فصلنامه

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم و فناوری‌های نوین، گروه زیست فناوری، اصفهان، ایران

2 دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، اصفهان، ایران

10.52547/JCT.6.1.97

چکیده

هدف: هدف این مطالعه افزایش تولید هورمون رشد انسانی توسط اضافه کردن ترکیبات شیمیایی به محیط کشت فاقد سرم سلول‌های CHO و بررسی خواص hGH تولید شده می‌باشد.
مواد و روش‌ها: در این مطالعه، تاثیر تیمارهای مختلف شامل غلظت‌های مختلف گلیسرول،DMSO ، NaBu و ZnSO4 در سلول‌های CHO مورد بررسی قرار گرفت و تولید GH به‏روش الایزا سنجیده شد.سلول‌ها به هر چاهک یک پلیت 12 خانه حاوی DMEM-F12 و FBS10 درصد اضافه شدند. پس از 24 ساعت محیط رویی دور ریخته شد و با محیط فاقد سرم جایگزین شد و با غلظت‌های مختلف ترکیبات شیمیایی تیمار شدند وتولید rhGH با استفاده از الایزا، دات بلات و وسترن بلات ارزیابی شد.
نتایج: در این گزارش، در غلظت‌های 1 درصد دی‌متیل سولفوکساید، 5/0 درصد گلیسرول، در غلظت 1 میلی‏مولار سدیم بوتیرات و 50  میکرو مولارسولفات روی در سلول‌های CHO افزایش بیان rhGH مشاهده شد.
نتیجه‌گیری: این نتایج نشان داد که کنترل شرایط کشت سلولی به توسعه یک فرآیند صنعتی و در مقیاس وسیع برای تولید rhGH کمک می‌کند.
 

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Enhanced Production of human Growth Hormone in CHO Cells through the Control of Culture Conditions

نویسندگان [English]

  • ZS A 1
  • SH Z 2

چکیده [English]

Aim: The purpose of this study was enhancement of hGH synthesis by chemical components addition to Serum-Free CHO cells culture and investigate the characteristics of produced hGH.
Material and Method: The effects of different treatments including various concentrations of glycerol, DMSO, NaBu and ZnSO4 in CHO cells were investigated and the GH production was assessed using ELISA method. Cells are seeded into each well of a 12 well plate containing DMEM-F12 and 10% FBS. After 24 hours, media was aspirated and replaced with SFM and treatment with different concentrations of chemicals and rhGH production was assessed using ELISA, dot blotting and western blotting.
Results: Concentrations of 1%DMSO, 0.5% Glycerol, 1mM NaBu and 50 μM ZnSO4 were caused to elevate the expression of rhGH in the CHO cells.
Conclusion: These findings indicate that control of culture aid to development of an efficient large-scale and industrial process for the production of rhGH.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Chinese hamster ovary (CHO) cell
  • Human growth hormone (hGH)
  • Serum Free Media

مقدمه

به‏علت توانایی سلول­های پستانداران در تولید پروتئین­هایی با کیفیت بالا و با ویژگی­های بیوشیمیایی شبیه به‏شکل طبیعی پروتئین، امروزه تعداد زیادی از پروتئین­های درمانی نوترکیب در سلول­های پستانداران تولید می­شوند. با وجود این­که امروزه تعداد زیادی از رده­های سلولی در دسترس هستند اما نزدیک به 70 درصد از پروتئین­های درمانی نوترکیب در سلول­های تخمدان همستر چینی (CHO)  Chinese Hamster Ovary cell تولید می­شوند. سلول­های CHO دارای ویژگی­هایی هستند که آن­ها را به یک رده مناسب برای تولید پروتئین­های نوترکیب انسانی با کاربرد بالینی تبدیل می­کند. این سلول­ها دارای توانایی کشت به‏صورت سوسپانسیون به جای کشت چسبنده هستند که این‏حالت، کشت سلولی در مقیاس وسیع و استفاده از بیوراکتورها را امکان پذیر می­کند. این سلول­ها دارای این قابلیت می­باشند که به‏منظور ورود آسان DNA خارجی و بیان مقدار زیادی از پروتئین خارجی به آسانی دستخوش اصلاحات ژنتیکی قرارگیرند، این سلول­ها قابلیت تولید پروتئین  به‏صورت گلیکوزیله و انجام اصلاحات پس از ترجمه­ای که برای فعالیت زیستی پروتئین لازم است را دارا می­باشند؛ ایمن بودن محصول، ویژگی کلیدی دیگری است که باید در انتخاب میزبان سلولی در نظر گرفته شود. سلول میزبان نباید به عوامل نابجای بیماری­زا که نهایتا ممکن است به انسان منتقل شود، اجازه رشد و تکثیر دهد. اثبات شده است که سلول­های CHO، میزبان­های ایمن برای تولید مواد دارویی هستند. درمطالعه­ای مشخص شد که ۴۴ ویروس بیماری­زای انسان که از جمله ویروس نقص ایمنی اکتسابی (Human Immunodeficiency Virus) HIV، آنفلونزا، پولیو، هرپس و سرخک قابلیت همانندسازی در این رده سلولی را ندارند (1). سرم مخلوط بسیار پیچیده­ای حاوی تعداد زیادی از ترکیبات شناخته شده شامل فاکتورهای رشد، پروتئین‫های حامل، عناصر ضروری، هورمون­ها و غیره می­باشد که برای تکثیر و تمایز سلول­ها ضروری است. متداول‏ترین سرمی که در محیط کشت سلولی استفاده می­شود سرم جنین گاوی یا (Fetal Bovine Serum) FBS است زیرا غنی­تر بوده و حاوی ایمونوگلوبولین‏های کمتری نسبت به سایر سرم­ها می­باشد. با این وجود استفاده از سرم به‏علت ملاحضات اخلاقی، علمی، ایمنی و اقتصادی معایبی نیز دارد. که از آن جمله می­توان به آسیب به جنین­های گاوی، آلودگی­های ویروسی، هزینه بالا، مداخله در خالص سازی محصولات نوترکیب را می­توان نام برد. لذا سعی بر این است که به‏جای سرم از محیط فاقد سرم برای تولید پروتئین­های نوترکیب استفاده شود (2).

