بررسی مقایسه¬ای اثر عصاره گیاه یونجه پا کلاغی (Lotus corniculatus L.) و کرم فنی توئین 1 درصد بر التیام زخم پوست رت: مطالعه مورفومتریک و هیستوپاتولوژیک

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

چکیده

هدف: هدف از این مطالعه بررسی التیام زخم پوستی پس از مصرف موضعی عصاره بخش های هوایی گیاه یونجه پا کلاغی در مقایسه با پماد فنی توئین در رت بود.
مواد و روش‏ها: پس از القای بیهوشی در 80 سر موش صحرایی نر، زخمی مستطیل شکل در پشت هرکدام از آنها ایجاد شد. التیام زخم در 8 گروه شامل: کنترل (A)، کرم فنی توئین 1 درصد (B)، پماد عصاره 10 درصد (C)، پماد عصاره 20 درصد (D)، پماد عصاره 40 درصد (E)، کرم فنی توئین 1درصد + پماد عصاره 10 درصد (F)، کرم فنی توئین 1 درصد + پماد عصاره 20 درصد (G) و کرم فنی توئین 1 درصد + پماد عصاره 40 درصد(H)  بررسی گردید. درمان و اندازه گیری زخم ها با آنالیز تصاویر دیجیتالی به مدت 21 روز صورت پذیرفت. جهت مطالعات میکروسکوپی در روزهای 3، 7، 14 و 21 از محل ترمیم نمونه برداری شد. التیام زخم برای همه گروه‏های تحت تیمار مشخص گردید. داده ها با نرم افزار SPSS18 آنالیز شدند.
نتایج: متوسط سطح زخم التیام یافته در گروه‏های E و H از متوسط سطح زخم سایر گروه ها کمتر بود (01/0>P). همچنین بر اساس نتایج هیستوپاتولوژیکی برآیند کلی التیام زخم گروه های  Eو H بهتر از سایر گروه ها بود.
نتیجه گیری: با توجه به اثرات ضد التهابی، ضد میکروبی و ترمیمی عصاره گیاه یونجه پا کلاغی در مقایسه با داروی فنی توئین 1 درصد می‏توان اذعان نمود که ترکیبات موجود درگیاه عامل موثرتری در التیام زخم های جلدی تمام ضخامت می‏باشند.
 

کلیدواژه‌ها


مقاله پژوهشی                                                                                                                        مجله سلول و بافت (علمی - پژوهشی)

                                                                                                                                             جلد 2، شماره3، پاییز 1390، 223-213

 

بررسی مقایسه­ای اثر عصاره گیاه یونجه پا کلاغی (Lotus corniculatus L.) و کرم فنی توئین 1 درصد بر التیام            زخم پوست رت: مطالعه مورفومتریک و هیستوپاتولوژیک

 

معصومه اسدبگی1*، ناصر میرازی2، مهران وطنچیان3

 

1- دانشجوی کارشناسی ارشد زیست شناسی، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی واحد همدان

2- گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه بوعلی سینا همدان

3- بخش بافت شناسی، گروه علوم پایه، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی خراسان شمالی

* پست الکترونیک نویسنده مسئول: masimj@ymail.com

 

تاریخ دریافت: 2/8/1390                               تاریخ پذیرش: 26/10/1390

 


چکیده

هدف: هدف از این مطالعه بررسی التیام زخم پوستی پس از مصرف موضعی عصاره بخش های هوایی گیاه یونجه پا کلاغی در مقایسه با پماد فنی توئین در رت بود.

مواد و روش‏ها: پس از القای بیهوشی در 80 سر موش صحرایی نر، زخمی مستطیل شکل در پشت هرکدام از آنها ایجاد شد. التیام زخم در 8 گروه شامل: کنترل (A)، کرم فنی توئین 1 درصد (B)، پماد عصاره 10 درصد (C)، پماد عصاره 20 درصد (D)، پماد عصاره 40 درصد (E)، کرم فنی توئین 1درصد + پماد عصاره 10 درصد (F)، کرم فنی توئین 1 درصد + پماد عصاره 20 درصد (G) و کرم فنی توئین 1 درصد + پماد عصاره 40 درصد(H)  بررسی گردید. درمان و اندازه گیری زخم ها با آنالیز تصاویر دیجیتالی به مدت 21 روز صورت پذیرفت. جهت مطالعات میکروسکوپی در روزهای 3، 7، 14 و 21 از محل ترمیم نمونه برداری شد. التیام زخم برای همه گروه‏های تحت تیمار مشخص گردید. داده ها با نرم افزار SPSS18 آنالیز شدند.

نتایج: متوسط سطح زخم التیام یافته در گروه‏های E و H از متوسط سطح زخم سایر گروه ها کمتر بود (01/0>P). همچنین بر اساس نتایج هیستوپاتولوژیکی برآیند کلی التیام زخم گروه های  Eو H بهتر از سایر گروه ها بود.

نتیجه گیری: با توجه به اثرات ضد التهابی، ضد میکروبی و ترمیمی عصاره گیاه یونجه پا کلاغی در مقایسه با داروی فنی توئین 1 درصد می‏توان اذعان نمود که ترکیبات موجود درگیاه عامل موثرتری در التیام زخم های جلدی تمام ضخامت می‏باشند.

