نوع مقاله : علمی - پژوهشی
چکیده
هدف: ماتریکس خارج سلولی علاوه بر نقش فیزیکی، میتواند کنترل کننده رفتارهای سلولی از قبیل تکثیر، تمایز و مهاجرت سلولی نیز باشد. مطالعه رفتار سلولی در ماتریکس های سه بُعدی میتواند از نظر بُعد، معماری و قطبیت سلولی ریز محیطی مشابه با شرایط in vivo فراهم کند. در اینجا از ماتریکس خارج سلولی مشتق شده از استخوان اسفنجی و غضروف مفصلی گاو به عنوان بستری سه بُعدی برای مطالعه مهاجرت و قطبیت سلولهای بافت بلاستمایی استفاده گردید.
مواد و روشها: برای حذف سلولها از ماتریکس خارج سلولی، از روش فیزیکی و شیمیایی سلول زدایی شامل فریز- ذوب سریع و شوینده یونی سدیم دودسیل سولفات (SDS) استفاده گردید. سپس ماتریکس های سه بُعدی تهیه شده با حلقه بافت بلاستمایی حاصل از پانچ لاله گوش خرگوش نر نژاد نیوزلندی در شرایط in vitro، در روز های مختلف کشت داده شد.
نتایج: با استفاده از رنگ آمیزیهای بافتی، حذف سلولها از بافت تائید شد. آنچه که بعد از کشت بافت بلاستما در کنار ماتریکس خارج سلولی استخوان اسفنجی و غضروف مفصلی اتفاق افتاد، چسبندگی، قطبیت و مهاجرت سلولهای بافت بلاستما در این ماتریکس بود.
نتیجه گیری: نتایج این تحقیق نشان میدهد کشت بافت بلاستما که دارای سلولهای پویایی است، در کنار داربست مشتق شده از ماتریکس خارج سلولی که ویژگی سه بعدی دارد، میتواند مدل مناسبی جهت بررسی رفتارهایی همچون قطبیت و حرکت سلولی در شرایط in vitro فراهم نماید.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
In vitro experimental study of interactions between blastema tissue and three-dimensional matrix derived from bovine cancellous bone and articular cartilage
چکیده [English]
Aim: Extracellular matrix (ECM), in addition to physical role can control the cellular behavior such as proliferation, differentiation and migration. With respect to dimension, architecture, cell polarity and microenvironment similar to in vivo, it is important to study cellular behavior in the three dimensional culture compare to two dimensions. In this study, ECM derived from bovine articular cartilage and cancellous bone were used as a three dimensional environments to study the movement and polarity of cells from blastema tissues.
Material and Methods: In order to remove cells from the cancellous bone and articular cartilage, physicochemical methods including snap freeze–thaw and sodium dodecyl sulfate (SDS) as an ionic detergent were used. Then the prepared decellulized matrix were assembled with the rings of the blastema tissues originated from pinnas of male New Zealand white rabbits and cultured in different days in vitro.
Results: The removals of the cells have been confirmed by histotechniques. In addition adhesion, polarity and migration of the blastema cells around the trabeculae of bone and articular cartilage ECM took place.
Conclusion: This study showed that the co-culture of blastema tissue with dynamic cells and 3D scaffolds might be a suitable model to study cell behavior such as migration and polarity in vitro.
