سلول و بافت
فصلنامه

تنوع ژنتیکی Hesperis persica ، بر اساس DNA چند شکلی تقویت شده بین رتروترانسپوزونی (IRAP)

نوع مقاله : علمی - پژوهشی

نویسنده

سمیه اسفندانی بزچلوئی

پژوهشکده فناوری نوین زیستی، دانشگاه زنجان، زنجان، ایران

https://doi.org/10.61882/JCT.16.4.322
چکیده
هدف : تنوع ژنتیکی یکی از جنبه‌های تنوع زیستی است که برای استراتژی‌های حفاظتی، به‌ویژه در گونه‌های کمیاب و اندمیک بسیار مهم است . جنس Hesperis L. (Brassicaceae) شامل گیاهان دو ساله و چند ساله است و از 46 گونه در سراسر جهان تشکیل شده است که عمدتاً در مناطق مختلف اروپا، قفقاز، ماوراء قفقاز و به میزان کمتر در شمال و آسیای مرکزی و به میزان بیشتر در ترکیه با 28 گونه یافت میشود. این جنس با 11 یا 6 گونه متعلق به بخش های Hesperis Dvořák, Diaplictos Dvořák and Pachycarpos Fourn. نشان داده می شود.

مواد و روش ها: با توجه به اهمیت این گونه، در مجموع 73 فرد به نمایندگی از 11 جمعیت طبیعی H. persica Boiss. subsp. persica and H. persica subsp. kurdica (F. Dvořák & Hadac) F. Dvořák, نمونه برداری شدند. برای شناسایی صحیح گونه (Hesperis persica) از مراجع مختلفی استفاده شد.

نتایج: آزمون AMOVA تفاوت ژنتیکی معنی‌داری (88/0=PhiPT، 010/0=P) در بین جمعیت‌های مورد مطالعه ایجاد کرد و همچنین نشان داد که 40 درصد از کل تنوع ژنتیکی به دلیل تنوع درون جمعیتی و 60 درصد به دلیل تمایز ژنتیکی بین جمعیت است.

نتیجه‌گیری: نمودار PCoA جمعیت ها با خوشه بندی WARD داده های مولکولی مطابقت داشت. این نتایج نشان داد که جمعیت های جغرافیایی Hesperis persica بر اساس نشانگرهای (IRAP) به خوبی متمایز می شوند.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها

جریان ژن
IRAP
Hesperis persica
تمایز جمعیت
dor -

موضوعات

عنوان مقاله English

Genetic Diversity of Hesperis persica, Based On Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism

نویسنده English

somayeh esfandani bozchaloyi
University of Zanjan, Zanjan, Iran
چکیده English

Introduction: Knowledge of spatial genetic structures provides a valuable tool for inferring the evolutionary forces such as selective pressures and drift. Low gene flow due to spatial isolation of populations may even increase the degree of local differentiation. Nevertheless, phenotypic plasticity rather than genetic differentiation may be an alternative way of matching genotypes to environment; indeed increasing environmental variation favors higher levels of plasticity.Genetic diversity is one aspect of biological diversity that is extremely important for conservation strategies, especially in rare and narrowly endemic species. The genus Hesperis L. (Brassicaceae) comprises biennial and perennial herbs and consists of 46 species worldwide, mainly occurring in different parts of Europe, Caucasus, Transcaucasia, and to a lesser extent in northern and central Asia, and mostly in Turkey with 28 species. The genus is represented by 11 or six species belonging to sections Hesperis Dvořák, Diaplictos Dvořák and Pachycarpos Fourn. in Iran.
Aim: Moreover, due to extensive morphological variability of this species in the country, there is possibility of having infra-specific taxonomic forms in this species. Therefore, we carried out population genetic analysis and morphometric study of 11 geographical populations for the first time in the country. For genetic study, we used the inter-retrotransposon amplified polymorphism (IRAP) method that displays insertional polymorphisms by amplifying the segments of DNA between two retrotransposons. It has been used in numerous studies of genetic diversity. The objectives of this research were to study genetic diversity Hesperis persica with a different geographical origin by inter-retrotransposon amplified polymorphism (IRAP) method.
Materials and Methods: A total of 73 individuals were sampled representing 11 natural populations of H. persica Boiss. subsp. persica and H. persica subsp. kurdica (F. Dvořák & Hadac) F. Dvořák, in Mazandaran, East Azerbaijan, Kohgilouye-Boirahmad, Chaharmahal Bakhtiari, Fars, Zanjan, Tehran, Kordestan, Provinces of Iran during July-Agust 2019-2024.
Fresh leaves were used randomly from 6-10 plants in each of the studied populations. These were dried by silica gel powder. CTAB activated charcoal protocol was used to extract genomic DNA. The quality of extracted DNA was examined by running on 0.8% agarose gel. A set of six outward-facing LTR primers  were used for IRAP analysis. We also used 15 different combinations of outward-facing LTR pair primers. PCR reactions were carried in a 25μl volume containing 10 mM Tris-HCl buffer at pH 8; 50 mM KCl; 1.5 mM MgCl2; 0.2 mM of each dNTP (Bioron, Germany); 0.2 μM of a single primer; 20 ng genomic DNA and 3 U of Taq DNA polymerase (Bioron, Germany).  The thermal program was carried out with an initial denaturation for 1 min at 94°C, followed by 40 cycles in three segments: 35 s at 95°C, 40s at 47°C and 55s at 72°C. Final extension was performed at 72°C for 5 min. The amplification products were observed by running on 1% agarose gel, followed by the ethidium bromide staining. The fragment size was estimated by using a 100 bp molecular size ladder (Fermentas, Germany).The IRAP profiles obtained for each samples were scored as binary characters.  Parameter like Nei’s gene diversity (H), Shannon information index (I), number of effective alleles, and percentage of polymorphism were determined.Nei’s genetic distance among populations was used for Neighbor Joining (NJ) clustering and Neighbor-Net networking. Mantel test checked the correlation between geographical and genetic distance of the studied populations . These analyses were done by PAST ver. 2.17 , DARwin ver. 5 (2012) and SplitsTree4 V4.13.1 (2013) software. AMOVA (Analysis of molecular variance) test (with 1000 permutations) as implemented in GenAlex 6.4, and Nei,s Gst analysis as implemented in GenoDive ver.2 (2013) were used to show genetic difference of the populations. Moreover, populations, genetic differentiation was studied by G'ST est = standardized measure of genetic differentiation, and D_est = Jost measure of differentiation. The genetic structure of populations was studied by Bayesian based model STRUCTURE analysis , and maximum likelihood-based method of K-Means clustering of GenoDive ver. 2. (2013). For STRUCTURE analysis, data were scored as dominant markers. The Evanno test was performed on STRUCTURE result to determine proper number of K by using delta K value. In K-Means clustering, two summary statistics, pseudo-F, and Bayesian Information Criterion (BIC), provide the best fit for k.
 