واژگان کلیدی: التیام زخم، عصاره گیاه یونجه پا کلاغی، فنی توئین، پوست، موش صحرایی

 

 

 

 


مقدمه

یکی از اهداف اصلی درمانی علم پزشکی در جوامع کنونی، ترمیم زخم در زمان کوتاهتر و با عوارض جانبی کمتر می‌باشد (1). زخم به عنوان اصلی‌ترین و مهمترین مساله در جراحی از دیرباز مورد توجه خاص محققان  پزشکی و فیزیولوژی بوده است. به همین دلیل تحقیقات بسیار گسترده‌ای در این مورد انجام گرفته و از روش‌های مختلف در درمان آن استفاده شده است (2،3و4). از جمله استفاده از داروهای شیمیایی، گیاهی، هومیوپاتی و روش‌های فیزیکی مثل لیزرتراپی و سایر روش های متداول می‏باشد. هدف از انجام همه این روش‌ها درمان سریع، کم‌عارضه، سریع و در عین حال کم‌ هزینه زخم می باشد )4و5). با بررسی گزارش های ثبت شده و تجربیات محققان بدلیل تفاوت‌های فردی و متفاوت بودن ماهیت زخم‌های سطحی و دیگر دلایل تا این زمان هیچکدام از مواردی که به صورت شیمیایی و یا گیاهی معرفی شده‌اند، نتوانسته‌اند به عنوان یک روش مؤثر توصیه شوند (6).

از جمله تحقیقاتی که در این زمینه صورت گرفته می‏توان به مطالعه اثر مصرف موضعی آنتی سپتیک‏ها اشاره کرد. بر پایه مطالعات، مصرف موضعی آنتی سپتیک ها می‏تواند منجر به تاخیر روند اپی تلیالی شدن در موضع زخم گردد. طبق بررسی‏های صورت گرفته مصرف آنتی بیوتیک های موضعی نیز که به منظور کاهش عفونت زخم مورد استفاده قرار می‏گیرند، می‏توانند باعث درماتیت تماسی گردند. همچنین تحقیقات نشان داده که تابش لیزر بر لکوسیت‏ها از یک سو موجب افزایش فعالیت فاگوسیت‏ها و از سوی دیگر افزایش ترشح مدیاتورها خواهد شد (7). تابش لیزر در موضع زخم به افزایش تولید عوامل و فاکتورهای رشد کمک می کند. البته تابش مقادیر بالای اشعه در موضع، به ویژه در 4 تا 48 ساعت اول بعد از ایجاد زخم نه فقط ترمیم را به تاخیر می‏اندازد بلکه زخم‏های آلوده را نیز مستعد عفونت می‏کند (8).

استفاده از سایر مواد به طور موضعی و به منظور تسریع روند التیام از گذشته تا امروز ادامه داشته است. از جمله استفاده از کره و عسل که در مصر مرسوم بوده است. استفاده از بادام تلخ و نیز نیشکر که دارای برگ های حاوی ساکارز است. ساکارز به جز در روده در جای دیگری قابل متابولیزاسیون نیست. بنابراین ضمن اینکه قندی برای رشد باکتریها نمی‏باشد، آب اضافی را از محل زخم خارج می کند و تولید بافت جوانه‏ای را تحریک می‏نماید و بدین ترتیب باعث تسریع در روند التیام می‏گردد. استفاده از آنالوگ‏های آنژیوتانسین باعث تسریع روند التیام زخم با کمترین میزان اسکار می‏شود و اگر در مرحله بازسازی به تجویز سیستمیک آنها ادامه داده ‌شود باعث بازسازی ضمائم پوستی حتی در مرکز زخم می‏گردد (9).

با توجه به اهمیت ترمیم زخم و اینکه عدم درمان زخم‌های باز پوستی ممکن است منجر به عفونت موضعی و در نهایت سرطان شود و از دیگر سو درمان‌های موجود علاوه برعدم اثربخشی بالا، می‏توانند عوارض جانبی سوء نیز داشته باشند، منجر به این شده است که تلاش در این راستا همواره انجام گیرد (1و6). یکی از بهترین روش‌هایی که می‌تواند ما را در رسیدن به هدف فوق یاری کند استفاده از مواد بیولوژیک خالص شده است (10). امروزه شاهد تمایل زیاد وگرایش روزافزون به بررسی اثرات فیزیولوژی و فارماکولوژی عصاره گیاهی می‌باشیم که به دلایلی همچون عوارض سوء جانبی کمتر، هزینه های اقتصادی پایین تر، گوناگونی ترکیبات موثری موجود در گیاهان، توسعه ی صنایع وابسته به کشت گیاهان دارویی، جلوگیری از خروج ارز به خارج از کشور، ایجاد کار مفید و خصوصا پیشنهاد استفاده از گیاهان دارویی توسط سازمان جهانی بهداشت و بسیاری از دلایل دیگر بوجود آمده است (11، 12، 13و14). از سوی دیگر با توجه به عدم معرفی یک داروی مؤثر برای التیام زخم، ‌مطالعه ی اثر گیاهان دارویی برای ترمیم زخم ضرورت دارد (6). در نگرشی بر گذشته و مطالعه متون و اسناد و طب سنتی ایران و اسلام به مواردی برخورد می شود که از گیاهان به عنوان مواد موثر در ترمیم زخم‌ها نامبرده شده است. از آن جمله می‌توان به گیاه همیشه بهار کوهی، پیاز، برگ عشقه و... اشاره کرد که به عنوان مرهم زخم‌های پوستی مطرح هستند (15و16).

گیاه یونجه پاکلاغی یا پا مرغی با نام علمی                   Lotus corniculatus از تیره‌ی Fabaceae می‌باشد. این گیاه در نواحی جنوبی ایران، کوه دنا، آذربایجان، کوه الوند و نواحی دیگر یافت می‌شود (17). مطالعات انجام شده نشان‌ دهنده‏ی برخی اثرات شامل: اثرات آنتی‌ باکتریال، بندآورنده خون، ضد التهاب، ضدکرم و... درگیاه یونجه پاکلاغی می‌باشد (18، 19، 20و21). این گیاه در طب سنتی، جمعیت عشایر و کشاورزان و باغداران استان همدان جایگاه ویژه‌ای به عنوان مرهم زخم‌های جلدی دارا می‌باشد. با توجه به اینکه تاکنون داروی موثری برای التیام زخم معرفی نشده است (22)، هدف از این پژوهش، بررسی علمی تاثیر التیام بخشی عصاره گیاه یونجه پاکلاغی بر روی زخم جلدی موش سفید بزرگ آزمایشگاهی و همچنین مقایسه اثر آن با اثر داروی شیمیایی موجود به نام فنی توئین که در درمان زخم‌های جلدی مفید است، می‌باشد. بدیهی است که نتایج مثبت حاصل از این مطالعه با توجه به عوارض جانبی کمتر و اثرات مهاری این ماده بر شروع روند التهاب و نیز اثرات ضد میکروبی آن که طبق بررسی‌های پیشین ثابت شده است، درمورد انسان نیز سودمند واقع خواهد شد.

