نوع مقاله : علمی - پژوهشی
چکیده
هدف: اکتین آلفای ماهیچۀ صاف (α-SMA) یک ایزوفرم اکتین است که در بسیاری از انواع سلولهای یوکاریوت وجود دارد. در این تحقیق نحوۀ بیان این پروتئین در ضمائم پوستی مورد مطالعه قرار گرفت.
مواد و روشها: در تحقیق حاضر بیان پروتئین آکتین آلفای ماهیچه صاف در سلولهای درمی سه نوع از ضمائم پوستی در شرایط in vitro و در یک مورد در شرایط in situ به روش ایمونوهیستوشیمی مورد مطالعه قرار گرفت.
نتایج: نتایج بدست آمده نشان داد که در شرایط in vitro این پروتئین تقریباً در تمام سلولهای پاپیلای درمی فولیکول موی ویبریسا بیان شد. سلولهای درمی بستر چنگال نیز با درصد بالایی این پروتئین را بیان نمودند، ولی فقط درصد کمی از سلولهای پاپیلای درمی فولیکول پر دارای این پروتئین مثبت بودند. در شرایط in situ این پروتئین بشدت در سلولهای پاپیلای درمی فولیکول پر و سایر بافتهای درمی قاعدۀ فولیکول بیان گردید.
نتیجه گیری: در این تحقیق برای اولین بار بیان α-SMAدر سلولهای درمی چنگال و پر، را در محیط کشت گزارش میشود. بعلاوه نتایج بدست آمده به همراه شواهد موجود توسط سایر محققین ثابت میکند که این پروتئین یک نقش اساسی در فعالیتهای طبیعی و ترمیمی پوست و ضمائم پوستی پستانداران و سایر مهرهداران بازی مینماید. همچنین بیان بسیار زیاد این پروتئین در فولیکول پر، موید نقش مهمتر این پروتئین در پرندگان نسبت به نقشی است که آن در فولیکول موی پستانداران برعهده دارد ولی تعیین دقیق این نقش به مطالعات بیشتری نیاز دارد.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Study of expression of α-SMA in dermal cells of skin appendages by immunohistochemistry
چکیده [English]
Aim: Alpha smooth muscle actin (α-SMA) is an actin isoform present in many kinds of eukaryotic cells. In this survey the expression of this protein in skin appendages was examined.
Materials and Methods: In present study we examined the expression of this protein in 3 populations of dermal cells derived from three different skin appendages in vitro and in one case in situ by means of immunohistochemistry.
Observations: The results obtained here showed that in culture this protein is expressed nearly in all dermal papilla cells derived from vibrissa follicles. In case of dermal cells derived from claw unit a high percentage of cells expressed the protein, but in feather follicles only a small percentage of dermal papilla cells were positive for this protein. The α-SMA was also strongly expressed in dermal components reside at basal region of feather follicles in situ.
Discussion: Here we report for the first time that α-SMA is expressed in cultured dermal cells of claw and feather follicle. Moreover, these findings along with the results provided by other workers reinforce the crucial role of this protein in normal activities of skin and cutaneous appendages in mammals and other vertebrates. Given to a high expression of this protein in dermal cells of feather follicle particularly in situ, it can be concluded that α-SMA plays a more important role in birds compared to its role in hair follicle of mammals but the exact role of this protein needs to be elucidated.
کلیدواژه‌ها [English]
- α-SMA
- Immunohistochemistry
- Skin appendages
- Dermis
مقاله پژوهشی مجله علمی پژوهشی سلول و بافت
جلد 1، شماره 2، زمستان 1389، 78-69
بررسی بیان اکتین آلفای ماهیچه صاف (α-SMA) در سلولهای درمی ضمائم پوستیبه روش ایمونوهیستوشیمی
احمد قارزی Ph.D.1*، محسن عباسی Ph.D.2، کالین جاهوداPh.D. 3
1- گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه لرستان، خرم آباد، ایران.
2- گروه علوم پایه، آموزشکده دامپزشکی، دانشگاه لرستان، خرم آباد، ایران.
3- گروه زیست شناسی، دانشگاه دورهام، دورهام ، انگلستان
* پست الکترونیک نویسنده مسئول: ahgharzi@yahoo.com
تاریخ دریافت: 30/11/ 1389 تاریخ پذیرش: 24/3/1390
چکیده
هدف: اکتین آلفای ماهیچۀ صاف (α-SMA) یک ایزوفرم اکتین است که در بسیاری از انواع سلولهای یوکاریوت وجود دارد. در این تحقیق نحوۀ بیان این پروتئین در ضمائم پوستی مورد مطالعه قرار گرفت.
مواد و روشها: در تحقیق حاضر بیان پروتئین آکتین آلفای ماهیچه صاف در سلولهای درمی سه نوع از ضمائم پوستی در شرایط in vitro و در یک مورد در شرایط in situ به روش ایمونوهیستوشیمی مورد مطالعه قرار گرفت.
