نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه اراک، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، کدپستی 8349-8-38156
2 دانش آموخته کارشناسی ارشد، دانشگاه اراک، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی
چکیده
هدف: هدف از این مطالعه بررسی اثر حفاظتی روغن سیاه دانه بهعنوان یک آنتی اکسیدانت بر بافت بیضه موش‌های تیمار شده با بیس فنول A بود.
مواد و روشها: در این مطالعه 24 سر موش نر بالغ NMRI به چهار گروه (6=n) : کنترل، بیس فنول A (mg/kg/day 200)، روغن سیاه دانه (ml/kg/day 5) و بیس فنول A + روغن سیاه دانه تقسیم شدند. 34 روز پس از تیمار دهانی با اندازه‌گیری وزن موش، بیضه راست خارج و فیکس شد. پارامترهای مورفومتریک بافت بیضه پس از انجام برش گیری، پاساژ بافتی و رنگ آمیزی Heidenhain's Azan ، توسط روش استریولوژی مورد ارزیابی قرار گرفت.
نتایج : میانگین حجم لوله‌های منی‌ساز، ارتفاع اپیتلیوم زایشی، قطر و ضخامت غشا پایه لوله‌های منی‌ساز، تعداد سلول‌های اسپرماتوسیت، اسپرماتید گرد و دراز، اسپرماتوگونی و سلول‌های سرتولی در گروه بیس فنول A نسبت به گروه کنترل کاهش معنی‌داری نشان داد (05/0 p <). افزایش میانگین حجم لوله‌های منی‌ساز و تعداد سلول‌های سرتولی در گروه بیس فنول A + روغن سیاه دانه در حد گروه کنترل بود اما میانگین تعداد سلول‌های اسپرماتوسیت و اسپرماتید گرد و دراز در این گروه نسبت به گروه بیس فنول A دارای افزایش معنی‌داری شد (05/0p <).
نتیجه گیری: مصرف همزمان روغن سیاه دانه و بیس فنول A از اثرات نامطلوب بیس فنول A بر بافت بیضه موش بالغ جلوگیری نمود.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Protective effect of Nigella sativa oil on the Bisphenol A induced-testicular toxicity in adult mice(NMRI): a stereological study
نویسندگان [English]
- M S 1
- SMA Sh 1
- M A 2
چکیده [English]
Aim: The aim of this study was to investigate the protective effect of Nigella sativa oil (NSO),as an antioxidant, on the testicular tissue in mice treated with bisphenol A.
Material and Methods: In this study, 24 adult male mice NMRI were divided into four groups (n=6): control, bisphenol A (200 mg/kg/day), nigella sativa oil (5 ml/kg/day) and bisphenol A + nigella sativa oil. 34 days after oral treatment, the right testis was taken out, fixed and processed followed by Heidenhain's Azan staining. The morphometric parameters of the testicular tissue were evaluated using stereological methods.
Results: The mean volume of seminiferous tubules and it's height of the germinal epithelium, the mean diameter and thickness of the basement membrane, the mean number of spermatocytes, round and long spermatids, spermatogonia and sertoli cells significantly reduced in the bisphenol A group compared to the controls (p < 0.05). The mean volume of seminiferous tubules and the mean number of Sertoli cells significantly increased in the bisphenol A + nigella sativa oil group to the control level, The mean number of spermatocytes and round and long spermatids also showed a significant increase in this group compared to the bisphenol A group (p < 0.05).
Conclusion: Co-administration of nigella sativa oil with bisphenol A can prevent the adverse effects of bisphenol A on the testicular tissue in adult mice.
کلیدواژه‌ها [English]
- Stereology
- Bisphenol A
- Testes
- Nigella sativa oil
مقدمه
بیس‌فنول A (BPA) یک ماده زنواستروژن است که در تولید مونومرهای پلی‌کربنات و رزین‌های اپوکسی و پلیمرهای سبک ولی سخت استفاده می‌شود مثل: شیشه کودکان، ظروف، شیشه‌های شیر، بطری‌های آب معدنی، روکش رنگی مواد ساختمانی (1و2). بیس فنول A میتواند از طریق بسته بندی مواد غذایی مثل ظروف پلاستیکی پلی کربناته و قوطیهای نوشیدنی وارد مواد غذایی شده و در نهایت وارد بدن شود (3). انسانها ازطریق رژیم غذایی خود، استنشاق گرد و غبار خانگی و پوست در معرض بیس فنول A هستند (4).
