آلودگی­های ویروسی، هزینه بالا، مداخله در خالص سازی محصولات نوترکیب را می­توان نام برد. لذا سعی بر این است که به‏جای سرم از محیط فاقد سرم برای تولید پروتئین­های نوترکیب استفاده شود (2).

هورمون رشد یکی از پروتئین­های درمانی است که امروزه مورد توجه محققین قرار گرفته است. هورمون رشد انسانی (hGH) که با نام سوماتوتروپین نیز شناخته می­شود، یک هورمون پروتئینی است که توسط سلول­های سوماتوتروپیک غده هیپوفیز پیشین ساخته و ترشح می­شود (3). هورمون رشد انسانی دارای نقش کلیدی در رشد سوماتیک کودکان و در متابولیسم بزرگسالان است که تاثیر خود را از طریق اثر بر متابولیسم کربوهیدرات­ها، پروتئین­ها و لیپیدها اعمال می­کند (4). hGH یک زنجیره پلی‫پپتیدی منفرد با 191 اسید­آمینه است و دارای دو باند دی سولفیدی است که یک باند بین سیستئین شماره 53 و سیستئین 165 است که باعث تشکیل یک لوپ بزرگ در مولکول می­شود. و باند دیگر بین سیستئین شماره 182 و سیستئین 189 است که یک لوپ کوچک نزدیک به انتهای کربوکسیلیک ایجاد می­کند (5). کاربرد هورمون رشد در درمان بیماری­هایی از قبیل کمبود هورمون رشد GHD در کودکان و در بزرگسالان (4 و 6 و 7)، سندرم ترنر (8)، سندرم پرادرویلی (9)، سندرم­های دیس­مورفیک مثل سندرم راسل­سیلور (9 و 10) و سندرم نونان (11) و سندرم داون (12)، آرتریت روماتوئید جوانان (13)، نارسایی مزمن کلیه CRF (Chronic Renal Falure) (14)، دیسپلازی اسکلتی (15)، فیبروز کیستیک (16)، کوتاهی قد به­واسطه استروئید (17)، بیماری التهاب روده (18)، معکوس کردن عوارض جانبی کهولت سن (19) و استفاده توسط ورزشکاران (20) و غیره گزارش شده است.

تولید پروتئین به فاز چرخه سلولی و بیان چندین ژن­ که به‏مقدار زیادی در فاز G1 بیان می­شوند از قبیل آن­هایی که در تکامل ریبوزوم نقش دارند و ژن­هایی که در ترجمه پروتئین درگیرند بستگی دارد. سلول­هایی که در انتهای فاز G1 چرخه سلولی متوقف می­شوند از نظر متابولیکی فعال­ترند و اندازه بزرگتری نسبت به سلول­هایی که در این فاز نیستند دارند. به دلایل ذکر شده، فاز G1 چرخه سلولی زمان ایده‏آل برای افزایش تولید پروتئین نوترکیب در نظر گرفته می­شود و وقفه در فاز G1 باعث افزایش قابلیت تولید پروتئین در تعدادی از رده‏های سلولی از قبیل CHO و هیبریدوما می­شود (21). سلول­های CHO به‏طور گسترده­ای برای تولید پروتئین­های نوترکیب به­کار می‏روند. با این وجود میزان تولید در مقایسه با میزبان­های پروکاریوتی پایین است. استراتژی­های گوناگونی در این سلول­ها برای افزایش میزان تولید به­کار گرفته شده از قبیل تنظیم دمای کشت، اضافه کردن مواد شیمیایی و مهندسی بیوراکتور (22). از جمله ترکیبات شیمیایی که برای متوقف کردن چرخه سلولی به­کار می­رود می­توان به دی­متیل­سولفوکساید و سدیم بوتیرات اشاره کرد (23).