هورمون رشد یکی از پروتئین­های درمانی است که امروزه مورد توجه محققین قرار گرفته است. هورمون رشد انسانی (hGH) که با نام سوماتوتروپین نیز شناخته می­شود، یک هورمون پروتئینی است که توسط سلول­های سوماتوتروپیک غده هیپوفیز پیشین ساخته و ترشح می­شود (3). هورمون رشد انسانی دارای نقش کلیدی در رشد سوماتیک کودکان و در متابولیسم بزرگسالان است که تاثیر خود را از طریق اثر بر متابولیسم کربوهیدرات­ها، پروتئین­ها و لیپیدها اعمال می­کند (4). hGH یک زنجیره پلی‫پپتیدی منفرد با 191 اسید­آمینه است و دارای دو باند دی سولفیدی است که یک باند بین سیستئین شماره 53 و سیستئین 165 است که باعث تشکیل یک لوپ بزرگ در مولکول می­شود. و باند دیگر بین سیستئین شماره 182 و سیستئین 189 است که یک لوپ کوچک نزدیک به انتهای کربوکسیلیک ایجاد می­کند (5). کاربرد هورمون رشد در درمان بیماری­هایی از قبیل کمبود هورمون رشد GHD در کودکان و در بزرگسالان (4 و 6 و 7)، سندرم ترنر (8)، سندرم پرادرویلی (9)، سندرم­های دیس­مورفیک مثل سندرم راسل­سیلور (9 و 10) و سندرم نونان (11) و سندرم داون (12)، آرتریت روماتوئید جوانان (13)، نارسایی مزمن کلیه CRF (Chronic Renal Falure) (14)، دیسپلازی اسکلتی (15)، فیبروز کیستیک (16)، کوتاهی قد به­واسطه استروئید (17)، بیماری التهاب روده (18)، معکوس کردن عوارض جانبی کهولت سن (19) و استفاده توسط ورزشکاران (20) و غیره گزارش شده است.

تولید پروتئین به فاز چرخه سلولی و بیان چندین ژن­ که به‏مقدار زیادی در فاز G1 بیان می­شوند از قبیل آن­هایی که در تکامل ریبوزوم نقش دارند و ژن­هایی که در ترجمه پروتئین درگیرند بستگی دارد. سلول­هایی که در انتهای فاز G1 چرخه سلولی متوقف می­شوند از نظر متابولیکی فعال­ترند و اندازه بزرگتری نسبت به سلول­هایی که در این فاز نیستند دارند. به دلایل ذکر شده، فاز G1 چرخه سلولی زمان ایده‏آل برای افزایش تولید پروتئین نوترکیب در نظر گرفته می­شود و وقفه در فاز G1 باعث افزایش قابلیت تولید پروتئین در تعدادی از رده‏های سلولی از قبیل CHO و هیبریدوما می­شود (21). سلول­های CHO به‏طور گسترده­ای برای تولید پروتئین­های نوترکیب به­کار می‏روند. با این وجود میزان تولید در مقایسه با میزبان­های پروکاریوتی پایین است. استراتژی­های گوناگونی در این سلول­ها برای افزایش میزان تولید به­کار گرفته شده از قبیل تنظیم دمای کشت، اضافه کردن مواد شیمیایی و مهندسی بیوراکتور (22). از جمله ترکیبات شیمیایی که برای متوقف کردن چرخه سلولی به­کار می­رود می­توان به دی­متیل­سولفوکساید و سدیم بوتیرات اشاره کرد (23).

DMSO و گلیسرول ترکیباتی هستند که باعث می­شوند پروتئین در پیکربندی طبیعی خود پایدار شود و می­توانند با تاثیر بر فلدینگ پروتئین به‏عنوان چاپرون­های شیمیایی عمل کنند. همچنین DMSO باعث توقف رشد سلول، جلوگیری از آپوپتوزیس و افزایش تمایز فنوتیپی می­شود؛ و طبیعت قطبی آن باعث می­شود بدون این­که آسیب مهمی به غشای سلول وارد کند وارد سلول شود (24). DMSO  باعث توقف چرخه سلولی در فاز G1 می­شود (22) و با سست کردن واکنش­های غیرقطبی بین هیستون و کروماتین، سنتز RNA را توسط RNAPol افزایش می­دهد (25). گلسیرول به­طور گسترده­ای در صنعت داروسازی و بیوتکنولو‍‍ژی به­عنوان پایدارکننده پروتئین به‏کار می­رود. گلیسرول به­عنوان اسمولیت (Osmolyte) می­تواند باندهای هیدروژنی تشکیل داده و یک لایه­ی آبی در اطراف مولکول­های پروتئین تشکیل می­دهد و باعث افزایش کشش سطحی و ویسکوزیته محلول شده و در نتیجه از تشکیل تجمعات پروتئینی جلوگیری می‏کند. گلیسرول همچنین به­عنوان چاپرون شیمیایی عمل کرده و تاخوردگی صحیح پروتئین را بهبود می‏بخشد و باعث افزایش سنتز پروتئین می­شود (25). سدیم بوتیرات، نمک سدیم اسید بوتیریک است که به­طور گسترده­ای در کشت سلول­های CHO نوترکیب به‏منظور افزایش بیان پروتئین خارجی به‏­کار می­رود. یکی از واضح­ترین تغییراتی که توسط سدیم بوتیرات ایجاد می­شود استیلاسیون هیستون ­داستیلاز است که نتیجه این امر افزایش رونویسی و افزایش بیان پروتئین خارجی است. سدیم بوتیرات همچنین باعث مهار رشد سلول و القای آپوپتوزیس می­شود. روی به­عنوان متوقف کننده آپوپتوز در سلول­های انسانی شناخته می­شود و پایداری mRNA را افزایش می­دهد. روی یا توسط تغییر ساختار دوم mRNA و یا توسط افزایش اتصال پروتئین­های پایدارکننده به ­آن، باعث افزایش پایداری mRNA می­شود. همچنین روی  به‏صورت مستقیم یـا غیر مستقیم، یک یـا بیشتر ریبونوکلئازهـای مسئول