نتایج: نتایج بدست آمده نشان داد که در شرایط in vitro این پروتئین تقریباً در تمام سلولهای پاپیلای درمی فولیکول موی ویبریسا بیان شد. سلولهای درمی بستر چنگال نیز با درصد بالایی این پروتئین را بیان نمودند، ولی فقط درصد کمی از سلولهای پاپیلای درمی فولیکول پر دارای این پروتئین مثبت بودند. در شرایط in situ این پروتئین بشدت در سلولهای پاپیلای درمی فولیکول پر و سایر بافتهای درمی قاعدۀ فولیکول بیان گردید.
نتیجه گیری: در این تحقیق برای اولین بار بیان α-SMAدر سلولهای درمی چنگال و پر، را در محیط کشت گزارش میشود. بعلاوه نتایج بدست آمده به همراه شواهد موجود توسط سایر محققین ثابت میکند که این پروتئین یک نقش اساسی در فعالیتهای طبیعی و ترمیمی پوست و ضمائم پوستی پستانداران و سایر مهرهداران بازی مینماید. همچنین بیان بسیار زیاد این پروتئین در فولیکول پر، موید نقش مهمتر این پروتئین در پرندگان نسبت به نقشی است که آن در فولیکول موی پستانداران برعهده دارد ولی تعیین دقیق این نقش به مطالعات بیشتری نیاز دارد.
واژگان کلیدی: اکتین آلفای ماهیچۀ صاف، ایمونوهیستوشیمی، فولیکول مو، پر، ناخن، سلولهای درمی
مقدمه
اکتین یک پروتئین اسکلت سلولی است که در تمام سلولهای یوکاریوت یافت میشود. این پروتئین فراوانترین پروتئین موجود در بسیاری از سلولهای یوکاریوت میباشد و اغلب تا 5 درصد از کل پروتئین سلول را شامل میگردد(1). این پروتئین به همراه سایر پروتئینها ضمن فراهم آوردن حمایت مکانیکی برای سلول در اعمال مختلف سلولی همچون انقباض، چسبندگی و حرکت دخالت دارد (2و3). در بافتهای یوکاریوتها سه نوع ایزوفرم اکتین وجود دارد (آلفا، بتا و گاما) که آنها را میت وان بر مبنای نقاط ایزوالکتریک متفاوت که در ژل الکتروفورز دو بعدی آشکار میشود از هم متمایز نمود (4و5). در حالیکه اکتین بتا بطور غیر افتراقی در تمام سلولهای یوکاریوت وجود دارد، اکتین آلفای قلبی، اکتین آلفای اسکلتی و اکتین آلفای ماهیچۀ صاف (α-smooth muscle actin یا α-SMA) بعنوان اکتین خاص-بافت در نظر گرفته میشوند (6 و 7).
اکتین آلفای ماهیچه صاف (α-SMA) عمدتاً در ماهیچۀ صاف طبیعی بالغ و بطور موقت در طی نمو ماهیچه اسکلتی و قلبی بیان میشود (8). این پروتئین مهمترین پروتئین ماهیچه صاف بوده و بعنوان یک نشانگر اختصاصی برای این نوع ماهیچه محسوب میشود. اما بیان این پروتئین تنها به سلولهای ماهیچۀ صاف محدود نمیشود و در سایر سلولها همچون سلولهای میوفیبروبلاست (9و10) و میواپیتلیال (11) و سایر سلولهایی که خاصیت انقباضی دارند یافت میگردد. بیش از چند دهه است که مشخص شده سلولهای فیبروبلاست بافت همبند نیز فعالیت انقباضی شبه- ماهیچهای از خود نشان میدهند (12). گزارشهایی وجود دارد که نشان میدهد انقباض فیبروبلاستها در بعضی از بافتهای همبند (درم) یک نقش کلیدی در بسته شدن زخمها در جریان التیام جراحت پوست بازی میکند (13، 14، 15و16) و تایید شده که این رفتار انقباضی فیبروبلاستها ناشی از بیان α-SMA در آنها است (17،18، 19و20). وجود این پروتئین حتی در سلولها و بافتهای ظاهراً غیر انقباضی نظیرکندروسیتها، استئوبلاستها، سلولهای مزانشیمی مغز استخوان، آملئوبلاستها، دیسکهای بین مهرهای و سلولهای اپیتلیالی عدسی چشم تایید شده است (21، 22و 23). هر چند که نقش واقعی α-SMA در این سلولها و بافتها هنوز مشخص نشده است ولی یکی از احتمالات این است که سلولهای حاوی α-SMA در فـرایندهای تـرمیمی و التیـامی چـه طبیعی و چـه
پاتولوژیکی شرکت میکنند.
پروتئین α-SMA علاوه بر پوست در ضمائم پوستی نیز بیان میشود. ضمائم پوستی که در مهره داران شامل مو، پشم، ویبریسا (موهای زبر روی سطح پشتی لب فوقانی بعضی پستانداران)، پر، ناخن، چنگال، شاخ و غیره میباشند در دورۀ جنینی تماماً طی برهمکنشهای مولکولی و بیوشیمیایی تقریباً مشابهی که بین لایۀ اپیدرمی و مزانشیمی جنین اتفاق میافتد منشاء میگیرند و در سرتاسر حیات شباهتهایی را بین خود آشکار میکنند (24)، بطوریکه بعنوان مثال گفته شده که ناخن یا چنگال مهرهداران در حقیقت یک فرم بازنشده از فولیکول مو است که بجای مو صفحۀ کراتینی میسازد (25).