DMSO و گلیسرول ترکیباتی هستند که باعث می­شوند پروتئین در پیکربندی طبیعی خود پایدار شود و می­توانند با تاثیر بر فلدینگ پروتئین به‏عنوان چاپرون­های شیمیایی عمل کنند. همچنین DMSO باعث توقف رشد سلول، جلوگیری از آپوپتوزیس و افزایش تمایز فنوتیپی می­شود؛ و طبیعت قطبی آن باعث می­شود بدون این­که آسیب مهمی به غشای سلول وارد کند وارد سلول شود (24). DMSO  باعث توقف چرخه سلولی در فاز G1 می­شود (22) و با سست کردن واکنش­های غیرقطبی بین هیستون و کروماتین، سنتز RNA را توسط RNAPol افزایش می­دهد (25). گلسیرول به­طور گسترده­ای در صنعت داروسازی و بیوتکنولو‍‍ژی به­عنوان پایدارکننده پروتئین به‏کار می­رود. گلیسرول به­عنوان اسمولیت (Osmolyte) می­تواند باندهای هیدروژنی تشکیل داده و یک لایه­ی آبی در اطراف مولکول­های پروتئین تشکیل می­دهد و باعث افزایش کشش سطحی و ویسکوزیته محلول شده و در نتیجه از تشکیل تجمعات پروتئینی جلوگیری می‏کند. گلیسرول همچنین به­عنوان چاپرون شیمیایی عمل کرده و تاخوردگی صحیح پروتئین را بهبود می‏بخشد و باعث افزایش سنتز پروتئین می­شود (25). سدیم بوتیرات، نمک سدیم اسید بوتیریک است که به­طور گسترده­ای در کشت سلول­های CHO نوترکیب به‏منظور افزایش بیان پروتئین خارجی به‏­کار می­رود. یکی از واضح­ترین تغییراتی که توسط سدیم بوتیرات ایجاد می­شود استیلاسیون هیستون ­داستیلاز است که نتیجه این امر افزایش رونویسی و افزایش بیان پروتئین خارجی است. سدیم بوتیرات همچنین باعث مهار رشد سلول و القای آپوپتوزیس می­شود. روی به­عنوان متوقف کننده آپوپتوز در سلول­های انسانی شناخته می­شود و پایداری mRNA را افزایش می­دهد. روی یا توسط تغییر ساختار دوم mRNA و یا توسط افزایش اتصال پروتئین­های پایدارکننده به ­آن، باعث افزایش پایداری mRNA می­شود. همچنین روی  به‏صورت مستقیم یـا غیر مستقیم، یک یـا بیشتر ریبونوکلئازهـای مسئول

تجزیه mRNA های ناپایدار را مهار می­کند (26).

در مجموع، افزایش بیان پروتئین می‏تواند به‏طور قابل توجهی باعث کاهش هزینه و زمان در تولید پروتئین‏های درمانی شود.  به‏همین منظور و با توجه به اهمیت این هورمون در زمینه پزشکی و زیست فناوری بهینه سازی تولید هورمون رشد در سلول­های CHO حائز اهمیت است. با توجه به نقش گسترده و اهمیت فیزیولوژیک هورمون رشد و اینکه کشور ما هنوز از نظر دارا بودن این هورمون وابسته می‏باشد و با توجه به اینکه تولید این هورمون جزء اولویت­های درجه یک وزارت بهداشت قرار گرفته است، به‏نظر می­رسد نیازمند تلاش گسترده در جهت رفع نیازهای ملی و رسیدن به پایه­های اساسی علمی و عملی در زمینه تولید محصول و تجاری سازی آن به‏منظور اهداف درمانی و بیوتکنولوژیک می­باشد.

مواد و روش‏ها

کشت سلولی: در این مطالعه تجربی به‏منظور تولید و بهینه سازی هورمون رشد انسانی، پلازمید pSeqTag حاوی ژن hGH تحت کنترل پروموتور سایتو­مگالو­ویروس (CMV)  به‏صورت پایدار به داخل سلول­های تخمدان همستر چینی (CHO) ترانسفکت شده و کلون پایدار از سلول­های تولید کننده rhGH  توسط اضافه کردن آنتی بیوتیک جنتیسین به محیط کشت سلولی انتخاب شدند. به منظور رشد سلول­ها، از محیط  Dulbecco's Modification of Eagle's Medium/Hams F12 (DMEM/Ham’s F12)  (از شرکت GIBCO، آمریکا) حاوی 10 درصد سرم FBS ( Fetal Bovine Serum) (از شرکت GIBCO، آمریکا)، 1 درصد مخلوط آنتی بیوتیک پنی­سیلین-استرپتومایسین (Sigma، آمریکا) استفاده شد؛ و بعد از رشد سلول­ها به‏منظور برطرف کردن مداخلات سرم در فرآیندهای پایین دستی از قبیل خالص­سازی، از محیط فاقد سرم SFM (Serum Free Media) حاوی گلوتامکس (Sigma، آمریکا) ، پلورونیک (Pluronic-F68) (Sigma، آمریکا) و سدیم بی­کربنات (Merck، آلمان) استفاده شد.

