نوع مقاله : علمی - پژوهشی
نویسندگان
1 دانشگاه آزاد اسلامی واحد دامغان ، گروه زیست شناسی، دامغان، ایران
2 دانشگاه آزاد اسلامی واحد مشهد، گروه زیست شناسی، مشهد، ایران
چکیده
هدف: هدف از این مطالعه بررسی کمی بیان mRNA ژنSALL4 در مزنسفالن طی مراحل رشد و نمو جنینی جوجه است . مواد و روش‌ها : در این پژوهش تجربی از تخم مرغهای نطفه دار انکوبه شده در حرارت37 تا 5/37 درجه سانتیگراد و رطوبت 60 تا 65 درصد استفاده شد. پس از شروع رشد و نمو جنینی قسمتی از بافت پروزنسفالن مغز بهطور روزانه از تخم مرغها جمع آوری گردید، از بافت تفکیک شده Total RNA استخراج و سنتز cDNA انجام شد. cDNA سنتز شده بهعنوان الگو برای بررسی کمی بیان SALL4 mRNA ؛ بهروش Real Time PCR مورد استفاده قرار گرفت. نتایج: نتایج حاصل از Real-time PCR رونوشت‌هایSALL4 در بافت مزونسفالون مغز در طی تکوین جوجه نشان میدهد که بیان ژنSALL4 در طول رشد و نمو جنین در مزنسفالن متغیر است، درحالیکه بیان mRNA ژن SALL4 در طول رشد و نمو جنینی بررسی‌شد، بیشترین تعداد نسخههایmRNA ژنSALL4 از لحاظ کمی در نوزدهمین روز جنینی یافت شد. نتیجه گیری: در بررسی سطح بیانmRNA ژنSALL4 طی مراحل مختلف رشد و نمو جنینی جوجه، از روی شواهد میتوان پیشبینی نمود که احتمالا ارتباطی بین بیانSALL4 درمراکزعصبی مزنسفالن مغز و تکامل اندامهایی بینایی وجود داشته باشد.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Expressional analysis of stem cell marker SALL4 in mesencephalon during chicken embryogenesis
نویسندگان [English]
- M B 1
- S Z 2
- M F 1
چکیده [English]
Aim: Our aim in this study was to analyze and quantify mRNA expression of SALL4 in mesencephalon, during different stages of chicken embryogenesis. Material and methods: In this experimental study, incubated Ross fertilized eggs were applied in 37°C-37.5°C in 60-65% humidified atmosphere after beginning of embryogenesis. Mesencephalon part of the brain tissue was collected from the eggs, daily. Total RNA extraction and cDNA synthesis was performed from resected tissues. The synthesized cDNA was used as template for quantitatively analysis of SALL4 mRNA expression by real-time PCR. Results: The Real-time PCR analysis of SALL4 mRNA expression in mesencephalon tissues indicated that the level of gene expression is significantly variable during embryogenesis. While the basal level of SALL4 mRNA expression was detected during the rest of embryogenesis, the maximum copy number of SALL4 mRNA was quantified on 19th day of chicken development. Conclusion: Having analyzed the level of SALL4 mRNA expression in different stages of chicken embryogenesis, we can extrapolate that a probable relationship may be existed between expression of SALL4 in nerve centers of mesencephalon brain and development of optic organs. Keywords:
کلیدواژه‌ها [English]
- Embryogenesis
- Gene expression
- Mesencephalon
- Real time PCR
- SALL4
مقدمه
یکی از ابزارهای بیولوژیکی مهم در جنین شناسی، مطالعه جنین جوجه میباشد که به دلایل متعددی حائز اهمیت است، تشابه زیادی در نمو جنینی انواع پرندگان بالاخص جنین جوجه با انواع پستانداران دیده میشود. علاوه بر این با بهوجود آوردن سیستم مصنوعی جهت رشد و نمو جنینی مطالعه آنها در آزمایشگاه بهسهولت امکان پذیر است؛ این موجود برای سالهای زیادی از پیشرفتهترین مدلهای مناسب برای جنین شناسی تجربی بوده است و به این ترتیب نشان دهنده مکمل مهمی برای سیستمهای نظیر مدل موش میباشد (1).