مطالعاتی که بر روی بیان α-SMA در فولیکول مو صورت گرفته نشان میدهد که در شرایط in situ سلولهای غلاف درمی و پاپیلای درمی این پروتئین را بیان میکنند ولی سطح بیان آن در نقاط مختلف فولیکول فرق میکند (5). ضمن اینکه میزان بیان این پروتئین حتی در یک نوع سلول فولیکول مو در شرایط in vitro با شرایط in situ متفاوت است (26). بنظر میرسد که این پروتئین در فولیکول مو یک نقش اساسی در کنترل فعالیت چرخهای آن بازی میکند ولی این موضوع هنوز کاملاً تایید نشده است.
علیرغم شباهتهای ذکر شده بین ضمائم پوستی، تاکنون مطالعهای بر روی بیان یا عدم بیان این پروتئین در سایر ضمائم پوستی صورت نگرفته است و با وجود این شباهتهای جنینی و ساختاری مشخص نیست که آیا این شباهتها در مورد این پروتئین نیز صادق است یا تفاوتهایی بین آنها دیده میشود. این شباهتها یا تفاوتها میتواند کلیدی برای تعیین نقش دقیق و واقعی این پروتئین در ضمائم پوستی باشد و به ما نشان خواهد داد که آیا این پروتئین بطور کلی نقش یکسانی در تمام ضمائم پوستی دارد، یا اینکه با توجه به وظایف و ویژگیهای منحصر به فرد این ضمائم در مهرهداران این پروتئین در هر یک از آنها دارای یک نقش متفاوت و اختصاصی میباشد. برای آگاهی از این موضوع ما بر آن شدیم که بیان این پروتئین را علاوه بر سلولهای درمی فولیکول موی ویبریسا در سلولهای درمی موجود در چنگال پستاندار و فولیکول پر پرنده مورد بررسی قرار دهیم تا با توجه به نتایج حاصله بتوانیم نقش احتمالی این پروتئین در این ضمائم پوستی بهتر درک نماییم.
مواد و روشها
جدا نمودن سلولهای درمی از فولیکول موی ویبریسا موش صحرایی: تعداد 5 موش صحرایی نژاد PVG (inbred Piebald Virol Glaxo rat) کشته شدند و پس از خارج نمودن فولیکولهای ویبریسای آنها، پاپیلای درمی این فولیکولها به ترتیبی که توسط سایرین توضیح داده شده (5، 26 و 27) جدا گردید. کلیه مراحل انجام طرح با توجه به پروتکلهای تعریف شده در دانشگاه دورهام، انگلستان صورت گرفته است. بطور خلاصه، بعد از شکافتن پوست لب فوقانی موش با کمک قیچی، لبه پوست بریده شد و با انبرهای ریز گرفته و کشیده شد تا اینکه فولیکولهای بزرگ ویبریسا از زیر نمایان شدند. سپس با کمک پنس فولیکولها یکی یکی و بآرامی از ناحیه گردن گرفته، جدا و در ظرف حاوی MEM (Eagle’s Minimal Essential Medium, Gibco, Life Technologies, UK) قرار داده شدند. در زیر استرئومیکروسکوپ (Nikon SMZ-10, Japan) و با استفاده از یک قیچی ریز ناحیۀ قاعدۀ فولیکولها از بخشهای فوقانی آن جدا و به ظرف جداگانه انتقال داده شد. در اینجا با کمک پنس ظریف لبه کپسول کلاژنی اطراف قاعدۀ فولیکول را گرفته و با استفاده از یک پنس دیگر سطح پائینی آن بطرف بالا فشار داده شد تا با معکوس کردن آن محتویات داخل کپسول که شامل پاپیلای درمی (dermal papilla)، مرکزی و غلاف سلولهای اپیدرمی ماتریکس هستند، از کپسول خارج گردد. با کمک پنسهای ظریف، پاپیلای درمی از سلولهای غلاف اپیدرمی جدا و به ظروف کشت انتقال یافت.
جدا سازی پاپیلای درمی از فولیکول پر کبوتر: تعداد دو کبوتر معمولی بالغ تهیه شد و پس از کشتن، بالهای آنها از بقیه بدن جدا گردید. سپس تمام پرهای روی بال بجز پرهای کوچک تازه بیرون آمده با دست از بال کنده شدند. سپس با استفاده از قیچی، ساقه پرها از محل خروج از پوست قطع و دور انداخته شد. باقیمانده بالها پس از شستشو در اتانول 70درصد برای کارهای بعدی به ظروف حاوی MEM و آنتی بیوتیک منتقل شدند. با استفاده از قیچیهای ظریف، پوست روی بال به همراه فولیکولهای پر آن از بافتهای زیرین جدا شدند. چون قاعده فولیکولهای پر در تماس نزدیک با استخوانهای بال قرار دارد، دقت زیادی بعمل آمد تا حین جدا کردن پوست به قاعده فولیکولها آسیبی نرسد. پوست جدا شده به همراه فولیکولهای موجود در آن به ظرف دیگری حاوی MEM و آنتیبیوتیک تازه منتقل شدند. متعاقباً در این ظرف فولیکولها از بافتهای اطراف جدا شدند. در اینجا بعضی از این فولیکولها برای بررسی بیان α-SMA در شرایط in situ برای برش با فریزمیکروتوم (کرایوستات) آماده شدند. اما بقیه فولیکولها برای خارج کردن پاپیلای درمی و کشت سلولی بطریق زیر آماده شدند. ابتدا با کمک قیچیهای ریز پوشش شاخی اطراف فولیکول پاره گردید. در زیر این پوشش یک غلاف درمی وجود دارد که آن نیز پاره و خارج شد تا اینکه محتویات داخلی فولیکول که شامل بافت اپیتلیالی خارجی و پاپیلای درمی مرکزی است آشکار گردد. سپس با کمک سر سرنگ و پنسهای بسیار ریز بخش اپیدرمی جدا و دور انداخته شد ولی بخش داخلی که شامل پاپیلای درمی است به ظروف کشت حاوی محیط کشت منتقل گردیدند.