تجزیه mRNA های ناپایدار را مهار می­کند (26).

در مجموع، افزایش بیان پروتئین می‏تواند به‏طور قابل توجهی باعث کاهش هزینه و زمان در تولید پروتئین‏های درمانی شود.  به‏همین منظور و با توجه به اهمیت این هورمون در زمینه پزشکی و زیست فناوری بهینه سازی تولید هورمون رشد در سلول­های CHO حائز اهمیت است. با توجه به نقش گسترده و اهمیت فیزیولوژیک هورمون رشد و اینکه کشور ما هنوز از نظر دارا بودن این هورمون وابسته می‏باشد و با توجه به اینکه تولید این هورمون جزء اولویت­های درجه یک وزارت بهداشت قرار گرفته است، به‏نظر می­رسد نیازمند تلاش گسترده در جهت رفع نیازهای ملی و رسیدن به پایه­های اساسی علمی و عملی در زمینه تولید محصول و تجاری سازی آن به‏منظور اهداف درمانی و بیوتکنولوژیک می­باشد.

 

مواد و روش‏ها

کشت سلولی: در این مطالعه تجربی به‏منظور تولید و بهینه سازی هورمون رشد انسانی، پلازمید pSeqTag حاوی ژن hGH تحت کنترل پروموتور سایتو­مگالو­ویروس (CMV)  به‏صورت پایدار به داخل سلول­های تخمدان همستر چینی (CHO) ترانسفکت شده و کلون پایدار از سلول­های تولید کننده rhGH  توسط اضافه کردن آنتی بیوتیک جنتیسین به محیط کشت سلولی انتخاب شدند. به منظور رشد سلول­ها، از محیط  Dulbecco's Modification of Eagle's Medium/Hams F12 (DMEM/Ham’s F12)  (از شرکت GIBCO، آمریکا) حاوی 10 درصد سرم FBS ( Fetal Bovine Serum) (از شرکت GIBCO، آمریکا)، 1 درصد مخلوط آنتی بیوتیک پنی­سیلین-استرپتومایسین (Sigma، آمریکا) استفاده شد؛ و بعد از رشد سلول­ها به‏منظور برطرف کردن مداخلات سرم در فرآیندهای پایین دستی از قبیل خالص­سازی، از محیط فاقد سرم SFM (Serum Free Media) حاوی گلوتامکس (Sigma، آمریکا) ، پلورونیک (Pluronic-F68) (Sigma، آمریکا) و سدیم بی­کربنات (Merck، آلمان) استفاده شد.

تولید هورمون رشد انسانی نوترکیب در سلول­های CHO: بعد از انتخاب کلون پایدار از سلول­های CHO ترانسفکت شده با پلازمید حاوی ژن GH توسط اضافه کردن آنتی­بیوتیک جنتیسین (Sigma، آمریکا) با غلظت 400 میکروگرم بر میلی‏لیتر به محیط کشت سلول‏ها، به­منظور تولید GH، این سلول­ها در محیط DMEM/Ham’s F12 حاوی 10 درصد  سرم در فلاسک کشت سلولی (25 cm2 T flask) و در شرایط 5 درصد CO2  و دمای 37 درجه سانتی‏گراد و رطوبت قرار داده شدند. سپس محیط رویی سلول­ها به‏منظور بررسی تولید GH برداشت شد. به‏منظور اثبات تولید GH توسط این سلول­ها، سلول­های طبیعی CHO که با این پلازمید ترانسفکت نشده­اند، به‏عنوان کنترل منفی در شرایط کاملا مشابه با سلول­های ترانسفکت شده، کشت داده شدند و محیط رویی این سلول­ها نیز برای آنالیزهای بعدی برداشت شد.