 

مواد و روش‏ها

حیوانات مورد مطالعه: در این مطالعه از تعداد 80 سر موش صحرایی نر نژاد ویستار با محدوه وزنی 40±250 گرم استفاده شد. موش ها با غذای پلت و آب سالم تغذیه شده و در اتاقی با شرایط کنترل شده و در قفسه های جداگانه نگه داری شدند. تمام مراحل این تحقیق با در نظر گرفتن اصول اخلاقی حاکم بر کاربرد حیوانات آزمایشگاهی در تحقیقات بیومدیکال منطبق بود.

جمع آوری گیاه، عصاره گیری و تهیه پماد: گیاه یونجه پاکلاغی (lotus corniculatus) در اواخر اردیبهشت ماه از اراضی باغی اطراف شهر همدان جمع آوری و پس از تهیه منابع معتبر و شناسایی علمی توسط متخصص گیاه شناس با کد هرباریومی 271583 دانشگاه بوعلی سینا همدان، به آزمایشگاه انتقال داده شد. بعد از خشک شدن گیاه یونجه پاکلاغی در اتاق (سایه)، به وسیله آسیاب برقی و با استفاده از الک قسمت های هوایی گیاه به صورت پودر تهیه گردید (18). پودر تهیه شده گیاه در داخل بشر ریخته شد و جهت عصاره گیری به روش خیساندن، به نسبت 1به 8 به آن اتانول 96درصد اضافه گردید و به مدت یک ماه در یخچال قرار داده شد. در طی این مدت 2 بار بشرهای محتوی عصاره به مدت 15 دقیقه به منظور استخراج بهتر و بیشتر ترکیبات موثر گیاه در دستگاه اولتراسوند ساخت شرکت فراز طب تجهیز قرار داده شدند (15و19). پس از آن محتویات داخل بشر بوسیله کاغذ صافی و قیف شیشه ای صاف گردید. سپس توسط دستگاه روتاری مدل lab tech, Ev 311 تغلیظ و جهت خشک شدن داخل پتری دیش ریخته و زیر هود قرار داده شد (18). بعد از سپری شدن 4 روز، عصاره خشک گیاه یونجه پاکلاغی بدست آمد. عصاره خشک به نسبت وزنی با میزان مناسب از پماد اوسرین (Euserin) مخلوط شد تا پماد با درصدهای 10 و 20 و 40 تهیه گردد (23).

نحوه ایجاد تروما: پس از القای بیهوشی با تزریق داخل صفاقی مخلوط کتامین10درصد و با دوز 50 میلی گرم بر کیلوگرم و زایلازین 2 درصد و با دوز10 میلی گرم بر کیلوگرم، موش ها به صورت شکمی بر روی میز جراحی قرار داده شدند. سپس سطح پشتی موش ها آماده سازی و اسکراپ شده و یک زخم تمام ضخامت مستطیل شکل در قسمت وسط پشت، بین دو کتف به مساحت2 سانتی متر مربع (ابعاد 1سانتی متر×2 سانتی متر) با استفاده از شابلن استریل و تیغ جراحی ایجاد شد و روز عمل، روز صفر محسوب شد. عمق زخم شامل درم وهیپودرمFull) thickness) بود (23و24)(شکل1). پس از ایجاد تروما سطح زخم به وسیله تیمار مربوطه به دارو آغشته گردید و سپس حیوانات با توجه به تیمار خود در قفس های مشخص شده هر تیمار نگهداری شدند (25).

 

شکل1: زخم تمام ضخامت ایجاد شده در ناحیه پشت و بین دو کتف موش صحرایی در روز آزمایش در گروه کنترل.

 

گروه‏های آزمایشی: پس از ایجاد زخم، حیوانات به طور تصادفی به 8 گروه تقسیم شدند که در هر گروه 10 سر موش صحرایی (7 موش صحرایی جهت مطالعه مورفو متریک و 3 موش صحرایی برای نمونه برداری هیستوپاتولوژیک) وجود داشت گروه‏ها عبارت بودند از:

گروه A: گروه کنترل، گروه B: گروه تحت درمان با کرم فنی توئین 1 درصد، گروه C: گروه تحت درمان با پماد 10 درصد گیاه یونجه پاکلاغی ،گروه D: گروه تحت درمان با پماد 20 درصد گیاه یونجه پاکلاغی، گروه E: گروه تحت درمان با پماد 40 درصد گیاه یونجه پاکلاغی، گروهF: گروه تحت درمان با ترکیب پماد 10درصد یونجه پاکلاغی و کرم فنی توئین، گروه G: تحت درمان با ترکیب پماد 20 درصد یونجه پاکلاغی و کرم فنی توئین، گروهH: گروه تحت درمان باترکیب پماد 40 درصد یونجه پاکلاغی و کرم فنی توئین. داروها به شکل موضعی به طوری که تمام حفره زخم را پر کند، به مدت 21 روز تجویز شد. کلیه مراحل این تحقیق با حفظ قواعد، ضوابط و توصیه های کمیته تحقیقات و معاونت پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی همدان صورت پذیرفت.