جدا نمودن و کشت سلولهای درمی از چنگال موش صحرایی: برای اینکار موشهای صحرایی ابتدا کشته شدند و اندامهای حرکتی آنها با الکل 70درصد شستشو داده شدند. سپس با استفاده از یک تیغۀ اسکالپل آخرین بند انگشت اندامهای حرکتی آنها که واجد چنگال است قطع گردید. بندهای انگشت قطع شده به پتری حاوی MEM و آنتیبیوتیک منتقل گردیدند. با استفاده از استرئومیکروسکوپ و قیچیهای ریز و تیز، با یک برش طولی پوست روی انگشتان برداشته شد، تا اینکه اجزاء داخلی آن آشکار گردد. اجزاء داخلی که شامل بافتهای اطراف استخوان آخرین بند انگشت و بافتهای مربوط به چنگال هستند متعاقباً به ظروف حاوی MEM تازه منتقل گردیدند. سپس صفحه کراتینی چنگال به آرامی از بافتهای اطراف استخوان بند انگشت جدا و دور انداخته شد. سپس پاییلای درمی که در زیر صفحۀ چنگال بود آشکار گردید. پاپیلا که فقط به بافتهای اطراف استخوان متصل بود با استفاده از پنس به آرامی از این بافتها جدا گردید و به ظروف 35 میلیمتری حاوی محیط کشت انتقال داده شد.
نحوۀ کشت بافتهای درمی: هر سه نوع بافت درمی خارج شده از فولیکول موی ویبریسا و بستر چنگال موش صحرایی فولیکول پر کبوتر بر طبق روشی که با جزئیات توسط دیگران توصیف شده، کشت داده شد (5 و 27). در اینجا بافتهای جدا شده برای شروع کشت ابتدا با کمک نوک سرنگ به قطعههای کوچکی به ابعاد 2-1 میلیمتر خرد شدند و در نهایت به ظروف کشت 35 میلیمتری (Falcon, Becton Dickinson, UK) حاوی 2-1 قطره محیط کشت انتقال یافت. محیط کشت مورد استفاده برای کشت شاملMEM + آنتیبیوتیکها (استروپتومایسین، پنیسیلین و فونگیزون هر یک با غلظت 50 units/ml) (Gibco) و 20 درصد FCS (Fetal Calf Serum, Biochrom) بود. ظروف کشت سپس در داخل انکوباتور با دمای 37درجه سانتیگراد و شرایط 95درصد اکسیژن و 5 درصد دی اکسید کربن قرار گرفت. بعد از 4-3 روز از شروع کشت، ظروف در زیر میکروسکوپ فازکنتراست مشاهده شد. پس از اینکه بافتهای درمی به کف ظروف چسبیدند و علائم رشد سلولی را نشان دادند، 2 میلیلیتر محیط کشت تازه به آنها افزوده شد. در طی مدت کشت، محیط قدیمی هر 4 روز یکبار با محیط جدید تعویض گردید. موقعیکه سلولها به تراکم نهایی رسیدند (حالت کانفلوئنت، confluent) کشتها پاساژ داده شد و به ظرفهای دیگر انتقال یافتند. سلولها پس از پاساژ دوم برای کارهای ایمونوهیستوشیمی به روش زیر آماده شدند.