کلیدواژه‌ها [English]
- Extracellular matrix
- Articular cartilage
- Sodium dodecyl sulfate
- Cell polarity
مقاله پژوهشی مجله علمی پژوهشی سلول و بافت
جلد 1، شماره 1، پاییز 1389، 62-53
مطالعه تجربی اعمال متقابل بین بافت بلاستما با ماتریکس سه بعدی مشتق شده از بافت استخوان اسفنجی
و غضروف مفصلی گاو در شرایطin vitro
امین توسلی. M.Sc1، فهیمه شهابی پور M.Sc.1، ناصر مهدوی شهریPh.D. 1و2*، مریم مقدم متین. Ph.D1و2،
مسعود فریدونی.Ph.D1
1- دانشگاه فردوسی مشهد، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی
2- دانشگاه فردوسی مشهد، پژوهشکده فناوری زیستی، گروه سلولی و مولکولی
* پست الکترونیک نویسنده مسئول: mahdavin@um.ac.ir
تاریخ دریافت: 27/10/ 1389 تاریخ پذیرش: 20/1/1390
چکیده
هدف: ماتریکس خارج سلولی علاوه بر نقش فیزیکی، میتواند کنترل کننده رفتارهای سلولی از قبیل تکثیر، تمایز و مهاجرت سلولی نیز باشد. مطالعه رفتار سلولی در ماتریکس های سه بُعدی میتواند از نظر بُعد، معماری و قطبیت سلولی ریز محیطی مشابه با شرایط in vivo فراهم کند. در اینجا از ماتریکس خارج سلولی مشتق شده از استخوان اسفنجی و غضروف مفصلی گاو به عنوان بستری سه بُعدی برای مطالعه مهاجرت و قطبیت سلولهای بافت بلاستمایی استفاده گردید.
مواد و روشها: برای حذف سلولها از ماتریکس خارج سلولی، از روش فیزیکی و شیمیایی سلول زدایی شامل فریز- ذوب سریع و شوینده یونی سدیم دودسیل سولفات (SDS) استفاده گردید. سپس ماتریکس های سه بُعدی تهیه شده با حلقه بافت بلاستمایی حاصل از پانچ لاله گوش خرگوش نر نژاد نیوزلندی در شرایط in vitro، در روز های مختلف کشت داده شد.
نتایج: با استفاده از رنگ آمیزیهای بافتی، حذف سلولها از بافت تائید شد. آنچه که بعد از کشت بافت بلاستما در کنار ماتریکس خارج سلولی استخوان اسفنجی و غضروف مفصلی اتفاق افتاد، چسبندگی، قطبیت و مهاجرت سلولهای بافت بلاستما در این ماتریکس بود.
نتیجه گیری: نتایج این تحقیق نشان میدهد کشت بافت بلاستما که دارای سلولهای پویایی است، در کنار داربست مشتق شده از ماتریکس خارج سلولی که ویژگی سه بعدی دارد، میتواند مدل مناسبی جهت بررسی رفتارهایی همچون قطبیت و حرکت سلولی در شرایط in vitro فراهم نماید.
واژگان کلیدی: ماتریکس خارج سلولی، غضروف مفصلی، سدیم دودسیل سولفات، قطبیت سلولی
مقدمه
در بافتهای پستانداران، سلول ها فقط با یکدیگر در ارتباط نیستند، بلکه با یک ساختار حامی بنام ماتریکس خارج سلولی (Extracellular matrix) نیز در ارتباط میباشند(1). ECM شامل ترکیبات مختلفی از جمله پروتئینهای کلاژن، پلی ساکارید هیالورونان، پروتئوگلیکانها و همچنین پروتئینهای چسبندهای میباشد که به پروتئینهای گیرنده سطح سلولی و سایر اجزای ماتریکس چسبیده و به ماتریکس قدرت و استحکام میبخشند. سلولهای هر بافت قادر به برهم کنش با ECM اطراف خود می باشند و این برهم کنش بین ECM و سلولهای یک بافت در جهت گیری و رفتار سلول ها نقش اساسی بازی میکند. بر هم کنش سلول های بافت با ECM، علاوه بر فراهم نمودن ساختار سه بعدی (3D) مناسب، مسیرهای پیام رسانی را برای رفتارهای سلولی از قبیل چسبندگی، مهاجرت، تمایز و تکثیر سلولی فراهم می سازد که این برای فرآیندهایی از قبیل، تکوین بافت، ترمیم زخم، پاسخ های ایمنی و پیشبرد سرطان مهم است (2). برای مطالعه فرآیندهای بیولوژیکی فوق نیاز به بررسی سلول ها در شرایط in vitro است اما رشد سلولها بر روی محیط دو بعدی (2D) ظرف کشت از نظر مورفولوژی، بر هم کنش سلول ـ سلول و سلول ـ ماتریکس و رشد فیزیولوژیکی و طبیعی با محیط in vivo سه بعدی بافت تفاوت هایی دارد (3-4). بنابراین استفاده از مدل 3D بهتر میتواند ریز محیطهای بافت های زنده را جهت بررسی رفتارهای سلولی تداعی کند. تا کنون داربست های 3D بیشماری به عنوان جانشینهای ECM جهت مطالعه رفتار و برهم کنش سلولی مورد استفاده قرار گرفتهاند. این داربستها متشکل از مولکولهای طبیعی و یا پلیمرهای سنتزی می باشند، اما آنها نقصهایی از جمله خاصیت هیدروفیلیسیته پائین، عدم اجازه کنترل چسبندگی سلولها، معماری مصنوعی بافت داربستی و عدم کنترل سختی مکانیکی دارند (5).