آزمایشات انجام گرفته در هر دو محیط آزمایشگاهی و موجود زنده نشان داده که BPA بهعنوان یک ماده شیمیایی تخریب کننده اندوکرین (EDC) عمل میکند (5). مشابه با استروژنهای دیگر BPA میتواند به رسپتورهای استروژنی متصل شود و از عمل آندروژنها ممانعت کند. شواهد نشان میدهد که بیس فنول A میتواند روی تکامل گنادها، غدد ضمیمه و اسپرماتوژنز تاثیر بگذارد، که این اثر بهوسیله عمل مستقیم بر روی برهمکنشهای بین سلول‌های سرتولی و رده سلول‌های زایگر ایجاد می‌شود (6 و 7). تحقیقات نشان داده که قرار گرفتن جوندگان در معرض بیس فنول A در دوران بارداری، باعث اختلال در عملکرد غدد درون ریز و سیستم تولید مثلی نوزادان نر و ماده می‌شود (8). مشاهده شده که BPA باعث افزایش سطح گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) و لیپید پراکسیداسیون دربافت بیضه رتهای بالغ نیز می‌شود (9). بیس فنول A همچنین موجب کاهش فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانتی مثل سوپر اکسید دیسموتاز، کاتالاز و گلوتاتیون میگردد و باعث ایجاد استرس اکسیداتیو و آسیب بافتی در بیضه، مغز، کبد، کلیه و دیگر اندامها می‌شود. افزایش استرس اکسیداتیو در بیضه لیپید پراکسیداسیون غشا را نیز بهدنبال خواهد داشت (10 و 11).
گیاه سیاه دانه با نام علمی (Nigella sativa) یک گیاه سالانه و بومی جنوب و جنوب غربی آسیاست. از دانه گیاه سیاه دانه چهار نوع آلکالوئید بهنامهای nigellicine, nigellidine, nigellimine-N-oxide, nigellone استخراج شده است. تیموکوینون، دی تیموکوینون، تیموهیدروکوینون و تیمول مواد موثره اصلی در عصاره آبی دانه گیاه هستند (15-12). این گیاه طیف گستردهای از خواص پزشکی را دارد که شامل اثرات ضد میکروب، ضد تومور، ضد ویروس، ضد التهاب و آنتی اکسیدانت میباشد (16). تحقیقات نشان داده است که بیشتر فعالیت بیولوژیکی دانه این گیاه مربوط به تیموکوینون (TQ)، یعنی جز اصلی روغن فرار دانه گیاه سیاه دانه است. هم روغن و هم اجزای تشکیل دهنده سیاه دانه و بهویژه تیموکوینون دارای خواص آنتی اکسیدانتی و ضد التهابی است و خواص ضد التهاب آن از طریق سرکوب واسطههای التهابی مانند پروستاگلندینها و لکوترینها اعمال می‌شود (17 و 18). اسیدهای چرب غیر اشباع در روغن سیاه دانه فعالیت آنزیم –β هیدروکسی استروئید دهیدروژناز را تحریک میکند، این آنزیم، در مسیر سنتز تستوسترون نقش دارد. همچنین سیاه دانه بهعنوان آنتی اکسیدانت روی بیضه، غدد ضمیمه، اپیدیدیم و اسپرم اثر میگذارد و از آسیب رادیکالهای آزاد جلوگیری میکند (19، 20 و 21). این مطالعه بهمنظور تعیین اثر روغن سیاه دانه بر اثرات بیس فنول A روی بافت بیضه موش بالغ نژاد NMRI انجام شد .
مواد و روشها
این مطالعه تجربی روی 24 سر موش نر بالغ نژاد NMRI با وزن تقریبی 3±32 گرم خریداری شده از انستیتو پاستور ایران در دانشگاه اراک طی سال 1393 انجام شد.
موشها در خانه حیوانات و در شرایط استاندارد شامل دمای 2±21 درجه سانتیگراد، نور محیطی با شرایط 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی و دسترسی آزادانه به آب و غذا نگهداری شدند. سپس حیوانات بهطور تصادفی در 4 گروه 6 تایی شامل کنترل، بیس فنول A (mg/kg/day 200)، روغن سیاه دانه (ml/kg/day 5) و روغن سیاه دانه (ml/kg/day 5)+ بیس فنول A (mg/kg/day 200) گروهبندی و بهصورت دهانی تیمار شدند.