نشان دار کردن سلولهای درمی در شرایط in vitro با آنتی α-SMA بروش ایمونوهیستوشیمی: مراحل ایمونوهیستوشیمی بر مبنای آنچه که توسط دیگران (5، 10 و 27) بیان شده و با تغییراتی، انجام گرفت. بطور خلاصه، سوسپانسیون سلولهای درمی بعد از دومین پاساژ روی لاملی که در کف ظروف کشت 35 میلیمتری گذاشته شده بود، کشت داده شدند. بعد از 10-7 روز که سلولها به سطح لامل چسبیده و در اثر رشد و تقسیم بحالت کانفلوئنت رسیدند، ظروف حاوی لامل از انکوباتور خارج و با کمک یک پنس ظریف لامل از ظرف کشت خارج گردید. لامل حاوی سلولها سپس چند بار با بافر PBS شسته شد و بعد از آن برای مدت 5 دقیقه در استون و دمای 20- درجه سانتیگراد تثبیت گردید و پس از تثبیت دوباره برای مدت چند بار و هر بار به مدت 5-3 دقیقه با بافر شستشو داده شد. سپس آنتی بادی منوکلونال α-SMA اولیه (تهیه شده توسط Dr. Gabbiani, Geneva, Switzerland) با PBS ده بار رقیق گردید و روی لامل حاوی سلولهای تثبیت شده، ریخته شد. لامل مذکور سپس به مدت 1 ساعت در دمای اتاق به حال خود رها شد. بعد از این مدت سلولها مجدداً برای 3 بار با PBS شستشو داده شدند و سپس به مدت 1 ساعت در معرضbiotinylated goat anti-mouse antibody (Sigma, Aldrich, UK) با رقت 1 به 90 قرار گرفتند. بعد از شتشوی دوباره با PBS نمونهها برای آخرین بار به مدت 1 ساعت دیگر در معرض fluorescein-liked sterptavidin (Sigma, Aldrich, UK) با رقت 1 به 100 قرار گرفتند. بعد از شستن نهایی، لامل با محلول citifluor (Agar aids) پوشانده شد و در زیر میکروسکوپ فلورسنس (Zeiss ICM 405) مورد مشاهده قرار گرفت و تصاویر مربوطه تهیه شد. برای هر یک از سلولهای درمی نمونه شاهد نیز تهیه شد. در نمونههای شاهد تمام مراحل مذکور انجام شد ولی بجای استفاده از آنتیبادی اولیه در اینجا سلولها فقط در معرض PBS خالص قرار گرفتند.
نشاندار کردن فولیکولهای پر با آنتی بادی α-SMA در شرایط in situ: فولیکولهای پر بعد از جدا شدن از بال پرنده به ترتیبی که در قسمت مربوطه توضیح داده شد در محلول tissue-tek (Agar aids) قالبگیری گردید و سپس با کمک نیتروژن مایع فریز شدند. سپس از قالبهای مذکور، با کمک دستگاه کرایواستات (model 1720, Leitz) برشهای 6 میکرومتری تهیه شد. برشهای تهیه شده سپس بر روی لامهای پوشیده شده با پولی-لیزین قرار داده شدند. برشها سپس در دمای اتاق گذاشته شد تا خشک شوند و بعد در دمای 4 درجه با استون به مدت 10 دقیقه تثبیت شدند. بعد از این مرحله برای نشاندار کردن برشها به همان ترتیبی که در قسمت قبل برای سلولهای محیط کشت توضیح داده شد، عمل گردید.
.
نتایج
ویژگی سلولهای درمی در شرایط in vitro
طی 5-3 روز بعد از خوابانده شدن بافتهای درمی جدا شده از فولیکول ویبریسا، چنگال و فولیکول پر در محیط کشت، سلولها شروع به رشد کردن در اطراف بافتهای پیوند شده یا explant نمودند (شکل A1) و بتدریج در اثر تقسیمات متوالی تمام کف ظرف کشت را اشغال میکردند. سلولهای حاصله از هر سه نوع بافت هر چند در ابتدای رشد و در مجاورت بافت اولیه کم و بیش گرد و کوچک بودند ولی بتدریج پهن شده و ظاهر دوکی یا ستارهای شکل پیدا میکردند. سلولها در ظروف کشت اولیه 35 میلیمتری حدود 5-4 هفته طول میکشید که به تراکم نهایی برسند و یک تک لایه را در کف ظرف ایجاد کنند و آن زمانی بود که سلولها برای پاساژ دادن آماده میشدند.
با بررسیها و مشاهدات بعمل آمده روی نحوه رشد این سه نوع بافت مشخص شد که بطور کلی سلولهای پاپیلای درمی فولیکول ویبریسا در ظروف کشت نسبت به دو نوع سلول دیگر حالت متراکمتری بخود می گرفتند که این حالت از همان ابتدای شروع رشد سلولها در اطراف explant نمایان بود. این سلولها هنگامیکه به مرحله تراکم نهایی نیز میرسیدند روی همدیگر سوار میشدند و تودههای سلولی (clamp) را بوجود میآوردند که این حالت در دو نوع دیگر سلولها مشاهده نمیشد یا اینکه بحالت مشخص وجود نداشت (شکل B1).
سلولهای جدا شده از بافت درمی زیر یا بستر چنگال موش نیز در حین رشد در محیط کشت ویژگیهای سلولهای درمی را بخود گرفته و از لحاظ مشخصات ظاهری مشابه فیبروبلاستهای حاصله از پوست که توسط دیگران توصیف شده بودند(21) یعنی اکثراً باریک و بلند بوده و ظاهری دوکی شکل داشتند. همانطور که در بالا ذکر شد این سلولها نسبت به سلولهای پاپیلای درمی در هنگام تشکیل تک لایه ای سلولی از تراکم کمتری برخوردار بودند و تشکیل تودههای سلولی (کلمپ) را نمیدادند یا اینکه این تودهها کمتر دیده میشد (شکلC1).