همانطورکه میدانیم بافت های موجودات زنده از سلولهای هستهدار در یک ECM فشرده که تشکیل شبکه ای 3D از مولکولهای الیافی را داده اند تشکیل شده است (6و7). لذا میتوان از ECM بافتهای موجودات زنده جهت بررسی رفتار سلولها در هنگام برهم کنش با آن در شرایط in vitro استفاده کرد. برای این کار از روش های سلول زدایی جهت حذف تاثیر سلولهای بافت از ECM میتوان بهره برد، تا در نهایت تنها ECM از بافت باقی بماند و بتوان از آن به عنوان داربست استفاده نمود (8، 9، 10و 11)
بجز سوبسترا، تعیین نوع منبع سلولی نیز نقش مهمی در مطالعه رفتار سلولها در هنگام برهم کنش با سوبسترا دارد، و معمولاً منبع سلولهایی که جهت بررسی رفتارهای سلولی استفاده میشود سلولهای فیبروبلاستی، بنیادی و یا سرطانی میباشند (8-11). اما برای شبیه سازی هر چه بیشتر شرایط حاکم بر سلولها در شرایط in vivo میتوان از کشت بافتهای پویا مانند بافتهایی که در پدیده ترمیم در جانوران پرسلولی نقش دارند، استفاده نمود. مطالعات نشان داده است، طی روند ترمیم، بافتی به نام بلاستما که دارای سلولهایی با قابلیت تکثیر و تمایز، مشابه سلول های جنینی تشکیل میشود و قادرند در شرایط in vivo به انواعی از سلولهای تخصص یافته تمایز یابند (12-14). یکی از بهترین مثالهای تشکیل بافت بلاستما در پستانداران، جایگزینی همه بافتها پس از ایجاد سوراخ در لاله گوش خرگوش نر نژاد نیوزلندی است (15-17).
هدف از انجام این تحقیق در مرحله اول، تهیه داربستهای 3D مشتق شده از ECM استخوان اسفنجی و غضروف مفصلی استخوان ران گاو بود. برای این کار از سلولزدایی استخوان اسفنجی و غضروف مفصلی اپیفیز ران گاو به منظور تهیه داربست ECM استفاده گردید. در بخش دوم این تحقیق، بر هم کنش بین ECM های 3D تهیه شده، با بافت بلاستمای حاصل از لاله گوش خرگوش نر نژاد نیوزلندی مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روش ها
آماده سازی داربست سه بعدی مشتق شده از ECM: ابتدا استخوان طویل ران گاو بلافاصله پس از قربانی شدن تهیه شد. سپس از غضروف مفصلی و استخوان اسفنجی اپی فیز ران گاو قطعات استوانه ای شکلی به قطر 2 میلیمتر جدا گردید. نمونه های حاصل توسط سرم فیزیولوژی شستشو شده و سپس در دمای 4- درجه سانتیگراد نگهداری شدند، تا مرحله فیزیکی سلول زدایی آغاز گردد. سپس نمونه ها از فریزر خارج گشته و بعد از ذوب شدن در دمای آزمایشگاه، با سرم فیزیولوژی نمونهها چند بار شستشو داده شدند. در مرحله بعد جهت snap freezing (فریز کردن آنی) به مدت 2 دقیقه در ازت مایع قرار گرفت و سپس بمدت 10 دقیقه در سرم فیزیولوژی با دمای 37 درجه سانتیگراد ذوب گردید. این مرحله 5 مرتبه تکرار شد و با بافر فسفات (PBS) شستشو داده شد. مرحله بعد، روش شیمیایی سلول زدایی بود. بطوریکه ابتدا نمونه ها بمدت 3 ساعت با شوینده یونی سدیم دودسیل سولفات (SDS, Merck) 5/2 درصد به آرامی هم زده شدند. در انتها نمونهها با بافر PBS بمدت نیم ساعت شستشو گردید.