بهینه­سازی تولید rhGH در سلول­های CHO در محیط فاقد سرم: این آزمایش در پلیت کشت سلولی 12 خانه و با تکرار سه تایی انجام شد. برای انجام این آزمایش بعد از شمارش سلول­ها، به هر چاهک  Cell/ml105×1 حاوی محیط کشت DMEM/Ham’s F12 و 10 درصد سرم اضافه شد و  به‏صورت شبانه در انکوباتور با شرایط 5 درصد دی اکسید کربن، دمای  37 درجه سانتی‏گراد و حاوی رطوبت قرار داده شد تا سلول­ها در این شرایط رشد کرده و به تراکم 80 درصد برسند؛ سپس محیط رویی سلول­ها دور ریخته شد و پس از دو بار شستشو با فسفات بافر نمکی (PBS) (CMG، ایران)  به‏صورت جداگانه و باتکرار سه تایی محیط SFM حاوی مواد افزاینده گلیسرول و دی­متیل­سولفوکساید (DMSO) (Sigma، آمریکا) با غلظت­های 0 تا 2 درصد، سدیم بوتیرات با غلظت  0 تا 400 میکرومول (Sigma، آمریکا) و سولفات روی (Merck، آلمان) با غلظت0 تا 400 میکرومول به محیط کشت اضافه و به‏مدت 72 ساعت در انکوباتور قرار داده شد. بعد از سپری شدن این زمان محیط رویی سلول­ها برداشت شده و در دمای 80-  درجه سانتی‏گراد قرار داده شد.

انجام دات بلات به‏منظور بررسی نسبی میزان :rhGHدات بلات (Dot Blot) یک تست سریع برای بررسی میزان نسبی پروتئین در نمونه می­باشد. در این تحقیق به‏منظور بررسی اولیه تولید هورمون رشد در سلول‏های CHO تست دات بلات انجام شد. برای این منظور محیط کشت رویی سلول­ها برداشت شد و از طریق لیوفیلیزاسیون نمونه­ها غلیظ شدند و همراه با غلظت‏های مختلف نمونه­های کنترل مثبت  به‏صورت لکه­های دایره­ای کوچک هر کدام به مقدار 3 میکرولیتر روی غشای نیتروسلولز قرار داده شدند. بعد از لکه گذاری نمونه­ی مجهول، کنترل مثبت و کنترل منفی روی کاغذ نیتروسلولز، برای انجام تست دات بلات مراحل زیر به‏ترتیب طی شد:

قرار دادن کاغذ نیتروسلولز در محلول بلاکینگ حاوی PBS و Skim Milk به‏منظور بلوکه کردن سطح کاغذ نیتروسلولز، شستشوی کاغذ نیتروسلولز توسط محلول حاوی PBS و Tween 20؛ انکوباسیون در محلول حاویSkim Milk  و آنتی بادی ضد هورمون رشد انسانی (10A7 anti- GH Antibody)؛ تکرار مرحله شستشو، انکوباسیون در محلول حاویSkim Milk  و آنتی بادی Anti-IgG کونژوگه با HRP (sheep anti-mouse IgG1 HRP)، تکرار مرحله شستشو؛ پوشاندن سطح کاغذ نیتروسلولز توسط محلول ECL (CMG، ایران)، بررسی بیان GH توسط فیلم رادیولوژی در اتاق تاریک.

نمونه­ی کنترل مثبت شامل رقت­های مختلف از هورمون رشد تجاری بوده و به­عنوان کنترل منفی PBS بارگذاری شد. نتیجه تست دات بلات در شکل 1 نشان داده شده است.

بررسی غلظت rhGH تولید شده بهروش الایزا: به­منظور بررسی تولید هورمون رشد انسانی در سلول­های CHO از روش اختصاصی ساندویچ الایزا استفاده شد. برای این منظور به‏هر چاهک پلیت 96 خانه الایزا آنتی بادی اولیه ضد GH اضافه شد و پلیت الایزا یک شبانه روز در دمای 4 درجه سانتی‏گراد انکوبه شد. پس از سه بار شستشو با بافر PBS-T پلیت  به‏صورت شبانه بلاکه شد و مجددا پس از 3 مرتبه شستشو با بافر PBS-T  غلظت‏های استاندارد با استفاده از هورمون رشد تجاری در PBS تهیه شدند و همراه با نمونه­های پروتئین  به‏صورت دوتایی به چاهک‏ها اضافه و به‏مدت دو ساعت در دمای اتاق قرار داده شدند. سپس آنتی­بادی ثانویه ضد GH نشاندار با بیوتین به‏هر چاهک اضافه شد. پس از یک ساعت انکوباسیون در دمای اتاق و سه مرحله شستشو با بافر PBS-T،HRP-Streptavidin  به‏هر چاهک اضافه شد و به‏مدت یک ساعت در دمای اتاق قرار داده شد. پس از شستشو، 100 میکرولیتر TMB به هر چاهک اضافه و زمانی­که تغییر رنگ مناسبی ایجاد شد، محلول متوقف کننده (اسید سولفوریک 1N) به هر چاهک اضافه و جذب آن در طول موج 450 نانومتر خوانده شد.

تعیینوزنمولکولی  rhGHتولیدشدهبهکمکروشوسترنبلات: ایمونوبلاتینگ یا وسترن بلاتینگ روشی دو مرحله ای است که طی آن ابتدا باندهای پروتئینی جدا شده به‏وسیله الکتروفورز از روی ژل SDS-PAGE به غشای دیگری که غالبا از جنس نیتروسلولز می‏باشد انتقال می­یابند و در مرحله دوم توسط آنتی بادی اختصاصی، پروتئین مورد نظر شناسایی می­شود. در این مرحله با استفاده از کیت وسترن بلاتینگ (شرکت CMG، ایران) وسترن بلات انجام شد و وزن مولکولی و خلوص rhGH تولید شده مورد بررسی قرار گرفت و با نمونه تجاری آن مورد مقایسه قرار گرفت.