سلولهای حاصله از فولیکول پر در محیط کشت دیرتر از دو نوع سلول دیگر شروع به ظاهر شدن در اطراف بافت پیوند شده میکردند ولی در هنگام ظاهر شدن همان مورفولوژی سلولهای مزانشیمی را آشکار مینمودند. این سلولها در محیط کشت بر خلاف دو نوع سلول دیگر از رشد آهستهای در محیط کشت برخوردار بودند بطوریکه حداقل دو هفته دیرتر از دو نوع دیگر بحالت تراکم نهایی در ظروف کشت میرسیدند. این رشد آهسته بطور مداوم هم در کشت های اولیه و هم بعد از پاساژ دادن قابل تشخیص بود. این سلولها همچنین به هیچ عنوان به تراکمی که در دو نوع سلول دیگر ظاهر میشد نمیرسیدند و همیشه فاصله اندکی بین سلولهای همسایه مشاهده میشد (شکلD1).
شکل 1: میکروگرافهای فاز کنتراست از سلولهای درمی ضمائم پوستی. A) سلولهای پاپیلای درمی که 6 روز بعد از کشت از کنار بافت پیوند شده (explant) شروع به رشد نمودهاند. همانطور که دیده می شود سلولهای مجاور بافت که به تازگی ایجاد شدهاند کوچکتر و متراکمتر از سلولهای حاشیهای میباشند. خط نشانه= 200 میکرومتر. B) سلولهای پاپیلای درمی فولیکول ویبریسا در حالت تراکم نهایی. علاوه بر تشکیل تک لایه ای، بعضی از سلولها روی هم سوار شده و تشکیل تودههای سلولی را دادهاند. خط نشانه= 100 میکرومتر. C) سلولهای درمی حاصل از بستر چنگال موش صحرایی در حالت تراکم نهایی. حالت تشکیل توده سلولی در اینجا به شدت پاپیلای درمی فولیکول ویبریسا (شکل 2) نیست. خط نشانه= 150 میکرومتر. D) سلولهای پاپیلای درمی فولیکول پر کبوتر در حالت تراکم نهایی. سلولها در اینجا بزرگتر و پراکندهتر از دو نوع دیگر هستند و حالت توده سلولی آشکاری ایجاد نمی گردد. خط نشانه= 100 میکرومتر.
بیان α-SMA در سلولهای درمی در شرایط in vitro
بیان α-SMA در سلولهای پاپیلای درمی فولیکول ویبریسا موش صحرایی قبلاً بوسیلۀ دیگران گزارش شده است (5 و 26). بطور کلی تقریباً تمام سلولهای پاپیلای درمی موجود در محیط کشت این پروتئین را بیان نمودند (شکل A2). به علاوه سلولهای پهن و گسترده شده و آنهایی که با فاصله از سلولهای همسایه قرار داشتند نسبت به سلولهای کوچکتر و متراکمتر خیلی شدیدتر این پروتئین را در سیتوپلاسم خود بیان نمودند (شکل B2).
درصد بالایی از سلولهای درمی مشتق شده از بستر چنگال موش صحرایی نیز همچون سلولهای پاپیلای درمی حاصل از فولیکول ویبریسا پروتئین α-SMAرا در سیتوپلاسم خود بیان نمودند. به علاوه در این سلولها این پروتئین در پاهای تیغهای سلولها شدیدتر از سیتوپلاسم مرکزی بیان میشد. همچنین هم چون سلولهای پاپیلای درمی ویبریسا، سلولهای پهن و با فاصله این پروتئین را بهتر از سلولهای متراکم بیان نمودند (شکل C2).
شکل 2: میکروگرافهای فلورسنت از سلولهای درمی ضمائم پوستی که با آنتی α-SMA رنگ شدهاند. A) پاپیلای درمی ویبریسا. تقریباً تمام سلولهای پاپیلای درمی از نظر بیان پروتئین α-SMA مثبت بودند. خط نشانه= 50 میکرومتر. B) تصویر A با بزرگنمایی بالاتر. خط نشانه= 25 میکرومتر. C) سلولهای درمی حاصل از بستر چنگال موش صحرایی. اکثریت سلولها ولی نه تماماً پروتئین α-SMA را در سیتوپلاسم خود بیان نمودند. ملاحظه میشود که پاهای تیغهای سلولها این پروتئین را شدیدتر بیان میکنند. خط نشانه= 25 میکرومتر. D) سلولهای پاپیلای درمی فولیکول پر در محیط کشت. فقط بخش کمی از سلولها پروتئین α-SMAرا در سیتوپلاسم خود بیان می کنند. خط نشانه= 25 میکرومتر. E) بیان α-SMA در مقطع طولی از فولیکول پر کبوتردر شرایط in situ. نواحی مختلف فولیکول که پروتئین مذکور را بیان نمودهاند با رنگ سبز قابل تشخیص است. پیکان زرد (پاپیلای درمی)، پیکان سفید (رگ خونی)، پیکان قرمز= ماهیچۀ راست کننده و p= پولپ. خط نشانه= 100 میکرومتر.
بر خلاف سلولهای درمی حاصل از موش صحرایی، پروتئین α-SMA فقط در درصد کمی (حدوداً یک سوم) از سلولهای پاپیلای درمی فولیکول پر کبوتر بیان شد و بقیۀ سلولها از نظر این پروتئین واکنش منفی نشان دادند. در اینجا سلولهای α-SMA مثبت معمولاً در گروههای مجزا و کنار هم دیده میشدند و کاملاً از سلولهای α-SMA منفی جدا میشدند. اما در هماهنگی با دو نوع سلول درمی دیگر در اینجا نیز پروتئین α-SMA در سلولهای پهن و کشیدهتر شدیدتر بیان میشد (شکلD2).