جهت استریل کردن و پاک کردن SDS از روی نمونه ها، داربست ها آماده شده توسط قیف مولی پر استریل در سه مرحله استریل و سم زدایی گردید. برای این کار ابتدا توسط الکل 75 درصد نمونه ها شستشو داده شدند، سپس برای از بین رفتن اثر الکل 75 درصد از آب مقطر استریل استفاده گردید. نمونهها در مرحله بعد توسط سرم فیزیولوژی نیز استریل شدند تا اثر آب مقطر بر روی داربستها باقی نماند. در آخرین مرحله نمونهها به مدت 10 دقیقه در محیط کشت DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium, Gibco) همراه با 15درصد سرم جنینی گاو FBS (Fetal bovine serum, biosera) در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد با CO2 5 درصد قرار گرفتند.
تهیه بافت بلاستما: در اجرای این پژوهش جهت تهیه حلقه بلاستما از لاله گوش خرگوش سفید نژاد نیوزلندی جنس نر 8-6 ماهه و با وزن تقریبی 5/2 کیلوگرم که از موسسه واکسن و سرم سازی رازی مشهد تهیه گشته بود، استفاده گردید. جهت تهیه حلقه ایی از بافت بلاستما، ابتدا با استفاده از کرم موبر موهای سطح پشتی و شکمی لاله گوش حذف گردید. و بعد از بی حسی موضعی لاله گوش توسط محلول لیدوکائین 10درصد، سوراخهایی با قطر 2 میلیمتر با پانچر مخصوص انجام گرفت، موقعیت سوراخ ها با توجه به سیستم عروقی موجود بر روی لاله گوش، بین شریان مرکزی و وریدهای محیطی قسمت میانی گوش انتخاب شدند. بعد از دو روز، پانچ دوم در اطراف سوراخهای پانچ شده اول با قطر 4 میلیمتر انجام گرفت تا حلقه بلاستما از لاله گوش جدا گردد. بعد از جداسازی حلقه بلاستما، جهت آلودگی زدایی 7 بار با سرم فیزیولوژی استریل در زیر هود لامینار شستشو داده شد تا آماده ورود به محیط کشت گردد.
مونتاژ داربست ECM با بافت بلاستما:بعد از تهیه و آلودگیزدایی ECM و بافت بلاستما، داربستهای ECM با بافت بلاستما مونتاژ شده و کشت داده شدند. برای این کار هر یک از داربست های ECM غضروفی و استخوان اسفنجی در میان حلقه بافت بلاستما در شرایط استریل مونتاژ گشت و در ظروف شش خانهای کشت قرار گرفتند و در هر خانه ظرف کشت میزان 2 میلیلیتر محیط کشت DMEM همراه با 15 درصد FBS و µl 100 آنتیبیوتیک پنیسیلین/ استرپتومایسین ریخته شد، سپس به انکوباتور 37 درجه سانتیگراد با CO2 5 درصد منتقل گردید. نمونه ها در 4، 10، 20 و 30 روز بعد از کشت مورد بررسی قرار گرفتند.
مطالعات بافت شناسی: بعد از فیکس کردن، آب گیری و قالب گیری با پارافین برشهایی با قطر 7 میکرون صورت گرفت. جهت رنگ آمیزی ابتدا برشها دِپارافینه و آبدهی شد. سپس با رنگهای هماتوکسیلین- ائوزین (H&E)، آبی تولوئیدین، پیکروفوشین و پیکروسیروس رِد رنگ آمیزی گردید. از رنگ آمیزی H&E جهت نشان دادن سلول زدایی از بافتهای غضروف مفصلی و استخوان اسفنجی و همچنین بررسی برهم کنش با بافت بلاستما استفاده گردید. رنگ آبی تولوئیدین برای نشان دادن محتوی پروتئوگلیکانهای ECM غضروف مفصلی استفاده شد. همچنین پیکروسیروس رِد بعنوان رنگ اختصاصی برای تعیین محتوای کلاژن داربستهای ECM مورد استفاده قرار گرفت.