Results: The highest value of percentage polymorphism (57.41%) was observed in Mazandaran, 30 km S. of Ramsar between Kash-e Chal mountain and Miankuh (population No.8, H. persica subsp. kurdica) which shows high value for gene diversity (0.34) and Shanon, information index (0.43). Population Chaharmahal Bakhtiari, Shahr-e Kurd, tang-e Sayyad protected area, Pir kuh mountain (No.3, H. persica subsp. persica) has the lowest value for percentage of polymorphism (28.11%) and the lowest value for Shanon, information index (0.088), and He (0.022).AMOVA (PhiPT = 0.98, P = 0.010), and Gst analysis (0.654, p = 0.001) revealed significant difference among the studied populations. It also revealed that, 40% of total genetic variability was due to within population diversity and 60% was due to among population genetic differentiation. Pairwise AMOVA produced significant difference among the studied populations. Moreover, we got high values for Hedrick standardized fixation index after 999 permutation (G’st = 0.654, P = 0.001) and Jost, differentiation index (D-est = 0.769, P = 0.001). These results indicate that the geographical populations of Hesperis persica are genetically differentiated from each other. The mean Nm = 0.455 was obtained for all IRAP loci, which indicates low amount of gene flow among the populations. Population assignment test also agreed with Nm result and could not identify significant gene flow among these populations. However, reticulogram obtained based on the least square method, revealed some amount of shared alleles among populations 2 and 3, and between 7 and 8, also between 1, and 4. This result is in agreement with grouping we obtained with PCoA plot, as these populations were placed close to each other. As evidenced by STRUCTURE plot based on admixture model, these shared alleles comprise very limited part of the genomes in these populations and all these results are in agreement in showing high degree of genetic stratification within Hesperis persica populations. In total 76 IRAP bands (loci) were obtained, out of which 14 bands were private. Populations 2 and 5-7 contained 2-5 private bands.
Conclusion: PCoA plot of populations was in agreement with WARD clustering of molecular data. These results indicated that geographical populations of Hesperis persica are well differentiated based on (IRAP) markers.

کلیدواژه‌ها English

Gene flow
IRAP
Hesperis persica
Population Differentiation

مقدمه

دانش و آگاهی از ساختارهای ژنتیکی ابزار ارزشمندی برای استنتاج نیروهای تکاملی مانند انتخاب طبیعی و رانش ژنتیکی فراهم می‌کند (1 و2و 3). میزان پایین جریان ژنی به دلیل ایزوله شدن جمعیت‌‌ها حتی ممکن است منجر به افزایش درجه تمایز جمعیت‌ها گردد (4و 5 و 6). با این وجود، انعطاف‌پذیری فنوتیپی به جای تمایز ژنتیکی ممکن است راهی جایگزین برای تطبیق ژنوتیپ‌‌ها با محیط باشد (2 و 3). در واقع افزایش تنوع محیطی به نفع سطوح بالاتر انعطاف پذیری است (7).

سرده Hesperis L. (Brassicaceae) شامل گیاهان دو ساله و چند ساله است و از 46 گونه در سراسر جهان تشکیل شده است. این سرده عمدتا در مناطق مختلف اروپا، قفقاز، ماوراء قفقاز و به‫میزان کم‫تر در شمال و آسیای مرکزی و به‫میزان بیشتر در ترکیه با 28 گونه یافت می‌شود. از این میان هفت تاکسون در ایران پراکنش دارد که تاکسون‌های ایرانی Hesperis متعلق به سه بخش  Hesperis Dvořák، Diaplictos Dvořák و Pachycarpos Fourn می‫باشد.

در ایران اولین مطالعات مربوط به زیرسرده و بخش در سرده Hesperis مربوط به ارزیابی ویژگی‌های ریخت‌شناسی، سیتولوژیکی و گرده‌شناسی می‌باشد، اما هنوز هم تاکسونومیست‌ها سعی می‌کنند طبقه‌بندی‌های جدید زیر سرده را معرفی کنند.