بیس فنول A، از شرکت (Sigma-Aldrich Chemie GmbH) و روغن سیاه دانه از پژوهشکده گیاهان دارویی جهاد دانشگاهی کرج خریداری و مورد استفاده قرار گرفت.
سایر مواد شیمیایی مورد استفاده از شرکت Merck آلمان تهیه شد. دوز بیس فنول A بر اساس دوزهای مورد استفاده در تحقیقات قبلی با پیامدهای آسیب شناختی بر روی سیستم تناسلی موش نر NMRI انتخاب شد (22) و دوز روغن سیاه دانه (23) نیز بر همین اساس انتخاب شد. مدت زمان قرارگیری در معرض بیس فنول A، 34 روز بود که زمان مورد نیاز برای تکمیل یک دوره کامل اسپرماتوژنز است (24) و تیمار با روغن سیاه دانه نیز بههمراه تیمار با بیس فنول A انجام گردید.
در پایان دوره تیمار ابتدا موشها وزن و سپس با استفاده از دی اتیل اتر بیهوش شدند و پس از تشریح، بیضه راست آنها خارج و پس از تمیز کردن وزن شد و حجم بیضه با استفاده از روش غوطه ورسازی (Immersion) (25) برآورد گردید. سپس برای انجام ثبوت بافتی در محلول ثبوتی اصلاح شده داویدسون (26) بهمدت یک هفته با دو بار تعویض محلول ثبوتی قرار داده شد. لازم بهذکر است که تمامی اصول بهداشتی در نگهداری و معدوم سازی حیوانات بر اساس پروتکل اخلاقی انجام شد.
از روش Orientator برای بهدست آوردن برش‌های IUR (همشکل و همسان تصادفی) استفاده شد (27). به این منظور، بیضهها بهطور تصادفی در ساعت فی(ф) که به نه قسمت مساوی تقسیم شده بود؛ قرار داده شد. سپس با انتخاب یک عدد تصادفی از یک تا نه بیضه در امتداد عدد انتخاب شده برش زده شد. نتیجه این برش ایجاد دو قطعه از بیضه بود. قطعه اول بر روی ساعت تتا که به 9 قسمت نابرابر تقسیم شده بود؛ طوری قرار گرفت که سطح برش خورده در طول محور 0-0 ساعت تتا (θ) قرار گرفت. سپس یک عدد تصادفی انتخاب و برشی موازی در امتداد عدد انتخاب شده، زده شد. ادامه برشها بهصورت موازی و مساوی با برش اول زده شد و قطعه دوم به اندازه 90 درجه چرخانده شد تا سطح برش خورده مماس بر محور 0-0 ساعت تتا قرار گرفت. سپس یک عدد تصادفی انتخاب و برشها بهموازات عدد انتخاب شده تهیه شدند (27). اسلایدهای تهیه شده از هر بیضه با حفظ جهت، پاساژ بافتی داده شد و پس از تهیه قالبهای پارافینی توسط میکروتوم (Leitz 1512) مقاطع با ضخامت 5 و 20 میکرومتر تهیه و با روش رنگ آمیزی هایدن هان آزان رنگ آمیزی شد.
بهمنظور محاسبه چروکیدگی با استفاده از تروکار بهصورت تصادفی سه قطعه گرد از برش‌های IUR بهدست آمده از بیضه هر موش ایجاد شد. سپس دو قطر عمود بر هم اندازه گیری و میانگین شعاع آن محاسبه شد و بهعنوان شعاع قبل از تثبیت بافتی در نظر گرفته شد. پس از تثبیت بافتی، پردازش بافت (پاساژ بافتی)، برش گیری و رنگ آمیزی مجددا اندازه‌گیری قطر قطعات همانند بالا انجام شد و میانگین شعاع حاصله بهعنوان شعاع پس از تثبیت در نظر گرفته شد. مقدار چروکیدگی در هر بیضه برآورد شد (28). برای بهدست آوردن حجم واقعی بیضه، مقدار چروکیدگی از حجم حاصل از روش غوطه ورسازی کم شد.