نتایج
نتایج حاصل از این تحقیق، در دو بخش نتایج تهیه داربست ECM، مشتق شده از غضروف مفصلی و استخوان اسفنجی استخوان ران گاو و همچنین بررسی برهم کنش بین ماتریکسهای تهیه شده با بافت بلاستمایی در شرایط in vitro ارائه می گردد.
سلول زدایی از بافت غضروف مفصلی و استخوان اسفنجی:
پس از انجام فرایند سلول زدایی، تصویر ماکروسکوپی وجود خلل و فرج در ماتریکس استخوان اسفنجی را نشان میدهد، همچنین بافت سلول زدایی شده غضروف مفصلی نیز در تصویر B شکل 1 نشان داده شده است (شکل 1).
مطالعه سلول زدایی غضروف مفصلی و استخوان اسفنجی توسط رنگ آمیزی H&E نشان میدهد که نمونههای تحت تیمار سلول زدایی نسبت به نمونه کنترل کاملاً فاقد سلول شده است (شکلهای 2 و 3). رنگ آمیزی پیکروسیروس رِد که جهت ارزیابی کیفی کلاژن بافتها بکار میرود و توسط میکروسکوپ پلاریزان عکسبرداری شده، نشان میدهد فیبریلهای کلاژن در بعد از فرآیند سلول زدایی در ECM غضروف مفصلی و استخوان اسفنجی حفظ شده است.
رنگ آبی تولوئیدین با رنگ آمیزی پروتئوگلیکانها و گلیکوزآمینوگلیکانهای ECM بافت غضروف مفصلی نشان میدهد در قبل و بعد از سلول زدایی این ترکیبات حفظ شده است (شکل 3، C و D).
بررسی برهم کنش بین داربستECM با بافت بلاستما:
بعد از مونتاژ ECM غضروف مفصلی و استخوان اسفنجی در درون حلقه بلاستمایی و قرار گیری در محیط کشت در روزهای4، 10، 20 و 30 بعد از کشت، ناحیه دارای هم بافت بلاستمایی و هم ECM که ایجاد بر هم کنش در آن فسمت امکانپذیر بود، مورد بررسی قرار گرفت (شکلهای 4، 5، 6 و 7).
شکل 1. تصویر ماکروسکوپی از ماتریکس سه بعدی تهیه شده از ECM استخوان اسفنجی و غضروف مفصلی سلول زدایی شده. A) پس از فرایند سلول زدایی، خلل و فرج فراوان در داربست استخوانی کاملا مشخص می باشند. B) بافت غضروف مفصلی پس از سلول زدایی. (دید استرمیکروسکوپ، درشتنمایی 10X)
شکل2. نمونه استخوان اسفنجی کنترل و سلول زدایی شده. A) بافت سلول دار استخوان اسفنجی به همراه سلول های استئوبلاست پراکنده شده در سطح ترابکولا و سلول های مغز استخوان در فضاهای بین تیغه های ترابکولا (درشتنمایی 40X). (B بافت سلول زدایی شده استخوان اسفنجی با رنگ آمیزی H&E (درشتنمایی 40X). C) بافت سلول دار استخوان اسفنجی به همراه رشته های کلاژن در رنگ آمیزی با پیکروسیروس رِد (درشتنمایی (100X. (Dبافت سلول زدایی شده که دارای رشته های کلاژن باقی مانده پس از فرایند سلول زدایی می باشد (درشتنمایی (100X.
شکل3. نمونه های غضروف مفصلی کنترل و سلول زدایی شده. A) رنگ آمیزی H&E نشان می دهد در غضروف مفصلی کندروسیت ها در ماتریکس غضروف بصورت پراکنده وجود دارند. B) نمونه سلول زدایی شده، خالی کندروسیت ها مشخص است. C) نمایی کلی از بافت غضروف مفصلی با رنگ آمیزی آبی تولوئیدین. D) عدم تغییر رنگ ماتریکس لاجوردی نشان دهنده عدم از دست رفتن پروتئوگلیکان های ماتریکس غضروف است. E) تصویر بافت غضروفی با میکروسکوپ پلاریزان. F) رنگ قرمز آجری و درخشنده نشان دهنده پیکروسیروس رد که توسط میکروسکوپ پلاریزان گرفنه شده است، وجود فیبریل های کلاژن در ماتریکس غضروف بعد از سلول زدایی می باشد (درشتنمایی 100X).