Hesperis  با داشتن غدد ساقه‌دار با ساقه‌های تک سلولی که به یک غده تک سلولی ختم می‌شود، به‫راحتی از بقیه Brassicaceae  قابل تشخیص است(8). این سرده ابتدا توسط آندژیوفسکی (1821) بازنگری شد و او این سرده را در یک بخش منفرد قرار داد . بعدها طبقه‌بندی این سرده توسط چندین محقق مورد بررسی قرار گرفت و بر اساس خصوصیات ریخت‌شناسی به بخش‌های مختلفی تقسیم شد. دو بخش Hesperidium DC و Deilosma Andrz (توسط دکاندول) سه بخش Hesperidium، Deilosma و Pachycarpos Fourn. Emend. Tzvelev) توسط فورنیر و تزولف) و دو بخش (sect. Purpureae Boiss. و Lividae  Boiss (توسط بوسیه) پیشنهاد شد. دووراک این سرده را به 5 زیرجنس، Hesperis، Mediterranea Borbas، Cvelevia Dvorak، Contorta Dvorak و Diaplictos Dvorak تفکیک نمود. کالن گونه‌های این سرده در ترکیه را در بخش‌ها جای نداد. علی‌رغم مطالعات متعدد در مورد طبقه‌بندی زیر جنس و زیرگونه‌ای این سرده، مشکلات تعیین حدود، هنوز حل نشده است (9و 10).

دوران و همکاران (12) در میان صفات گرده‌شناسی، سیتولوژیکی و ریزریخت‌شناسی (کرک)، از صفات ریخت‌شناسی سنتی، به‫عنوان مثال، فرم رویشی، ارتفاع ساقه، شکل برگ و ویژگی‌های تنوع میوه برای طبقه‌بندی در سطح بخش استفاده کرده‌است. اهمیت ریخت‌شناسی گرده و دانه Hesperis توسط دوران و اوجاک، دوران، پینار و همکاران، دوران و همکاران، دوران، پادوره و همکاران برای اهداف طبقه‌بندی انجام شده است. ریز ریخت‌شناسی سطح بذر منعکس کننده انتخاب طبیعی و سازش است. بنابراین این خصوصیات، در سطح سرده و گونه از اهمیت سیستماتیک برخوردار است. ریخت‌شناسی گرده رویکردی برای ارتباطات سیستماتیکی بین سرده‌های تیره شب بو فراهم می‌کند (11و12). آراس و همکاران (2) روابط فیلوژنتیکی در میان طبقات زیرگونه‌ای، گونه و فرا گونه‌ای 6 گونه از سرده Hesperis که از مناطق مختلف ترکیه جمع آوری شده بود را با تجزیه و تحلیل RAPD مورد بررسی قرار دادند. نتایج آن‫ها از این ایده حمایت می‌کند که (H. bicuspidata (sect. Hesperis، H. schischkinii (sect. Mediterranea)، H. pendula (sect. Pachycarpos)، H. breviscapa، H. kotschyi (sect. Cvelevia) و H. cappadocica (sect. Contorta)  باید بر اساس ویژگی‌های ریختی در بخش‌های مختلف قرار گیرند.

در سال‌های اخیر، سیستم‌های نشانگر مولکولی مانند چندشکلی قطعات DNA تکثیر یافته تصادفی (RAPD)، چندشکلی طولی قطعات تکثیر یافته (AFLP)، تکرار توالی ساده (ISSR)، توالی تکراری ساده (SSR) و چندشکلی تقویت‌شده بین رتروترانسپوزونی (IRAP) برای اندازه گیری تنوع ژنتیکی و روابط در ارقام و توده‌های Hesperis persica مورد استفاده قرار گرفته‌اند. همچنین با توجه به تنوع ظاهری وسیع این گونه در ایران، امکان وجود فرم های زیرگونه‫ای در این گونه وجود دارد. بنابراین، برای اولین بار در کشور، تجزیه و تحلیل ژنتیکی و ریخت شناسی 11 جمعیت جغرافیایی را انجام دادیم. هدف از این تحقیق بررسی تنوع ژنتیکی Hesperis persica با منشا جغرافیایی متفاوت با روش چندشکلی تقویت‌شده بین رتروترانسپوزونی (IRAP) است.

2-مواد و روش‌ها

مواد گیاهی: در مجموع، تعداد 73 فرد از 11 جمعیت جغرافیایی از دو زیرگونه H. persica subsp. persica و H. persica subsp. kurdica  طی ماه‌های تیر و مرداد سال‌های 1398 تا 1403 از استان‌های مازندران، آذربایجان شرقی، کهگیلویه و بویراحمد، چهارمحال و بختیاری، فارس، زنجان، تهران و کردستان نمونه‌برداری شدند (جدول 1). از هر جمعیت، برگ تازه 6 تا 10 فرد جمع‌آوری و بلافاصله در سیلیکا ژل خشک شد. شناسایی گونه‌ها بر اساس منابع معتبر فلورستیک و تاکسونومیکی انجام شد ( 6). جزئیات کامل محل‌های نمونه‌برداری در جدول 1 آمده است.

جدول 1: جمعیت‌های مورد مطالعه و موقعیت مکانی و بوم شناختی گونه  H.  persica

 

No

Subsp.

Locality

Altitude (m)

Pop1

subsp. persica

 

 

Azarbayejan, 25 km SE of Jolfa, Kiamaki Protected area, Gheshlagh village, Ghelenj mountain (NH3)

 

776

Pop2

subsp. persica

 

Fars, S. of Estahbanat, kuh-e Bah

1540

Pop3

subsp. persica

 

Chaharmahal Bakhtiari, Shahr-e Kurd, tang-e Sayyad protected area, Pir kuh mountain,

1610

Pop4

subsp. persica

 

Kohgiluye and Boirahmad, Yasuj, Sisakht, Bijan neck

1870

Pop5

subsp. persica

 