تولید هورمون رشد انسانی نوترکیب در سلول­های CHO: بعد از انتخاب کلون پایدار از سلول­های CHO ترانسفکت شده با پلازمید حاوی ژن GH توسط اضافه کردن آنتی­بیوتیک جنتیسین (Sigma، آمریکا) با غلظت 400 میکروگرم بر میلی‏لیتر به محیط کشت سلول‏ها، به­منظور تولید GH، این سلول­ها در محیط DMEM/Ham’s F12 حاوی 10 درصد  سرم در فلاسک کشت سلولی (25 cm2 T flask) و در شرایط 5 درصد CO₂  و دمای 37 درجه سانتی‏گراد و رطوبت قرار داده شدند. سپس محیط رویی سلول­ها به‏منظور بررسی تولید GH برداشت شد. به‏منظور اثبات تولید GH توسط این سلول­ها، سلول­های طبیعی CHO که با این پلازمید ترانسفکت نشده­اند، به‏عنوان کنترل منفی در شرایط کاملا مشابه با سلول­های ترانسفکت شده، کشت داده شدند و محیط رویی این سلول­ها نیز برای آنالیزهای بعدی برداشت شد.

بهینه­سازی تولید rhGH در سلول­های CHO در محیط فاقد سرم: این آزمایش در پلیت کشت سلولی 12 خانه و با تکرار سه تایی انجام شد. برای انجام این آزمایش بعد از شمارش سلول­ها، به هر چاهک  Cell/ml105×1 حاوی محیط کشت DMEM/Ham’s F12 و 10 درصد سرم اضافه شد و  به‏صورت شبانه در انکوباتور با شرایط 5 درصد دی اکسید کربن، دمای  37 درجه سانتی‏گراد و حاوی رطوبت قرار داده شد تا سلول­ها در این شرایط رشد کرده و به تراکم 80 درصد برسند؛ سپس محیط رویی سلول­ها دور ریخته شد و پس از دو بار شستشو با فسفات بافر نمکی (PBS) (CMG، ایران)  به‏صورت جداگانه و باتکرار سه تایی محیط SFM حاوی مواد افزاینده گلیسرول و دی­متیل­سولفوکساید (DMSO) (Sigma، آمریکا) با غلظت­های 0 تا 2 درصد، سدیم بوتیرات با غلظت  0 تا 400 میکرومول (Sigma، آمریکا) و سولفات روی (Merck، آلمان) با غلظت0 تا 400 میکرومول به محیط کشت اضافه و به‏مدت 72 ساعت در انکوباتور قرار داده شد. بعد از سپری شدن این زمان محیط رویی سلول­ها برداشت شده و در دمای 80-  درجه سانتی‏گراد قرار داده شد.

انجام دات بلات به‏منظور بررسی نسبی میزان :rhGHدات بلات (Dot Blot) یک تست سریع برای بررسی میزان نسبی پروتئین در نمونه می­باشد. در این تحقیق به‏منظور بررسی اولیه تولید هورمون رشد در سلول‏های CHO تست دات بلات انجام شد. برای این منظور محیط کشت رویی سلول­ها برداشت شد و از طریق لیوفیلیزاسیون نمونه­ها غلیظ شدند و همراه با غلظت‏های مختلف نمونه­های کنترل مثبت  به‏صورت لکه­های دایره­ای کوچک هر کدام به مقدار 3 میکرولیتر روی غشای نیتروسلولز قرار داده شدند. بعد از لکه گذاری نمونه­ی مجهول، کنترل مثبت و کنترل منفی روی کاغذ نیتروسلولز، برای انجام تست دات بلات مراحل زیر به‏ترتیب طی شد:

قرار دادن کاغذ نیتروسلولز در محلول بلاکینگ حاوی PBS و Skim Milk به‏منظور بلوکه کردن سطح کاغذ نیتروسلولز، شستشوی کاغذ نیتروسلولز توسط محلول حاوی PBS و Tween 20؛ انکوباسیون در محلول حاویSkim Milk  و آنتی بادی ضد هورمون رشد انسانی (10A7 anti- GH Antibody)؛ تکرار مرحله شستشو، انکوباسیون در محلول حاویSkim Milk  و آنتی بادی Anti-IgG کونژوگه با HRP (sheep anti-mouse IgG1 HRP)، تکرار مرحله شستشو؛ پوشاندن سطح کاغذ نیتروسلولز توسط محلول ECL (CMG، ایران)، بررسی بیان GH توسط فیلم رادیولوژی در اتاق تاریک.

نمونه­ی کنترل مثبت شامل رقت­های مختلف از هورمون رشد تجاری بوده و به­عنوان کنترل منفی PBS بارگذاری شد. نتیجه تست دات بلات در شکل 1 نشان داده شده است.