شکل4. مطالعه برهم کنش بین بافت بلاستمایی و داربست استخوان اسفنجی در روز دهم پس از کشت. A) رنگ آمیزی H&E، چسبندگی برخی از سلول های بافت بلاستمایی را در اطراف تیغه های ترابکولا قابل مشاهده است که با فلش ها نشان داده شده اند (درشتنمایی (100X. (Bپیکانها نشان دهنده شروع هجوم سلول ها از بافت بلاستمایی به داربست استخوانی می باشد (درشتنمایی (100X.
شکل5. مطالعه برهم کنش بین بافت بلاستمایی و ECM استخوان اسفنجی در روز بیستم پس از کشت. A) نفوذ بیشتر سلول ها به داخل داربست استخوان اسفنجی نشان داده شده است (درشتنمایی (100X. (B چسبندگی تعدادی از سلول ها در حاشیه ترابکولای استخوانی قابل مشاهده است (درشتنمایی (400X. C). تصویر بزرگ شده B، فلش ها دو سلول چسبیده به تیغه ترابکولای بافت استخوانی که دارای قطبیت هستند را نشان می دهند (درشتنمایی .(1000X
شکل 6. مقطع عرضی از حلقه بلاستما با ECM غضروفی (بزرگنمایی 40X). در شکل A تخریب بافت ECM با فلش مشخص شده است(درشتنمایی 200X). در شکل B عده ایی از سلول ها نفوذ کرده اند در حالی که یک سلول به حاشیه ECM متصل شده است(درشتنمایی 400X). شکل C تشکیل استطاله های سیتوپلاسمی و هجوم سلول ها را از بافت بلاستما به داخل ECM غضروفی نشان می دهد (درشتنمایی 1000X).
شکل 7. نمایش نفوذ سلول های بلاستمایی به درون بافت ECM غضروفی در روز های 20 و 30 بعد از کشت. در شکل A و B نمایی کلی از توده سلول های در حال نفوذ به ECM غضروفی در روز 20 بعد از کشت قابل مشاهده می باشد (درشتننمایی A40X و B درشتنمایی 200X). در شکل C مسیر نفوذ سلول ها از بافت بلاستمایی در ECM غضروفی و شکاف ایجاد شده در روز 30 بعد از کشت قابل مشاهده می باشد (درشتنمایی 100X). در بزرگ نمایی بیشتر آثار سلول های تخریب شده در میان شکاف ایجاد شده مشاهده می شود (تصویر D، درشتنمایی 200X).
بحث
همانطوریکه میدانیم هر بافت شامل دو جزء سلول ها و ECM است، پس در تهیه ماتریکس های مشتق شده از ECM، عمل اصلی برداشتن سلولها از بافت و باقی ماندن ECM است. ماتریکسهای ECM شامل مولکولهای عملکردی و ساختاری ترشح شده توسط سلولهای هر بافت و اندام است، بنابراین ترکیب بندی و توزیع ترکیبات ECM به منبع بافت بستگی دارد. ECM که ماده تشکیل دهنده این داربستهاست از انواعی از بافتها من جمله دریچههای قلبی، رگهای خونی، پوست، لایه زیر موکوسی روده کوچک (SIS)، مثانه، تاندون و لیگامندها مشتق شده است (18).
در این پژوهش ابتدا لازم بود با عملیات سلولزدایی داربستی مشتق شده از ECM غضروف مفصلی و استخوان اسفنجی گاو بدست آید. لذا از دو روش فیزیکی و شیمیایی برای این کار استفاده شد. برای انجام مرحله فیزیکی سلول زدایی، ابتدا نمونهها در فریزر 4- درجه سانتیگراد قرار گرفت. استلال این کار این بود که بیشتر حجم سلولها از آب تشکیل شده است و به این دلیل که تشکیل بزرگترین کریستالهای یخ در این دما صورت میگیرد، غشاء سلولها (چه غشاء سیتوپلاسمی و چه غشاء های داخلی) بر اثر ایجاد این کریستالهای حجیم یخ میترکد. بنابراین میتوان انتظار داشت که در این دما، تمامی سلولها با قرار گرفتن متناوب، دچار تغییر و تخریب در غشاء هایشان می شوند.