Tehran, SW of Kalan Lavasan

2500

Pop6

subsp. kurdica

Azarbayejan, Khoy, Belahzuk

1185

Pop7

subsp. kurdica

Fars, 25 km S. E. of Fasa, Salou village, kuh-e Raz

1550

Pop8

subsp. kurdica

Mazandaran, 30 km S. of Ramsar between Kash-e Chal mountain and Miankuh

54

Pop9

subsp. kurdica

Tehran, between Karaj and Chalus, Kandavan

1807

Pop10

subsp. kurdica

Zanjan, From Zanjan to Mahneshan, 12 km after andabad

1638

Pop11

subsp. kurdica

Kordestan, 61 km from Marivan on road to Paveh

1487

 

 

استخراج DNA و سنجش IRAP: برگ‌های تازه به‫طور تصادفی از 10-6 بوته در هر یک از جمعیت‌های مورد مطالعه استفاده شدند. این نمونه‌ها با پودر سیلیکاژل خشک شدند. برای استخراج DNA ژنومی از پروتکل زغال فعال CTAB استفاده شد (6). پس از انجام مراحل استخراج DNA از نمونه‌های مورد مطالعه، به‫منظور بررسی کیفیت DNA، از روش ژل آگارز و دستگاه الکتروفورز استفاده شد. مقدار 5 میکرولیتر از هر نمونه DNA Stock (نمونه رقیق نشده DNA) در داخل چاهک‌های ژل آگارز بارگذاری شد. سپس ژل بارگذاری شده در تانک الکتروفورز تحت جریان 100 ولت قرار گرفت، هنگامی‫که باندهای DNA به میانه ژل رسید جریان برق از تانک الکتروفورز قطع شده و از ژل مربوطه با دستگاه UV-transilluminator تصویری تهیه شد. باندهایی که در بالا قرار گرفته‌اند در واقع نشان دهنده  DNA هستند که وزن مولکولی بالایی دارند. در این ارزیابی از لدر bp 100 ( Fermentas، آلمان) به‫عنوان نشانگر استفاده شد. مجموعه‌ای از شش پرایمر LTR (جدول 2) برای تجزیه و تحلیل IRAP استفاده شد. ما همچنین از 15 ترکیب مختلف از پرایمرهای جفت LTR استفاده شد. به‫طور کلی، واکنش زنجیره‌ای پلیمراز حاوی 25 میکرولیتر حجم بود. این حجم 25 میکرولیتر حاوی بافر 10 میلی‫مول، Tris-HCl، 500 میلی‫مول، KCl بود. 5/1 میلی‫مول MgCl2 و ازهر 2/0 میلی‫مول dNTP و 2/0 میکرومولاز یک آغازگر واحد؛ 20 نانوگرم، DNA ژنومی و 3 U از Taq DNA پلیمراز (Bioron، آلمان). چرخه‌ها و شرایط زیر برای مراحل PCR مشاهده شد.

 

جدول 2: آغازگرهای IRAP بر اساس SMYKAL و همکاران (2011)

IRAP

Sequence (5´-3´)

GU735096

ACCCCTTGAGCTAACTTTTGGGGTAAG

GU980589

AGCCTGAAAGTGTTGGGTTGTCG

GU929878

GCATCAGCCTGGACCAGTCCTCGTCC

GU735096

CACTTCAAATTTTGGCAGCAGCGGATC

GU929877

TCGAGGTACACCTCGACTCAGG

GU980590

ATTCTCGTCCGCTGCGCCCCTACA

 

مراحل PCR: چرخه PCR شامل یک مرحله اولیه دناتوراسیون به‫مدت 5 دقیقه در دمای 94 درجه سانتی‌گراد، سپس 40 چرخه شامل: دناتوراسیون به‫مدت 1 دقیقه در 94 درجه سانتی‌گراد، اتصال آغازگر (Annealing) به‫مدت 1 دقیقه در دمای 52 تا 57 درجه (بسته به آغازگر) و گسترش (Extension) به‫مدت 2 دقیقه در دمای 72 درجه سانتی‌گراد و در نهایت یک مرحله گسترش نهایی به‫مدت 7 تا 10 دقیقه در 72 درجه بود.

3- آنالیز آماری

بررسی‌های آماری صفات ریخت شناسی: میزان متوسط و انحراف استاندارد صفات کمی در تاکسون‌های مورد مطالعه تعیین شد. برای گروه‌بندی تاکسون‌ها و جمعیت‌های مورد مطالعه بر پایه صفات ریخت‌شناسی، داده‌های حاصله استاندارد شده (میانگین = صفر و واریانس = یک) و برای فرایندهای تجزیه و تحلیل‌های آماری چند متغیره نظیر UPGMA و PCoA مورد استفاده قرار گرفتند. تجزیه و تحلیل آماری ANOVA برای تعیین معنی‫دار بودن تفاوت‌های صفات کمی در بین تاکسون‌ها و جمعیت‌های مورد مطالعه مورد استفاده قرار گرفت. همچنین ضریب همبستگی Pearson برای نمایش میزان پیوستگی محتمل بین صفات ریخت‌شناسی کمی با عوامل اکولوژیکی نظیر طول و عرض جغرافیایی ارتفاع محل رویش، متوسط حداقل و حداکثر دمای سالیانه زیستگاه به‫وسیله نرم افزار SPSS صورت پذیرفت.

 بررسی های آماری بخش مطالعه تنوع مولکولی IRAP: باندهای مشاهده شده به‫صورت صفات دو حالته کد گذاری شدند ( حضور = 1، عدم حضور0) پارامترهای تنوع ژنتیکی از جمله تعداد آلل‫های موثر، اندیس شانون، هتروزیگوتی و میزان پلی مورفیسم در هر جمعیت مشخص شد (13 و 14).  محاسبه فاصله ژنتیکی Nei’s در میان جمعیت‌های مورد مطالعه با استفاده از خوشه‌بندی Neighbor Joining (NJ) و روش شبکه‌ای NeighborNet با 1000 بار بوت استرپ (15و16) استفاده شد. دو روش برای مشخص شدن تفاوت ژنتیکی معنی‌دار در میان جمعیت‌های مورد مطالعه و استان‌ها به‫کار گرفته شد:

1- آزمون AMOVA (Analysis of molecular variance) توسط نرم افزار GenAlex ver. 6,4 انجام شد (17و 18).