بیان α-SMA در سلولهای پاپیلای درمی فولیکول پر در شرایط in situ
چون بیان α-SMAدر پاپیلای درمی ویبریسا در شرایط in situ قبلاً مطالعه شده و نظر به عدم امکان برش گیری چنگال موش صحرایی با کرایواستات (با توجه به سخت بودن این بافت) در این تحقیق فقط فولیکول پر از نظر بیان α-SMA در شرایط in situ مورد مطالعه قرار گرفت. مشاهدات انجام شده نشان داد که این پروتئین با شدت بالایی در پاپیلای درمی بیان میشود. همچنین این پروتئین در دیوارۀ عروق خونی موجود در فولیکول وجود دارد. به علاوه مشخص شد که به غیر از پاپیلای درمی و رگهای خونی بافتهای همبند اطراف قاعدۀ فولیکول نیز این پروتین را بیان میکنند. اما بیان این پروتئین در این بافتهای همبند در سطوح بالاتر به ناگهان قطع میشود و از نیمۀ فولیکول بطرف بالا این پروتئین در آنها بیان نمیشود. همچنین مشخص شد که پروتئین α-SMA قویاً در عضلۀ راست کنندۀ پر که به کنارۀ فولیکول پر متصل میشود بیان میگردد (شکل E2).
بحث
در توافق با مشاهدات قبلی (5) در این تحقیق نشان دادیم که سلولهای پاپیلای درمی فولیکولهای ویبریسا در شرایط in vitro پروتئین α-SMA را در سیتوپلاسم خود بیان میکردند. بعلاوه در این پژوهش برای اولین بار نشان دادیم که سلولهای درمی بستر چنگال و همچنین پاپیلای درمی فولیکول پر همچون همتای خود در فولیکول ویبریسا واجد این پروتیئن بودند. در مطالعات قبلی مشخص شده بود که سلولهای پاپیلای درمی ویبریسا منحصراً در شرایط in vitro این پروتئین را بیان میکنند ولی در اینجا نشان داده شد که در مورد پر سلولهای پاپیلای درمی هم در شرایط in vitro و هم in situ این پروتئین در آنها تظاهر پیدا میکند. همچنین مشخص گردید که بر عکس سلولهای پاپیلای ویبریسا که تقریباً تماماً در محیط کشت این پروتئین را تولید می کنند در مورد سلولهای پاپیلای پر فقط کسر کوچکی از سلولها به این کار اقدام میورزند و بقیه به این پروتئین پاسخ منفی نشان میدهند. این مشاهدات به همراه نتایج حاصله توسط دیگران که نشان دادهاند سلولهای غلاف درمی فولیکول مو نیز هم در شرایط in vitro و هم in situ پروتئین α-SMAرا بیان میکنند (26)، نقش مهم اکتین را در انقباض فولیکول نشان میدهد و انقباض فرآیندی است که فولیکول بدون آن نمیتواند وظایفش را انجام دهد. فولیکول مو دارای یک چرخۀ دورهای است و در طی این چرخه علاوه بر تغییرات فیزیولوژیک دگرگونیهای مورفولوژیک عمیقی را پشت سر میگذراند (21 و 28) ، به این ترتیب که در طی فاز رشد (anagen) رشته موی (fiber) تازه تشکیل شده بطور پیوسته بطرف بالا و سطح پوست رانده میشود و از اینرو به احتمال قوی پروتئین α-SMA موجود در جزء درمی فولیکول در این رانده شدن رشته مو دخالت مستقیم دارد. به علاوه در فاز انتقالی (catagen) در اکثر انواع فولیکولها، بخش پائینی فولیکول منقبض شده و بطرف بالا حرکت میکند و این خود دوباره اشاره به این دارد که سلولهای این ناحیه از فولیکول برای انجام این کار بایستی قابلیت انقباض داشته باشند. مضاف بر این وجود اکتینهای انقباضی در سلولهای درمی فولیکول مو ممکن است در آرایش سلولهای سازنده رشته مو دخالت داشته باشد. در تایید این مطلب مطالعات میکروسکوپ الکترونی نشان داده است که دستجات اکتین سلولهای درمی ناحیه تحتانی فولیکول دستجات حلقوی پیوستهای را در اطراف غلاف داخلی ریشه مو تشکیل میدهند (2) و این محل منطقه کراتینوژنز است که جایگاه ضروری برای تولید رشته مو میباشد. در طول فاز رشد سلولها در ناحیه ماتریکس (سلولهای اپیدرمی قاعدۀ فولیکول) پس از تکثیر بطرف بالا حرکت میکنند و در این حین و تا قبل از منطقه کراتینوژنز بر حجم آنها افزوده میگردد. در بالای ناحیه بولب (bulb) سلولهای حجیم شده همچون قیف بداخل منطقه کراتینوژنز باریک رانده میشوند و در این منطقه در اثر نیروی اعمال شده از اطراف به سلولهای باریک و بلند کراتینی تبدیل میشوند (29). این احتمال وجود دارد که در این فرایند نیروی اعمال شده به سلولها توسط دستجات اکتینی سلولهای درمی اطراف تامین میگردد (2). به علاوه، بدنبال قطع تولید مو در پایان فاز رشد، به نظر میرسد که در طی فاز انتقالی و استراحت (telogen) تمام عناصر انقباضی فولیکول بکار گرفته میشوند تا رشته موی قدیمی را که در طی فاز رشد قبلی ایجاد شده بطرف بالا برانند تا اینکه در نهایت آن از سطح پوست بیافتد و دوباره این نیروی انقباضی توسط α-SMA سلولهای اطراف بر رشته موی قدیمی اعمال میگردد. بنابراین بطور خلاصه نتایج این تحقیق به همراه سایر مشاهدات انجام شده تایید میکند که وجود α-SMA در اجزاء درمی فولیکول مو برای ساختار رشته مو و حفظ پیوستگی و تمامیت فولیکول مو ضروری است.