با استفاده از فهرست سادهای از آزمایشها، جوجه سهم مهمی در درک تنظیم تکامل اعضا مختلف نظیر تشکیل سیستم عصبی، استخوانبندی، اندام زایی، الگوهای جنینی، تشکیل سر و صورت، تکامل عروق، رگزایی، بهبود زخم و ایمونولوژی دارد (2). پیدایش و نمو مغز جوجه در اوایل دوره جنینی رخ میدهد و بخشهای مختلف مغز جوجه شامل پروزنسفالن، مزنسفالن و رومبنسفالن شکل میگیرد (3). در روزهای 3و4 جنینی دو نیمکره حبابی شکل مغز (telencephalon) درمنطقهای واقع در پروزنسفالون از لوله عصبی تشکیل میشود و در روز 4 مزنسفالون به عنوان ساختار مرکزی بزرگی شروع به رشد میکند (4).
خانواده ژن SALL نقش اساسی درطول تکامل حیوانات دارند، ژنهای مربوط به SALL در c.elegans، ماهی، قورباغه (زنوپوس)، موش و انسان تشخیص داده شده است (5). تاکنون سه عضو از خانواده ژنSALL شامل SALL1، SALL2، SALL4 در جوجه شناسایی شده است (6). ژنهای SALL4 وSALL1 درطول رشد و نمو جنینی در مغز، اندامهای در حال رشد و قوسهای احشایی بهطور همزمان بیان میشوند، محل قرارگیری ژن SALL4 درناحیه20q13.2 است، ژن SALL4 در بازوی بلند (q) کروموزوم 20 و در موقعیت2/13 قرارگرفته است (7). در سلولهای بنیادی ژن SALL4 نقش اساسی در وقایع نمو جنینی و همچنین تعمیر و نگهداری سلولهای پرتوان بنیادی جنینی برعهده دارد، بیان ژن SALL4 منتهی به تکثیر بسیار زیاد سلولهای بنیادی جنینی میشود بهطوریکه خاموشسازی این ژن در موش سبب مرگ موجود در روز 7 جنینی میشود (8). ژن SALL4 یک مارکر جدید و حساس در تشخیص ویژه تومورهای سلول زایشی اولیهی تخمدان و تومورهای سلول جنسی بیضهای است (9).
با توجه به نقش ژنSALL4 در رشد و نمو دوران جنینی، در این مطالعه به ارزیابی بیان ژن SALL4 در بافت مزنسفالن مغز جوجه در مراحل مختلف جنینی با روشReal Time PCR پرداخته شده است.
مواد و روش‌ها
جمع آوری بافت مغز:تخم مرغهای نطفه دارتهیه شده از تعاونی مرغداران طوس مشهد، نژادROSS جهت پرورش و سپس استخراج بافت مغز در داخل دستگاه جوجه کشی مدل (korea،RCOM Digital incubator) با 37 تا 5/37 درجه سانتیگراد و رطوبت بین60 تا 65- قرارداده شد. بافت مغز در زیر استرئومیکروسکوپ شامل پروزنسفالن، مزنسفالن و رومبنسفالن است، از روز4 جنینی به جداسازی بافت مزانسفالن پرداخته و از 5 الی6 نمونه در روزهای ابتدایی جنینی استفاده گردید و حجم بافت مزنسفالن جهت استخراجRNA حدود50 میلیگرم در هر نوبت استخراج است با توجه به اینکه در روزهای نزدیک به انتها رشد و نمو مزنسفالن افزایش بیشتری دارد از2 الی3 نمونه استفاده گردید، پس از جدا کردن مزونسفالن، بافت در درون محلول RNAlater (USA ،ziestbaran) قرارداده شده و دردمای20- درجه سانتیگراد نگهداری گردید.
استخراج RNA از بافت مزونسفالن: استفاده ازRNA سالم جهت بهکارگیری درروشهای ژنتیک مولکولی مانند میکرواریReal time PCR یاRT PCR کمی، ضروری است. استفاده از RNAبا کیفیت پایین، ممکن است نتایج بعدی حاصل از کار بر روی اینRNA را تحت تاثیر قراردهد. استخراج RNA با استفاده از دستورالعمل کیت تهیه شده از شرکت دنا زیست آسیا و برای هر روز جنینی طی سه مرحله تکرارگردید. بعد از استخراج،RNA درآب فاقد RNAase دردمای20- درجه سانتیگراد نگهداری میشود.