2- پارامترهای Gest و Dest با GenoDive ver.1 (2013) محاسبه شدند (19و 20).

آزمون Mantel برای مطالعه ارتباط بین فاصله جغرافیایی و فاصله ژنتیکی جمعیت‌های مورد مطالعه با استفاده از نرم افزار PAST و  GenAlex انجام شد. برای پرهیز از اشتباهات احتمالی محاسباتی در تعیین اختلاف معنی‌دار ،مقادیرFst و آنالیزAMOVA برای داده‌های IRAP توسط نرم افزار Hickory (ver.1) در میان جمعیت‌ها به‫صورت دو به دو (جفت شده) محاسبه شد. 

جهت گروه‌بندی افراد و جمعیت‌ها از PCoA (Principal coordinate analysis) استفاده شد. آنالیز (MDS) (Non-metric multidimensional scaling) برای فاصله ژنتیکی جمعیت‌ها با استفاده از برنامه PAST ver. 2,17 ، استفاده شد. از جمله نرم افزارهای آماری دیگر مورد استفاده در این مقاله برای رسم خوشه‌ها و گراف‌ها می‫توان به نرم افزارهای زیر اشاره کرد: PAST ver. 2.17, DARwin ver. 5, SplitsTree4 V4.13.1

4-نتایج

پارامترهای تنوع ژنتیکی در 11 جمعیت جغرافیایی H. persica تعیین شد که در جدول 3 آورده شده است . بیشترین مقدار درصد چندشکلی (41/57) درصد درجمعیت مازندران در 30 کیلومتری جنوب شرقی رامسر بین کوه کش چال و میانکوه مشاهده شد (جمعیت شماره 8، H. persica subsp. kurdica) که ارزش بالایی برای تنوع ژنی (34/0) و اندکس شانون (43/0 ) نشان می‌دهد. جمعیت چهارمحال بختیاری ، شهرکرد، منطقه حفاظت شده تنگ صیاد، پیرکوه (شماره 3، ( H. persica subsp. persica   کم‫ترین مقدار را برای درصد چندشکلی (11/28) درصد و کم‫ترین مقدار را برای اندکس شانون (88/0 )  و )He= 0.054( دارد .

 

 

 

جدول 3: پارامترهای تنوع ژنتیکی در جمعیت‌های مورد مطالعه N = تعداد نمونه، Na =  تعداد آلل‫های مختلف. Ne = تعداد آلل‫های موثر، I = شاخص اطلاعات شانون، He =  تنوع ژن، UHe =  تنوع ژنی بی طرف، P% = درصد چندشکلی

Pop          N             Na           Ne           I               He           UHe        %P

pop1        7.000       0.198       1.112       0.159       0.115       0.111       29.14%

pop2        6.000       0.233       1.231       0.289       0.222       0.224       38.14%

pop3        7.000       0.289       1.011       0.088       0.022       0.044       28.11%

pop4        10.000     1.190       1.211       0.242       0.267       0.236       32.43%

pop5        9.000       1.195       1.322       0.213       0.165       0.104       45.15%

pop6        8.000       0.586       1.283       0.138       0.177       0.131       39.10%

pop7        7.000       0.298       1.295       0.196       0.277       0.223       33.09%

pop8        17.000     1.375       1.190       0.432       0.344       0.392       57.41%

pop9        12.000     0.488       1.290       0.227       0.128       0.142       36.20%

pop10      15.000     0.188       1.199       0.291       0.295       0.286       44.18%

pop11      7.000       0.388       1.285       0.223       0.295       0.273       31.22%

 

تمایز ژنتیکی جمعیت

 AMOVA ( PhiPT = 0.98,  P = 0.001) و تجزیه و تحلیل(G’st = 0.654, P = 0.001) ، تفاوت معنی‌داری را بین جمعیت‌های مورد مطالعه نشان‌داد (جدول 4). همچنین 40 درصد از کل تنوع ژنتیکی به‫دلیل تنوع درون جمعیتی و 60 درصد به دلیل تمایز ژنتیکی بین جمعیت است. AMOVA تفاوت معنی‫داری در بین جمعیت‌های مورد مطالعه ایجاد کرد. این نتایج نشان می‌دهدکه جمعیت‌های جغرافیایی H.  persica  از نظر ژنتیکی از یکدیگر متمایز می‫شوند.

 

جدول 4: تجزیه و تحلیل واریانس مولکولی (AMOVA) گونه‌های مورد مطالعه.

Source

df

SS

MS

Est. Var.

%

ΦPT

Among Pops

112

1361.781

70.122

18.011

60%

 

60%

Within Pops

120

21.227

36.340

15.431

40%

Total

232

1382.112

  

33.442

100%

 

 

 

 

 

 

 

 

df : درجه آزادی؛ SS: مجموع مشاهدات مربعی. MS: میانگین مشاهدات مربعی. EV: واریانس تخمینی. Φ PT: نسبت کل واریانس ژنتیکی در بین افراد در یک الحاق، (P <0.001).