 

نمونه برداری و تهیه مقاطع هیستوپاتولوژی: در روزهای3، 7، 14 و 21 (روز پایان آزمایش) از هر گروه از موش های صحرایی به صورت تصادفی یک موش انتخاب شد و نمونه بافتی به شکل مربع تمام ضخامت از محل ترمیم زخم به همراه پوست سالم اطراف زخم با استفاده از قیچی و اسکالپل گرفته شد (11). اخذ بافت تحت بیهوشی جراحی با کتامین و زایلازین انجام گرفت. نمونه‏ها بعد از فیکس شدن تحت پاساژ بافتی قرار گرفتند، سپس قالب گیری شده و مقاطع نازک 5 میکرومتری از نمونه ها تهیه گردید. مقاطع تهیه شده با استفاده از روش رنگ آمیزی بافتی هماتوکسیلین و ائوزین رنگ آمیزی و آماده مطالعه گردید (11و26). در مجموع از گروه های هشت گانه مورد مطالعه، طی روزهای 3 و 7 و 14 و 21 مقدار 32 قالب بافتی تهیه گردید. شایان ذکر است که از یکی از حیوانات در روز صفر یعنی روز شروع آزمایش نمونه‏ای از پوست کاملا طبیعی موش سفید بزرگ آزمایشگاهی جهت مطالعه ساختار طبیعی پوست جدا شد و مقطع میکروسکپی آن نیز آماده گردید. باتوجه به اینکه به محض نمونه برداری از هر زخم در واقع یک زخم جدید بر روی زخم قبلی ایجاد می‏شود، حیوان مورد نمونه برداری از دور مطالعه کنار گذاشته می‏شد تا خدشه ای در نتایج ایجاد نشود. به همین دلیل در هرگروه 7 موش جهت مطالعه مورفومتریک و 3 موش صحرایی جهت نمونه برداری بافتی در نظر گرفته شد.

 

جمع آوری داده‏های مورفومتریک و هیستوپاتولوژیک: روزانه قبل از تجویز هر دارو ابتدا سطح هریک از زخم ها با یک تامپون استریل آغشته به سرم فیزیولوژی به طور جداگانه، به آرامی و با دقت تمیز می شدند. سپس با قرار دادن موشهای صحرایی در یک قفس که در قسمت کف آن کاغذ مدرج و مارکردار قرار داده شده بود، بدون آن که استرس یا فشار و کششی به حیوان وارد شود، توسط دوربین دیجیتال از زخم ها عکس تهیه می گردید. برای محاسبه مساحت زخم ها جهت بررسی مورفومتریک از نرم افزار آنالیز تصاویر فرآیند التیام زخم Scion ImageTm استفاده شد (23). روش اندازه گیری بدین صورت بود که پس از انتقال تصویر هر زخم به نرم افزار مذکور، ابتدا مقیاس سیستم اندازه گیری نرم افزار با انتخاب نقاط با فاصله شناخته شده در هر تصویر و در یکی از دو جهت افقی یا عمودی (از روی مقیاس متریکی که در هنگام تهیه تصویر در کنار زخم قرار داده شده بود) کالیبره می شد. پس از کالیبره کردن سیستم اندازه گیری نرم افزار، با به حرکت در آوردن مکان نمایی که نرم افزار در اختیار قرار می داد مرز ناحیه ای که هنوز توسط بافت پوششی پوشیده نشده بود را مشخص نموده و ناحیه مورد نظر در وضعیت انتخاب شده قرار می گرفت و سپس مساحت آن توسط نرم افزار محاسبه و ثبت می شد (23).

جهت مطالعه هیستوپاتولوژیک، مقاطع میکروسکوپی آماده شده با استفاده از میکروسکوپ معمولی مدل Olympus-cx31 با درشت نمایی ×40، ×100و ×400 عکس برداری گردید. به منظور شمارش فیبروبلاست ها و نیز شمارش جوانه های عروقی بافت جوانه ای در میلی متر مربع، تصاویر دیجیتالی تهیه شده از مقاطع بافتی در نرم افزار آنالیز تصاویر Scion ImageTm  مورد ارزیابی قرار گرفت. در این نرم افزار پس از کالیبراسیون به کمک لام مدرج، تصویر از جنبه های گوناگونی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. مثلا جهت تعیین سطح مورد نظر (میلی متر مربع) گرید روی تصویرترسیم گردید و سپس به شمارش فیبروبلاست‏ها و جوانه های عروقی و اجزای دیگر پرداخته شد (26).

آزمون آماری: داده های حاصل با استفاده ازنرم افزار آماری SPSS18 مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج بدست آمده به صورت Mean ± SEM مورد بررسی قرار گرفتند. برای مقایسه نتایج بین گروه ها از آزمون های آماری آنالیز واریانس دوطرفه بین آزمودنی به همراهآزمون تعقیبی بن فرونی استفاده گردید. تفاوت میانگین ها در سطح 05/0P< معنی دار در نظر گرفته شد.

 

نتایج

نتایج مورفومتریک:

چنانکه در نمودار شماره 1 مشاهده می شود، وسعت سطح زخم در گروه کنترل در سه روز اول روند افزایشی داشته است و در روزهای بعدی نیز به کندی سطح زخم کوچکتر شده است به گونه ای که طبق مشاهدات در روز بیست و یکم نیز زخم به طور کامل درمان نشد (شکل-A 2). در گروه تحت درمان با فنی توئین 1 درصد مشاهده شد که بعد از ایجاد زخم سطح زخم در روز اول و دوم، افزایش چشم گیری پیدا کرد. در روز‌های بعدی نیز سطح زخم به کندی کوچکتر شد به گونه‌ای که در روز بیست و یکم نیز زخم کاملا درمان نشد ولی نسبت به گروه کنترل از وضعیت بهتری برخوردار بود (شکل –D2).

سطح زخم در گروه تحت درمان با عصاره 10درصد (گیاه یونجه پاکلاغی) در روزهای اولیه افزایش یافت. مساحت زخم در روزهای بعدی رو به کاهش گذاشت (شکل-B2) و در نهایت در روز هفدهم زخم ترمیم  شده و روز هجدهم نیز زخم بطور کامل ناپدید گردید. این نتایج نسبت به گروه کنترل وگروه تحت درمان با فنی‌توئین اختلاف معنی داری را در سطح 05/0P< نشان نداد (نمودار1).