سنتز cDNA : RNAهای استخراج شده در روزهای مختلف بافت مزنسفالن مغز (E4-E20) با استفاده از کیت تهیه شده از شرکت پارس توس جهت سنتز cDNA مورد استفاده قرار گرفت. ترکیبات لازم برای سنتز cDNA با حجم نهایی20 میکرولیتر، 5 میکرولیتر RNATotal، 1میکرولیتر Oligodt، 4 میکرولیتر sterilized D.Wکه در دمای65 درجه سانتیگراد بهمدت 5 دقیقه در دستگاه ترموسایکلر قرار داده شد. در مرحله بعدی10 میکرولیترRT-preMix(2X) به ترکیبات اولیه اضافه گردید و مجددا دردمای25 درجه سانتیگراد بهمدت10 دقیقه در دستگاه قرار داده شد، سپس دستگاه برای مدت60 دقیقه دردمای50 درجه سانتیگراد و در مرحله آخر دستگاه برای مدت10 دقیقه در 70 درجه سانتیگراد تنظیم گردید.
بهینه سازی شرایط RT-PCR برای تکثیر ژن SALL4 : واکنشRT-PCR طبق دستور العمل کیت تهیه شده از شرکت پارس توس انجام شد بهطوریکه Mastermix با حجم نهایی 29 میکرولیتر تهیه شده و شامل بافرX 10بهمیزان3 میکرولیتر، 5/0 میکرولیتر dNTPs 1میکرولیتر 2Mgcl، پرایمر2میکرولیتر، 2/0میکرولیترآنزیمDNApolymerase Taq ، 3/21 میکرولیتر sterilized D.W و1میکرولیتر cDNA است. پس از آمادهسازی مواد جهت RT-PCR تنظیمات دستگاه ترموسایکلر شامل30 چرخه شامل واسرشتگی (Denaturation) بهمدت30 ثانیه دردمای 94 درجه سانتیگراد، اتصال(Annealing) بهمدت30 ثانیه در دمای 56 درجه سانتیگراد و بسط (Extention) بهمدت30 ثانیه در دمای 72 درجه سانتیگراد حرارت داده شد.
انجام Real time PCR : توالی پرایمرهاییکه برای بررسی ژن SALL4 استفاده شدند، شامل پرایمرهایی جهتReal time PCR و پرایمرهای مربوط به ژن GAPDH بهعنوان کنترل داخلی جهت نرمال سازی است که از شرکت تکاپو زیست طبق جدول 1 تهیه گردید.
جدول 1: توالی پرایمرهای طراحی شده جهت واکنش Real time PCR
|
5´→3´ |
Real –time PCR primer |
|
5-CGAAGGGGAACCTGAAGGTC-3 |
SALL4 Forward |
|
5-GAGATCTCGTTGGTCTTCATTG-3 |
SALL4 Reverse |
|
5´→3´ |
GAPDH primer |
|
5-AGATGGTGAAAGTCGGAGTCA-3 |
GAPDH Forward |
|
5-ATCATTGATGGCCACCACTTG-3 |
GAPDH Reverse |
مواد مورد نیاز جهت انجام Real time PCR با حجم نهایی20 میکرولیتر شامل10 میکرولیتر Sybergreen، 4/0 میکرولیتر ROX dye ،6/0 میکرولیتر پرایمر،7 میکرولیتر Sterilized D.W. و2 میکرولیترcDNA است.
با استفاده از پرایمـرهایPCR Real time و استفاده ازSybergreen، بیان ژن SALL4 در نمونه هایcDNA تهیه شده از بافت مغز در روزهای مختلف جنینی مورد ارزیابی قرار گرفت.
برنامه دمایی که دستگاه برای انجام Real time PCR تنظیم شد شامل یک مرحله 10دقیقه ای در دمای 95 درجه سانتیگراد و چرخههای دمایی شامل10 ثانیه 95 درجه سانتیگراد،30 ثانیه دمای 56 درجه سانتیگراد و 30 ثانیه دمای 72 درجه سانتیگراد بود که در45 سیکل تکرار گردید )شکل 1، (A. همراه با واکنشReal time PCR منحنی استاندارد و تکثیر ژن SALL4 بر اساس میزان فلورسانت ساطع شده نیز رسم گردید (شکل1، B).