 

 

 قرابت ژنتیکی

در درخت   NJ، نمونه‌های گیاهی هر جمعیت با هم گروه‌بندی شدند و خوشه‌های جداگانه تشکیل دادند. در نمونه‌های مورد مطالعه با فرم‌های میانی مواجه نشد. این نتایج نشان داد که داده‌های IRAP میتوانند جمعیت‌های  H.  persica را در دو خوشه یا گروه اصلی مختلف متمایز کنند (شکل1). اولین خوشه اصلی که با مقدار قابل توجه بوت استرپینگ 95 درصد حمایت می‌شود خود به‫ دو زیر خوشه اصلی تقسیم می‌شود تا گیاهان  H. persica subsp. persica )شماره 1-5) به‫دلیل تشابه ژنتیکی اولین زیر خوشه را تشکیل می‌دهد، در حالی‫که گیاهان H. persica subsp. kurdica ) شماره 6-11) دومین خوشه اصلی را تشکیل داد .

 

 

 

شکل 1: خوشه‌بندی NJ از جمعیت‎ها در H.  persica  بر اساس داده‌های IRAP

 

واگرایی ژنتیکی و جدایی جمعیت‌های H. persica subsp. persica (No.1-5) (شماره 1-5) و همچنین گیاهان H. persica subsp. kurdica. (شماره 6-11) از سایر جمعیت‌ها در نمودار PcoA داده‫های IRAP پس از 900 جای‫گشت مشهود است (شکل2). سایر جمعیت‌ها قرابت ژنتیکی  بیشتری را نشان دادند. آزمون منتل پس از 5000 جایگشت همبستگی معنی‌داری بین فاصله ژنتیکی و فاصله جغرافیایی در این جمعیت‌ها ایجاد کرده است. بنابراین، جمعیت‌هایی که از نظر جغرافیایی دورتر هستند، جریان ژنی کم‫تری دارند و جداسازی با فاصله (IBD) در H.  persica را دارد.

 

شکل2: نمودار PcoA جمعیت‌ها در H.  persica بر اساس داده‌های IRAP

5-بحث

تجزیه و تحلیل ژنتیک جمعیت در مطالعات ژنتیکی و اصلاحی مهم است. آن‫ها اطلاعاتی را در مورد سطوح تنوع ژنتیکی، تقسیم‫بندی تنوع ژنتیکی در درون/بین جمعیت‌ها، خود لقاحی و دگر لقاحی، اندازه موثر جمعیت ارائه می‫دهند (21و 22و 23 و 24). ظهور نشان‫گرهای مولکولی مطالعات ژنتیکی جمعیت را بسیار بهبود بخشیده است. این نشانگرها برای شناسایی ژنوتیپ‌های بالقوه جدید در میان بسیاری از نمونه‌های Hesperis  استفاده شده‌اند (25و 26و 27). در سال‌های اخیر، سیستم‌های نشانگر مولکولی مانند چندشکلی قطعات DNA تکثیر یافته تصادفی (RAPD)، چندشکلی طولی قطعات تکثیر یافته (AFLP)، توالی تکرار ساده (ISSR)، توالی تکرار ساده (SSR) و چندشکلی تقویت‌شده بین رتروترانسپوزونی (IRAP) برای اندازه‫گیری تنوع ژنتیکی و ارتباط در میان ارقام و کولتیوارهای نژادهای بومی استفاده می‫شود ( 28و 29و 30). عناصر قابل انتقال، به‫ویژه رتروترانسپوزون‌ها، بیشتر ژنوم گیاهان را تشکیل می‌دهند. تکثیر آن‫ها تنوع ژنومی ایجاد می‫کند و آن‫ها را به منبع عالی از نشان‫گرهای مولکولی تبدیل می‌کند (31 و32). روش چند شکلی تقویت‌شده بین رتروترانسپوزونی (IRAP) پلی‌مورفیسم‌های درج شده را با تقویت بخش‌های DNA بین دو رتروترانسپوزون نشان می‌دهد که در مطالعات متعددی در مورد تنوع ژنتیکی استفاده شده است  (25 و 28).

این مطالعه با هدف ارزیابی تنوع ژنتیکی در H.  persica به‫منظور کمک به ژرم پلاسم آن انجام شد. اطلاعات به‫دست آمده در مورد تنوع ژنتیکی بین و درون جمعیت‌های مختلف، زمینه را برای تدوین استراتژی های حفاظتی مناسب فراهم می‫کند. تحلیل حاضر نشان داد که  H.  persica  بسیار متغیر است، احتمالا به‫دلیل زمینه‌های ژنتیکی محلی خاص، فشار تولید مثل و یا تبادل محدود مواد ژنتیکی می‌باشد. ماهیت منحصر به فرد ژرپلاسم H. persica  که توسط نتایج نشان داده شد، از این مورد برای اجرای استراتژی‌های شناسایی، حفاظت و تولید مثل حمایت می‌کند. همچنین نشان‫گرهای IRAP مورد استفاده برای تعیین تنوع ژنتیکی جمعیت گونه‌های گیاهی در ایران مفید بودند. نتایج این سنجش مولکولی در 11 جمعیت مربوط به H.  persica  در جدول 3 ارائه شده است. در مجموع 86 باند توسط 6 آغازگر تکثیر شد که به‫طور متوسط 11 باند در هر آغازگر که 70 باند (85%) چندشکلی بودند. تعداد کل قطعات تکثیر شده بین 10 تا 18 و تعداد قطعات چندشکل بین 9 تا 15 بود.

تنوع ژنتیکی برای بقای گونه‌ها اهمیت اساسی دارد (۱۵ و ۱۷). سطح تنوع ژنتیکی در هر گونه به شدت با سیستم تولیدمثلی آن مرتبط است، به طوریکه دگرگشنی معمولاً منجر به سطوح بالاتر تنوع ژنتیکی می‌شود (14). بر اساس مطالعات، گونه‌های خودگشن در مقایسه با گونه‌های دگرگشن از تنوع ژنتیکی کم‫تری برخوردارند.