بهمنظور محاسبه حجم لوله‌های منی‌ساز و بافت بینابینی، با استفاده از روش نمونهگیری تصادفی منظم، بهطور میانگین 5 میدان دید از هر برش 5 میکرومتری بهوسیله قرار دادن تصادفی پروب نقطهای بر روی هر میدان دید، مورد بررسی قرار گرفت. کل نقاط برخورد کرده از پروب با کل میدان دید انتخاب شده و به همین ترتیب نقاط برخورد کرده با لوله‌های منی‌ساز و بافت بینابینی شمارش گردید و دانسیته حجمی هر یک از آنها محاسبه شد (28).
برای محاسبه میانگین قطر لوله‌های منی‌ساز از میکروسکوپ Olympus DP12 مجهز به یک دوربین و از فریم مخصوص شمارش استفاده شد. برای این کار از میدانهای دید مربوط به محاسبه طول لوله‌های منی‌ساز عکس گرفته شد و قطر عمود بر محور طولی حدود 130 تا 150 لوله منی‌ساز با استفاده از نرم افزار موتیک (Motic image 2000) اندازه گیری شد (29).
برای محاسبه ارتفاع اپیتلیوم زایشی با استفاده از ابژکتیو با بزرگنمایی 10 بهطور متوسط 5 میدان دید از هر برش 5 میکرومتری بافت بیضه مربوط به هر موش مورد مطالعه قرار گرفت. برای بهدست آوردن دانسیته حجمی اپیتلیوم زایشی، کل نقاط برخورد کرده از پروب با تصویر بافت بیضه مربوط بههر میدان دید شمارش و سپس تعداد کل نقاط برخورد کرده با اپیتلیوم زایشی نیز شمارش شد و بر مجموع نقاط برخورد کرده با بافت بیضه تقسیم شد. بدین ترتیب دانسیته حجمی اپیتلیوم زایشی بهدست آمد. سپس دانسیته سطح اپیتلیوم زایشی محاسبه شد (28).
بهمنظور محاسبه میانگین ضخامت غشا پایه لوله‌های منی‌ساز از روش اندازه‌گیری هارمونیک (Harmonic) استفاده شد (30). 24 تا 26 میدان دید از همه اسلایدهای 5 میکرومتری بافت بیضه هر موش با استفاده از ابژکتیو با بزرگنمایی 100 و روش تصادفی منظم انتخاب شد. سپس یک پروب که دارای خطوط موازی و مساوی (خطوط ایزوتروپیک) بود؛ بر روی عکسهای گرفته شده از مقطع بیضه انداخته شد و از محل برخورد خطوط پروب با غشا داخلی غشاء پایه یک خط عمود بر خط مماس غشا خارجی کشیده شد و سپس طول این خط توسط نرم افزار موتیک اندازه گیری شد و میانگین ضخامت غشاء پایه محاسبه گردید.
بهمنظور محاسبه طول لوله‌های منی‌ساز حدود 5 میدان دید (فریم، با سطح 6300 میکرومتر مربع) از هر برش 5 میکرومتری با استفاده از ابژکتیو با بزرگنمایی 10 انتخاب شد و بهطور میانگین 130 تا 150 لوله منی‌ساز در بیضه هر موش با استفاده از فریم شمارش (unbiased counting frame) شمارش گردید (28و27). دانسیته طولی لوله‌های منی‌ساز محاسبه شد (28). برای بهدست آوردن طول کل لوله‌های منی‌ساز، دانسیته طولی در حجم نهایی بیضه ضرب شد (28).
برای محاسبه تعداد انواع سلول‌ها از روش optical dissector و از فریم مخصوص شمارش استفاده شد (28 و 31). برای اینکار با استفاده از ابژکتیو با بزرگنمایی 100 از همه برش‌های 20 میکرومتری بیضه هر موش تعدادی فریم (سطح هر فریم،460میکرومتر مربع) برای شمارش انواع سلول‌ها، انتخاب شد و میکروکیتور (ND 221 B, Heidenhain, Germany)برای شمارش مورد استفاده قرار گرفت. سپس دانسیته عددی انواع سلول‌ها محاسبه گردید. برای محاسبه تعداد کل انواع سلول‌های مورد نظر، عدد حاصل در حجم کل بیضه مربوطه ضرب شد.
آنالیز آماری:دادههای حاصل توسط نرم افزار SPSS-16 و روش آنالیز واریانس یکطرفه و تست Tukey مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند و تفاوت میانگینها در سطح کمتر از 05/0 معنیدار در نظر گرفته شد.