در گروه تحت درمان با عصاره 20درصد مشاهده شد که سطح زخم در روزهای اول و دوم افزایش معنی داری در مقایسه با گروه کنترل نداشت ولی در روزهای بعدی سطح زخم با سرعت نسبتا بیشتری از گروه کنترل رو به کاهش گذاشته به طوری که در روز چهاردهم سطح زخم بسیار کم و در نهایت در روز پانزدهم زخم ترمیم گردید (05/0 P<). در گروه تحت درمان با عصاره 40 درصد سطح زخم در روزهای بعد از ایجاد زخم کمترین افزایش سطح اولیه را در مقایسه با گروه کنترل داشته و در روزهای بعدی وسعت زخم با سرعت بیشتری نسبت به گروه‌های کنترل، گروه تحت درمان با عصاره 10درصد و 20 درصد گیاه یونجه پاکلاغی رو به کاهش گذاشت (01/0 P<). در گروه تحت درمان با ترکیب پماد 10 درصد عصاره و فنی‌توئین افزایش سطح زخم در روزهای اولیه قابل مشاهده بود، در روزهای بعدی سطح زخم با سرعت کمی نسبت به گروه کنترل رو به کاهش گذاشت. کاهش وسعت زخم در این گروه در مقایسه با گروه کنترل از نظر آماری معنی دار نبود (نمودار1). در گروه تحت درمان با ترکیب پماد 20درصد عصاره  و فنی‌توئین، زخم در روزهای اول افزایش سطح کمتری نسبت به گروه کنترل نشان داد و در روزهای بعدی به سرعت رو به کوچک شدن نهاد. به گونه‌ای که در روز هفتم سطح زخم کاهش معنا‌دار پیدا کرد و نهایتا در روز پانزدهم زخم از بین رفت. در گروه تحت درمان با ترکیب عصاره 40 درصد و فنی توئین در روزهای اولیه سطح زخم کمی افزایش پیدا کرد و در روزهای بعد با سرعت زیادی نسبت به گروه کنترل سطح زخم رو به کاهش گذاشت (شکل C-11).

 

 

نمودار1: روند درمان سطح زخم در گروه های مورد مطالعه طی 21 روز آزمایش در مقایسه با گروه کنترل. روش آماری استفاده شده آنالیز واریانس دوطرفه بین آزمودنی می باشد. داده ها به صورت mean±SEM ارائه و اختلاف معنی دار بین گروه های مورد مطالعه با گروه کنترل در حد 05/0 *P<  و 01/0 P< ** نشان داده شده است (7n= ). (A: گروه کنترل، B: تحت درمان با کرم فنی توئین 1درصد C: تحت درمان با پماد 10درصد عصاره گیاه یونجه پاکلاغی، D: تحت درمان با پماد 20درصد عصاره گیاه یونجه پاکلاغی، E: تحت درمان با پماد 40درصد عصاره گیاه یونجه پاکلاغی، F: تحت درمان با ترکیب پماد 10درصد عصاره گیاه یونجه پاکلاغی و کرم فنی تویین 1درصد، G: تحت درمان با ترکیب پماد 20درصد عصاره گیاه یونجه پاکلاغی و کرم فنی توئین 1درصد، H: تحت درمان با ترکیب پماد 40درصد عصاره گیاه یونجه پاکلاغی و کرم فنی توئین 1درصد)

 

 

در این مطالعه در تمام گروه ها مشاهده گردید که اندازه زخم پس از ایجاد ابتدا در طی سه روز اول افزایش یافت و میانگین این افزایش در گروه کنترل از تمام گروه‌ها بیشتر و در گروه تحت درمان با عصاره 40درصد از بقیه گروه‌ها کمتر بود (01/0P<). همچنین بیشترین میانگین وسعت زخم مربوط به گروه کنترل بود که هیچ‌گونه درمانی را دریافت نکرده بودند وکمترین میانگین سطح زخم را گروه‌ تحت درمان با عصاره 40درصد (غلظت بالای عصاره) به خود اختصاص داد (نمودار1).

 

نتایج هیستوپاتولوژیک:

پس از مطالعه و بررسی میکروسکوپی مقاطع تهیه شده و شمارش فیبروبلاست‌ها و جوانه‌های عروقی در مرکز بافت جوانه‌ای درگروه‌های کنترل و آزمایش مشخص گردید که روند تغییرات سلولی در ناحیه ترمیم زخم در گروه کنترل و گروه‌های تحت آزمایش شبیه روند کلی ذکر شده در مورد ترمیم زخم یعنی مراحل التهاب، تکثیر و انقباض بود. هر چند که از نظر زمان رسیدن به هریک از این مراحل بین گروه‌های مختلف تفاوت‌هایی به چشم می‌خورد.

مقایسه تعداد فیبروبلاست‌ها و جوانه‏های عروقی در بافت جوانه‏ای گروه کنترل و گروه‌های آزمایش نشان داد که استفاده از عصاره گیاه علف‌جوش به تنهایی و نیز به همراه فنی‌توئین می‏توانست سرعت ترمیم زخم را افزایش دهد (شکل–B3وC-3) زیرا زمان رسیدن به حداکثر تراکم فیبروبلاست‌ها در گروه‌های E و H و G و D و C و F نسبت به گروه‌های A و B کوتاهتر بود (شکلA-3). از سوی دیگر تقریبا زمان رسیدن به این حداکثر تراکم فیبروبلاستی و نیز میزان تراکم فیبرو بلاستی وابسته به دوز عصاره‌ می‌باشد، به نحوی که با افزایش غلظت ماده موثره گیاهی میزان تراکم فیبروبلاستی نیز به طور قابل توجهی افزایش یافت (شکلC-3).