قبل از انجام وسترن بلاتینگ، 40 میکرولیتر از محیط کشت رویی سلول­های CHO توسط همین حجم از بافر نمونه (sample buffer)  رقیق شد. سپس نمونه­ها به ژل پلی­آکریل آمید 12 درصد منتقل شدند. پروتئین­ها روی ژل پلی­آکریل آمید 12 درصد جدا شده سپس به‏مدت 90 دقیقه در 40 ولت توسط بافر ترانسفر به غشای نیتروسلولز منتقل شدند. بقیه مراحل همانند آزمایش تست بلات انجام گرفت.

نتایج

به‏منظور اثبات تولید هورمون رشد انسانی توسط سلول­های CHO ابتدا تولید rhGH از طریق مقایسه با حالت کنترل منفی (سلول­های CHO ترانسفکت نشده) از طریق دات بلات (شکل 1) و تست الایزا (نمودار 1) بررسی و  اثبات گردید. همانطور که در نمودار 1 مشاهده می­شود نتایج الایزا نشان­دهنده تولید rhGH در سلول­های CHO و عدم تولید آن در سلول­های ترانسفکت نشده می­باشد.

 

 

شکل 1: تصویر دات بلات به‏منطور بررسی اولیه تولید rhGH در سلول‏های CHO، تصویر دات بلات نمونه­های کنترل مثبت، کنترل منفی و نمونه مجهول؛ الف1:  استاندارد ( غلظت 1/0 گرم بر لیتر)؛ ب1:  استاندارد ( غلظت 1000 میلی‏گرم بر لیتر)؛ ج1:  استاندارد (غلظت  100 میلی‏گرم بر لیتر)؛ الف2: استاندارد ( غلظت 100 میکروگرم بر لیتر)؛ ب2: محیط رویی سلول‏های nCHO (non-transfected CHO) به‏عنوان کنترل منفی؛ ج2: محیط رویی سلول‏های rCHO (recombinant CHO) ترانسفکت شده با ژن هورمون رشد انسانی.

 

 

 

نمودار 1: بررسی تولید rhGH از طریق مقایسه با سلول‏های ترانسفکت نشدهبه روش الایزا: مقایسه غلظت rhGH در محیط کشت سلول­های rCHO و nCHO به‏روش الایزا: نشان دهنده­ی عدم وجود rhGH در محیط کشت سلول ترانسفورم نشده nCHO و تولید این هورمون در سلول­های ترانسفکت شده­ی rCHO است.

Error bar  نشان دهنده انحراف معیار می­باشد. نتایج حاصل از 3 تکرار برای هر آزمایش می­باشد.

 

 

تست دات بلات: به‏منظور یک بررسی اولیه برای تولید GH در سلول­های CHO تست دات بلات انجام شد، نمونه­های کنترل مثبت شامل رقت­های مختلفی از هورمون رشد تجاری است که در شکل 1 مشاهده می­شود، دقت این آزمایش تا 100 میلی‏گرم بر لیتر از  غلظت نمونه­های کنترل مثبت را تشخیص می­دهد. همان‏طور که در شکل 1 نشان داده شده تولید GH در محیط رویی سلول­های CHO نیز توسط تست دات بلات تائید شد.

سپس به‏منظور بررسی بهینه­سازی تولید hGH با افزودن ترکیبات شیمیایی، میزان hGH تولید شده در محیط رویی این سلول­ها از طریق سنجش با الایزا بررسی شد. همانطور که در نمودار 2 نشان داده شده است نتایج بررسی تاثیر غلظت­های مختلف گلیسرول بر تولید rhGH توسط سلول­های CHO نشان­دهنده تاثیر مثبت گلیسرول بر روند تولید است که غلظت 0.5 درصد موثرترین غلطت بر تولید rhGH شناخته شد. نمودار 3 نشان دهنده تاثیر DMSO بر تولید rhGH را نشان می­دهد که DMSO نیز در غلظت 1 درصد با تاثیر مثبت بر روند تولید باعث افزایش دوبرابری در تولید rhGH گردید. نتایج الایزای تاثیر غلظت­های مختلف سولفات روی بر تولید rhGH در سلول‫های CHO تاثیر مثبت این ماده بر روند تولید را اثبات کرد و غلظت 50 میکرومول به عنوان موثرترین غلظت نشان داده شد (نمودار 4).

همچنین سدیم بوتیرات نیز در غلظت 1 میلی­مول باعث افزایش در تولید rhGH نسبت به حالت کنترل گردید (نمودار5).

 

 

نمودار 2:  مقاسیه میزان GH تولید شده در غلظت های مختلف گلیسرول به‏روش الایزا : نمودار بررسی اثر گلیسرول بر میزان تولید rhGH توسط سلول­های rCHO در محیط SFM و مشخص شدن غلظت 5/0 درصد به­عنوان موثرترین غلظت بر میزان تولید rhGH.

Error bar  نشان دهنده انحراف معیار می­باشد. نتایج حاصل از 3 تکرار برای هر آزمایش می­باشد.

 

 

 

نمودار 3:مقاسیه میزان GH تولید شده در غلظت های مختلف DMSO به‏روش الایزا:  نمودار بررسی اثر گلیسرول بر میزان تولید rhGH توسط سلول‏های rCHO در محیط SFM و مشخص شدن غلظت 1 درصد به­عنوان موثرترین غلظت بر میزان تولید rhGH.

Error bar  نشان دهنده انحراف معیار می­باشد. نتایج حاصل از 3 تکرار برای هر آزمایش می­باشد.

 

نمودار 4: مقاسیه میزان GH تولید شده در غلظت‏های مختلف سولفات روی به‏روش الایزا :نمودار بررسی تاثیر سولفات روی بر میزان تولید rhGH توسط سلول­های rCHO در محیط SFM و مشخص شدن غلظت 50 میکرومولبه­عنوان موثرترین غلظت بر میزان تولید rhGH.