مطالعه حاضر سطح پایینی از هتروزیگوسیتی (٫۲۲–۰٫۰۵۴ He =) را در H. persica نشان می‌دهد. نرخ بالای خودلقاحی در این گونه، که احتمالا علت اصلی پایین بودن سطح هتروزیگوسیتی برآورد شده است، مشاهده شده است. میانگین ۰٫۴۵۵  Nm= برای جایگاه‌های IRAP مورد بررسی در این مطالعه، جریان ژن محدود بین جمعیت‌ها را نشان داد که توسط تجزیه و تحلیل STRUCTURE  تایید می‌شود.

بررسی نتایج بیولوژیکی نشان می‌دهد که با کاهش فاصله ژنتیکی بین جمعیت‌ها، شباهت آن‫ها به یکدیگر افزایش می‌یابد. این امر احتمالا به‫دلیل سهولت پراکنش بذر توسط باد در این گونه است. همان‫طور که در تجزیه و تحلیل AMOVA نشان داده شده، درصد تنوع ژنتیکی در درون و بین جمعیت‌ها نسبی است. از آنجایی‫که H. persica گیاهی خودگشن است و بازتولید در درون جمعیت‌های همان گونه رخ می‌دهد، تمایز بین جمعیت‌ها در صفات فنوتیپی و تنوع آللی می‌تواند نتیجه رانش ژن، اثرات بنیان‫گذار و انتخاب طبیعی باشد (30).

ویژگی‌های ریخت‌شناسی گرده و بذر در گونه‌های ایرانی متعلق به سه بخش Hesperis،Diaplictos  و Pachycarpos برای اولین بار با استفاده از میکروسکوپ نوری (LM) و میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) مورد بررسی قرار گرفت. مطالعات فیلوژنتیک مولکولی Hesperis هنوز در مقیاس جهانی انجام نشده است. با این‫حال، در سایر اعضای تیره Brassicaceae، سیستم‌های طبقه‌بندی سنتی عمدتا به‫دلیل موازی‌سازی و هم‫گرایی صفات ریخت‌شناسی با مطالعات بیوسیستماتیک مدرن در تضاد هستند (۲۱). در نتیجه، درک موقعیت واقعی هر گونه دشوار خواهد بود.

پس از ترکیه، ایران دومین کشور از لحاظ تنوع برای سرده Hesperis محسوب می‌شود (۱۷) و علیرغم مطالعات متعدد در سطح فراگونه‌ای و زیرگونه‌ای روی این سرده، مشکلات طبقه‌بندی آن هنوز حل نشده است  (24).

6-نتیجه‌گیری

تاکنون هیچ تلاشی برای مطالعه تنوع ژنتیکی، سازگاری اکولوژیکی و تمایز درون و بین گونه‌ای همراه با مطالعات ریخت‌شناسی بر روی گونه Hesperis وجود ندارد. بنابراین مطالعه ریخت شناسی و مولکولی در  73 فرد از 11 جمعیت جغرافیایی H. persica Boiss.  subsp. persica   H. persica subsp. kurdica (F. Dvořák & Hadac) F. Dvořák, انجام گرفت. درپایان، ایران یکی از دو مرکز بزرگ Hesperis  در دنیا است. نتایج حاضر نشان داد که بررسی تنوع ژنتیکی با استفاده از نشانگرهای IRAP در برخی از افراد Hesperis persica اطلاعاتی را که برای حفاظت ژرم پلاسم H.  persica مرتبط است را ارائه کرد. نتایج فعلی نشان داد که H. persica تنوع ژنتیکی متوسطی دارند و بنابراین برای حفاظت ژنتیکی و برنامه‌ریزی برنامه‌های اصلاحی آتی بسیار مهم هستند.             

-

1. Andrzejewski, A. L. Hesperis L. DC. Syst. 1821; 2: 447-448.
2. Aras S, Duran A, Yenilmez G, Duman DC. Genetic relationships among some Hesperis L. (Brassicaceae) species from Turkey assessed by RAPD analysis. Afr Journ. Biot. 2009; 8: 3128-3134.
3. Brochmann C. Pollen and seed morphology of Nordic Draba (Brassicaceae): phylogenetic and ecological implications. Nord J Bot1. 1992; 657-673.
4. Duran A, Ocak A. Hesperis turkmendaghensis (Sect. Hesperis) (Cruciferae/Brassicaceae), a new species from the Central Anatolia region, Turkey. Bot. J. Lin. Soc. 2005;147: 239-247.
5. Al-Shehbaz IA, Beilstein MA, Kellogg EA. Systematics and phylogeny of the Brassicaceae (Cruciferae): An overview. Pl. Syst. Evol. 2006; 259: 89–120.
6. Assadi M, Sajedi S, Fakhr Ranjbari H, Mirzadeh Vaghefi S, Moazzeni H, Khodashenas M, Khosravi AR, Hatami A, Mehrnia M, Kaffash Sh, Heidarnia N, Sheidai M, Heidari Rikan M, Kavousi K, Sonboli A, Veiskarami Gh. & Aminian F. Hesperis L. In: Assadi, M. & Maassoumi, A. A. (Eds.) Flora of Iran. Vol. 143. Research Institute of Forests and Rangelands, Tehran, 2017;  647-663.
7. De Candolle AP. Prodromus. 1824; 1:188-190.
8. Duran A, Ünal F, Pınar NM. & Çetin Ö. Morphological, palynological, seed-coat surface and karyological studies of Hesperis bicuspidata and H. stellata (Cruciferae) from Turkey. Nordic J. Bot. 2011; 29: 641-651.
9. Cullen J. Flora of Turkey and the East Aegean Islands. Davis PH (ed.). 1965; 1: 452-460. Edinburgh: Edinburgh Univ. Press.
10. Duran A. A taxonomic update of the genus Hesperis in Turkey. 5th International Conference on Agriculture, Environment and Biological Sciences (ICAEBS-16), Pattaya, Thailand, 2016; 26-29.
11. Dvořák F. Hesperis L. In: Rechinger K.H. (Eds.) Flora Iranica. Vol. 57/28.2. Akademische Druck-u, Verlagsanstalt, Graz. 1968; 266-273.
12. Dvořák F. Infrageneric classification of Hesperis L. Feddes. Rep. 1973; 84: 259-272.
13. Duran A, Ünal F. & Pınar M. The Revision of the Genus Hesperis L. in Turkey. The Scientific and Technical Research Council of Turkey, Ankara, XV 2003: 293.
14. Duran A. Two new species with pendulous fruits in Hesperis (Brassicaceae) from South Anatolia region, Turkey. Novon. 2008; 18: 453-463.
15. Duran A. Hesperis ozcelikii (Brassicaceae), a new species from Turkey. Ann. Bot. Fen. 2009; 46: 577-584.
 