 

 

 

شکل2: وضعیت التیام زخم در روز چهاردهم:A ) گروه کنترل، B)گروه تحت درمان باپماد10درصد عصاره گیاه یونجه پاکلاغی،C) گروه تحت درمان باترکیب پماد 40درصد عصاره گیاه یونجه پاکلاغی +کرم فنی توئین 1درصد وD) گروه تحت درمان با کرم فنی توئین 1درصد

 

شکل3: نمای ریز بینی موضع ترمیم در روز هفتم:A ) گروه تحت درمان با پماد 10درصد گیاه یونجه پاکلاغی،B ) گروه تحت درمان با پماد 20درصد گیاه یونجه پاکلاغی، C) گروه تحت درمان با ترکیب پماد 40درصد یونجه پاکلاغی و کرم فنی توئین). 1: فیبروبلاست، 2: جوانه عروقی، 3: ماتریکس خارج سلولی، 4: سلول‌های آماسی و ماکروفاژ (رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزینx 400).

 

 

بحث

گیاهان داروئی از قدمت و اعتبار خاصی برخوردار هستند و به عنوان گنجینه پر ارزشی در علوم داروئی محسوب می شوند.‌ استفاده از عصاره گیاهان دارویی در روند التیام زخم های پوستی از زمان های قدیم در طب سنتی رایج بوده است. عصاره گیاه علف‌جوش علاوه بر داشتن خواص متنوع، فرآیند التیام زخم را در پوست تسریع می‌کند. اثر ضد التهابی عصاره گیاه یونجه پاکلاغی توسط کوئلزر و همکاران (18) گزارش شده است. بر پایه نتایج بدست آمده از مطالعه حاضر، پماد تهیه شده از عصاره گیاه یونجه پاکلاغی در روزهای آغازین دوره ترمیم اثر ضد التهابی خوبی از خود نشان داد. احتمال دارد بخشی از اثرات التیام بخشی پماد عصاره گیاه علف‌جوش مرتبط به اثر ضد التهابی آن باشد که در فاز التهابی ترمیم زخم موثر بوده است. مین و همکاران (21) اثر ضد التهابی عصاره گیاه یونجه پاکلاغی را گزارش نمودند. طبق مطالعات بول و همکاران (27) گزارش شد که تعدیل مرحله التهاب زخم موجب تسریع بهبودی زخم می شود. از سوی دیگر با توجه به تجربیات خاکساری و همکاران (6) مبنی بر وجود برخی ترکیبات ضد التهابی در گیاه رازیا که موجب تسریع در التیام زخم سطحی در موش های صحرایی گردید. همچنین اثر ضد التهابی گیاه یونجه پاکلاغی، طبق گزارشات کوئلزر و همکاران (18)، این چنین برداشت می شود که گیاه یونجه پاکلاغی به دلیل دارا بودن خاصیت ضد التهابی که ناشی از مهار لکوسیت‌ها و کاهش ترشحات زخم و همین طور مهار آنزیم های پیش‌التهابی و میانجی‌هایی مثلIL- 1B (interleukin-1 beta) ,ADA (adenosine-deaminase), MPO (myeloperoxidase) می باشد، با تعدیل در مرحله التهاب، تسریع در التیام زخم را موجب شده است. نتایج حاصل از این تحقیق با نتایج گزارشات فوق الذکر هم‌خوانی دارد. کوپرا و همکاران (28) و دالمارکو و همکاران (29) افزایش خون رسانی و اکسیژن ‌رسانی به محل زخم از طریق گشاد نمودن عروق را یکی دیگر از عوامل موثر در روند التیام زخم دانستند. از سوی دیگر مین و همکاران (20) گزارش نمودند که گیاه علف‌جوش دارای فعالیت آنتی‌اسپاسمودیک می‌باشد. احتمال می رود که این خاصیت گیاه، کمک به سزایی به التیام زخم نموده و منجر به کوتاه شدن زمان التیام زخم گردیده است.

خاکساری و همکاران (6) گزارش نمودند که جلوگیری از عفونت زخم، بهبودی زخم را تسریع می بخشد. همچنین داروهای آنتی بیوتیک موضعی از طریق کنترل عفونت زخم موجب تسریع التیام زخم می شوند. اشرفی و همکاران (30) اثر ضد میکروبی گیاه یونجه پاکلاغی را گزارش نمودند. بر پایه گزارشات فوق می توان اذعان نمود که احتمالا عصاره گیاه یونجه پاکلاغی به دلیل دارا بودن خواص ضد میکروبی تسریع روند التیام پوست را موجب شده است (31).

دیل و همکاران (32) اثرات افزایشی فیبروبلاست های بافت عضلانی و افزایش فاکتورهای رشد بافتی توسط فنی توئین را گزارش نمودند. سونگ و همکاران (33) به افزایش تعداد ماکروفاژ‌های زخم در زخم درمان شده با فنی توئین اشاره نمودند. طبق مطالعات مداقه و همکاران (34) مصرف موضعی فنی توئین موجب افزایش قدرت کشش پذیری زخم، افزایش عروق جدید، افزایش سنتز کلاژن و افزایش فیلتراسیون فیبروبلاست‌ها می گردد. در مقایسه ای که بین گروه های تحت درمان با عصاره گیاه علف‌جوش و فنی توئین انجام شد آشکار گردید التیام زخم در گروه‌هایی که عصاره گیاه علف‌جوش را به صورت موضعی دریافت کرده بودند بسیار بهتر و سریعتر از گروه تحت درمان با فنی‌توئین می باشد. بنابراین این احتمال وجود دارد که مکانیسم هایی که برای عملکرد فنی‌توئین در سرعت بخشیدن به التیام زخم مطرح است، با قدرت بیشتر و اثر‌گذای بالاتر به عنوان ساز و کارهای گیاه علف‌جوش نیز مطرح باشند.