بررسی غلظت rhGH تولید شده به‏روش الایزا: به­منظور بررسی تولید هورمون رشد انسانی در سلول­های CHO از روش اختصاصی ساندویچ الایزا استفاده شد. برای این منظور به‏هر چاهک پلیت 96 خانه الایزا آنتی بادی اولیه ضد GH اضافه شد و پلیت الایزا یک شبانه روز در دمای 4 درجه سانتی‏گراد انکوبه شد. پس از سه بار شستشو با بافر PBS-T پلیت  به‏صورت شبانه بلاکه شد و مجددا پس از 3 مرتبه شستشو با بافر PBS-T  غلظت‏های استاندارد با استفاده از هورمون رشد تجاری در PBS تهیه شدند و همراه با نمونه­های پروتئین  به‏صورت دوتایی به چاهک‏ها اضافه و به‏مدت دو ساعت در دمای اتاق قرار داده شدند. سپس آنتی­بادی ثانویه ضد GH نشاندار با بیوتین به‏هر چاهک اضافه شد. پس از یک ساعت انکوباسیون در دمای اتاق و سه مرحله شستشو با بافر PBS-T،HRP-Streptavidin  به‏هر چاهک اضافه شد و به‏مدت یک ساعت در دمای اتاق قرار داده شد. پس از شستشو، 100 میکرولیتر TMB به هر چاهک اضافه و زمانی­که تغییر رنگ مناسبی ایجاد شد، محلول متوقف کننده (اسید سولفوریک 1N) به هر چاهک اضافه و جذب آن در طول موج 450 نانومتر خوانده شد.

تعیینوزنمولکولی  rhGHتولیدشدهبهکمکروشوسترنبلات: ایمونوبلاتینگ یا وسترن بلاتینگ روشی دو مرحله ای است که طی آن ابتدا باندهای پروتئینی جدا شده به‏وسیله الکتروفورز از روی ژل SDS-PAGE به غشای دیگری که غالبا از جنس نیتروسلولز می‏باشد انتقال می­یابند و در مرحله دوم توسط آنتی بادی اختصاصی، پروتئین مورد نظر شناسایی می­شود. در این مرحله با استفاده از کیت وسترن بلاتینگ (شرکت CMG، ایران) وسترن بلات انجام شد و وزن مولکولی و خلوص rhGH تولید شده مورد بررسی قرار گرفت و با نمونه تجاری آن مورد مقایسه قرار گرفت.

قبل از انجام وسترن بلاتینگ، 40 میکرولیتر از محیط کشت رویی سلول­های CHO توسط همین حجم از بافر نمونه (sample buffer)  رقیق شد. سپس نمونه­ها به ژل پلی­آکریل آمید 12 درصد منتقل شدند. پروتئین­ها روی ژل پلی­آکریل آمید 12 درصد جدا شده سپس به‏مدت 90 دقیقه در 40 ولت توسط بافر ترانسفر به غشای نیتروسلولز منتقل شدند. بقیه مراحل همانند آزمایش تست بلات انجام گرفت.

نتایج

به‏منظور اثبات تولید هورمون رشد انسانی توسط سلول­های CHO ابتدا تولید rhGH از طریق مقایسه با حالت کنترل منفی (سلول­های CHO ترانسفکت نشده) از طریق دات بلات (شکل 1) و تست الایزا (نمودار 1) بررسی و  اثبات گردید. همانطور که در نمودار 1 مشاهده می­شود نتایج الایزا نشان­دهنده تولید rhGH در سلول­های CHO و عدم تولید آن در سلول­های ترانسفکت نشده می­باشد.

شکل 1: تصویر دات بلات به‏منطور بررسی اولیه تولید rhGH در سلول‏های CHO، تصویر دات بلات نمونه­های کنترل مثبت، کنترل منفی و نمونه مجهول؛ الف1:  استاندارد ( غلظت 1/0 گرم بر لیتر)؛ ب1:  استاندارد ( غلظت 1000 میلی‏گرم بر لیتر)؛ ج1:  استاندارد (غلظت  100 میلی‏گرم بر لیتر)؛ الف2: استاندارد ( غلظت 100 میکروگرم بر لیتر)؛ ب2: محیط رویی سلول‏های nCHO (non-transfected CHO) به‏عنوان کنترل منفی؛ ج2: محیط رویی سلول‏های rCHO (recombinant CHO) ترانسفکت شده با ژن هورمون رشد انسانی.