نتایج
از مقایسه میانگین حجم کل بیضه موشها در بین گروههای مختلف موش اختلاف آماری معنی‌داری مشاهده نشد، اما میانگین حجم لوله‌های منی‌ساز (mm3) در گروه بیس فنول A نسبت به سایر گروهها کاهش معنی‌داری را نشان داد (01/0 p<). همچنین در گروه تیماری همزمان روغن سیاه دانه با بیس فنول A، نسبت به گروهی که فقط بیس فنول A دریافت کرده بودند اختلاف معنی‌داری مشاهده شد (006/0p<)(جدول 1).
میانگین طول لوله‌های منی‌ساز در بین چهار گروه تفاوت آماری معنی‌داری نشان نداد. این در حالی است که کاهش آماری معنی‌داری در میانگین قطر لوله‌های منی‌ساز (001/0p<)، ارتفاع اپیتلیوم زایشی (01/0 p<) و میانگین ضخامت غشا پایه لوله‌های منی‌ساز (01/0 p<) در گروه بیس فنول A نسبت به گروه کنترل دیده شد. افزایش پارامترهای فوق در گروه همزمان روغن سیاه دانه با بیس فنول A نسبت به گروه بیس فنول A معنیدار نبود (جدول2).
جدول 1: مقایسه میانگین حجم کل بیضه (mm3)، حجم لوله‌های منی‌ساز (mm3) و حجم بافت بینابینی (mm3) در گروههای مختلف موش 34 روز پس از تیمار با بیس فنول A (mg/kg/day200) و روغن سیاه دانه (ml/kg/day5).
|
گروهها |
میانگین حجم لوله‌های منی‌ساز (mm3) |
میانگین حجم کل بیضه (mm3) |
میانگین حجم بافت بینابینی (mm3) |
|
کنترل بیس فنول A بیس فنول A+ روغن سیاه دانه روغن سیاه دانه |
a13/5±60/56 b22/7±41/45 a72/4±84/58 a07/7±14/58 |
a91/6±55/72 a66/8±86/63 a57/4±43/75 a91/7±58/73
|
a89/1±95/15 a76/1±45/18 a84/1±59/16 a35/2±44/15 |
جدول 2: مقایسه میانگین طول (m) ، قطر (μm)، ضخامت غشاء پایه (μm) و ارتفاع اپیتلیوم زایشی لوله‌های منی‌ساز (μm) در گروههای مختلف موش 34 روز پس از تیمار با بیس فنول A(mg/kg/day200) و روغن سیاه دانه (ml/kg/day5).
|
گروهها |
ضخامت غشا پایه لوله‌های منی‌ساز (μm) |
قطر لوله‌های منی‌ساز (μm) |
طول لوله‌های منی‌ساز (m) |
ارتفاع اپیتلیوم زایشی لوله‌های منی‌ساز (μm) |
|
کنترل بیس فنول A بیس‌فنول A + روغن سیاه دانه روغن سیاه دانه |
a36/0±83/4 b35/0±14/4 ab41/0±56/4 a14/0±87/4 |
a86/5±77/200 b81/6±93/185 ab99/7±42/191 a75/6±15/197 |
a15/0±81/1 a24/0±65/1 a24/0±94/1 a36/0±86/1 |
a97/4±76/59 b83/2±58/48 ab75/9±58/54 a63/4±75/58 |
کاهش معنی‌داری در میانگین تعداد سلول‌های اسپرماتوگونی (003/0p<)، سرتولی (01/0p<)، اسپرماتوسیت (001/0p<)، اسپرماتید دراز (001/0p<) و اسپرماتید گرد (001/0p<) در گروه بیس فنول A نسبت به گروه کنترل مشاهده شد . از طرفی میانگین تعداد سلول‌های اسپرماتوسیت ، اسپرماتید دراز و گرد و سرتولی(در حد گروه کنترل) در گروه تیماری همزمان با بیس فنول A و روغن سیاه دانه دارای افزایش معنی‌داری نسبت به گروه بیس فنول A بود (03/0p<). علاوه بر این میانگین تعداد سلول‌های اسپرماتوسیت و اسپرماتید دراز و گرد نسبت به گروه کنترل نیز دارای تفاوت معنی‌داری بود (002/0p<). میانگین تعداد سلول‌های اسپرماتوگونی در گروه تیماری همزمان با روغن سیاه دانه و بیس فنول A دارای اختلاف معنی‌داری با گروه کنترل نبود (جدول 3).