Error bar  نشان دهنده انحراف معیار می­باشد. نتایج حاصل از 3 تکرار برای هر آزمایش می­باشد.

 

 

نمودار 5: مقاسیه میزان GH تولید شده در غلظت‏های مختلف سدیم بوتیرات به‏روش الایزا: نمودار بررسی تاثیر سولفات روی بر میزان تولید rhGH توسط سلول­های rCHO در محیط SFM و مشخص شدن غلظت 1 میلی‏مول به­عنوان موثرترین غلظت بر میزان تولید rhGH.

Error bar  نشان دهنده انحراف معیار می­باشد، نتایج حاصل از 3 تکرار برای هر آزمایش می­باشد.

 

 

تست وسترن بلات: پس از  بررسی کمی میزان rhGH در نمونه­هایی که به‏طور نسبی خالص سازی و تغلیظ شده­ بودند، به‏منظور بررسی وزن مولکولی rhGH تولید شده، تست وسترن بلات انجام شد. الکتروفورز پروتئین در ژل 12 درصد انجام و برای این تکنیک از آنتی بادی ضد GH استفاده شد. با توجه به اینکه وزن مولکولی هورمون رشد 22 کیلودالتون است، همان‏طور که در شکل 2 نشان داده شده است هورمون رشد نوترکیب تولید شده بین دو نشانگر 15 و 25 کیلودالتون قرار گرفته است که نشان می­دهد وزن مولکولی هورمون رشد تولید شده صحیح است.

 

شکل 2:  نتایج حاصل از وسترن بلات به منظور تعیینوزنمولکولی  rhGHتولیدشده، وسترن بلات نمونه­های GH تجاری و rhGH تولید شده: 1) مارکر پروتئینی، 2) هورمون رشد تجاری، 3) نمونه rhGH تولید شده.

بحث

هورمون رشد انسانی یک پروتئین ترشحی تک رشته‏ای است که از سلول­های غده هیپوفیز همه مهره­‏داران ترشح می­شود و نقش مهمی در رشد ایفا می­کند. به‏علت فعالیت­های زیستی مهم و متنوع هورمون رشد، این هورمون دارای کاربرد­های گسترده­ای در پزشکی و بیوتکنولوژی می­باشد. رده سلولی پستانداران به‏خاطر توانایی در ایجاد فلدینگ و اصلاحات پس از ترجمه ضروری برای فعالیت زیستی درون سلول، اغلب به‏عنوان سیستم نوترکیب برای تولید مواد دارویی استفاده می­شوند. زمانی­که یک پروتئین در سلول­های پستانداران بیان می­شود در مقایسه با زمانی­که در سایر میزبان­ها از جمله باکتری­ها، گیاهان و مخمر بیان می­شود کیفیت و اثر بهتری دارد. با این وجود بهره­وری اختصاصی این سلول­ها در مقایسه با سیستم­های تولید در میزبان­های پروکاریوتی پایین باقی مانده است. به همین منظور و برای غلبه بر این مشکل روش­های مختلفی برای بهینه سازی تولید پروتئین نوترکیب در سلول­های پستانداران که دارای کاربرد قابل توجهی در تولید و ساخت پلی پپتیدهای درمانی هستند در نظر گرفته شده است. افزایش بیان پروتئین می‏تواند به‏طور قابل توجهی باعث کاهش هزینه و زمان تولید پروتئین‏های نوترکیب شود. سلول­هایCHO سیستم ارجح برای تولید پروتئین­های نوترکیب برای استفاده درمانی در مقیاس وسیع هستند زیرا این سلول­ها به‏سرعت رشد می­کنند، به آسانی ترانسفکت می­شوند و می­توانند اصلاحات پیچیده پس ازترجمه مورد نیاز برای فعالیت زیستی را انجام دهند. همچنین این سلول­ها برای تولید داروهای نوترکیب ایمن هستند و به همین دلیل قابل اعتمادند. در این تحقیق هدف بهینه سازی تولید هورمون رشد انسانی نوترکیب به‏کمک سلول­های CHO­ می­باشد که به این منظور سلول­های CHO ترانسفکت شده با پلازمید حاوی ژن هورمون رشد کشت داده می­شود و در شرایط مختلف به‏منظور افزایش سطح تولید، تولید هورمون رشد را القا می­کنیم تا در صورت به‏دست آوردن مقدار بهینه، مقدمه­ ای برای تولید در مقیاس صنعتی فراهم شود. به این دلیل که GH از سلول­های CHO به محیط کشت سلولی ترشح می­شود، ابتدا تولید هورمون رشد در سلول­های ترانسفکت شده از طریق بررسی محیط رویی این سلول­ها با سلول­های کنترل (ترانسفکت نشده) توسط تکنیک الایزا و دات بلات اثبات شد. مقادیر بسیار ناچیز هورمون رشد در محیط کشت سلول­های فاقد پلازمید به‏دلیل وجود سرم در محیط کشت است، به­  این دلیل که سرم مخلوط بسیار پیچیده­ای حاوی مواد مختلف از جمله فاکتورهای رشد، پروتئین­های حامل، عناصر ضروری و هورمون­ها مثل هورمون رشد و غیره است. سرم برای نگه‏داری، تکثیر و تمایز سلول­های انسانی و حیوانی در محیط کشت لازم است؛ ولی با این وجود استفاده از سرم به چندین دلیل چالش برانگیز است که از آن جمله می­توان به هزینه بالا، مداخله در خالص سازی محصولات نوترکیب و امکان آلودگی­های ویروسی اشاره کرد. به همین دلیل در این تحقیق سعی بر این بوده است که پروتئین نوترکیب در محیط فاقد سرم تولید شود.