نمودار 1: بررسی تولید rhGH از طریق مقایسه با سلول‏های ترانسفکت نشدهبه روش الایزا: مقایسه غلظت rhGH در محیط کشت سلول­های rCHO و nCHO به‏روش الایزا: نشان دهنده­ی عدم وجود rhGH در محیط کشت سلول ترانسفورم نشده nCHO و تولید این هورمون در سلول­های ترانسفکت شده­ی rCHO است.

Error bar  نشان دهنده انحراف معیار می­باشد. نتایج حاصل از 3 تکرار برای هر آزمایش می­باشد.

تست دات بلات: به‏منظور یک بررسی اولیه برای تولید GH در سلول­های CHO تست دات بلات انجام شد، نمونه­های کنترل مثبت شامل رقت­های مختلفی از هورمون رشد تجاری است که در شکل 1 مشاهده می­شود، دقت این آزمایش تا 100 میلی‏گرم بر لیتر از  غلظت نمونه­های کنترل مثبت را تشخیص می­دهد. همان‏طور که در شکل 1 نشان داده شده تولید GH در محیط رویی سلول­های CHO نیز توسط تست دات بلات تائید شد.

سپس به‏منظور بررسی بهینه­سازی تولید hGH با افزودن ترکیبات شیمیایی، میزان hGH تولید شده در محیط رویی این سلول­ها از طریق سنجش با الایزا بررسی شد. همانطور که در نمودار 2 نشان داده شده است نتایج بررسی تاثیر غلظت­های مختلف گلیسرول بر تولید rhGH توسط سلول­های CHO نشان­دهنده تاثیر مثبت گلیسرول بر روند تولید است که غلظت 0.5 درصد موثرترین غلطت بر تولید rhGH شناخته شد. نمودار 3 نشان دهنده تاثیر DMSO بر تولید rhGH را نشان می­دهد که DMSO نیز در غلظت 1 درصد با تاثیر مثبت بر روند تولید باعث افزایش دوبرابری در تولید rhGH گردید. نتایج الایزای تاثیر غلظت­های مختلف سولفات روی بر تولید rhGH در سلول‫های CHO تاثیر مثبت این ماده بر روند تولید را اثبات کرد و غلظت 50 میکرومول به عنوان موثرترین غلظت نشان داده شد (نمودار 4).

همچنین سدیم بوتیرات نیز در غلظت 1 میلی­مول باعث افزایش در تولید rhGH نسبت به حالت کنترل گردید (نمودار5).

نمودار 2:  مقاسیه میزان GH تولید شده در غلظت های مختلف گلیسرول به‏روش الایزا : نمودار بررسی اثر گلیسرول بر میزان تولید rhGH توسط سلول­های rCHO در محیط SFM و مشخص شدن غلظت 5/0 درصد به­عنوان موثرترین غلظت بر میزان تولید rhGH.

Error bar  نشان دهنده انحراف معیار می­باشد. نتایج حاصل از 3 تکرار برای هر آزمایش می­باشد.

نمودار 3:مقاسیه میزان GH تولید شده در غلظت های مختلف DMSO به‏روش الایزا:  نمودار بررسی اثر گلیسرول بر میزان تولید rhGH توسط سلول‏های rCHO در محیط SFM و مشخص شدن غلظت 1 درصد به­عنوان موثرترین غلظت بر میزان تولید rhGH.

Error bar  نشان دهنده انحراف معیار می­باشد. نتایج حاصل از 3 تکرار برای هر آزمایش می­باشد.

نمودار 4: مقاسیه میزان GH تولید شده در غلظت‏های مختلف سولفات روی به‏روش الایزا :نمودار بررسی تاثیر سولفات روی بر میزان تولید rhGH توسط سلول­های rCHO در محیط SFM و مشخص شدن غلظت 50 میکرومولبه­عنوان موثرترین غلظت بر میزان تولید rhGH.

Error bar  نشان دهنده انحراف معیار می­باشد. نتایج حاصل از 3 تکرار برای هر آزمایش می­باشد.

نمودار 5: مقاسیه میزان GH تولید شده در غلظت‏های مختلف سدیم بوتیرات به‏روش الایزا: نمودار بررسی تاثیر سولفات روی بر میزان تولید rhGH توسط سلول­های rCHO در محیط SFM و مشخص شدن غلظت 1 میلی‏مول به­عنوان موثرترین غلظت بر میزان تولید rhGH.

Error bar  نشان دهنده انحراف معیار می­باشد، نتایج حاصل از 3 تکرار برای هر آزمایش می­باشد.