میانگین وزن بدن موش و وزن بیضه نیز پس از اتمام دوره تیمار در بین گروههای مختلف اختلاف آماری معنی‌داری نشان نداد (جدول 4).
جدول3: مقایسه میانگین تعداد انواع سلول‌های اسپرماتوگونی، اسپرماتوسیت، اسپرماتید(گرد و دراز)، سرتولی (106×) در گروههای مختلف موش 34 روز پس از تیمار با بیس فنول A (mg/kg/day200) و روغن سیاه دانه (ml/kg/day5).
|
گروهها |
میانگین تعداد سلول‌های اسپرماتید گرد 106× |
میانگین تعداد سلول‌های اسپرماتید دراز 106× |
میانگین تعداد سلول‌های اسپرماتوسیت 106× |
میانگین تعداد سلول‌های اسپرماتوگونی 106× |
میانگین تعداد سلول‌های سرتولی 106× |
|
کنترل بیس فنول A بیس‌فنول A + روغن سیاه دانه روغن سیاه دانه |
a79/1±1/40 b18/1±1/28 c47/1±8/32 a51/3±0/39 |
a79/1±4/39 b21/1±7/27 c07/1±5/33 a07/3±2/38 |
a76/1±5/21 b17/7±6/12 c79/1±5/17 a95/1±3/21 |
a41/0±5/5 b52/0±5/4 ab39/0±2/5 a37/0±3/5 |
a32/0±86/3 b47/0±20/3 a21/0±80/3 a34/0±79/3 |
جدول 4: مقایسه میانگین وزن بیضه (میلیگرم) و وزن موش (گرم) در گروههای مختلف موش 34 روز پس از تیمار با بیس فنول A(mg/kg/day200) و روغن سیاه دانه (ml/kg/day5).
|
گروهها |
میانگین وزن موش در پایان تیمار(گرم) |
میانگین وزن اولیه موش(گرم) |
میانگین وزن بیضه (میلیگرم) |
|
کنترل بیس فنول A بیس‌فنول A + روغن سیاه دانه روغن سیاه دانه |
a93/0±63/34 a05/3±33/34 a77/6±53/34 a54/2±63/33 |
a22/3±85/32 a64/1±32/32 a12/3±80/32 a80/3±46/29 |
a72/14±33/108 a11/12±33/93 a16/8±33/113 a02/16±67/111 |
لوله‌های منی‌ساز در گروه کنترل اسپرماتوژنز طبیعی داشته، اپیتلیوم زایشی لوله‌ها شکل طبیعی خود را حفظ کرده و سلول‌ها دارای نظم و ترتیب و بههم پیوستگی بود (شکل A-1). در بیضه‌های موش‌های گروه بیس‌فنول آ آتروفی لوله‌های منی‌ساز مشاهده شد( شکل B-1). همچنین در گروه بیس‌فنول‌آ+روغن سیاه دانه اکثر تغییرات تخریبی ایجاد شده بهوسیله بیس‌فنول‌آ با تجویز روغن سیاه دانه تا حدودی برگشت و تعدیل یافته بود (شکل C-1). در گروه روغن سیاه‌دانه نیز ساختار لوله‌های منی‌ساز و ضخامت اپیتلیوم زایشی تقریبا مشابه گروه کنترل بود (شکل D-1).
شکل 1: بافت بیضه موش‌های بالغ در گروههای مختلف، تیمار شده با بیس فنول A (mg/kg/day200) و روغن سیاه دانه (ml/kg/day5)، (برش‌های 5 میکرومتری، رنگ آمیزی هایدنهانآزان، بزرگنمایی ×200)، (A) اپیتلیوم زایشی در گروه کنترل، (B) کاهش ضخامت اپیتلیوم زایشی و بینظمی اپیتلیوم زایشی در گروه تیمار شده با بیس‌فنول‌آ، (C) نمای لوله‌های منی‌ساز در گروه تیمار شده با بیس‌فنول آ +روغن سیاه دانه، (D) اپیتلیوم زایشی در گروه تیمار شده با روغن سیاه دانه.