محققان تاثیر سرم، گلیسرول و دما را بر میزان تولید rhGH  بررسی کردند  و مشخص گردید گلیسرول 1 درصد، سرم 10 درصد و دمای 31 درجه سانتی‏گراد سطوح مناسب برای افزایش میزان تولید پروتئین هستند (27). در پژوهشی دیگر تاثیر DMSO بر بیان ژن­های خارجی در سلول­های CHO نوترکیب مورد بررسی قرار گرفت و مشاهده شد غلظت 1 درصد DMSO، باعث افزایش بیان این ژن­ها می‏شود. همچنین در این پژوهش تاثیر هم‏زمان پنتانوئیک اسید ( mMا( و DMSO (1 درصد) بر تولید پروتئین فیوژن CH0 -NTHU-108 تعیین شد و مشاهده شد میزان بیان 8/2 برابر افزایش یافت در حالی­که در حضور هر یک از این دو ماده به تنهایی، میزان بیان 6/1 برابر افزایش می‏یافت (28). Rodrigues و همکارانش (31) تاثیر DMSO، گلیسرول، سدیم بوتیرات و دما را بر میزان تولید اینترفرون بتا توسط سلول­های CHO بررسی کردند؛ در این آزمایش مشخص شد دمای 30 درجه سانتی‏گراد  با بیشترین تاثیر باعث افزایش 4 برابری در میزان تولید  می­شود، DMSO میزان تولید را 2 برابر، سدیم بوتیرات افزایش 3 برابری و گلیسرول میزان تولید را 85/0 برابر افزایش می­دهد (29). در مطالعه­ای دیگر میزان سرم محیط کشت، سدیم بوتیرات و سولفات روی بر میزان تولید اینترفرون بتا بررسی شد و مشخص شد حضور هر یک از این ترکیبات را 2 تا 8 برابر افزایش می­دهد اما زمانی­که این ترکیبات به­صورت هم‏زمان به محیط کشت افزوده می­شوند میزان تولید افزایش بیشتری خواهد داشت (30). Rodrigues و همکارانش (31) تاثیر سدیم بوتیرات را بر میزان تولید پرولاکتین انسانی نوترکیب در سلول­های CHO بررسی نمودند و مشاهده کردند در غلظت 1 درصد از این ترکیب تولید افزایش خواهد یافت. Liu  و Chen (32) مشاهده کردند در غلظت 1 درصد این ماده تولید M-CSF

نوترکیب در سلول­های CHO افزایش خواهد یافت.

DMSO و سدیم بوتیرات باعث توقف رشد سلول در فاز G1 و افزایش رونویسی و بیان پروتئین خارجی می­شوند. گلیسرول نیز به­عنوان چاپرون شیمیایی عمل کرده و فلدینگ صحیح پروتئین را بهبود می­بخشد و باعث افزایش سنتز پروتئین می­شود. روی به­عنوان متوقف کننده آپوپتوزیس در سلول­های انسانی شناخته می­شود و پایداری mRNA  را افزایش می­دهد و از این طریق تولید پروتئین افزایش می­یابد. به این دلیل که فاز G1 چرخه سلولی زمان ایده­آل برای افزایش تولید پروتئین نوترکیب در نظر گرفته می­شود، ابتدا سلول­ها به محیط حاوی سرم اضافه می‏شوند و پس از این­که سلول­ها به تراکم 80 درصد رسیدند بهترین زمان برای افزودن ترکیبات شیمیایی و جایگزین کردن محیط فاقد سرم است. در این مطالعه همانطور که انتظار می­رفت با افزودن این ترکیبات شیمیایی به محیط کشت بیان پروتئین افزایش و تا حدود دو برابر حالت کنترل رسید.

 

نتیجه گیری

نتایج حاصل از بهینه سازی تولید rhGH در CHO نشان دهنده­ی این مطلب بود که همه­ی فاکتورهای انتخاب شده تاثیر مثبت بر میزان تولید rhGH داشتند. فاکتور گلیسرول در غلظت 5/0 درصد بیشترین تاثیر بر میزان تولید را داشت و موثرترین غلظت برای فاکتورهای DMSO، سدیم بوتیرات و سولفات روی به ترتیب 1 درصد، 1میلی­مولار و 50 میکرومولار بود. بیشترین میزان تولید مربوط به فاکتور DMSO است که این فاکتور میزان تولید rhGH را حدود 2 برابر نسبت به حالت کنترل افزایش داده است.

 

تشکر و قدردانی

مقاله حاضر نتیجه قسمتی از طرح پژوهشی با شماره 265660/90 مصوب کمیته زیست فناوری دانشگاه اصفهان می‫باشد. مولفین از حمایت­های کمیته زیست فناوری، گروه زیست­شناسی و دانشگاه اصفهان تشکر و قدردانی می­نمایند.