علیرغم عدم وجود شواهد دیگر، با توجه به شباهتهای جنینی و ساختاری که بین فولیکول مو و چنگال وجود دارد، نقش α-SMA در سلولهای درمی بستر چنگال احتمالاً اعمال نیروی انقباضی در جهت آرایش و سازمانبندی سلولهای کراتینی چنگال یا ناخن و همچنین راندن بافت ساخته شده به سمت بیرون میباشد، چیزی مشابه وظیفهای که برای این پروتئین در دیگر ساختار پوستی یعنی غده پستانی مشخص شده است. گزارشی وجود دارد که α-SMA موجود در سلولهای میواپیتلیال غده پستانی در انقباض این سلولها و آزاد سازی شیر از سلولهای لومینال دخالت دارد (30) ولی اینکه این پروتئین در چنگال نیز دقیقاً نقش انقباضی دارد یا در اعمال دیگر نیز مشارکت دارد یا خیر احتیاج به شواهد و مدارک بیشتری دارد. به علاوه گزارش شده که سلولهای بیان کننده α-SMA در حقیقت یکی از مهمترین سلولهای تولید کننده رشتههای کلاژن میان بافتی هستند (31). از اینرو شاید یکی از نقشهای این پروتئین ممکن است دخالت در سنتز و ترشح رشتههای موجود در لابلای سلولهای درمی باشد. همچنین بیان قوی و شدید α-SMAدر سلولهای بافت همبند، رگ خونی، ماهیچه و پاپیلای درمی فولیکول پر در شرایط in situ به نقش با اهمیت این پروتئین در این ساختار اشاره میکند. در پرندگان پروازی همچون کبوتر، پر در مقایسه با مو در پستانداران نقش بسیار با اهمیتتری در حیات حیوان بازی میکند. این اهمیت را میتوان در همین تحقیق با توجه به وجود یک رگ خونی مستقل برای پاپیلای درمی فولیکول پر درک نمود، چیزی که تاکنون در مورد پاپیلای درمی فولیکول مو گزارش نشده است. از طرفی بر خلاف پاپیلای درمی فولیکول مو که در شرایط in situ این پروتئین در آنها بیان نمیشود در اینجا مشاهده شد که این پاپیلا و حتی رگ خونی آن پروتیئن α-SMA را بیان میکنند. این نتایج دوباره به نقش بارز α-SMA در فولیکول پر اشاره مینماید.
وجود تفاوتهایی که در این تحقیق بین سلولهای درمی سه نوع ضمائم پوستی از نظر بیان پروتئین α-SMA مشاهده شد میتواند منعکس کننده این واقعیت باشد که علاوه بر نقش مشترک، ترمیم و انقباض، این پروتئین به احتمال زیاد در این ضمائم یک نقش اختصاصی نیز بازی میکند که بسته به فعالیتهای آنها فرق میکند. از طرفی همانطور که مشاهده شد بیان این پروتئین در سلولهای درمی بستر چنگال خیلی کمتر و محدود تر از بیان این پروتئین در فولیکول پر و مو میباشد و فولیکولها در مقایسه با چنگال ضمائم بسیار فعالتری هستند چراکه همانطور که در بالا اشاره شد دارای چرخههای متوالی رشد و بازسازی هستند که این چرخهها در چنگال دیده نمیشود. بنابراین با توجه به این نتایج میتوان چنین استنباط کرد که α-SMA در فعل و انفعالات دینامیک این ضمائم نقش فعال و بارزی ایفا می کند ولی اینکه دقیقاً این نقش چیست و از چه طریق و با واسطه چه مولکولهای دیگری این نقش اعمال میگردد نیاز به تحقیقات بیشتری دارد.
نتیجه گیری
با توجه به نتایج بدست آمده در این تحقیق میتوان چنین استنباط کرد که α-SMA در فعل و انفعالات دینامیک ضمائم پوستی نقش فعال و بارزی ایفا میکند ولی اینکه دقیقاً این نقش چیست و از چه طریق و با واسطۀ چه مولکولهای دیگری این نقش اعمال میگردد نیاز به تحقیقات بیشتری دارد.
)