بحث
در این مطالعه تیمار موش‌های بالغ با بیس فنول A بهمدت 34 روز باعث کاهش حجم لوله‌های منی‌ساز، کاهش قطر، ارتفاع و ضخامت غشا پایه لوله‌های منی‌ساز، کاهش تعداد سلول‌های اسپرماتوگونی، اسپرماتوسیت، اسپرماتید دراز و گرد و سرتولی گردید.
از جمله دلایلی که می‌توان برای اثرات بیس فنول A بر بافت بیضه ذکر کرد، اثر استرس اکسیداتیوی آن است. BPA باعث افزایش سطح رادیکالهای آزاد (ROS) و لیپید پراکسیداسیون و کاهش فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدانتی مانند سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز و گلوتاتیون در بافت بیضه می‌شود (32). بافت بیضه بهدلیل دارا بودن درصد بالای اسیدهای چرب غیر اشباع در غشا سلولهایش و درجه بالای متابولیسم و تکثیر سلولی در این بافت، به استرس اکسیداتیو بسیار حساس می باشد که این مساله نشان دهنده پر اهمیت بودن ظرفیت آنتی اکسیدانتی بافت بیضه است (33). بنابراین اثرات مشاهده شده در این مطالعه را می‌توان تا حدی ناشی از اثرات استرس اکسیداتیوی BPA دانست. نتایج مطالعه حاضر کاهش معنی‌داری را در قطر و ارتفاع اپیتلیوم زایشی لوله‌های منی‌ساز نشان داد. در مطالعه Atsushi و همکارانش (34) بر روی موش‌های ICR والد که با دوزهای µg/kg/day 100 و mg/kg/day 5 از BPA تیمار شدند، کاهش قطر لوله‌های منی‌ساز در نوزادان نر آنها دیده شد. همچنین Tan و همکارانش (35) نشان دادند که بیس فنول A بر اسپرماتوژنز رتها اثر میگذارد. آنها به رتهای نر از 23 تا 53 روز بعد از تولد ، دوز mg/kg bw 100 از بیس فنول A را بهصورت گاواژ دادند و مشاهده کردند که بیس فنول A باعث دژنره شدن اپیتلیوم زایشی می‌شود. بیس فنول A کاهش سطح هورمون تستوسترون، اختلال در اسپرماتوژنز و کم شدن لایههای اپیتلیوم زایشی را موجب می‌شود (36 و 37). بنابراین تغییر در سطح این هورمون نیز خود ممکن است دلیلی بر کاهش قطر لوله‌های منی‌ساز در بیضه موش‌های تیمار شده با بیس فنول A باشد. ROS ایجاد شده بهوسیله بیس فنول A نیز میتواند باعث لیپید پراکسیداسیون اپیتلیوم زایشی شود و قطر لوله‌های منی‌ساز را کاهش دهد (38). کاهش در ارتفاع اپیتلیوم زایشی در موش‌های تیماری با بیس فنول A نیز نشان دهنده کاهش تعداد سلول‌های جنسی در اپیتلیوم زایشی و آزاد سازی زود هنگام اسپرماتیدهای نابالغ به لومن است . BPA با آسیب زدن به ارتباطات بین سلول‌های سرتولی در مناطق ES (Ectoplasmic Specialization) منجر به بی ثباتی سد خونی- بیضهای و در نهایت باعث از دست رفتن اسپرماتوسیتها، اسپرماتیدها و آزاد سازی زود هنگام اسپرماتوزوآ بهداخل لومن می‌شود (7 و 39). بنابراین احتمال میرود BPA از این طریق موجب کاهش ارتفاع اپیتلیوم زایشی شده باشد .
با توجه به این که غشا پایه نیز از جنس پروتئین میباشد (40)، این احتمال وجود دارد که بیس فنول A با تاثیر بر روی پروتئینهای غشا پایه باعث کاهش ضخامت آن شده باشد .
نتایج حاضر کاهش معنی‌داری را در حجم لوله‌های منی‌ساز نشان داد. در این مورد Takahashi و Oishi (41) نیز آتروفی لوله‌های منی‌ساز را در موش‌های بالغ پس از تیمار با بیس فنول A گزارش کردند که با یافتههای مطالعه حاضر همراستا است. در مطالعه حاضر حجم بیضه در گروه بیس فنول A نسبت به گروه کنترل تغییر معنی‌داری نشان نداد. احتمال دارد که دوز بیس فنول A و طول مدت تیمار در مطالعه حاضر برای القا تغییرات آناتومیکی بزرگ در بیضه موشها کافی نبوده باشد. نتایج نشان داد که در پایان دوره تیمار در وزن بدن و بیضه حیوانات گروه بیس فنول A کاهشی صورت نگرفت که با مطالعات پیشین در این ارتباط سازگار است.