 

1. Jayapal KP, Wlaschin KF, Hu WS. Recombinant protein therapeutics from CHO cells-20 years and counting.Chemical Engineering Progress. 2007; 103: 40-48.
2. Ferruzza S, Rossi C, Sambuy Y, Scarino ML. Serum-reduced and serum-free media for differentiation of Caco-2 cells. ALTEX. 2013; 30: 159-68.
3. Zhan X, Giorgianni F, Desiderio DM. Proteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary. Proteomics. 2005; 5(5): 1228-41.
4. Vance ML, Mauras N. Growth hormone therapy in adults and children. N Engl J Med. 1999; 341(16): 1206-16.
5. Martial JA, Hallewell RA, Baxter JD, Goodman HM. Human growth hormone: complementary DNA cloning and expression in bacteria. Science. 1979; 167(10): 602-7.
6. de Boer H, Blok GJ, Voerman B, de Vries P, et al. The optimal growth hormone replacement dose in adults, derived from bioimpedance analysis. J ClinEndocrinolMetab. 1995; 80: 2069-76.
7. Finkelstein BS, Imperiale TF, Speroff T, Marrero U, et al. Effect of growth homrone therapy on height in children with idiopathic short stature: a meta-analysis. Arch PediartAdolesc Med. 2002; 156: 230-40.
8. Sybert VP. Adult height in Turner syndrome with and without androgen therapy. J Pediatr. 1984; 104: 365-9.
9. Carrel AL, Myers SE, Whitman BY, Allen DB. Benefits of long-term GH therapy in Prader-Willi syndrome: a 4-year study. J ClinEndocrinolMetab. 2002; 87(4): 1581-5.
10. Rizzo V, Traggiai C, Stanhope R. Growth hormone treatment does not alter lowers limb asymmetry in children with Russell-Silver syndrome. Horm Res. 2001; 156(3-4): 114-6.
11. MacFarlane CE, Brown DC, Johnston LB, Patton MA, et al. Growth hormone therapy and growth in children with Noonan’s syndrome: results of 3 year’s follow-up. J ClinEndocrinolMetab. 2001; 86: 1953-6.
12. Anneren G, Sara VR, Hall K, Tuvemo T. Growth and somatomedin responses to growth hormone in Down’s syndrome. Arch Dis Child. 1986; 61(1): 48-52.
13. Simon D, Prieur A, Czernichow P. Treatment of juvenile rheumatoid arthritis with growth hormone. Horm Res. 2000; 53(3): 82-6.
14. Koch VH, Lippe BM, Nelson PA, Boechat MI, et al. Accelerated growth after recombinant human
 
growth hormone treatment of children with chronic renal failure. J Pediatr. 1989; 115(3): 365-71.
15. Bridges NA, Hindmarsh PC, Brook CG. Growth of children with hypochondroplasia treated with growth hormone for up tothree years. Horm Res. 1991; 36: 56-60.
16. Hardin DS, Sy JP. Effects of growth hormone treatment in children with cystic fibrosis: the National Cooperatve Growth Study experience. J Pediatr. 1997; 131: S65-9.
17. Key LL Jr, Gross AJ. Response to growth hormone in children with chondrodysplasia. J Pediatr. 1996; 128: S 14-7.
18. Henker J. Therapy with recombinant growth hormone in children with Crohn disease and growth failure. Eur J Pediatr. 1996; 155(12): 1066-7.
19. Rudman D, Feller AG, Nagraj HS, Gergans GA, et al. Effects of human growth hormone in men over 60 years old. N Engl J Med. 1990; 323(1): 1-6.
20. Rickert VI, Pawlak-Morello C, Sheppard V, Jay MS. Human growth hormone: a new substance of abuse among adolescents. ClinPediatr. 1992; 31:723-6.
21. Kumar N, Gammell P, Clynes M. Proliferation control strategies to improve productivity and survival during CHO based production culture: A summary of recent methods employed and the effects of proliferation control in product secreting CHO cell lines. Cytotechnology. 2007; 53(1-3):33-46.
22. Liu CH, Chen LH. Enhanced recombinant M-CSF production in CHO cells by glycerol addition: model and validation. Cytotechnology. 2007; 54:89-96.
23. Reddy P. Identification of novel small molecule enhancers of protein production by cultured mammalian cells. BiotechnolBioeng. 2008; 100:1193-204.
24. Rodriguez J, Spearman M, Huzel N, Butler M. Enhanced production of monomeric interferon-beta by CHO cells through the control of culture conditions. BiotechnolProg. 2005; 21:22-30.
25. Ling WL, Deng L, Lepore J, Cutler C, et al. Improvement of monoclonal antibody production in hybridoma cells by dimethyl sulfoxide.  BiotechnolProg. 2008; 19:158-62.
26. Zuqueli R, Prieto C, Etcheverrigaray M, Kratje R. Effect of sodium butyrate and zinc sulphate supplementation on recombinant human IFN-β production by mammalian cell culture. Latin American Applied Research. 2006; 36: 321-7.
27. Rezaei M, Zarkesh-Esfahani SH, Gharagozloo M. The effect of different media composition and temperatures on the production of recombinant human growth hormone by CHO cells. Research in Pharmaceutical Sciences.  2013; 8(3): 211-217.
29. Rodriguez J, Spearman M, Huzel N, Butler M. Enhanced production of monomeric interferon-beta by CHO cells through the control of culture conditions. Biotechnology Progress.  2005; 21: 22-30.
30. Zuqueli R, Prieto C, Etcheverrigaray M, Kratje R. Effect of sodium butyrate and zinc sulphate supplementation on recombinant human IFN-β production by mammalian cell culture Latin American applied research. 2006; 36: 321-327.
31. Rodrigues Goulart H, Arthuso Fdos S, Capone MV, de Oliveira TL, et al. Enhancement of human prolactin synthesis by sodium butyrate addition to serum-free CHO cell culture. J Biomed Biotechnology. 2010; 405872. 
32. Liu CH, Chen LH. Enhanced recombinant M-CSF production in CHO cells by glycerol addition: model and validation. Cytotechnology.  2007; 54: 89-96.