شکل 1: (A تنظیمات دستگاه برای برنامه دمایی جهت انجام Real time PCR، (B منحنی استاندارد سنجش کمیRNASALL4 شامل رقت های3-10-7-10و محاسبه تعداد کپیهای ژنی است.
آنالیزهای آماری: نتایج با استفاده از آزمونهای آماری Chi-square و t-test در محیط نرم افزاری SPSS، تجزیه و تحلیل شدند.
نتایج
براساس مطالعات آناتومیکی و استناد به جدول هامبورگ-همیلتون (H-H) با استفاده از استرئومیکروسکوپ استخراج از بافت مزنسفالن صورت پذیرفت، مزنسفالن از روز3 جنینی شروع به بزرگتر شدن کرده و از قسمت خلفی به ناحیه باریکی از رومبنسفالن متصل میگردد، تغییرات مورفولوژی مزنسفالن در روزهای مختلف جنینی در شکل2 (روز3 و6 جنینی) مشخص شده است .
شکل 2: A) جنین 72 ساعت جوجه با درشتنماییX 5/12، B) جنین 6 روزه با درشتنمایی ×10 (تصاویری از تغییرات مزنسفالن درطی رشدو نمو جوجه)
با استفاده از RNAاستخراج شده برای بهینه سازی واکنش PCR و انتخاب سیکل مناسب، قبل از انجام واکنش PCR ،Total RNA حاصل از مزنسفالن در طول رشد و نمو جنین جوجه درشرایطRNase-free تهیه گردید و برای بررسی کیفیتRNA های استخراج شده در روزهای رشد و نمو جنینی مزنسفالن از ژل آگارز استفاده شد، سپس سنتزcDNA ازTotal RNA بافت جنینی مزنسفالن برای استفاده بهعنوان الگو درReal time PCR انجام گرفت شده و از ژنGAPDH بهعنوان نرمالایز استفاده شد (شکل-3).
شکل3: A) ا لکتروفورز RNA های استخراج شده در روزهای جنینی جهت بررسی کیفی حضور باندهای S28 وS 18بر روی ژل آگارز, B) الکتروفورز cDNA های مزنسفالن مغز جوجه (روز 19 جنینی) وژن GAPDH بر روی ژل آگارز جهت استفاده در Real time PCR چاهک 1 مربوط به ژن GAPDH ، چاهک 2 مربوط به نشانگر و چاهک 3 مربوط به ژن SALL4 میباشد.
نتایج حاصل از Real time PCR بافت مزنسفالون مغز در طی تکوین جوجه نشان میدهد بیان ژن SALL4 درطول رشد و نمو جنین در مزنسفالن متغیر است بهطوریکه در روز 6 جنینی104 × 72/1، روز10 جنینی104× 74/3، روز16 جنینی104 × 18/2 و در روز 19جنینی104×54/18 نسخههای ژنی را نشان میدهد که بیان بالاتری نسبت به روزهای دیگر جنینی دارد، بیان این ژن در روز 18 جنینی در بافت مزنسفالن مغز شروع به افزایش و در روز 19 به حداکثر بیان خود میرسد (نمودار 1).
نمودار 1: رشد و نمو در مزونسفالن مغز جنین جوجه در روزهای تکوین و میزان بیان ژن SALL4
بحث
ژن SALL4 ارائه دهنده دستور العمل برای ساخت پروتئینهایی است که در تشکیل بافتها و اندامها در طی رشد و نمو جنین نقش دارند، خانوادهSALL از عوامل رونویسی است به این معنی که به مناطق خاصی از DNA متصل میشود و به کنترل فعالیت ژنهای خاصی کمک میکنند، براساس عملکرد پروتئینهای مشابه SALL4 در دیگر ارگانسیمها مانند گوره خرماهی و موش به نظر میرسد، این پروتئین نقش حیاتی در اندامهای در حال رشد ایفا میکند، این پروتئین برای رشد عصبهای تحت کنترل حرکات چشم و برای جداسازی دیواره بین دهلیزهای قلب نقش کلیدی دارد (10). با توجه به نتایج بهدست آمده بیان این ژن درطی3 روز انتهایی تکوین مزنسفالن جنین جوجه، افزایش بیشتری نشان میدهد بهطوریکه در طول روز6 جنینی نیز افزایش دارد؛ و این زمان مطابق با تمایز لوبهای بینایی میباشد (11).