تعدادی پروتئین مانند occludin ، zonula occludens-1 ، N-cadherin و connexin 43 در اتصالات بین سلولی در رده سلول‌های سرتولی وجود دارد که بیس فنول A میتواند منجر به کاهش بیان ژن یا تغییر جایگاه آنها بر روی غشا شود (42). از این طریق به این اتصالات آسیب وارد کند و اسپرماتوژنز را دچار اختلال نماید. برخی مطالعات نیز در محیط in vitro نشان داده که BPA موجب آپوپتوز سلول‌های سرتولی می‌شود (43 و 44).
در کل با توجه به نتایج حاصل از این تحقیق و نتایج دیگران می‌توان کاهش سلول‌های اسپرماتوسیت، اسپرماتید گرد و دراز و سرتولی را به چند دلیل مربوط دانست. 1) بر هم خوردن تعادل هورمون های جنسی 2) از آنجایی که سلول‌های جنسی در یک محیط تولید شده توسط سلول‌های سرتولی زندگی میکنند (45)، لذا با از بین رفتن سلول‌های سرتولی شرایط مناسب برای زندگی سلول‌های جنسی نیز از بین میرود. 3) افزایش آپوپتوزیس 4) القا استرس اکسیداتیو.
در مطالعه حاضر روغن سیاه دانه در گروه بیس فنول A + روغن سیاه دانه باعث شد که کاهش در حجم لوله‌های منی‌ساز در حد گروه کنترل بهبود یابد. همچنین قطر، ضخامت غشا پایه و ارتفاع اپیتلیوم زایشی لوله‌های منی‌ساز هم در گروه بیس فنول A+ روغن سیاه دانه نسبت به گروه بیس‌فنول‌آ افزایش داشت اما این تفاوت معنیدار نبود. این یافته با گزارشات پیشین هم سو است. نقش روغن سیاه دانه در دستگاه تولید مثلی و بنابراین در تولید مثل بهوسیله کاهش پراکسیداسیون لیپیدی به اثبات رسیده است. این احتمال وجود دارد که روغن سیاه دانه باعث افزایش سطح گلوتاتیون و گروههای تیول شده و این گروهها با خنثی کردن رادیکالهای آزاد باعث کاهش پراکسیداسیون لیپیدی و استرس اکسیداتیو شوند (19 و 46). بنابراین با توجه به مطالب ذکر شده در مورد اثرات حفاظتی روغن سیاه دانه بر بافت بیضه، دور از انتظار نیست که این روغن موجب بهبود پارامترهای فوق در مطالعه حاضر شده باشد.
نتیجهگیری
نتایج این مطالعه نشان داد که بیس فنول A قادر به القا سمیت در بافت بیضه موش بالغ است و روغن سیاه دانه بهعنوان یک آنتی اکسیدانت توانست اثرات نامطلوب آن را بر بافت بیضه جبران کند. با توجه به نتایج این مطالعه و مطالعات دیگران می‌توان نتیجه گرفت که اثرات نامطلوب بیس فنول A بر بافت بیضه موش بالغ عمدتا بهدلیل القا استرس اکسیداتیو توسط این آلاینده بر بافت بیضه است. در نتیجه می‌توان پیشنهاد داد که روغن سیاه دانه را بهعنوان یک آنتی اکسیدانت در برابر سمیت بیضوی ایجاد شده بر اثر بیس فنول A استفاده کرد.
تشکر و قدردانی
این مقاله حاصل پایان نامه آقای مهدی آزادپور برای اخذ درجه کارشناسی ارشد در رشته زیست سلولی تکوینی از دانشکده علوم پایه دانشگاه اراک بود و با حمایت مالی حوزه معاونت محترم پژوهشی و فناوری دانشگاه اراک به انجام رسیده است. در ضمن از کمکهای ارزشمند خانم نادری و همچنین آقای مهدی نوده فراهانی در این مطالعه صمیمانه سپاسگزاری می‌شود.
)