درگروه تحت درمان با پماد 10درصد عصاره گیاه یونجه پاکلاغی میانگین سطح زخم نسبت به گروه کنترل کمتر بود. ولی میانگین سطح زخم گروهی که ترکیب توام پماد 10درصد عصاره و داروی فنی توئین را دریافت نمود، بیشتر از گروه کنترل بود. در نتیجه طبق مشاهدات و آنالیز آماری ترکیب داروی فنی توئین و عصاره با هم اثر معناداری بر التیام زخم در این سطح نشان نداد. شاید این امر به دلیل کاهش غلظت ماده موثره در داروی فنی توئین در زمان مصرف توام با عصاره 10درصد و همچنین وجود مواد نگهدارنده موجود در داروی فنی توئین باشد.

این مطالعه نشان داد که میانگین سطح زخم موش‌های صحرایی که عصاره 20درصد دریافت نموده بودند از میانگین سطح زخم موش‌هایی که ترکیب عصاره 20درصد وکرم فنی توئین 1درصد دریافت نموده‌اند، بیشتر می باشد. شاید علت این موضوع، وجود اثر تقویت کنندگی دارو و عصاره بر یکدیگر با غلظت فوق باشد که در این سطح، اثر التیام‌ بخشی یکدیگر را تقویت می کنند. این اثر در گروهی که عصاره 40درصد همراه با فنی توئین دریافت نمودند واضح تر بوده و از نظر آماری نیز معنی دار می باشد.

با توجه به نتایج حاصل که با افزایش غلظت عصاره افزایش سرعت جمع‌ شدگی و ترمیم زخم بوجود می آید، چنین برداشت می‌شود که نتایج مربوطه حاکی از آن است که در گروه تیمار موضعی عصاره 40درصد باعث افزایش معنی‌دار سرعت التیام و جمع‌شدگی زخم نسبت به گروه کنترل، گروه دریافت کننده داروی فنی توئین و گروه های دریافت کننده عصاره با غلظت‌های10و20درصد خصوصا در روزهای اول دوره تیمار می‌شود.

مطالعات انجام شده توسط تسگاهون و همکاران (35) بر روی گیاه یونجه پاکلاغی مشخص نموده که این گیاه حاوی مقدار زیادی ماده آنتوسیانین، فلاونوئید، استرول، آلکالوئید وتانن می باشد. همچنین براساس گزارشات دایکو و همکاران (36) تانن‌ها توانایی انجام واکنش‌های بیولوژیکی زیادی را دارند. بنابراین احتمال می رود که تسریع در روند التیام زخم باز ایجاد شده در پوست موش های مورد آزمایش بواسطه وجود ترکیبات فعال موجود در گیاه یونجه پاکلاغی باشد. همینگ ویو همکاران (37) اثرات التیامی تانن ها را  گزارش نمودند. از طرفی طبق گزارشات تقی‏زاده جاهد و همکاران (11) مهار تولید رادیکال‌های آزاد موجب بهبودی سریع‌تر زخم‌های جلدی باز می شود. از آنجائیکه عصاره گیاه یونجه پاکلاغی دارای مواد تاننی و خواص آنتی اکسیدانی می باشد (29)، شاید اثرات التیام بخشی آن در بهبود ترمیم زخم های پوستی، بدلیل وجود مواد تاننی و خاصیت آنتی اکسیدانی گیاه باشد. با این حال، روشن شدن دقیق تر این مکانیسم‏ها نیاز به مطالعات تکمیلی بیشتری داشته که امید است در پژوهش‏های بعدی این سئوالات پاسخ داده شود.

 

نتیجه گیری

یافته های تحقیق حاضر نشان می دهد که استفاده از عصاره گیاه علف‌جوش با غلظت‌های مختلف می‌تواند بر روند تغییرات سلولی ترمیم زخم از نظر زمانی تاثیر گذارد و با ایجاد زمینه رگ‌زایی سریع تر در بافت جوانه‌ای و نیز تکثیر سریع تر و بیشتر فیبروبلاست ها و متعاقب آن تولید سریع تر و بیشتر کلاژن و دیگر ترکیبات ماتریکس خارج سلولی، وضعیت کلی ترمیم زخم را بهبود ببخشد. بنابراین تحقیق حاضر ضمن تایید نتایج محققین قبلی در مورد گیاه یونجه پاکلاغی قادر است با استناد به روش کار و نتایج اخذ شده نشان دهد که این عصاره از لحاظ مورفومتریک وهیستوپاتولوژیک بعد از مصرف موضعی در زخم‌های جلدی باز موجب تخفیف التهاب و تسریع فرآیند التیام می‌گردد.

 

1. Adzick NS. Wound healing, Text book of surgery, the biological basis of modern surgical practice. 5thedn. New York: WB Sanders Company; 1997.

2. Rao CM, KummarA. Wound profile of cupper mefenamic acid. J Indian Med Res.1988; 88(1): 273-277.

3. William KJ. The effect of topically applied zinc on the wound healing in open wound. J Sur Res. 1979; 27(3): 62-97.

4. Barnett EE, Varly SJ. The effect of calcium alginate on wound healing. J Ann Surg. 1987; 69(2): 153-155.

5. Cohen I.K, Diegeimann RF.Wound care and wound healing. In Schwartz SI, Shires CT, Speneer FC, Storer EH,(eds). Principle of surgery. New York: MC Grow Hill; 1999; 263-295.

6. Khaksari M, Rezvani ME, Sajadi MA, Soleimani A. The effect of topically applied water extract of Rhazyastricta on cutaneous wound healing in rats. J Semnanuniversity of medical Science. 2000; 1(3): 1-10.

7. Nowrouzian I, Azarabad H, Nasirian A, Ghamsari S.M. Wound healing in large Animals histopathology and surgical management. Tehran: Tehran University press. 2009; 74-87.

8. Silver IA. some factors affecting wound healing.J equine veterinary. 1953; 5(2): 47-49.

9. Rodgers K, Xiong S, Felix J, Roda N, et al. Development of angiotensin as an agent to accelerate dermal repair. J wound Repair Regen. 2003; 9(3): 238-247.

10. Isler H, Bauen A, HublerM. Morphometric assessment of wound healing in rats treated with a pritein-free hemodylisis. J Burns. 1991; 17: 99-103.