سپس با قرار دادن نمونهها در ازت مایع، باعث تخریب هر چه بیشتر غشاءها و خارج شدن محتویات اندامکهای سلولی و همچنین آسیب به پروتئینهای سلولی میگردد. البته بدلیل ساختار فیبری و محکم پروتئینهای ECM میتوان انتظار داشت که تاثیر این تغییرات دمای روی ECM بسیار ناچیز باشد (8).
در پروژه حاضر از SDS بعنوان ماده سلول زدا در مرحله شیمیایی سلول زدایی استفاده شد. از این رو مطالعات انجام گرفته نشان میدهد که شوینده یونی SDS بهترین ماده شیمیایی سلول زدا برای بافتهای مختلف میباشد. مطالعات بافتشناسی و ارزیابی تستهای مکانیکی مشخص کرده است که در غلظتهای 2 درصد تا 3 درصد از این ماده، بهترین نتایج سلول زدایی مشاهده میگردد. از طرفی غلظتهای بیشتر SDS باعث حذف پروتئوگلیکانها از ماتریکس غضروفی میشود. SDS با توجه به ساختار دوگانه دوستش (دارای یک سر آنیونی آب دوست و یک دم دوازده کربنه اشباع آب گریز) میتواند با غشاءهای سلولی بر هم کنش داده و سبب لیز شدن غشاء سلولی و غشاء هسته گردد (19). همچنین SDS در سلولها باعث unfold شدن پروتیئنهای سلولی و بدین ترتیب از بین رفتن آنها میگردد (20). در تحقیق حاضر رنگ آمیزی های اختصاصی از قبیل آبی تولوئیدین، نشان دهنده حفظ پروتئوگلیکان های ECM غضروف و پیکروسیروس رِد که جهت ارزیابی کیفی کلاژن ECM غضروف و استخوان اسفنجی است، حاکی از حفظ ترکیب ECM در قبل و بعد از فرآیند سلول زدایی است (شکل های 2 و 3).
در حالت طبیعی بعد از پانچ گوش خرگوش، رشد اپی تلیوم گوش خرگوش نژاد نیوزلندی بصورت رشد بطرف مرکز می باشد (16) و این باعث ترمیم سوراخ ایجاد شده در گوش خرگوش در شرایط in vivo می گردد. در اینجا از این خاصیت در لاله گوش خرگوش استفاده شد و بعد از قرار دادن در مجاورت داربست ECM غضروف مفصلی و استخوان اسفنجی در بین حلقه بافت حلقه بلاستمایی، برهم کنش آن ها در روزهای مختلف بررسی گشت.
مطالعه در روز چهارم بعد از کشت نشان داد که در آن روز هیچ سلولی به داربست ECM غضروف مفصلی و استخوان اسفنجی نفوذ نکرده است (شکل نشان داده نشده است). اما در روز دهم بعد از کشت، قرار گرفتن سلول هایی در مرز بین بافت بلاستما و داربست ECM غضروف مفصلی و استخوان اسفنجی نفوذ سلول های بافت بلاستما، مشهود بود. همچنین در این روز سلول های بافت بلاستما با ایجاد استطاله هایی سعی در تخریب داربست ECM غضروف مفصلی و نفوذ به آن را داشتند. (شکل 6). اما سوال این است که چه عاملی سبب تخریب داربست در هنگام نفوذ سلول ها به آن می شود. طبق مطالعات انجام شده بر روی سلول های توموری در حال تهاجم، یکی از دلایل تخریب ECM در هنگام مهاجرت سلولها، متالوپروتئینازهای ماتریکس (MMPs) هستند. جالب این جاست که یکی از فاکتورهای لازم در فعال کردن MMPs، پاهای کاذب تهاجمی (invadopodia) در سلولهای توموری است. در حقیقت بیان MMPs در سلولهای توموری و همچنین سلولهای استرومایی اطراف تومور برای متاستاز و تهاجم توموری لازم هستند (21). علاوه بر این سلولهای بافت بلاستما در داربست ECM استخوان اسفنجی بیشتر به حاشیه ترابکولارها متصلند (شکل 4).