16. Ellis JR, JM, Burke. EST-SSRs as a resource for population genetic analyses. Heredity, (2007); 99: 125-132.
17. Evanno G S, Regnaut J, Goudet. Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE: a simulation study. Mol. Ecol. 2005;14:2611-2620.
18. Esfandani Bozchaloyi S M, Sheidai M, Keshavarzi Z, Noormohammadi. Genetic Diversity and Morphological Variability in Geranium Purpureum Vill. (Geraniaceae) of Iran. Genetika. 2017a;  49:  543-557.
19. Esfandani Bozchaloyi S M, Sheidai M, Keshavarzi Z, Noormohammadi. Species Delimitation In Geranium Sect. Batrachioidea: Morphological and Molecular. Act. Bot. Hung. 2017b; 59(3–4):319–334.
20. Eslami Farouji A, Khodayari H, Assadi M, Özüdoğru B, Çetin Ö, Mummenhoff K. & Bhattacharya S. Numerical taxonomy contributes to delimitation of Iranian and Turkish Hesperis L. (Brassicaceae) species. Phytotaxa. 2018; 234-568.
21. De Kort H, Vandepitte K, Honnay O. A meta-analysis of the effects of plant traits and geographical scale on the magnitude of adaptive differentiation as measured by the difference between QST and FST. Evol. Ecol. 2012; 27:622-677.
22. Franzke A, Lysak MA, Al-Shehbaz IA, Koch MA, Mummenhoff  K.  Cabbage family affairs: the evolutionary history of Brassicaceae. Trends Plant Sci. 2011; 16: 108–116.
33. Fournier ME. Monographie du genre Hesperis. Bul. de la Soc. Bot.de Fra. 1868; 13: 326-362.
23. Esfandani Bozchaloyi SM, Sheidai M, Keshavarzi Z, Noormohammadi. Genetic and morphological diversity in Geranium dissectum (Sec. Dissecta, Geraniaceae) populations. Biologia. 2017c;72(10): 1121-1130
24. Esfandani Bozchaloyi SM, Sheidai M, Keshavarzi Z, Noormohammadi. Morphometric and ISSR-analysis of local populations of Geranium molle L. from the southern coast of the Caspian Sea. Cytology and genetics. 2018c; 52,  4: 309–321.
25. Esfandani-Bozchaloyi SM, Sheidai Molecular diversity and genetic relationships among Geranium pusillum and G. pyrenaicum with inter simple sequence repeat (ISSR) regions, Caryologia. 2018d; 71, 4: 1-14.
26. Esfandani-Bozchaloyi S, M, Sheidai Comparison of DNA Extraction Methods from Geranium (Geraniaceae). Acta Botanica Hungarica. 2019; 61(3–4): 251–266.
27. Eslami Farouji A, Khodayari H, Assadi M, Özüdoğru B, Çetin Ö, Mummenhoff K. & Bhattacharya S. Numerical taxonomy contributes to delimitation of Iranian and Turkish Hesperis L. (Brassicaceae) species. Phytotaxa. 2018;222-234.
28. Falush DM, Stephens JK, Pritchard. Inference of population structure using multilocus genotype data: dominant markers and null alleles. Mol. Ecol. Notes. 2007. 7:574−578.
29. Freeland Jr, H, Kirk SD, Peterson Molecular Ecology, 2nd Ed. Wiley-Blackwell, Chichester. 2011;464-477.
30. Esfandani Bozchaloyi SM, Sheidai M, Keshavarzi Z, Noormohammadi.  Analysis of genetic diversity in Geranium robertianum by ISSR markers.  Phytologia Balcanica. 2017d; 23(2):157–166.
31. Esfandani Bozchaloyi S M, Sheidai M, Keshavarzi Z, Noormohammadi. Species Relationship and Population Structure Analysis In Geranium Subg.  Robertium (Picard) Rouy With The Use of ISSR Molecular Markers. Act. Bot. Hung. 2018a; 60(1–2): 47–65.
32. Esfandani Bozchaloyi SM, Sheidai M, Keshavarzi Z, Noormohammadi. Species Identification and Population Structure  Analysis In Geranium Subg. Geranium (Geraniaceae) .  Hacquetia. 2018b; 17/2: 235–246.
سلول و بافت
دوره 16، شماره 4
زمستان 1404
صفحه 322-336

  • تاریخ دریافت 17 بهمن 1403
  • تاریخ بازنگری 19 شهریور 1404
  • تاریخ پذیرش 18 آبان 1404

صفحه اصلی

راهنمای نویسندگان

ارسال مقاله

سرقت ادبی

تماس با ما