11. Taghizadeh-Jahed M, Jarolmasjed SH, Mohamadnejad S, Rezaii A, et.al. The effect of Echinacea purpurea aerial organ dried extract vs. Zinc oxide on skin wound healding in rat: a morphometric & histopathologicstudy. JTehran University Medical. 2008; 66(9): 625-632.

12. Lazareva EB, Smirnov SV, Khvatov VB, Spiridonova TG, et.al. Oral adminatration of pectins for prophylaxis and treatment of purulent septic complications in patients with burns. JAntibiotKhimioter. 2002; 47(4): 16-19.

13. SylvesterKG, Nesbit M, Radu A, Herlyn M, et al. Adenoviral-mediated gene transfer in wound healing: acute inflammatory response in human skin in the SCID mouse model.Wound repair j. 2000; 8(1): 36-44.

14. Sobizewska E, Szmigielski S. The role of selected cell growth factors in the wound healing process.PrzeglLek. 1997; 54(9): 634-638.

15. Moniee SH. Giahdarou. Tehran Iran: Ketabsara press; 1981; 75. [Persian].

16. Moatar F, Samsam Sharif H, Afshari pour S. Darmanbagiah. Esfehan Iran: Mashal press; 1989;63-66. Persian.

17. Yousaf S, Andria V, Richenauer TG, Smalla K, et al. phylogentic and functional diversity of alkane degrading bacteria associated with Italian ryegrass and Birth foot trefoil (lotus corniculatus) in a petroleum oil-contaminated environment. J Plant Biol. 2010; 244(9): 3-25.

18. Koelzer J, Pereira DA, Dalmarco JB, Pizzolatti MG, et al. Evaluation of the anti-inflammatory efficacy of lotus corniculatus.j foodchem. 2009; 117(3): 444-450.

19. Min BR, BarryTN, Attwood GT, McNabbWC. The effect of condensed tannins on the nutrition and health of ruminants fed fresh temperate forage: a review . J food chem. 2003; 9(1):76-81.

20. Ramirez-Restrepoa CA. Use of lotus corniculatus containing condensed tannins to increase summer lamb growth under commercial dry land farming conditions with minimal outhelmintic drench input. J Anim Feed SciTecnol. 2004; 117(1):85-105.

21. Molan Al, Attwood GT, Min BR, Mcnabb WC. The effect of condensed tannin from lotus corniculatus and lotus pedunculatus on the growth of proteolytic rumen bacteria in vitro and their possible mode of action. JCanMicroboil. 2001; 47(7): 623-633.

22. Pereira DA, Koelzer J, Dalmarco JB, Pizzolatti MG, et al. Evaluation of the anti-inflammatory efficacy of lotus pedunculatus. J Green Pharm. 2009; 3(2):105-111.

23. Rezaii A, Taghizadeh-Jahed M, Jarolmasjed SH, Mohamadnejad S, et al. Effect of Echinacea purpurea herbal extract versus Zinc oaide in rat skin wound healing model: histometric and histopathologicstudy.JPharmaceutical Sciences. 2008; 4(2): 43-52.

24.Hafezi F, Elmi Rad H, Pedram MS. Determination of the Macroscopic Effect of Kiwi Fruit on Wound Healing in Rats. J Iran Surg. 2009; 17(1): 2-10.

 

25.Wanda A, Dorset-Martin DVM. Rat Models of skin Wound healing: A review.Wound REP REG.2004; 12: 591-599.

26. Derakhshanfar A, Oloumi M, Mirzaie M. Study on the effect of peganumharmala extract on experimental skin wound healing in rat: pathological  and biomechanical findings. J Comp ClinPathol. 2010; 19(24): 169-172.

27. BVL NN, MckenzieAL, WestI M, whitney JD. Low-dose ultrasound effects on wound healing A controlled study with yucalan pigs. J Arch PhysMedRehabil. 1992; 73(2): 658-664.

28. Chopra RN, Nayar SL, chopraI C. Glossary of Indian Medicinal plants.NewDehli: Councl of scientific and Industrial Research. 1986; 85.

29. Dalmarco JB, Dalmarco EM, Koelzer J, Pizzolatti GM, et al. Isolation and identification of responsible for the anti-bacteria efficacy of lotus corniculatusvar Sao Gabreil.J Green Pharm. 2010; 4(2): 108-114.

30. Ashrafi K, Esmaeli E, Shahinfard N, Ansari R, et al. The effect of hydroalcoholic extract of Zizipus vulgaris L. burn healing. JShahrekord university of Medical sciences. 2010; 12(4): 78-83.

31. Restrepoa-Rami’rez CA, Barrya TN, Pomroya WE, Lopez-Villalobsa N, et al. Use of lotus corniculatus to increase Lamb and wool production under dryland farming conditions.JAnim food Sci Technol. 2004; 117(2): 85-105.

32. Dill RE, Lacopino AM. Myofibroblasts in phenytoin induced hyperplastic connective tissue in rat and in human gingival overgrowth. JPeriodontal. 1997; 68: 375-380.

33. Song S, Cheng T. The effect of Systemic and Local irradiation on wound macrophages and the repair promoting action of phenytoin sodium. Chung HuaI  HsuchTsa chi. 1997; 77: 54-57.

34. Modaggh S, Salchian S. Use of phenytoin in healing war and non war wounds. J Dermatol. 1989; 28(3): 347-350.

35. Tsegahun A. The effect of Dry Season supplementation of lotus corniculatusHay on Body and fleece weights of three sheep Breeds grazing Natural pasture under Ethiopian conditions. kasetsart J. 2006; 40: 978-986.

36. Dicko M. Biochemical characterization of the major sorghum grain peroxidase. Febs  Journal. 2006; 10: 1742-1751.

37. Hemingway, R.W, Karchesy, J.J. Chemistry and significance of condensed tannins.3thEd. plenum press; 1989; 85-88.