روز 20ام بعد از کشت با تخریب و نفوذ بیشتری از سلولهای بافت بلاستمایی در درون داربستECM غضروف مفصلی همراه است. نکته قابل توجه در این روز تشکیل تودههای سلولی در درون داربست است (شکل 7). همانطوری که اشاره شد بر اثر تاثیر سلولهای بافت بلاستما داربست غضروفی تخریب شده است اما مطالعات Reing و همکاران در سال 2009 نشان میدهد که محصولات تخریب داربست نیز دارای فعالیت کموتاکتیکی و میتوژنیک برای سلول های پیش ساز چند توان هستند. بنابراین همانطوریکه بافت بلاستما باعث تخریب داربست غضروفی میگردد، تجزیه داربست نیز می تواند عاملی برای تکثیر سلولهای بافت بلاستما گردد (22). در این روز تغییر شکل سلولهای بافت بلاستما و کشیده شدن آنها در حالت چسبیده به تیغههای استخوان اسفنجی نیز اهمیت دارد (شکل 5). تحقیقات نشان داده است که حرکت سلولها توسط گرادیانی از پیامهای شیمیایی هدایت میشود و از طرفی دیگر برهم کنشهای فیزیکی بین سلول و سوبسترا نیز در این نوع حرکت میتوانند نقش داشته باشند. از طرفی طی فرایند استخوان سازی داخل غضروفی، سلولهای استئوبلاست با آرایشی ردیفی و منظم در اطراف تیغه های استخوانی قرار میگیرند (23). در این تحقیق هم در روزهای 10 و 20 پس از کشت آرایش ردیفی سلول ها در اطراف تیغههای استخوانی مشاهده گردید که شروع فرایند احتمالی استخوان سازی میباشد (شکل های 4 و 5) .
در روز 30ام بعد از کشت عملاً سلولها وارد شده به داربست بسیار کم هستند و یا حداقل سلولها کاملاً مورفولوژی روزهای 10ام و 20ام را از دست دادهاند (شکل 7، C و D). این امکان وجود دارد در این روز، سلولهای بافت بلاستمایی توانایی زیست خود را از دست داده باشند. اما حرکت سلولهای بافت بلاستما در روز سیام پس از کشت به داربست استخوان اسفنجی بیشتر بوده و همزمان این سلولها چسبندگی به اطراف تیغههای ترابکولا را نیز نشان دادند (شکل نشان داده نشده است).
نتیجه گیری
نتایج حاصل از بخش اول این تحقیق، یعنی بحث سلول زدایی و تشکیل داربست 3D از ECM غضروف مفصلی و استخوان اسفنجی گاو نه تنها میتواند سوبسترایی 3D جهت بررسی رفتار سلولی باشد، بلکه میتواند آغازی در جهت خلق بافتهای جایگزین غیر ایمنوژنیک در مهندسی بافت باشد. همچنین در بخش دوم این تحقیق نشان داده شد، استفاده از بافت بلاستما که در هنگام زخم در برخی از موجودات تشکیل میگردد و دارای ویژگی های سلولهای جنینی است، میتواند در بررسی رفتار سلولها در شرایط مختلف بافتی، مدل مناسبی باشد. بطوریکه در این تحقیق رفتارهایی همچون چسبندگی، تکثیر، قطبیت و حتی مرگ سلولی قابل مشاهده بود.
تشکر و قدردانی
پژوهشگران بر خود لازم میدانند مراتب سپاس و امتنان خود را از حوزه معاونت پژوهشی دانشگاه فردوسی مشهد بخاطر تامین بخشی از هزینههای این تحقیق که از محل گرانت پژوهشی مربوط به فرم شماره 2 بنام "مطالعات تجربی و مقدماتی آماده سازی نیمه صنعتی داربستهای سه بعدی ( Bioscaffoldیا (3D matrix بهمنظور کاربرد در مهندسی بافت" فراهم گردیده ابراز نماید.
)