در تحقیق حاضر بیان ژن 4SALL در بافت مزنسفالن مغز جنین جوجه با استفاده از روش Real time PCR در طول رشد و نمو این موجود مورد بررسی قرار گرفت و تغییرات بیان این ژن در طی تکوین این بافت ارزیابیگردید، بهطوریکه بیشترین بیان در روز 19جنینی مشاهده شد.
ژنSALL4 در برخی از مسیرهای سیگنالینگ در طول مهاجرت سلولهای تاج عصبی و تشکیل قلب نقش دارند (12-14)، SALL4در طی مراحل ابتدایی رشد و نمو جنینی در توده سلولهای داخلی بلاستوسیست و ترفواکتودرم و همچنین در مراحل پایانی جنینی در تشکیل لوله عصبی، تکوین مغز، قوسهای ریوی و جوانه اندامها دخالت دارد، جهش درSALL4 طی اوایل دوران بارداری، سبب تغییر شکل در روده جنین و فقدان در بسته شدن لوله عصبی میشود (8). Nanog وSALL4 بهترتیب فاکتورهای کلیدی در حفظ مرحله عدم تمایز و تکثیر سلولی میباشند خاموش شدن بیان ژن SALL4 منتهی به تکثیر بسیار زیاد سلولهای بنیادی جنینی میشود و در صورت از بین رفتن SALL4 موشها قادر به زنده ماندن تا روز 7 جنینی نمی باشند (15).
میزان بیانmRNA ،SALL4 در سرطانهای پستان بهوسیله روش RT-PCR روی نمونه بافتهای سرطانی و غیرسرطانی بهدست آمده از بیماران مبتلا به سرطان پستان انجام گرفته است که سطح بیانmRNA ،SALL4 در بافتهای سرطانی بهطور قابل توجهی بیشتر از بافتهای غیر سرطانی بود، میزان بیان Nanog در سلولهای سرطانی بیماران مبتلا به سرطان پستان افزایش مییابد. تنظیم متقابل بیان ژن، بین SALL4 و Nanog که در سلولهای بنیادی موش مشاهده شدهاند ممکن است در انسان هم اتفاق بیافتد به این ترتیب این امکان وجود دارد که چندین مولکول مرتبط سلولهای بنیادی با همکاری این ژن نقش اساسی در رفتار سلولهای سرطانی انسان را داشته باشند (10).
نتیجه گیری
با توجه به اینکه بیشترین بیان در روز 19 جنینی در مزنسفالن رخ داده است و این قسمت مغز دارای مراکز تطبیق و انعکاس برای پیامهای بیناییاست تکوین کامل مراکز انعکاسی و تطابق و تمایز لوبهای بینایی در طی روزهای پایانی انجام یافته است. با مقاسیه بیان این ژن در روزهای مختلف جنینی در طی مراحل تکوین مزنسفالن جنین جوجه، در روزهای ابتدایی جنینیکه مغز در حالتشکیل میباشد، نوسانات زیادی در بیان ژن 4SALL در بافت مزنسفالن مغزمشاهده نشد، در حالیکه در روز19 جنینی که رشد و نمو مزنسفالن در حال تکمیل است بیان این ژن افزایش بیشتری نشان میدهد. به نظر میرسد افزایش ناگهانی بیان این ژن در روزهای آخر جنینی در مزنسفالن که مرکز انعکاسهای بینایی است به هدایت و پردازش اطلاعات حسی در این بخش و ارتباط بین اندامهای بینایی و مراکز عصبی جهت کنترل سیستم بینایی مربوط باشد که نیاز به مطالعات بیشتری دارد.
تشکر و قدردانی
بدین وسیله مراتب قدردانی و سپاس خود را از همکاری و مساعدتهای خانمها مریم خالقی زاده و سیما اردلان ابراز داشته و همچنین از پرسنل پژوهشکده بوعلی مشهد بخش ژنتیک انسانی و همکاران آزمایشگاه زیست شناسی تکوینی دانشگاه آزاد اسلامی مشهد در اجرای این پژوهش نهایت سپاسگزاری را داریم.
)